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Präparation und Analyse histologischer Objektträger von Augäpfeln von Ratten und Mäusen zur Beurteilung der Netzhaut

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DOI:

10.3791/66663

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23. August 2024

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1Chair and Department of Experimental and Clinical Physiology, Laboratory of Centre for Preclinical Research, Medical University of Warsaw, 2Department of Pathology, Medical University of Warsaw

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Manuskript stellt ein Protokoll zur histologischen Präparation von Objektträgern aus Augäpfeln von Nagetieren vor. Mit der vorgeschlagenen Methode kann die innere Netzhaut einfach sichtbar gemacht und unter einem Lichtmikroskop beurteilt werden. Das Verfahren wird für die Augäpfel von Mäusen und Ratten vorgestellt.

Zusammenfassung

Ein Augapfel für Nagetiere ist ein mächtiges Werkzeug, um die Pathomechanismen vieler Augenerkrankungen wie Glaukom, hypertensive Retinopathie und viele mehr zu erforschen. Präklinische Experimente ermöglichen es den Forschern, die Wirksamkeit neuartiger Medikamente zu untersuchen, neue Behandlungsmethoden zu entwickeln oder nach neuen Pathomechanismen zu suchen, die an der Entstehung oder dem Fortschreiten der Krankheit beteiligt sind. Eine histologische Untersuchung liefert viele Informationen, die notwendig sind, um die Auswirkungen der durchgeführten Experimente zu beurteilen, und kann Degeneration, Gewebeumbau, Infiltration und viele andere Pathologien aufdecken. In der klinischen Forschung gibt es nur selten eine Chance, Augengewebe zu gewinnen, das für eine histologische Untersuchung geeignet ist, weshalb Forscher die Chance nutzen sollten, die die Untersuchung von Augäpfeln von Nagetieren bietet. Dieses Manuskript stellt ein Protokoll für die histologische Vorbereitung von Schnitten von Augäpfeln von Nagetieren vor. Das Verfahren wird für die Augäpfel von Mäusen und Ratten vorgestellt und umfasst die folgenden Schritte: (i) Entnahme des Augapfels, (ii) Konservierung des Augapfels für die weitere Analyse, (iii) Verarbeitung des Gewebes in Paraffin, (iv) Vorbereitung von Objektträgern, (v) Färbung mit Hämatoxylin und Eosin, (vi) Beurteilung des Gewebes unter einem Lichtmikroskop. Mit der vorgeschlagenen Methode kann die Netzhaut einfach sichtbar gemacht und detailliert beurteilt werden.

Einleitung

Der Augapfel ist eine kugelförmige Struktur, die das Sehorgan bildet. Das Innere des Augapfels kann in zwei Segmente unterteilt werden: das vordere Segment, das die Hornhaut, die Iris, den Ziliarkörper, die Linse, die Vorderkammer und die hintere Kammer umfasst, und das hintere Segment, das den Glaskörper, die Netzhaut, die Aderhaut, die Sklera und den Sehnervenkopf umfasst. Die vordere Kammer befindet sich zwischen der Hornhaut und der Iris 1,2. Die Iris ist eine kreisförmige Struktur mit einer Öffnung in der Mitte, die als Pupille bezeichnet wird. An der Verbindungsstelle zwischen Hornhaut und Iris befindet sich der Abflusswinkel, an dem ein spezialisiertes System von Trabekeln das Kammerwasser vom Augapfel in das Venensystem ableitet. Die hintere Kammer wird durch die Iris, den Ziliarkörper und die Linse sowie die Aufhängebänder begrenzt, die die Linse an Ort und Stelle halten, begrenzt. Hinter der Linse befindet sich der Glaskörper, der die größte Struktur des Augapfels darstellt. Der Glaskörper haftet an der Netzhaut und stabilisiert deren Position. Die Netzhaut wird von der Aderhaut und der Sklera1 umgeben. Die Anatomie des Augapfels ist in Abbildung 1 zusammengefasst.

Die Augapfelwand besteht aus drei Schichten. Die äußerste Schicht ist die Sklera, die den Augapfel vor Verletzungen schützt und seine Form beibehält. Am vorderen Pol des Augapfels verwandelt sich die Sklera in eine durchsichtige Hornhaut. Unter der Sklera befindet sich eine Gefäßstruktur, die Uvea genannt wird und deren Hauptfunktion darin besteht, die Strukturen des Auges zu nähren. Die Uvea bildet die Aderhaut und innerhalb des vorderen Pols den Ziliarkörper und die Iris1. Die innerste Schicht ist die Netzhaut, eine hochspezialisierte Struktur des Auges, die aus Neuronen, Gliazellen und Pigmentepithelzellen besteht. Zu den retinalen Neuronen gehören die Photorezeptorzellen (Stäbchen und Zapfen), horizontale Zellen, bipolare Zellen, Amakrinzellen und retinale Ganglienzellen (RGCs). Diese Zellen sind in komplexe Schichten unterteilt und haben die Aufgabe, Lichtreize zu empfangen und zu verarbeiten 2,3. Zu den Gliazellen der Netzhaut gehören die Müller-Zellen, Astrozyten und Mikroglia, die in allen Schichten der Netzhaut vorhanden sind. Zu den vielen Funktionen der Gliazellen gehören die Ernährung der Neuronen, die Unterstützung der Blut-Netzhaut-Schranke, die strukturelle Unterstützung der Neuronen zur Aufrechterhaltung der Schichtstruktur der Netzhaut, die Regulierung des Stoffwechsels der Neuronen, die Sekretion biologisch aktiver Proteine, die die Funktion, das Wachstum und das Überleben der Neuronen regulieren, sowie die Regulierung der immunologischen Prozesse in der Netzhaut4. Die Pigmentepithelzellen bilden die äußerste Schicht der Netzhaut und fungieren als Barriere zwischen Aderhaut und Photorezeptoren. Diese Zellen regulieren den bidirektionalen Transport von Abfallprodukten und Nährstoffen und schützen die Netzhaut auch vor übermäßigen lichtinduzierten Schäden, indem sie Lichtenergie absorbieren und lichterzeugte reaktive Sauerstoffspezies neutralisieren5.

Die Netzhaut kann in zehn Schichten unterteilt werden: (i) das retinale Pigmentepithel, (ii) die Photorezeptorsegmentschicht (Stäbchen und Zapfen), (iii) die äußere Grenzmembran (ELM), (iv) die äußere Kernschicht (ONL), (v) die äußere plexiforme Schicht (OPL), (vi) die innere Kernschicht (INL), (vii) die innere plexiforme Schicht (IPL), (viii) die Ganglienzellschicht (GCL), (ix) die retinale Nervenfaserschicht (RNFL), und (x) interne Grenzmembran (ILM)2. Zu den kernhaltigen Schichten der Netzhaut gehören ONL, INL und GCL, während die Schichten mit synaptischen Verbindungen zwischen den Zellen OPL und IPL6 umfassen. Die Kerne von Stäbchen und Zapfen bilden das ONL, und ihre Axone erstrecken sich in das OPL, wo sie sich mit den Dendriten der bipolaren und horizontalen Zellen verbinden. Innerhalb des INL befinden sich die horizontalen, bipolaren und amakrinen Zellkerne. Innerhalb des IPL synapsieren die Axonendigungen von bipolaren und amakrinen Zellen mit den Dendriten der RGCs. Innerhalb der GCL machen die RGCs den größten Teil der Zellkörper aus, aber auch einige dislozierte Amakrinzellen sind dort zu finden. Die Axone der RGCs bilden den RNFL und weiter den Sehnerv 7,8,9.

Viele Augenerkrankungen, wie z. B. neurodegenerative Erkrankungen der Netzhaut, führen zu irreversibler und unheilbarer Erblindung10. Das Sehen gilt als einer der wichtigsten Sinne11, und eine dauerhafte Erblindung schränkt die Lebensqualität des Patienten erheblich ein. Um das Verständnis der Pathomechanismen vieler Krankheiten zu verbessern, wird die präklinische Forschung mit Zellkulturen oder Tiermodellen breit angelegt. Präklinische Studien an Versuchstieren bieten die Möglichkeit, die Pathomechanismen von Augenerkrankungen zu untersuchen und neue Therapiestrategien zu entwickeln. Augenkrankheiten können sowohl bei großen Tieren (Affen, Kühe, Hunde und Katzen) als auch bei kleinen Tieren (Kaninchen, Ratten, Mäuse und Zebrafische) modelliert werden. Die Verwendung größerer Tiere ermöglicht aufgrund seiner Größe einen besseren Zugang zum Auge. Experimente, die mit Nagetieren durchgeführt werden, ermöglichen hingegen aufgrund ihrer relativ schnellen Fortpflanzung die Züchtung von Inzuchtstämmen, die sich durch eine Anfälligkeit für bestimmte Krankheiten auszeichnen12,13.

In Tiermodellen ist eine Enukleation möglich, die eine detaillierte histopathologische Untersuchung des Augapfels ermöglicht, mit der Beurteilung kleinerer Pathologien, die in bestimmten Strukturen des Auges während der Entwicklung der Krankheit auftreten - eine Untersuchung, die beim Menschen sehr selten durchgeführt werden kann. Die histopathologische Beurteilung ist ein äußerst wertvolles Instrument bei der Erforschung der Pathomechanismen von Augenerkrankungen. In der veröffentlichten Literatur sind die Beschreibungen der Methodik für die histologische Untersuchung von Augäpfeln sehr begrenzt, und es fehlen Schritt-für-Schritt-Anleitungen, was es Anfängern erschwert, sie nachzubilden. Ziel dieser Studie ist es, eine einfache und prägnante Methode zur Vorbereitung histologischer Objektträger und zur Beurteilung der Netzhaut von Ratte und Maus bereitzustellen.

Protokoll

Die Forschung wurde in Übereinstimmung mit den institutionellen Richtlinien durchgeführt. Die in dieser Studie verwendeten Augäpfel wurden von Tieren gewonnen, die in einem Experiment enthalten waren, das auf der Grundlage der Studiengenehmigungsnummer WAW2/122/2020 durchgeführt wurde, die von der 2. Lokalen Ethikkommission an der Warschauer Universität für Naturwissenschaften in Warschau, Polen, ausgestellt wurde. Unser Protokoll wurde entwickelt, indem wir Mäuse im Alter von 11 und 44 Wochen und Ratten im Alter von 6, 12 und 16 Wochen untersuchten.

1. Vorbereitung der Mausaugäpfel

HINWEIS: Dieses Protokoll stellt die Methode zur Präparation von Schnitten von Augäpfeln von Mäusen dar und wurde unter Verwendung von Augäpfeln entwickelt, die von weiblichen C57Bl/6-Mäusen im Alter von 11 Wochen (Durchschnittsgewicht 21 g), weiblichen C57Bl/6-Mäusen im Alter von 44 Wochen (Durchschnittsgewicht 25 g), weiblichen DBA/2-Mäusen im Alter von 11 Wochen (Durchschnittsgewicht 21,5 g) und weiblichen DBA/2-Mäusen im Alter von 44 Wochen mit Glaukom (Durchschnittsgewicht 25 g) entnommen wurden.

  1. Enukleation
    1. Verwende eine kleine Pinzette, um die Augenlider zu öffnen. Drücke auf die Augenlider, damit der Augapfel prolapsiert.
    2. Präpariere den Augapfel von der Augenhöhle, indem du das Gewebe hinter dem Augapfel mit einer kleinen, scharfen Schere abschneidest. Sobald der Augapfel aus der Augenhöhle entfernt ist, schneiden Sie das herstehende Bindegewebe und die periokularen Muskeln ab.
      1. Markieren Sie die Augäpfel zur besseren Orientierung, indem Sie zum Beispiel eine kleine Naht an den Sehnenstumpf des lateralen Rektusmuskels des Augapfels binden, um die Schläfenseite des Augapfels zu markieren.
  2. Fixierung von Geweben
    1. Legen Sie den enukleierten Augapfel in 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen und lassen Sie ihn 24 Stunden lang in einer 4%igen Lösung von Paraformaldehyd (PFA) ruhen, die in Phosphatpuffer-Kochsalzlösung (PBS) gelöst ist.
    2. Behandeln Sie anschließend den Augapfel 24 Stunden lang in einer 10%igen Saccharoselösung, entfernen Sie ihn und legen Sie ihn 24 Stunden lang in eine 20%ige Saccharoselösung, und schließlich entfernen Sie ihn und legen Sie ihn für 24 Stunden in eine 30%ige Saccharoselösung.
      HINWEIS: Halten Sie den Augapfel während des gesamten Vorgangs auf einer niedrigen Temperatur von 4 °C. Nadeleinstiche zur Saccharoseinfiltration sollten vermieden werden, um das Risiko einer Augapfelschädigung zu minimieren.
  3. Einfrieren und Lagern von Gewebe
    1. Nehmen Sie den Augapfel aus der Saccharoselösung und trocknen Sie ihn, indem Sie ihn leicht mit einem Papiertuch abtupfen.
    2. Legen Sie den Augapfel in ein sauberes 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen und frieren Sie es für die zukünftige Verarbeitung bei -80 °C ein.
      HINWEIS: Bei einer Lagerung bei -80 °C kann ein Augapfel bis zu 12 Monate bis zur zukünftigen Verarbeitung lebensfähig bleiben.
  4. Vorbereitung der Objektträger
    1. Tauen Sie den Augapfel bei Raumtemperatur auf. Schieben Sie es aus dem Mikrozentrifugenröhrchen in eine Kassette und spülen Sie es 20 Minuten lang unter fließendem Wasser ab, um die Saccharose auszuwaschen.
    2. Dehydrieren Sie den Augapfel, indem Sie ihn in die folgenden Lösungen unter einem Abzug legen und dann aus den folgenden Lösungen entfernen: 70%ige Lösung von Ethylalkohol (EtOH) für 10 min, 80%ige Lösung von EtOH für 10 min, 96%ige Lösung von EtOH für 10 min, 99,9%ige Lösung von EtOH für 10 min und Aceton für 5 min.
    3. Reinigen Sie den Augapfel, indem Sie ihn 5 Minuten lang unter einem Abzug in Xylol legen.
    4. Schmelzen Sie das Paraffin, indem Sie etwas festes Paraffin in ein Becherglas geben und es in einen Laborinkubator geben, der auf eine Temperatur eingestellt ist, die höher ist als die vom Paraffinhersteller angegebene Schmelztemperatur (die Schmelztemperatur von Paraffin liegt zwischen 46 °C und 68 °C). Nachdem das Paraffin vollständig geschmolzen ist (die Zeit hängt von der Menge des verwendeten Paraffins ab), den Augapfel in das Becherglas mit dem Paraffin schieben und 1 h im Inkubator warm halten. Während 1 h Paraffininfiltration in das Gewebe das Paraffin alle 10 - 15 min umrühren.
      HINWEIS: Für diesen Schritt kann ein Gewebeprozessor verwendet werden, der die Paraffininfiltration beim Rühren der Lösung ermöglicht.
    5. Betten Sie den Augapfel in einen Paraffinblock ein, wie unten beschrieben.
      1. Öffnen Sie die Kassette und entfernen Sie die obere Abdeckung. Wähle eine Metallform und gieße eine kleine Menge Paraffin ein, um den Boden der Form zu bedecken. Entfernen Sie den Augapfel mit einer Pinzette aus der Kassette und legen Sie ihn auf das Paraffin in der Form. Lege den Augapfel auf die Seite, um einen Schnitt in der Sagittalebene zu gewährleisten.
        HINWEIS: Wenn Sie den Augapfel auf die Seite legen (mit dem vorderen Pol auf der einen Seite und dem hinteren Pol auf der anderen), können Sie in der Sagittalebene schneiden. Auf diese Weise werden Schnitte durch die Hornhaut, die Iris, den Ziliarkörper, die Pupille, die periphere und die zentrale Netzhaut erhalten.
      2. Kühlen Sie die Form auf einer auf -15 °C eingestellten Kühlplatte kurz ab, damit sich das Paraffin leicht verfestigt und das Gewebe an Ort und Stelle verankert. Decken Sie das Taschentuch vorsichtig mit Paraffin ab und den Kassettenboden zu einem Block. Legen Sie den Block auf eine Kühlplatte, damit er vollständig erstarrt. Nehmen Sie dann den Block aus der Metallform und legen Sie die Paraffinblöcke vor dem Schneiden für mindestens 15 Minuten zum Abkühlen auf die Kühlplatte.
    6. Befestigen Sie einen Paraffinblock im Mikrotom. Stellen Sie das Mikrotom so ein, dass es das überschüssige Paraffin vom Block abschneidet (wir stellen es so ein, dass es 15 μm schneidet) und trimmen Sie es bis zur Mitte des Augapfels. Ändern Sie die Mikrotomeinstellungen, um dünnere Abschnitte zu schneiden (wir haben es auf 3,5 μm eingestellt) und platzieren Sie den Schnitt auf einem Objektträger. Wenn Sie ein Mikrotom mit einem angrenzenden Wasserbad verwenden, entfernen Sie das überschüssige Wasser mit einem feuchten Tuch vom Objektträger.
      HINWEIS: Das Ziel ist es, mindestens 3 Querschnitte durch die Pupille zu erhalten. Je weniger erfahren der Forscher ist, desto mehr Schnitte sollten erhalten werden, um eine Schnittbildung auf dem Niveau des Schülers zu gewährleisten. Platzieren Sie ein paar Abschnitte auf einer Folie. Auch für weniger erfahrene Forscher schneiden Sie das Gewebe dicker, z. B. in 4 μm oder 5 μm dicke Abschnitte. Die Verwendung eines Mikrotoms mit einem angrenzenden Wasserbad erleichtert die Übertragung von Gewebeschnitten auf Objektträger im Vergleich zur Verwendung von Mikrotomen ohne Wasserbäder erheblich. Ein weiterer erwähnenswerter Punkt ist, dass die Linse möglicherweise schwer zu durchschneiden ist. Um das Risiko einer Gewebebeschädigung durch die spröde Linse zu minimieren, verwenden Sie nur scharfe Mikrotomklingen, die zum Durchtrennen von hartem Gewebe bestimmt sind. Erwägen Sie, eine Klinge zum Trimmen und eine andere zum Schneiden von Abschnitten zu verwenden, um die Abstumpfung der Klinge zu minimieren.
    7. Legen Sie den Objektträger für 30 min in einen Laborinkubator, der auf 56 °C eingestellt ist.
    8. Nehmen Sie den Objektträger aus dem Inkubator und beginnen Sie mit der manuellen Färbung mit Hämatoxylin und Eosin (H&E), indem Sie den Objektträger nacheinander in die folgenden Lösungen legen und daraus entfernen. Beginnen Sie mit 7 min Xylol, 5 min Xylol (ein weiteres Becherglas mit einer sauberen Lösung) und 5 min Xylol (ein weiteres Becherglas mit einer sauberen Lösung). Anschließend 2 min 96 % EtOH, 1 min 96 % EtOH (ein weiteres Becherglas mit einer sauberen Lösung), 1 min 96 % EtOH (ein weiteres Becherglas mit einer sauberen Lösung) auftragen.
    9. Waschen Sie in 5 min fließendem Wasser, dann 2 min Mayer's Hämatoxylin, 2 min Mayer's Hämatoxylin (ein anderes Becherglas mit einer sauberen Lösung), 5 min fließendes Wasser, 5 min fließendes Wasser (ein weiteres, sauberes Becherglas).
    10. 1 % Eosin für 2 min zugeben, gefolgt von 1 min 96 % EtOH, 30 s 96 % EtOH (ein weiteres Becherglas mit einer sauberen Lösung), 30 s 96 % EtOH (ein weiteres Becherglas mit einer sauberen Lösung), 2 min Xylol, 1 min Xylol (ein weiteres Becherglas mit einer sauberen Lösung), 2 min Xylol (ein weiteres Becherglas mit einer sauberen Lösung).
      HINWEIS: Alternativ können Sie einen automatischen Objektträgerfärbeer verwenden.
    11. Versiegeln Sie den Objektträger mit einem automatischen Objektträgerversiegelungsgerät. Der vorbereitete Objektträger ist bereit für die Lagerung und Beurteilung unter einem Lichtmikroskop.
      HINWEIS: Alternativ können Sie die Gleitversiegelung manuell durchführen, indem Sie eine dünne Schicht Polystyrol-Eindeckmittel auf das befleckte Tuch auftragen und es mit einem Glasdeckglas abdecken.
      VORSICHT: Schritte, die PFA, EtOH, Aceton und Xylol enthalten, sollten unter einem Laborabzug durchgeführt werden.

2. Vorbereitung des Rattenaugenschnitts und der Schlittenmontage

HINWEIS: Dieses Protokoll stellt die Methode zur Präparation von Schnitten von Augäpfeln von Ratten dar und wurde unter Verwendung von Augäpfeln entwickelt, die entnommen wurden von: männlichen SHR-Ratten im Alter von 6 Wochen (Durchschnittsgewicht 115,5 g), männlichen SHR-Ratten im Alter von 12 Wochen mit arterieller Hypertonie (Durchschnittsgewicht 262,5 g), männlichen WKY-Ratten im Alter von 6 Wochen (Durchschnittsgewicht 143,5 g), männlichen WKY-Ratten im Alter von 12 Wochen (Durchschnittsgewicht 265 g), männliche Lewis-Ratten im Alter von 12 Wochen (Durchschnittsgewicht 310 g) und männliche Lewis-Ratten im Alter von 16 Wochen mit induziertem Diabetes mellitus (Durchschnittsgewicht 259 g).

  1. Enukleation
    1. Verwende eine kleine Pinzette, um die Augenlider zu öffnen. Drücken Sie auf die Augenlider, um den Augapfel vorzufallen.
    2. Präpariere den Augapfel von der Augenhöhle, indem du das Gewebe hinter dem Augapfel mit einer kleinen, scharfen Schere abschneidest.
      HINWEIS: Markieren Sie die Augäpfel zur besseren Orientierung, indem Sie z. B. eine kleine Naht an den Stumpf der Sehne des lateralen Rektusmuskels des Augapfels binden, um die Schläfenseite des Augapfels zu markieren.
  2. Fixierung von Geweben
    1. Legen Sie den enukleierten Augapfel in ein 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen und lassen Sie ihn 24 Stunden lang in einer 4%igen Lösung von Paraformaldehyd (PFA) ruhen, die in Phosphatpuffer-Kochsalzlösung (PBS) gelöst ist.
    2. Behandeln Sie anschließend den Augapfel 24 Stunden lang in einer 10%igen Saccharoselösung, entfernen Sie ihn und legen Sie ihn 24 Stunden lang in eine 20%ige Saccharoselösung, und entfernen Sie ihn schließlich und legen Sie ihn für 24 Stunden in eine 30%ige Saccharoselösung.
      HINWEIS: Halten Sie den Augapfel während des gesamten Vorgangs auf einer niedrigen Temperatur von 4 °C. Nadeleinstiche zur Saccharoseinfiltration sollten vermieden werden, um das Risiko einer Augapfelschädigung zu minimieren.
  3. Einfrieren und Lagern von Gewebe
    1. Nehmen Sie den Augapfel aus der Saccharoselösung und trocknen Sie ihn, indem Sie ihn leicht mit einem Papiertuch abtupfen.
    2. Legen Sie den Augapfel in ein sauberes 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen und frieren Sie es für die zukünftige Verarbeitung bei -80 °C ein.
      HINWEIS: Bei einer Lagerung bei -80 °C kann der Augapfel bis zu 12 Monate lang lebensfähig bleiben, bis er in Zukunft verarbeitet werden kann.
  4. Vorbereitung der Objektträger
    1. Nehmen Sie den Augapfel aus dem Gefrierschrank und aus dem Mikrozentrifugenröhrchen. Schneiden Sie den Augapfel entlang der Sagittalebene mit einem scharfen Skalpell in zwei Hälften. Entfernen Sie das Objektiv und entsorgen Sie es.
      HINWEIS: Dieser Schritt ist am einfachsten an einem gefrorenen Augapfel durchzuführen, der frisch aus dem Gefrierschrank genommen wurde. Beim Schneiden des Augapfels kann die Linse das umliegende Gewebe beschädigen. Um das Risiko einer Beschädigung zu minimieren, verwenden Sie ein sehr scharfes Skalpell und bleiben Sie vorsichtig.
    2. Tauen Sie den Augapfel bei Raumtemperatur auf. Schieben Sie die beiden Hälften in eine Kassette und spülen Sie sie 20 Minuten lang unter fließendem Wasser ab, um die Saccharose auszuwaschen.
    3. Dehydrieren Sie den Augapfel, indem Sie ihn in die folgenden Lösungen unter einem Abzug legen und dann daraus entfernen: 70% ige Lösung von Ethylalkohol (EtOH) für 15 min, 80% ige Lösung von EtOH für 15 min, 96% ige Lösung von EtOH für 15 min, 99,9% ige Lösung von EtOH für 15 min und Aceton für 7 min.
    4. Reinigen Sie den Augapfel, indem Sie ihn 7 Minuten lang unter einem Abzug in Xylol legen.
    5. Schmelzen Sie das Paraffin, indem Sie etwas festes Paraffin in ein Becherglas geben und es in einen Laborinkubator geben, der auf eine Temperatur eingestellt ist, die höher ist als die vom Paraffinhersteller angegebene Schmelztemperatur (die Schmelztemperatur von Paraffin liegt zwischen 46 °C und 68 °C). Nachdem das Paraffin vollständig geschmolzen ist (die Zeit hängt von der Menge des verwendeten Paraffins ab), den Augapfel in das Becherglas mit dem Paraffin schieben und 1 h im Inkubator warm halten. Während 1 h Paraffininfiltration in das Gewebe das Paraffin alle 10 - 15 min umrühren.
      HINWEIS: Für diesen Schritt kann ein Gewebeprozessor verwendet werden, der die Paraffininfiltration beim Rühren der Lösung ermöglicht.
    6. Betten Sie den Augapfel in einen Paraffinblock ein, wie unten beschrieben.
      1. Öffnen Sie die Kassette und entfernen Sie die obere Abdeckung. Wähle eine Metallform und gieße eine kleine Menge Paraffin ein, um den Boden der Form zu bedecken. Entfernen Sie den Augapfel mit einer Pinzette aus der Kassette und legen Sie ihn auf das Paraffin in der Form. Platzieren Sie eine Augapfelhälfte mit dem Boden des Bechers nach oben und die andere nach unten.
        HINWEIS: Wenn Sie die Augapfelhälften mit der einen Hälfte nach oben und der anderen nach unten platzieren, können Sie das Gewebeschneiden in der Sagittalebene durchführen. Auf diese Weise werden Schnitte durch die Hornhaut, die Iris, den Ziliarkörper, die Pupille, die periphere und die zentrale Netzhaut erhalten.
      2. Kühlen Sie die Form auf einer auf -15 °C eingestellten Kühlplatte kurz ab, damit sich das Paraffin leicht verfestigt und der Augapfel an Ort und Stelle verankert ist. Bedecke den Augapfel vorsichtig mit Paraffin und den Kassettenboden, sodass ein Block entsteht. Legen Sie den Block auf eine Kühlplatte, damit er vollständig erstarrt. Nehmen Sie dann den Block aus der Metallform und legen Sie die Paraffinblöcke vor dem Schneiden für mindestens 15 Minuten zum Abkühlen auf die Kühlplatte.
    7. Befestigen Sie einen Paraffinblock im Mikrotom. Stellen Sie das Mikrotom so ein, dass es das überschüssige Paraffin vom Block abschneidet (wir stellen es so ein, dass es 15 μm schneidet) und trimmen Sie, bis Sie die Mitte des Augapfels erreichen. Ändern Sie die Mikrotomeinstellungen, um dünnere Abschnitte zu schneiden (wir haben es auf 3,5 μm eingestellt) und platzieren Sie den Schnitt auf einem Objektträger. Wenn Sie ein Mikrotom mit einem angrenzenden Wasserbad verwenden, entfernen Sie das überschüssige Wasser mit einem feuchten Tuch vom Objektträger.
      HINWEIS: Das Ziel ist es, mindestens 3 Querschnitte durch die Pupille zu erhalten. Je weniger erfahren der Forscher ist, desto mehr Schnitte sollten erhalten werden, um eine Schnittbildung auf dem Niveau des Schülers zu gewährleisten. Platzieren Sie ein paar Abschnitte auf einer Folie. Auch für weniger erfahrene Forscher schneiden Sie das Gewebe dicker, z. B. in 4 μm oder 5 μm dicke Abschnitte. Die Verwendung eines Mikrotoms mit einem angrenzenden Wasserbad erleichtert die Übertragung von Gewebeschnitten auf Objektträger im Vergleich zur Verwendung von Mikrotomen ohne Wasserbäder erheblich.
    8. Entfernen Sie den Objektträger und beginnen Sie mit der manuellen Färbung mit Hämatoxylin und Eosin (H&E), indem Sie den Objektträger nacheinander in die folgenden Lösungen legen und daraus entfernen. Beginnen Sie mit 7 min Xylol, 5 min Xylol (ein weiteres Becherglas mit einer sauberen Lösung) und 5 min Xylol (ein weiteres Becherglas mit einer sauberen Lösung). Anschließend 2 min 96 % EtOH, 1 min 96 % EtOH (ein weiteres Becherglas mit einer sauberen Lösung), 1 min 96 % EtOH (ein weiteres Becherglas mit einer sauberen Lösung) auftragen.
    9. Waschen Sie in 5 min fließendem Wasser, dann 2 min Mayer's Hämatoxylin, 2 min Mayer's Hämatoxylin (ein anderes Becherglas mit einer sauberen Lösung), 5 min fließendes Wasser, 5 min fließendes Wasser (ein weiteres, sauberes Becherglas).
    10. 1 % Eosin für 2 min zugeben, gefolgt von 1 min 96 % EtOH, 30 s 96 % EtOH (ein weiteres Becherglas mit einer sauberen Lösung), 30 s 96 % EtOH (ein weiteres Becherglas mit einer sauberen Lösung), 2 min Xylol, 1 min Xylol (ein weiteres Becherglas mit einer sauberen Lösung), 2 min Xylol (ein weiteres Becherglas mit einer sauberen Lösung).
      HINWEIS: Alternativ können Sie einen automatischen Objektträgerfärbeer verwenden.
    11. Versiegeln Sie den Objektträger mit einem automatischen Objektträgerversiegelungsgerät. Die vorbereiteten Objektträger sind bereit für die Lagerung und Beurteilung unter einem Lichtmikroskop.
      HINWEIS: Alternativ können Sie die Gleitversiegelung manuell durchführen, indem Sie eine dünne Schicht Polystyrol-Eindeckmittel auf das befleckte Tuch auftragen und mit einem Glasdeckglas abdecken.
      VORSICHT: Schritte, die PFA, EtOH, Aceton und Xylol enthalten, sollten unter einem Laborabzug durchgeführt werden.

3. Beurteilung der Augapfelabschnitte

  1. Scannen von Objektträgern
    1. Legen Sie den Objektträger in einen histopathologischen Objektträgerscanner und scannen Sie die Schnitte im Scan-Modus: 40x. Speichern Sie die Bilder als hochauflösende digitale Dateien.
  2. Analyse von Objektträgern
    1. Öffnen Sie die gescannte Datei mit Hilfe einer Bildbetrachtungssoftware. Finden Sie Pupillenquerschnitte und analysieren Sie drei aufeinanderfolgende Schnitte.
    2. Suchen Sie die dickste Stelle der Netzhaut und vergrößern Sie das Bild auf das 20-fache, indem Sie auf das Vergrößerungsfeld in der oberen rechten Ecke drücken und das 20-fache auswählen. Bewegen Sie die Maus auf die ELM-Ebene an der dicksten Stelle der Netzhaut, drücken Sie die rechte Maustaste und wählen Sie "Kommentieren" und "Lineal".
    3. Bewegen Sie die Maus in Richtung ILM, und klicken Sie auf die linke Schaltfläche. Benennen Sie die Messung RT und aktivieren Sie die Kontrollkästchen Titel anzeigen und Länge anzeigen. Auf diese Weise wird die Netzhautdicke (RT) gemessen und die Messung in μm angezeigt. Repräsentative Ergebnisse sind in Abbildung 2 und Abbildung 3 dargestellt.
    4. Verwenden Sie das Lineal, messen Sie die Dicke jeder Netzhautschicht, einschließlich ONL, OPL, INL und IPL, und beschriften Sie sie. Repräsentative Ergebnisse sind in Abbildung 4 und Abbildung 5 dargestellt.
    5. Um die Anzahl der Zellen innerhalb der GCL zu zählen, legen Sie eine vorgegebene Länge der Netzhaut fest. Verwenden Sie beispielsweise für die Netzhaut der Maus einen 500-μm-Schnitt und für die Netzhaut der Ratte fünf 100-μm-Abschnitte.
    6. Messen Sie mit dem Lineal den gewählten Abstand entlang der GCL. Drücken Sie die rechte Maustaste und wählen Sie Annotate > Saved > 1x RBC aus. Klicken Sie auf jede Zelle, die als runde, hämatoxylingefärbter Körper entlang der GCL über die vorgegebene Länge der Netzhaut identifiziert wurde. Zählen Sie die Anzahl der eingekreisten Zellen. Repräsentative Ergebnisse sind in Abbildung 6 und Abbildung 7 dargestellt.
    7. Nachdem Sie drei aufeinanderfolgende Abschnitte analysiert haben, ziehen Sie den Durchschnitt für alle Messungen.

Ergebnisse

Mit Hilfe des vorgestellten Protokolls kann die Anatomie und Morphologie spezifischer Strukturen des Augapfels detailliert beurteilt werden. Unser Team konzentriert sich auf die Erforschung der Pathomechanismen der Neurodegeneration bei Netzhauterkrankungen wie dem Glaukom, der diabetischen Retinopathie und der hypertensiven Retinopathie. Um die Merkmale der Neurodegeneration in der Netzhaut zu beurteilen, untersuchten wir die RT (Maus-Augapfel -Abbildung 2, Ratten-Augapfel -Abbildung 3), ONL, OPL, INL und IPL (Maus-Augapfel -Abbildung 4, Ratten-Augapfel -Abbildung 5) und die Anzahl der Zellen der GCL (Maus-Augapfel -Abbildung 6, Ratten-Augapfel -Abbildung 7). Es wird erwartet, dass die RT und die Zellen der GCL in der zentralen Netzhaut am höchsten und in der Peripherie am niedrigsten sind. Durch den Schnitt des Augapfels auf Höhe der Pupille werden Querschnitte durch die zentrale (am hinteren Pol des Augapfels) und die periphere (nahe dem Ziliarkörper) Netzhaut auf einem Objektträger erzielt.

Während die Zählung von GCL-Zellen als recht objektiv angesehen werden kann, kann eine Verzerrung, die durch schiefe Schnitte verursacht wird, die Ergebnisse der Messung der spezifischen Netzhautschichten beeinflussen. Um Verzerrungen zu vermeiden, können die Messungen als Verhältnis der Dicke einer bestimmten Schicht zum RT-Wert dargestellt werden: ONL/RT, OPL/RT, INL/RT und IPL/RT.

Anatomiediagramm des Auges mit beschrifteten Teilen: Netzhaut, Sklera, Linse, Hornhaut, Sehnerv, Makula.
Abbildung 1: Anatomie des Augapfels. Sagittaler Querschnitt eines Augapfels mit der Beschriftung seiner größten Strukturen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Mikroskopische Aufnahme eines Netzhautquerschnitts mit Gewebeschichten, Dickenmessung 125 μm.
Abbildung 2: Dicke der Netzhaut bei einer Maus. Messung der Netzhautdicke (RT) von der äußeren Grenzmembran bis zur inneren Grenzmembran an der breitesten Stelle, markiert mit dem grünen Balken. Maus-Augapfel (Stamm: C57Bl/6, Alter: 44 Wochen). Der Maßstabsbalken in der linken Ecke zeigt die Länge von 100 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Histologischer Schnitt mit Netzhautschichten, 53,4 μm dick; Mikroskopiebild, Gewebestudie.
Abbildung 3: Netzhautdicke bei einer Ratte. Messung der Netzhautdicke (RT) von der äußeren Grenzmembran bis zur inneren Grenzmembran an der breitesten Stelle, markiert mit dem grünen Balken. Rattenaugapfel (Stamm: Lewis, Alter: 16 Wochen). Der Maßstabsbalken in der linken Ecke zeigt die Länge von 100 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Querschnittsdiagramm des Netzhautgewebes; Gemessene Schichten: IPL, INL, OPL, ONL; Mikroskopische Analyse.
Abbildung 4: Netzhautschichten in einer Maus. Messung der Dicke der einzelnen Netzhautschichten: äußere Kernschicht (ONL), äußere plexiforme Schicht (OPL), innere Kernschicht (INL) und innere plexiforme Schicht (IPL), markiert mit grünen Balken. Maus-Augapfel (Stamm: C57Bl/6, Alter: 44 Wochen). Der Maßstabsbalken in der linken Ecke zeigt die Länge von 100 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Mikroskopische Aufnahme des Netzhautquerschnitts mit markierten Schichten: OPL, ONL, IPL, INL; Maßstabsleiste 100 μm.
Abbildung 5: Netzhautschichten bei einer Ratte. Messung der Dicke der einzelnen Netzhautschichten: äußere Kernschicht (ONL), äußere plexiforme Schicht (OPL), innere Kernschicht (INL) und innere plexiforme Schicht (IPL), markiert mit grünen Balken. Rattenaugapfel (Stamm: Lewis, Alter: 16 Wochen). Der Maßstabsbalken in der linken Ecke zeigt die Länge von 100 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Histologie-Sektion mit Schichtzellstruktur, Mikroskopbild, Gewebeanalyse, 500 μm Skala.
Abbildung 6: Zählen von Zellen der Ganglienzellschicht in einer Maus. Die Methode zur Zählung der Zellen der Ganglienzellschicht (GCL) entlang der Netzhaut auf einer Länge von 500 μm. Einzelzellkörper wurden als runde, hämatoxylingefärbte Körper identifiziert, die sich innerhalb der Ganglienzellschicht befinden. Die Zellen sind mit schwarzen Kreisen markiert. Maus-Augapfel (Stamm: DBA/2, Alter: 44 Wochen). Der Maßstabsbalken in der linken Ecke zeigt die Länge von 100 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Histologie-Objektträger, Netzhautquerschnitt; sichtbare Gewebeschichten; Mikroskopische Untersuchung, 100 μm Maßstab.
Abbildung 7: Zählen von Zellen der Ganglienzellschicht bei einer Ratte. Die Methode zum Zählen der Zellen der Ganglienzellschicht (GCL) entlang der Netzhaut auf einer Länge von 100 μm. Einzelzellkörper wurden als runde, hämatoxylingefärbte Körper identifiziert, die sich innerhalb der Ganglienzellschicht befinden. Die Zellen sind mit schwarzen Kreisen markiert. Rattenaugapfel (Stamm: Lewis, Alter: 16 Wochen). Der Maßstabsbalken in der linken Ecke zeigt die Länge von 100 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Diskussion

Die histologische Untersuchung des Augapfels von Maus und Ratte ist ein mächtiges Werkzeug auf dem Gebiet der experimentellen Ophthalmologie. Sie kann neue Informationen über Veränderungen der Augenstrukturen im Verlauf von Augenerkrankungen liefern, die sonst im klinischen Umfeld nicht beobachtet würden. Die beschriebenen Protokolle stellen eine einfache Methode zur Durchführung einer histologischen Analyse der Netzhaut dar. Die Feinheiten des Verfahrens, das zur Bearbeitung von vorderem Gewebe, wie z. B. der Hornhaut, erforderlich ist, werden hier nicht beschrieben.

In der vorliegenden Studie wurde die Enukleation nach dem Einschläfern der Tiere durchgeführt, da neben den Augäpfeln auch andere Gewebe (Blut, Nieren) zu Forschungszwecken entnommen wurden. Die Enukleation kann jedoch auch an lebenden Tieren unter Narkose durchgeführt werden. Wilding et al. haben das Verfahren14 beschrieben, und wir möchten die Leser auf diese Arbeit verweisen, um Fotos des Enukleationsverfahrens zu sehen.

Obwohl die Protokolle für die Vorbereitung von Objektträgern mit Maus- und Ratten-Augäpfeln ähnlich sind, besteht der Hauptunterschied zwischen Maus- und Ratten-Augäpfeln, die bei der Vorbereitung von Objektträgern zu berücksichtigen sind, in ihrer Größe. Die Augäpfel der Ratte haben im Vergleich zu Mäusen ein 8x - 10x größeres Volumen, während die durchschnittliche axiale Länge eines Maus-Augapfels etwa 3,2 mm beträgt und die axiale Länge eines Ratten-Augapfels typischerweise um 6,91 mm oszilliert15,16. Dies erleichtert die Notwendigkeit, die Augäpfel der Ratten in zwei Hälften zu schneiden, um das Eindringen der Reagenzien in das Gewebe während der Verarbeitung zu verbessern. Außerdem ist die Zeit, die für das Eindringen des Reagenzes in das Rattengewebe benötigt wird, länger als bei Mausaugäpfeln. Beim Schneiden der Augäpfel der Ratte ist es wichtig, eine scharfe Klinge zu verwenden, da sich die feste, eingefrorene Linse als Hindernis erweisen kann.

Ein weiterer diskussionswürdiger Punkt ist die Fixierung von Geweben nach der Entnahme von den Tieren. In dem vorgestellten Protokoll wurden Augäpfel nach der Enukleation mit PFA fixiert und in Saccharoselösungen getaucht. Saccharose wirkt als Kryoprotektivum, da sie die Zellen großer Gewebe vor Schäden durch Eiskristalle schützt, die sich beim Einfrieren bilden17. Das Einfrieren des Gewebes ermöglicht es den Forschern, das Gewebe länger zu lagern und es in Zukunft auch für verschiedene Untersuchungen zu verwenden, darunter eine histopathologische Analyse mit einem Mikrotom (wie vorgestellt), eine histopathologische Analyse mit einem Kryotom und Immunmarkierung zur Beurteilung mittels konfokaler Mikroskopie. Wenn beispielsweise ein Augapfel einer Ratte in zwei Hälften geschnitten wird (Schritt 2.4.1), wenn der Schnitt effizient und schnell (innerhalb von 5 - 10 s) durchgeführt wird und das Auge keine Zeit zum Auftauen hat, kann eine Hälfte des Augapfels für die Histopathologie verwendet werden, und eine andere kann für die zukünftige Immunmarkierung wieder in den Gefrierschrank gelegt werden. Wir empfehlen, keine Immunmarkierung an Geweben durchzuführen, die zuvor mit Paraffin infiltriert wurden, da sich die Konformation der Proteinepitopen nach der Paraffinfixierung möglicherweise verändern könnte. Wenn eine Gruppe von Forschern jedoch nur plant, eine histopathologische Analyse mit einem Mikrotom durchzuführen, kann eine einfachere Standardmethode zur Fixierung von Geweben für die Paraffineinbettung verwendet werden - zum Beispiel anstatt die Schritte 1.2.1 - 1.4.1 für Mäuse oder die Schritte 2.2.1 - 2.4.2 für Ratten durchzuführen, legen Sie das Gewebe für 24 h in eine 10%ige PFA-Lösung, und lagern Sie sie dann bis zur Verarbeitung in PBS bei 4 °C. Saccharose wird dann nicht als Kryoprotektivum benötigt, da das Gewebe nicht eingefroren wird. Mit dieser vorgeschlagenen Methode wird der Gefrierprozess vermieden, was sich als vorteilhaft erweisen und dazu führen kann, dass Objektträger von höherer Qualität erhalten werden. Das Einfrieren der Augäpfel gibt den Forschern zwar mehr Freiheit bei der Wahl des Zeitpunkts für die histopathologische Untersuchung, ist aber ein Schritt, der möglicherweise die Probenqualität beeinträchtigen und zu einer Netzhautablösung führen kann. Man sollte jedoch bedenken, dass bei der Lagerung von Geweben bei 4 °C deren biologische Stabilität kürzer ist und das Gewebe innerhalb von 4 Wochen analysiert werden sollte. Auch bei der Arbeit mit Ratten-Augäpfeln wird Schritt 2.4.1 (die Augäpfel in zwei Hälften schneiden) bei einem nicht gefrorenen Augapfel viel schwieriger durchzuführen sein.

Die vorgestellte Methodik wurde auf der Grundlage der von Chai et al.18, Igarashi et al.19, Zhang et al.20 und Dorfman et al.21 beschriebenen Methodik auf der Grundlage persönlicher Erfahrungen und einer Methode von Versuch und Irrtum entwickelt. Die Methode zur Messung der Dicke der Netzhaut und der einzelnen Schichten wird auf der Grundlage der von Chai et al.16 und Barber et al.18,22 vorgestellten Methodik beschrieben. Die retinale RGC-Zählmethode wurde aus einer Überprüfung der Arbeiten von Chai et al.16, Zhang et al.18, Steinle et al.19 und Dorfman et al.18,20,21,23 entwickelt. Insgesamt unterscheidet sich die Präparation histopathologischer Objektträger von Augäpfeln von einer standardmäßigen formalinfixierten, in Paraffin eingebetteten Gewebepräparation, da der Augapfel kugelförmig ist und daher schwieriger zu handhaben, zu schneiden und zu schneiden ist. Außerdem ist die Sklera eine Barriere für die Infiltration von Reagenzien in das Gewebe. Bei der Vorbereitung histologischer Objektträger von Augäpfeln muss man vorsichtiger und präziser arbeiten, wobei man darauf achten muss, die empfindlichen Strukturen des inneren Teils des Augapfels nicht zu beschädigen. Modifikationen dieses Protokolls können die Verwendung der Methacrylat-Einbettungstechnik anstelle der Paraffineinbettung umfassen, die Berichten zufolge bessere morphologische Ergebnisse liefern kann. Allerdings haben nur sehr wenige Forscher diese Methode zur Beurteilung der Netzhaut verwendet24,25.

Dieses Protokoll ist nicht frei von Voreingenommenheit. Das größte Problem, mit dem unser Team zu kämpfen hatte, waren Netzhautrisse und Netzhautablösungen. Besonders anfällig für Risse war die Netzhaut von Rattenaugäpfeln, da diese vor der Diavorbereitung in zwei Hälften geschnitten werden mussten und die Netzhaut daher anfälliger für Beschädigungen war. Aufgrund der Netzhautablösung kann dieses Protokoll nicht für die Beurteilung der Aderhaut, des retinalen Pigmentepithels oder der Photorezeptorsegmentschicht verwendet werden. Unser Team ist jedoch der Meinung, dass dieses Protokoll zur Beurteilung der inneren Netzhaut (von ILM bis ELM) verwendet werden kann. Um das Ausmaß der Netzhautrisse und -ablösungen zu minimieren, sollte jeder Schritt des Protokolls sorgfältig, langsam und mit präzisen Bewegungen durchgeführt werden.

Die histopathologische Analyse der Netzhaut gehört nicht zur Standarddiagnostik am Menschen, ist aber eine weit verbreitete Methode in der präklinischen Forschung. Die Ergebnisse der histopathologischen Bewertung der Netzhaut in präklinischen Studien können mit den Ergebnissen der optischen kohärenten Tomographie (OCT)26 in Verbindung gebracht und diskutiert werden, d. h. einer Untersuchung, die einen Querschnitt durch die Netzhaut während einer In-vivo-Untersuchung zeigt, die in einem klinischen Umfeld am Menschen in klinischen Studien durchgeführt werden kann. Die OCT ist jedoch eine weniger detaillierte Untersuchung. Daher sind die Informationen, die wir aus histologischen Studien ziehen können, die im Rahmen der präklinischen Forschung durchgeführt wurden, unersetzlich und notwendig für die Entwicklung medizinischer Erkenntnisse.

Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass kein Interessenkonflikt besteht.

Danksagungen

Die Arbeit, einschließlich Ratten, wurde im Rahmen des Projekts TIME 2 MUW - Lehrexzellenz als Chance für die Entwicklung der Medizinischen Universität Warschau finanziert, die aus dem Europäischen Sozialfonds im Rahmen des Operationellen Programms Entwicklung der Wissensbildung für 2014-2020 kofinanziert wurde, die Nummer der Kofinanzierungsvereinbarung: POWR.03.05.00-00-Z040/18-00. Die Arbeit, einschließlich Mäusen, wurde im Rahmen eines Projekts durchgeführt, das in den Jahren 2020 bis 2022 durchgeführt wurde und durch einen Zuschuss für die Wissenschaft finanziert wurde, der von der Medizinischen Universität Warschau erhalten wurde.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Aceton Chempur 
Dumont Pinzette #5, 11cm, 0,05 x 0,01mm SpitzenWorld Precision Instruments14095kleine, mikrochirurgische Pinzette
EosinMar-Four4P.05.2001/LWässrige Lösung
Ethylalkohol 96 %Chempur CH.ET. AL.96%CZDA.
Ethylalkohol 99,9 %Chempur Ch. ETYL. ALK.99,9%BWZur Herstellung von 70%igen und 80%igen Lösungen von EtOH
Glacier - 86 ° C Ultratiefkühlschrank NU-9483ENuAire13027D0034Gefriertemperatur - 80 &Grad; C
Glas-ObjektträgerMar-Four MI.15.01673Mattglas-Objektträger mit beidseitig mattem Feld für Beschreibung
Leica CV5030 Vollautomatischer Glas-DeckschuhLeica Biosystems 14,04,78,80,101Automatisierte Gleitversiegelung 
Mayer-HämatoxylinChempur 
Formen auf Metallbasis 15 mm x 15 mmLeica Biosystems
Microme HM 340 EThermo Scientific90-519-0Mikrotom
Mikrotom RasierklingenMar-FourHI. N.35Schnittwinkel 35°;
Mikro-Twin-BiopsiekassetteMar-FourLN.13874550
Mikrowellen-HybridgewebeprozessorMilestone
Multistainer Leica ST5020Leica Biosystems Automatisierter Objektträgerfärbemaschinen 
NanoZoomer 2.0-HT DiascannerHamamatsuC9600Histopathologischer Diascanner
NDP.view2 BildbetrachtungssoftwareHamamatsuU12388-01Bildbetrachtungssoftware
Paraffin Pathowax PlusMar-Four4P. PWP.010Schmelztemperatur 56 ° C - 58 &Grad; C
ParaformaldehydSigma - Aldrich441244-1KGBereiten Sie eine 4%ige Lösung in PBS
PBS Tablettenvor Merck Millipore524650-1EAZur Herstellung einer Lösung von Phosphatpuffer-Kochsalzlösung gemäß den Anweisungen des Herstellers
Mikrozentrifugenröhrchen durchstechen, 1,5 mLThermo Scientific69715
Kühl-/Gefrierkombination EN14000AWElectrolux925032562-00Kühlung 4 &Grad; C
SkalpellklingeSwann-MortonT.OST. SKAL00.024
SaccharoseChempur 
SuperCut Federschere, 12,5 cm, gebogenWorld Precision Instruments501925gebogene, kleine mikrochirurgische Schere
Klebeband für automatische VersiegelungsgeräteMar-FourKP-3020/SMRH001
XylolChempur Ch. KSYL.5l.METALL.OP 
111024800CH1246874023803081 verwenden 427720906

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