Ein Abonnement von JoVE ist erforderlich, um diesen Inhalt anzuzeigen. Melden Sie sich an oder beginnen Sie noch heute mit einer kostenlosen Testphase.

Methodenartikel

Tränenabgeleitetes exosomales miR-15a als neues diagnostisches Werkzeug für diabetische Retinopathie

1.2K Aufrufe

⸱

DOI:

10.3791/66687

⸱

30. Dezember 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1UM Eye Research Centre (UMERC), Department of Ophthalmology, Faculty of Medicine, Universiti Malaya, 2Department of Ophthalmology, Universiti Malaya Medical Centre, 3Department of Anaesthesiology and Department of Pathology, Johns Hopkins School of Medicine

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieser Artikel beschreibt ein Protokoll zur Sammlung und Erkennung von miR-15a aus Tränen als neues diagnostisches Werkzeug für diabetische Retinopathie.

Zusammenfassung

Die diabetische Retinopathie (DR) ist eine große Komplikation von Diabetes mellitus und betrifft einen bedeutenden Prozentsatz der Diabetikerpopulation. Frühe Diagnose und Intervention sind entscheidend, um irreversiblen Sehverlust zu verhindern. Die aktuellen diagnostischen Methoden sind zwar wirksam, haben aber Einschränkungen. miRNA, eine kleine nicht-kodierende RNA, die die Stabilität und/oder Translation einer mRNA durch Bindung an die 3'-untranslierten Regionen (3'-UTRs) der Ziel-mRNAs hemmt, wird zunehmend als signifikant mit Diabetes assoziiert anerkannt und kann aus Rissen gewonnen werden. Diese Studie untersuchte das Potenzial von exosomalem miR-15a aus Tränenflüssigkeit als neuartigem diagnostischem Marker für DR. Tränenproben wurden von 135 diabetischen Patienten (36 mit diabetischer Retinopathie [DR] und 50 ohne DR) und 49 gesunden Kontrollpersonen entnommen. Exosomen wurden isoliert, und die Expressionswerte von exosomalem miR-15a wurden mittels tropfendigitaler PCR (ddPCR) gemessen. Die Ergebnisse zeigten, dass die exosomale miR-15a-Expression bei diabetischen und DR-Patienten im Vergleich zu gesunden Personen verändert wurde. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass exosomales miR-15a, das aus Tränenflüssigkeit gewonnen wird, eine Rolle in den molekularen Mechanismen spielen könnte, die Diabetes und dessen Komplikationen zugrunde liegen. Darüber hinaus bietet es Potenzial als nicht-invasiver und zuverlässiger diagnostischer Biomarker für diabetische Retinopathie und bietet eine hohe Sensitivität und Spezifität.

Einleitung

Die diabetische Retinopathie (DR) ist eine der prominentesten mikrovaskulären Komplikationen von Diabetes und bedroht das Sehvermögen von Millionen Menschen weltweit. Die globale Prävalenz von DR wurde laut Bevölkerungsdaten des IDP Atlas 2019 auf 22,7 % der gesamten Diabetikerpopulation weltweit geschätzt, wobei die Zahl der neuen Fälle stetig steigt, insbesondere inIndustrie- und Entwicklungsländern. Klinisch ist DR gekennzeichnet durch eine frühe Stadium der DR oder nicht-proliferativen diabetischen Retinopathie (NPDR), eine späte Stadium der DR oder proliferative diabetische Retinopathie (PDR) sowie das Vorhandensein von Makulödem. Eine erhöhte vaskuläre Permeabilität und Kapillarblockade sind zwei häufige pathologische Veränderungen bei NPDR, und eine abnormale Neovaskularisation der Iris, Makula, Sehnervenscheibe oder Netzhaut wird im Fall von PDR 2,3 beobachtet. Das Fortschreiten in die PDR, das potenziell zu einer Glaskörperblutung und Netzhautablösung führen kann, kann eine erhebliche Sehbeeinträchtigungverursachen 3. In allen Fällen können pathologische Veränderungen durch Funduskopie oder Fundusfotografie durch ausgebildete Augenärzte erkanntwerden. Mit der Standard-Fundusfotografie-Methode kann diabetische Retinopathie mit einer Sensitivität von 78–96 % und einer Spezifitätvon 86–97 % nachgewiesen werden. Diese Methode erkennt jedoch erst, wenn eine Schädigung der Netzhaut entstanden ist. Es besteht ein unerfüllter Bedarf an einer frühzeitigen Erkennung von DR vor dem Beginn klinisch sichtbarer Netzhautsymptome, wie blot-Netzhautblutungen, Mikroaneurysmen, Exsudaten und der Proliferation neuer Gefäße.

Die Weiterentwicklung molekularer Werkzeuge führte zur Entdeckung von Exosomen als potenzielles diagnostisches Werkzeug für verschiedene Krankheiten, darunter Krebs und Herz-Kreislauf-Erkrankungen 6,7. Exosomen sind nanogroße Teilchen, die durch eine Lipid-Doppelschichtmembran gebunden sind, die von den meisten Zellen in ihren extrazellulären Vesikelraum (EV) ausgeschieden wird. Diese Exosomen können durch Biofluide wie Blut, Tränen, Speichel und Urin transportiert werden, wodurch sie für nicht-invasive oder minimalinvasive Diagnoseverfahren leicht zugänglich sind8. Sie tragen verschiedene Ursprungszellmarker, darunter Proteine, Lipide und Nukleinsäuren. Besonders interessant sind kleine nicht-kodierende RNAs, die in EVs transportiert werden. Obwohl diese RNAs nicht für Proteine codiert sind, spielen sie eine entscheidende Rolle in der Genregulation und sind an vielen physiologischen und pathologischen Prozessen beteiligt, einschließlich der Pankreas-β-Zellen, die für die Entwicklung von Diabetes von großer Bedeutungsind.

Konkret wurde gezeigt, dass miR-15a eine starke Verbindung zur Entstehung von Diabetes hat, hauptsächlich durch die Regulation der Insulinproduktion und der Beta-Zellfunktionender Bauchspeicheldrüse. Unsere Gruppe hat kürzlich nachgewiesen, dass miR-15a im Plasma der diabetischen Retinopathie verändert ist. Außerdem wurde gezeigt, dass miR-15a von den Pankreas-Betazellen ausgeschieden wird und durch den Blutkreislauf zur Netzhaut12 gelangt. Tränenflüssigkeit gilt als leicht zugängliche Flüssigkeit, die leicht aus dem Auge auf eine nicht-invasive und kostengünstige Weise aufgenommen werden kann13. Es enthält eine Mischung verschiedener Proteine, Lipide, Elektrolyte und anderer Moleküle, die den physiologischen Zustand der Augenoberfläche und der umliegenden Gewebe, einschließlich der Netzhaut14, widerspiegelt. Eine höhere Anzahl von miRNAs wurde in Tränenflüssigkeit nachgewiesen als in Serum- und wässriger Humorlösung 15,16. Die Zusammensetzung der Tränen ändert sich als Reaktion auf verschiedene systemische Erkrankungen, einschließlich Diabetes17. Tatsächlich hat sich gezeigt, dass die Tränenflüssigkeitsanalyse ein vielversprechendes Potenzial für die Überwachung und Diagnose anderer nicht augenbezogener Erkrankungen wie Multiple Sklerose und Brustkrebshat 18,19. Mit dem direkten Zusammenhang der diabetischen Retinopathie mit dem Auge wäre es relevanter, nach potenziellen diagnostischen Eigenschaften von Tränenflüssigkeit bei dieser Erkrankung zu suchen. Die Spiegel von IL-1RA, IL-8, IL-6 und TNF-α in den Tränenflüssigkeiten von Patienten mit diabetischer Retinopathie haben Veränderungen beobachtet, die ebenfalls je nach Schwere der Erkrankung variieren. Im Vergleich zur traditionellen Funduskopieuntersuchung bietet die Tränenflüssigkeitsanalyse bei diabetischer Retinopathie potenzielle Vorteile hinsichtlich Zugänglichkeit, Nichtinvasivität und Spezifität und ermöglicht eine frühzeitige Erkennung vor Ausbruch der Krankheit22.

Das Hauptziel dieser Studie ist daher die Untersuchung des Potenzials des exosomalen miR-15a aus Tränenflüssigkeit als neuartigen diagnostischen Marker für diabetische Retinopathie durch miRNA-Isolierung und Quantifizierung aus Tränenflüssigkeiten der diabetischen Retinopathie-Population. Damit würde es eine neue Erkennungsmethode für diabetische Retinopathie durch Tränenflüssigkeitsscreening geben, die bereits vor Beginn der Netzhautkomplikationen nachweisbar ist und so frühzeitige präventive oder therapeutische Maßnahmen ermöglicht.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Protokoll

Die Studie wurde mit Zustimmung des Medical Research Ethics Committee der Universiti Malaya Medical Centre durchgeführt (Referenznummer: 20165-2446). Vor der Rekrutierung wurde von allen menschlichen Probanden eine schriftliche Zustimmung eingeholt. Insgesamt wurden 135 Probanden aus den Patienten aufgenommen, die die Augenklinik des Universiti Malaya Medical Centre (UMMC) in Kuala Lumpur besuchten. Die Einschlusskriterien umfassten Patienten, die im Rahmen der UMMC Leistungen erhielten und zwischen 20 und 80 Jahre alt waren. Patienten, die sich einer aktiven Insulinbehandlung unterzogen hatten, in den letzten 3 Monaten eine Vorgeschichte von Laser- oder Anti-VEGF-Behandlung hatten oder regelmäßig Blutplättchen- oder Blutverdünner eingenommen hatten, wurden aus der Studie ausgeschlossen. Die Probanden wurden dann in drei Gruppen eingeteilt: (1) gesunde Kontrolle (Kontrolle), (2) Diabetiker ohne Retinopathie (DM No DR) und (3) Diabetiker mit Retinopathie (DR). Eine Zusammenfassung des Protokolls ist in Abbildung 1 dargestellt. Details zu den in dieser Studie verwendeten Reagenzien und Geräten sind in der Materialtabelle aufgeführt.

figure-protocol-1
Abbildung 1: Ein Überblick über das Protokoll. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

1. Vorbereitung der Materialien    

  1. Legt ein steriles Grundverbandset mit zwei Pinzetten, sechs Wattebäuschen, vier Mullbindenpads, einem Tablett und einer Bio-Gefahren-Tüte bereit.
  2. Gieße 5 ml 0,9 % mit Natriumchlorid-Bewässerungslösung in ein Tablett.
  3. Öffnen Sie ein Päckchen Augenlidreinigungstücher und legen Sie es auf das sterile Feld.
  4. Bereiten Sie ein Rohr mit 250 μL Konservierungslösung vor.
  5. Falten Sie einen Schirmerstreifen auf Keilhöhe, während er noch in der Verpackung ist, bevor Sie den sterilen Streifen auf das sterile Feld legen.
  6. Tragen Sie aseptische chirurgische Handschuhe.
  7. Mit einer sterilen Pinzette befeuchten Sie die Wattebäuschel mit 0,9 % w/v steriler Natriumchlorid-Bewässerungslösung.

2. Vorbereitung menschlicher Probanden    

  1. Lassen Sie die Person bequem sitzen und bitten Sie, die Augen zu schließen.
  2. Wischen Sie die periorbitale Haut viermal mit in einer Spüllösung eingeweichten Wattebäuschchen ab.
  3. Wischen Sie die periorbitale Haut mit einem Augenlidreinigungstüch ab.

3. Sammlung menschlicher Tränenflüssigkeit

  1. Sammeln Sie Tränenflüssigkeiten mit dem Schirmers-Streifen, der am temporalen unteren Fornix aufgetragen wird.
  2. Wenn Sie den teilweise gefalteten Streifen auf das rechte Auge legen, bitten Sie die Person, nach links zu schauen. Zieh das untere Deckel herunter, um den unteren Fornix freizulegen.
  3. Mit einem Paar steriler Pinzetten wird ein Schirmerstreifen auf die äußeren zwei Drittel des unteren bindehautförnix gelegt. Vermeiden Sie es, dass der Streifen die Haut berührt, um eine Kontamination der Probe mit Schweiß oder anderen Materialien auf der Haut zu vermeiden.
  4. Lege ein Mullpad unter den Streifen, um Hautkontakt zu verhindern.
  5. Lassen Sie die Tränen bis zur 20-mm-Marke oder maximal 5 Minuten in den Streifen einziehen, je nachdem, was zuerst eintritt.
  6. Wenn die 20-mm-Grenze nicht erreicht wird, dokumentieren Sie den Rissgrad anhand der Markierungen, um eine Standardisierung des Tränflüssigkeitsvolumens zu ermöglichen.
  7. Mit einer sterilen Pinzette entfernen Sie vorsichtig den Schirmerstreifen und legen Sie ihn in ein Rohr mit 1x Phosphatpuffer-Kochsalzlösung (PBS).
  8. Lege das Rohr in eine Kühlbox für den Transport ins Labor.
  9. Reinigen Sie die periorbitale Oberfläche, indem Sie eventuelle Restlösungen auf der Haut entfernen.

4. Vorverarbeitung von Tränenproben    

  1. Vortex das Rohr mit dem Schirmer-Streifen wurde 5 Minuten lang bei Raumtemperatur in PBS eingeweicht.
  2. Rühre das Rohr 5 Minuten lang auf einer Wippe bei Zimmertemperatur.
  3. Zentrifugiere das Rohr bei 2000 x g für 15 Minuten bei 4 °C.
  4. Die Lösung in ein neues Rohr übergeben, beschriften und bis zur Nachbearbeitung bei -80 °C halten.
  5. Wirf den restlichen Streifen weg.

5. Exosomenisolierung

HINWEIS: Die RNA-Isolierung erfolgt mit einem kommerziell erhältlichen Kit nach dem Herstellerprotokoll (siehe Materialtabelle).

  1. Tauen Sie die Tränenlösung 10 Minuten auf Eis auf.
  2. Die Spin-Säule 15 Minuten bei Raumtemperatur ausgleichen, bevor sie verwendet wird.
  3. Entfernen Sie den unteren Auslass der Säule und legen Sie ihn auf die bereitgestellte Abfallaufbereitungsscheibe.
  4. Entferne die obere Dichtungsmatte und lasse den Speicherpuffer durch die Säule durch Gravitationskraft fließen.
  5. Fügen Sie 250 μL PBS hinzu und lassen Sie es durch die Säule fließen.
  6. Wiederhole Schritt 5.5.
  7. Trage eine 110-μL-Probe auf die Oberseite jeder Spalte an und lasse die Probe in die Spalte eindringen.
  8. Übertragen Sie die Säule auf eine bereitgestellte Probenentnahmeplatte.
  9. Fügen Sie 100 μL PBS hinzu und lassen Sie es durch die Säule in die Probenentnahmeplatte gelangen.
  10. Übertragen Sie die Säule auf die Abfallabfallplatte.
  11. Fügen Sie der Säule 4x 200 μL PBS hinzu und lassen Sie es in die Säule eindringen, um die freie Proteinfraktion von der ersten Ladung zu entfernen.
  12. Fügen Sie 110 μL Probe in die Säule hinzu. Erlauben Sie, die Spalte zu betreten.
  13. Legen Sie die Säule auf eine Probensammlungsplatte. Fügen Sie 100 μL PBS hinzu und lassen Sie es durch die Säule fließen.
  14. Zentrifugieren Sie die Probenentnahmeplatte kurz bei 100 x g für 30 Sekunden. Die isolierten Exosomen sind nun bereit für die RNA-Isolierung.

6. RNA-Isolierung

HINWEIS: Die RNA-Isolierung erfolgt mit einem kommerziell erhältlichen Kit nach dem Herstellerprotokoll (siehe Materialtabelle).

  1. 200 μL der isolierten Exosomen der RNA-Isolierung unterzogen.
  2. Fügen Sie 60 μL Lysepuffer zu den isolierten Exosomen hinzu. Vortex für 5 Sekunden.
  3. Inkubieren Sie bei Zimmertemperatur für 3 Minuten.
  4. Fügen Sie 20 μL Inhibitor-Präzipitationspuffer hinzu, Vortex für 20 Sekunden, und inkubieren Sie bei Raumtemperatur für 3 Minuten.
  5. Zentrifugiere bei 12.000 x g für 3 Minuten bei Raumtemperatur.
  6. Übertragen Sie das klare, farblose Überlagermittel in eine neue Tube.
  7. Gib 1 Volumen Isopropanol dazu.
  8. Vortex für 5 Sekunden und übertragen Sie die Lösung auf die im Kit enthaltene Mini-Spin-Säule.
  9. Zentrifugiere bei Raumtemperatur für 15 Sekunden bei 8000 x g. Verwerfen Sie den Durchfluss.
  10. Waschen Sie die Säule mit 700 μL RWT-Waschpuffer.
  11. Zentrifugiere 15 Sekunden lang bei 8000 x g. Verwerfen Sie den Durchfluss.
  12. Waschen Sie die Säule mit 500 μL RPE-Waschpuffer.
  13. Zentrifugiere 15 Sekunden lang bei 8000 x g. Verwerfen Sie den Durchfluss.
  14. Füge 500 μL 80%-Ethanol zur Proben-Mini-Spin-Säule hinzu.
  15. Zentrifugiere 2 Minuten bei 8000 x g. Entsorge den Durchfluss und das Sammelrohr.
  16. Setze die Mini-Spin-Säule in ein neues 2-mL-Sammelrohr.
  17. Zentrifugieren Sie die Säule und das Rohr bei 18.000 x g für 5 Minuten. Entsorge den Durchfluss und das Sammelrohr.
  18. Setzen Sie die Mini-Spin-Säule in ein neues 1,5-mL-Rohr und fügen Sie 15 μL RNase-freies Wasser in die Mitte der Spin-Säulenmembran hinzu.
  19. Inkubiere 3 Minuten bei Zimmertemperatur.
  20. Zentrifugiere bei 18.000 x g für 1 Minute, um die RNA zu elutieren. RNA ist bereit für die nachgelagerte Verarbeitung.
  21. Durchführung von Nanopartikel-Tracking-Analysen zur Qualitätskontrolle und zur Überprüfung des RNA-Ertrags.

7. cDNA-Synthese

  1. Führen Sie cDNA-Synthese mit kommerziell erhältlichen Bausätzen nach den Herstellerprotokollen durch (siehe Materialtabelle).
  2. Bereiten Sie die Hauptmischung gemäß Tabelle 1 in einer 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhre vor.
  3. Mischen Sie die Lösung, indem Sie auf und ab pipetten.
  4. Pipette 5,1 μL des Masters in 0,1 μL PCR-Röhren.
  5. Fügen Sie 9,9 μL Probe dem zugewiesenen Röhrchen hinzu, das den Mastermix enthält.
  6. Setze die PCR-Schläuche in einen Thermocycler und führe sie gemäß Tabelle 2 durch.
    HINWEIS: Die cDNA ist für eine weitere Analyse bereit.
KomponenteLautstärke/Reaktion
10x RT-Puffer1,5 μL
100M dNTP-Mix0,15 μL
RNAse-Inhibitor (200U/μL)0,19 μL
Multiscribe RT-Enzym (50U/μl)1 μl
20x RT Primer0,75 μL
RNAse Free Water1,51 μL
Beispiel9,9 μL
Gesamtvolumen15 μL

Tabelle 1: Herstellung der PCR-Mastermischung, die zur cDNA-Synthese aus der isolierten RNA verwendet wird.

SchrittTemperaturDauer
Umgekehrte Transkription16 °C30 Minuten
42 °C30 Minuten
Stopp85 °C5 Minuten
Halt4 °C

Tabelle 2: Thermozyklusbedingungen für die cDNA-Synthese.

8. Digitaler Tröpfchen-PCR

HINWEIS: Digitales Tropfen-PCR (ddPCR) wird mit kommerziell erhältlichen Bausätzen durchgeführt, die den Herstellerprotokollen folgen (siehe Materialtabelle).

  1. Bereiten Sie die Hauptmischung für ddPCR in einer 1,5-mL Mikrozentrifugenröhre gemäß Tabelle 3 vor.
  2. Pipette 19,8 μL Master in 0,1 μL PCR-Röhren. Fügen Sie 2,2 μL Proben hinzu und mischen Sie gut, indem Sie das Gemisch zehnmal auf und ab pipetten.
  3. Übertragen Sie 20 μL der Probenmischung in die Probenbahn der ddPCR-Kartusche.
  4. Gib 50 μL Öl in die Ölleitung der Patrone.
  5. Befestigen Sie eine Dichtung mit dem Haken an der Platte an der Kartusche.
  6. Setzen Sie die Kartusche in die Tröpfchengenerierungsmaschine. Ein Klickgeräusch zeigt das ordnungsgemäße Einführen der Patrone in die Tröpfchengenerierungsmaschine an.
  7. Übertragen Sie vorsichtig alle erzeugten Tröpfchen in Brunnen einer 96-Well-Platte. Füge mindestens einen Well of No Template Control Well als negative Kontrollquelle hinzu.
  8. Versiegeln Sie die Platte mit einer durchschlagbaren Folie in einer Plattenversiegelungsmaschine (siehe Materialtabelle).
  9. Setzen Sie die Platte in einen Thermocycler und führen Sie sie gemäß Tabelle 4 durch.
  10. Übertragen Sie die Platte in die Tröpfchenlesemaschine, um positive und negative Tröpfchen zu zählen.
  11. Quantifizieren Sie die Kopienzahl/mL mit dem Kopierzahl/20 μL-Wert, der durch den Durchlauf erzeugt wird.
KomponenteLautstärke/Reaktion
2x ddPCR Supermix für Sonden (kein dUTP)10 μL
20x Zündhütchen/ Sonde1 μL
Beispiel7 μL
RNAse Free Water2 μL
Gesamtvolumen20 μL

Tabelle 3: Zubereitung des PCR-Mastermixes, der für ddPCR verwendet wird.

SchrittTemperaturDauerRampeZyklus
Enzymaktivierung95 °C10 Minuten~2 °C/s pro Schritt1
Denaturierung94 °C30 S40
Glühen60 °C1 Min.40
Enzymdeaktivierung98 °C10 Minuten1
Halt4 °CN/AN/A

Tabelle 4: Thermozyklusbedingungen für das ddPCR.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Ergebnisse

Standardkurve
Eine Standardkurve wurde erstellt, um das genaue Volumen der von jedem Patienten gesammelten Risse zu bestimmen. Im Grunde wurden verschiedene Volumina von Konservierungsbereichen zwischen 3 μL und 25 μL Schirmerstreifen ausgesetzt. Und die Entfernung des Feuchtbereichs am Schirmer wurde beobachtet. Der Eingriff wurde für jeden Eingriff dreimal wiederholt, und der Durchschnittswert wurde berechnet. Eine Standardkurve des Volumens der gesammelten Risse im...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Diskussion

Funduskopieuntersuchungen, optische Kohärenztomographie und Fluorescein-Angiographie sind derzeit verfügbare Nachweistechniken für den Nachweis diabetischer Retinopathie. Die drei Techniken werden häufig zusammen eingesetzt, um eine umfassende Bewertung verschiedener Netzhaut- und Choroiderkrankungen zu ermöglichen. Die Funduskopie ist eine klinische Untersuchung, die routinemäßig während der Begutachtung der diabetischen Retinopathie durchgeführt wird. Diese Methode wird von ausgebildet...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden Interessen haben.

Danksagungen

Diese Forschung wurde vom Alcon Research Institute (IF011-2020) und dem FOM UMSC Care Postdoctoral Research Grant 2021 unterstützt.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
0,9 % mit NatriumchloridAin Medicare Sdn BhdGB16165967618
1x Phosphatpuffer-KochsalzlösungThermo Fisher Scientific10010-023
Angewandte Biosysteme  TaqMan MicroRNA Reverse-Transkriptions-KitAngewandte Biosysteme4366596
ddPCR Supermix für Sonden (kein dUTP)BioRad Laboratories1863024
ddPCR 96-Well-PlattenBioRad Laboratories12001925
DG8-PatronenBioRad Laboratories1864008
DG8-DichtungenBioRad Laboratories1863009
Tröpfchenerzeugungsöl für SondenBioRad Laboratories1863005
Exospin-96 Exosomen-IsolationssetZelllenksystemeEX07-96
miRNeasy Serum/Plasma Fortschrittliches KitQiagen  217204
PX1 PCR-PlattenversiegelungBioRad Laboratories1814000
QX100 Tropfen-Digital-PCR-SystemBioRad LaboratoriesQX100
QXDx Tropfengenerator BioRad Laboratories12001049
SchirmerstreifenOptitechSCH-100
T100 ThermocyclerBioRad Laboratories1861096
Taqman MicroRNA Assay MTOMED 20 (Assay ID: 000389)Angewandte Biosysteme4440887Zielsequenz: UAGCAGCACAUAAUGGUUUGUG

Referenzen

  1. Teo, Z. L., et al. Global prevalence of diabetic retinopathy and projection of burden through 2045: Systematic review and meta-analysis. Ophthalmology. 128 (11), 1580-1591 (2021).
  2. Sayin, N., Kara, N., Pekel, G. Ocular complications of diabetes mellitus. World J Diabetes. 6 (1), 92-108 (2015).
  3. Wang, W., Lo, A. C. Y. Diabetic retinopathy: Pathophysiology and treatments. Int J Mol Sci. 19 (6), 1816(2018).
  4. Yang, Z., Tan, T. E., Shao, Y., Wong, T. Y., Li, X. Classification of diabetic retinopathy: Past, present and future. Front Endocrinol (Lausanne). 13, 1079217(2022).
  5. Goh, J. K. H., et al. Retinal imaging techniques for diabetic retinopathy screening. J Diabetes Sci Technol. 10 (2), 282-294 (2016).
  6. Parizadeh, S. M., et al. Circulating exosomes as potential biomarkers in cardiovascular disease. Curr Pharm Des. 24 (37), 4436-4444 (2018).
  7. Nair, S., Tang, K. D., Kenny, L., Punyadeera, C. Salivary exosomes as potential biomarkers in cancer. Oral Oncol. 84, 31-40 (2018).
  8. Dellar, E. R., Hill, C., Melling, G. E., Carter, D. R. F., Baena-Lopez, L. A. Unpacking extracellular vesicles: RNA cargo loading and function. J Extracell Biol. 1 (5), e40(2022).
  9. Fluitt, M. B., Kumari, N., Nunlee-Bland, G., Nekhai, S., Gambhir, K. K. miRNA-15a, miRNA-15b, and miRNA-499 are reduced in erythrocytes of pre-diabetic African-American adults. Jacobs J Diabetes Endocrinol. 2 (1), 014(2016).
  10. Belgardt, B. F., et al. The microRNA-200 family regulates pancreatic beta cell survival in type 2 diabetes. Nat Med. 21 (6), 619-627 (2015).
  11. Sun, L. L., et al. MicroRNA-15a positively regulates insulin synthesis by inhibiting uncoupling protein-2 expression. Diabetes Res Clin Pract. 91 (1), 94-100 (2011).
  12. Kamalden, T. A., et al. Exosomal microRNA-15a transfer from the pancreas augments diabetic complications by inducing oxidative stress. Antioxid Redox Signal. 27 (13), 913-930 (2017).
  13. Posa, A., et al. Schirmer strip vs. capillary tube method: Non-invasive methods of obtaining proteins from tear fluid. Ann Anat. 195 (2), 137-142 (2013).
  14. Ohashi, Y., Dogru, M., Tsubota, K. Laboratory findings in tear fluid analysis. Clin Chim Acta. 369 (1), 17-28 (2006).
  15. Nakagawa, A., Nakajima, T., Azuma, M. Tear miRNA expression analysis reveals miR-203 as a potential regulator of corneal epithelial cells. BMC Ophthalmol. 21 (1), 377(2021).
  16. Chan, H. W., et al. A pilot study on microRNA profile in tear fluid to predict response to anti-VEGF treatments for diabetic macular edema. J Clin Med. 9 (9), 2920(2020).
  17. Barmada, A., Shippy, S. A. Tear analysis as the next routine body fluid test. Eye (Lond). 34 (10), 1731-1733 (2020).
  18. Tomečková, V., et al. Experimental analysis of tear fluid and its processing for the diagnosis of multiple sclerosis. Sensors (Basel). 23 (11), 5251(2023).
  19. Daily, A., et al. Development and validation of a short-term breast health measure as a supplement to screening mammography. Biomark Res. 10 (1), 76(2022).
  20. Quevedo-Martínez, J. U., et al. Pro-inflammatory cytokine profile is present in the serum of Mexican patients with different stages of diabetic retinopathy secondary to type 2 diabetes. BMJ Open Ophthalmol. 6 (1), e000717(2021).
  21. Sorkhabi, R., Ahoor, M. H., Ghorbani Haghjo, A., Tabei, E., Taheri, N. Assessment of tear inflammatory cytokines concentration in patients with diabetes with varying severity of involvement. Exp Eye Res. 224, 109233(2022).
  22. Adigal, S. S., et al. Human tear fluid analysis for clinical applications: Progress and prospects. Expert Rev Mol Diagn. 21 (8), 767-787 (2021).
  23. Mackay, D. D., Garza, P. S., Bruce, B. B., Newman, N. J., Biousse, V. The demise of direct ophthalmoscopy: A modern clinical challenge. Neurol Clin Pract. 5 (2), 150-157 (2015).
  24. Saeedi, P., et al. Global and regional diabetes prevalence estimates for 2019 and projections for 2030 and 2045: Results from the International Diabetes Federation Diabetes Atlas, 9th edition. Diabetes Res Clin Pract. 157, 107843(2019).
  25. Kong, L., et al. Significance of serum microRNAs in pre-diabetes and newly diagnosed type 2 diabetes: A clinical study. Acta Diabetol. 48, 61-69 (2011).
  26. Baldeón, R. L., et al. Decreased serum level of miR-146a as sign of chronic inflammation in type 2 diabetic patients. PLoS One. 9 (12), e115209(2014).
  27. Liang, Y. Z., et al. Identification of neuroendocrine stress response-related circulating microRNAs as biomarkers for type 2 diabetes mellitus and insulin resistance. Front Endocrinol (Lausanne). 9, 132(2018).
  28. Wan, S., et al. Increased serum miR-7 is a promising biomarker for type 2 diabetes mellitus and its microvascular complications. Diabetes Res Clin Pract. 130, 171-179 (2017).
  29. Santovito, D., et al. Plasma microRNA signature associated with retinopathy in patients with type 2 diabetes. Sci Rep. 11 (1), 4136(2021).
  30. Smit-McBride, Z., et al. Unique molecular signatures of microRNAs in ocular fluids and plasma in diabetic retinopathy. PLoS One. 15 (7), e0235541(2020).
  31. Sun, Y., Liu, W., Zuo, C. Regulatory role of miRNA-23a in diabetic retinopathy. Exp Ther Med. 22 (6), 1-9 (2021).
  32. Wong, W. K. M., et al. MicroRNA profiling from tears as a potential non-invasive method for early detection of diabetic retinopathy. Methods Mol Biol. 2678, 117-134 (2023).
  33. Amorim, M., et al. Putative biomarkers in tears for diabetic retinopathy diagnosis. Front Med (Lausanne). 9, 873483(2022).
  34. Arroyo, C. A. -D., et al. Diurnal variation on tear stability and correlation with tear cytokine concentration. Cont Lens Anterior Eye. 45 (6), 101705(2022).
  35. Patel, S., Mittal, R., Kumar, N., Galor, A. The environment and dry eye: Manifestations, mechanisms, and more. Front Toxicol. 5, 1173683(2023).
  36. Benito, M. J., et al. Intra- and inter-day variation of cytokines and chemokines in tears of healthy subjects. Exp Eye Res. 120, 43-49 (2014).
  37. Bachhuber, F., Huss, A., Senel, M., Tumani, H. Diagnostic biomarkers in tear fluid: From sampling to preanalytical processing. Sci Rep. 11 (1), 10064(2021).
  38. Shoji, J., Aso, H., Inada, N. Clinical usefulness of simultaneous measurement of the tear levels of CCL17, CCL24, and IL-16 for the biomarkers of allergic conjunctival disorders. Curr Eye Res. 42 (5), 677-684 (2017).
  39. Gijs, M., et al. Pre-analytical sample handling effects on tear fluid protein levels. Sci Rep. 13 (1), 1317(2023).
  40. Vandermeid, K. R., Su, S. P., Krenzer, K. L., Ward, K. W., Zhang, J. Z. A method to extract cytokines and matrix metalloproteinases from Schirmer strips and analyze using Luminex. Mol Vis. 17, 1056-1063 (2011).
  41. Benlloch-Navarro, S., et al. Lipid peroxidation is increased in tears from the elderly. Exp Eye Res. 115, 199-205 (2013).
  42. Li, K., Chen, Z., Duan, F., Liang, J., Wu, K. Quantification of tear proteins by SDS-PAGE with an internal standard protein: A new method with special reference to small volume tears. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 248 (6), 853-862 (2010).
  43. Grigor'eva, A. E., et al. Exosomes in tears of healthy individuals: Isolation, identification, and characterization. Biochem (Moscow) Suppl B Biomed Chem. 10 (2), 165-172 (2016).
  44. Hu, L., et al. Discovering the secret of diseases by incorporated tear exosomes analysis via rapid-isolation system: iTEARS. ACS Nano. 16 (8), 11720-11732 (2022).
  45. Ter-Ovanesyan, D., et al. Framework for rapid comparison of extracellular vesicle isolation methods. eLife. 10, e70725(2021).
  46. Guo, J., et al. Establishment of a simplified dichotomic size-exclusion chromatography for isolating extracellular vesicles toward clinical applications. J Extracell Vesicles. 10 (11), e12145(2021).
  47. Aqrawi, L. A., et al. Proteomic and histopathological characterisation of sicca subjects and primary Sjögren's syndrome patients reveals promising tear, saliva and extracellular vesicle disease biomarkers. Arthritis Res Ther. 21 (1), 181(2019).
  48. Aqrawi, L. A., et al. Identification of potential saliva and tear biomarkers in primary Sjögren's syndrome, utilizing the extraction of extracellular vesicles and proteomics analysis. Arthritis Res Ther. 19 (1), 14(2017).
  49. McKay, T. B., Hutcheon, A. E. K., Zieske, J. D., Ciolino, J. B. Extracellular vesicles secreted by corneal epithelial cells promote myofibroblast differentiation. Cells. 9 (5), 1080(2020).
  50. Atienzar-Aroca, S., et al. Oxidative stress in retinal pigment epithelium cells increases exosome secretion and promotes angiogenesis in endothelial cells. J Cell Mol Med. 20 (8), 1457-1466 (2016).
  51. Liu, J., et al. Roles of exosomes in ocular diseases. Int J Nanomedicine. 15, 10519-10538 (2020).
  52. Kenny, A., et al. Proteins and microRNAs are differentially expressed in tear fluid from patients with Alzheimer's disease. Sci Rep. 9 (1), 15437(2019).
  53. Wijesinghe, P., et al. MicroRNAs in tear fluids predict underlying molecular changes associated with Alzheimer's disease. Life Sci Alliance. 6 (6), e202201757(2023).
  54. Urbizu, A., Arnaldo, L., Beyer, K. Obtaining miRNA from saliva-Comparison of sampling and purification methods. Int J Mol Sci. 24 (3), 2386(2023).
  55. Cirillo, P. D. R., Margiotti, K., Mesoraca, A., Giorlandino, C. Quantification of circulating microRNAs by droplet digital PCR for cancer detection. BMC Res Notes. 13 (1), 351(2020).
  56. Sangalli, E., et al. Circulating microRNA-15a associates with retinal damage in patients with early stage type 2 diabetes. Front Endocrinol (Lausanne). 11, 254(2020).

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Nachdrucke und Genehmigungen

Tags

TränenexosomenBiomarker der TränenflüssigkeitDroplet Digital PCRExosomenisolationMicroRNA-ProfilingNanopartikel-Trackingnicht-invasive DiagnostikVorbeugung von Sehverlust
Tränenabgeleitetes exosomales miR-15a als neues diagnostisches Werkzeug für diabetische Retinopathie
Kontaktieren Sie uns
Der Bibliothek empfehlen

Datenschutz

Nutzungsbedingungen

Richtlinien

Urheberrecht © 2026 MyJoVE Corporation. Alle Rechte vorbehalten.