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Methodenartikel

Isolierung, Expansion und Differenzierung von fibro-adipogenen Vorläuferzellen aus dem Modell der stacheligen Maus

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DOI:

10.3791/66717

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15. November 2024

 ,  ,  , 
1School of Biomedical Engineering and Department of Medical Genetics, University of British Columbia, 2Aspect Biosystems

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt die Isolierung von fibro-adipogenen Vorläuferzellen (FAPs) des Skelett- und Herzmuskels aus stacheligen Mäusen (Acomys) durch enzymatische Dissoziation und fluoreszenzaktivierte Zellsortierung. Die aus diesem Protokoll gewonnenen FAPs können effektiv zu Myofibroblasten und Adipozyten erweitert und differenziert werden.

Zusammenfassung

Aufgrund ihres außergewöhnlichen Reparaturprogramms ist die Stachelmaus ein aufstrebendes Forschungsmodell für die regenerative Medizin. Fibro-adipogene Vorläuferzellen sind geweberesidente Zellen, die in der Lage sind, sich in Adipozyten, Fibroblasten und Chondrozyten zu differenzieren. Fibro-adipogene Vorläuferzellen sind von grundlegender Bedeutung für die Orchestrierung der Geweberegeneration, da sie für den Umbau der extrazellulären Matrix nach Verletzungen verantwortlich sind. Diese Studie konzentriert sich auf die Untersuchung der spezifischen Rolle von fibro-adipogenen Vorläuferzellen bei der Herzreparatur und der Regeneration der Skelettmuskulatur der Stachelmaus. Zu diesem Zweck wurde ein Protokoll für die Aufreinigung von fibro-adipogenen Vorläuferzellen der Stachelmaus mittels Durchflusszytometrie aus enzymatisch dissoziierten Skelett- und Herzmuskeln optimiert. Die aus diesem Protokoll erhaltene Population ist in der Lage, sich in vitro zu vermehren und kann zu Myofibroblasten und Adipozyten differenziert werden. Dieses Protokoll bietet Forschern ein wertvolles Werkzeug, um die charakteristischen Eigenschaften der Stachelmaus zu untersuchen und sie mit dem Mus musculus zu vergleichen. Dies wird Erkenntnisse liefern, die das Verständnis der regenerativen Mechanismen in diesem faszinierenden Modell voranbringen könnten.

Einleitung

Ursprünglich für ihre außergewöhnlich empfindliche Haut und ihre bemerkenswerte Fähigkeit, Hautverletzungen zu reparieren, bekannt, hat die Stachelmaus im Vergleich zu Mus musculuseine überlegene Regenerationsfähigkeit in verschiedenen Organsystemen wie Bewegungsapparat, Nieren, Zentralnervensystem und Herz-Kreislauf gezeigt 1,2.

Fibro-adipogene Vorläuferzellen (FAPs) sind eine Untergruppe von Stromazellen, die in verschiedenen Geweben beheimatet sind, einschließlich Skelett- und Herzmuskeln. Diese Zellen besitzen eine einzigartige Fähigkeit, sich in vivo und in vitro an fibrogene und adipogene Linien zu binden 3,4. FAPs spielen eine entscheidende Rolle bei der Geweberegeneration, indem sie die extrazelluläre Matrix modulieren und die Funktionen anderer Zelltypen unterstützen, die am Reparaturprozess beteiligt sind. In der Skelettmuskulatur werden FAPs als Reaktion auf Verletzungen aktiviert und erleichtern die Differenzierung von Muskelstammzellen und die Myogenese 5,6. Bei ischämischen Verletzungen des Herzens legen FAPs Narbengewebe ab, um die Integrität des Myokards zu erhalten. Im Gegensatz zu Muskeln werden kardiale FAPs chronisch aktiviert und tragen zum pathologischen Umbau bei 7,8.

Frühere Studien haben gezeigt, dass die extrazelluläre Matrix der Stachelmaus im Vergleich zu Mus musculus eine andere Zusammensetzung, Struktur und Eigenschaften aufweist, die die Regeneration unterstützen. Bei Muskel- und Herzverletzungen wurde festgestellt, dass FAPs zu einer überlegenen Heilung bei Stachelmäusen beitragen 11,12,13. Das Verständnis des Verhaltens und der regulatorischen Kontrolle von stacheligen Maus-FAPs und Stroma könnte Aufschluss über den Mechanismus hinter ihren regenerativen Fähigkeiten geben. Während FAPs in anderen Tiermodellen, wie z. B. in Mus musculus14,15, ausführlich untersucht werden, gibt es derzeit keine veröffentlichten Protokolle für die Isolierung von stacheligen Maus-FAPs. Die Entwicklung eines solchen Protokolls würde eine bedeutende Lücke auf diesem Gebiet schließen und es den Forschern ermöglichen, die zellulären und molekularen Mechanismen zu untersuchen, die dem regenerativen Potenzial der Stachelmaus zugrunde liegen.

Dieses Protokoll beschreibt ein robustes und reproduzierbares Protokoll zur Isolierung, Erweiterung und Differenzierung von Skelett- und Herzmuskel-FAPs aus stacheligen Mäusen. Das hier beschriebene Protokoll liefert qualitativ hochwertige Einzelzellsuspensionen, die für die fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS) geeignet sind. Durch die Verwendung von rh-TGFβ1 oder einem kompatiblen kommerziell erhältlichen Medium, zwei Methoden, die häufig zur Differenzierung von Mus musculus FAPs16 verwendet werden, behalten die sortierten stacheligen FAPs ihre Fähigkeit zur Differenzierung entlang der fibrogenen bzw. adipogenen Linie bei (Abbildung 1).

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Protokoll

Alle Tierhaltungs- und Versuchsverfahren wurden in Übereinstimmung mit der Genehmigung des Tierpflegeausschusses der University of British Columbia und den Vorschriften der University of British Columbia durchgeführt. Die Tiere wurden in einer geschlossenen pathogenfreien Anlage unter Standardbedingungen (12:12 Hell-Dunkel-Zyklus, 21-23 °C und 40%-60% Luftfeuchtigkeit) untergebracht und erhielten eine proteinreiche Mausnahrung und Wasser ad libitum. Für diese Studie wurden adulte (4 bis 6 Monate alte, 50-60 g) weibliche und männliche Acomys dimidiatus-Mäuse verwendet. Die Details zu allen verwendeten Reagenzien und Geräten sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Vorbereitung der Lösung und des Puffers

  1. Bereiten Sie 1x Phosphatpuffer Kochsalzlösung (PBS) vor.
  2. Bereiten Sie PBS-EDTA vor, indem Sie 4 mL 0,5 M EDTA (2 mM) und 996 mL 1x PBS, pH = 7,4, mischen.
  3. Bereiten Sie 250 mM CaCl2 vor, indem Sie 2,7745 g CaCl2 zu 100 mL nukleasefreiem Wasser hinzufügen.
  4. Aufschlusspuffer vorbereiten: Mischen Sie 50 μg/ml Liberase, 2,5 mM CaCl2 und 5 % fötales Rinderserum (FBS) in DMEM/F12.
  5. Bereiten Sie den FACS-Puffer vor, indem Sie 488 ml 1x PBS, 2 ml 0,5 m EDTA und 10 ml FBS mischen.
  6. Bereiten Sie den Viabilitätspuffer vor, indem Sie FACS-Puffer mit Propidiumiodid (PI; 1 μg/ml) mischen.
  7. Bereiten Sie Basismedien vor, indem Sie DMEM/F12 mit 5 % FBS und 1 % (v/v) Stift/Streptokokken mischen.
  8. Bereiten Sie das Proliferationsmedium vor, indem Sie DMEM/F12 mit 10 % FBS, 1 % (v/v) Pen/Strep und 2,5 ng/ml bFGF mischen.
  9. Herstellung fibrogener Medien durch Mischen von basischen Medien und 10 ng/ml rh-TGFβ1,
  10. Bereiten Sie adipogenes Medium (1x) vor, indem Sie DMEM/F12 mit 1% Stift/Streptokokken und einem im Handel erhältlichen 10x Maus-Adipogen-Differenzierungszusatz mischen.
  11. Bereiten Sie 4% PFA vor, indem Sie 4% Paraformaldehyd (w/v) zu 1x PBS hinzufügen.
  12. Bereiten Sie 0,3% PBS-Triton vor, indem Sie 498,5 mL 1x PBS und 1,5 mL TritonX-100 mischen.
  13. Bereiten Sie den Eselblockierungspuffer vor, indem Sie 5 % (v/v) Eselserum, 1 % BSA (w/v) und 0,3 % PBS-Triton mischen.
  14. Bereiten Sie Donkey + MOM Blockierungspuffer vor, indem Sie 2,5 ml Donkey Blocking-Puffer und 2 Tropfen MOM Block mischen.
  15. Bereiten Sie die DAPI-Färbelösung vor, indem Sie 600 nM 4′,6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) in 1x PBS mischen.

2. Entnahme von Gewebe

  1. Euthanasieren Sie das Tier gemäß den Richtlinien des Institutional Animal Care and Use Committee. Für stachelige Mäuse wird Isofluran gefolgt von CO2 (20 % des Käfigvolumens/min) und Wirbelsäulenluxation empfohlen, um den Tod sicherzustellen.
  2. Legen Sie die Maus in Rückenlage auf den Seziertisch und besprühen Sie sie gründlich mit 70%igem Ethanol, um eine Kontamination mit Mäusefell zu vermeiden.
  3. Machen Sie einen 2-3 cm langen vertikalen Schnitt an der ventralen Mittellinie und legen Sie den Brustkorb und die Bauchmuskulatur frei. Den Muskel am Xiphoid-Prozess mit einer Gewebeschere durchtrennen und das Zwerchfell freilegen. Schneiden Sie das Zwerchfell und den Brustkorb auf beiden Seiten ab. Verwenden Sie ein Blutstillungsmittel, um die abgeschnittenen Rippen festzuklemmen und zurückzuschälen.
  4. Schneiden Sie den rechten Vorhof mit einer Gewebeschere ein, platzieren Sie eine 23-g-Nadel, die an einer 20-ml-Spritze befestigt ist, in der Spitze des Herzens und perfundieren Sie sie, indem Sie langsam 20 ml 2 mM PBS-EDTA INJIZIEREN.
  5. Schneiden Sie das Herz heraus, spülen Sie es in kaltem 1x PBS in einer 60 mm Petrischale auf Eis, entfernen Sie die Vorhöfe und reinigen Sie das Blut so weit wie möglich.
  6. Entfernen Sie die Haut oberhalb des Kniegelenks. Entfernen Sie mit einer feinen Pinzette die Faszie und isolieren Sie den Quadrizepsmuskel mit einer Schere, indem Sie den Oberschenkelknochen als Führung verwenden. In eine separate Petrischale mit kaltem 1x PBS geben.
  7. Wiederholen Sie Schritt 2.6 für das andere Bein.

3. Verdauung des Gewebes

  1. Geben Sie 2 ml Verdauungspuffer in ein 5-ml-Transportfläschchen für das Herz und 4 ml Verdauungspuffer in ein 15-ml-Zentrifugenröhrchen für zwei Quadrizepsmuskeln.
  2. Das Gewebe mit einer Gewebeschere am Deckel der Petrischale in kleinere als 1 mm3 Stücke zerkleinern.
  3. Geben Sie gehacktes Gewebe in die entsprechenden Verdauungsröhrchen. 2 s bei niedriger Geschwindigkeit zum Mischen vortexen.
  4. Inkubieren Sie bei 37 °C unter leichtem Drehen und Schütteln.
  5. Nehmen Sie nach 20 Minuten die Schläuche vom Rotator und lassen Sie die Gewebestücke absetzen. Nehmen Sie den Überstand mit einer P1000-Pipette ab und geben Sie ihn in 20 mL eiskalten FACS-Puffer in 50-ml-Zentrifugenröhrchen.
  6. Füllen Sie die Aufschlussröhrchen mit 2 mL bzw. 4 mL Aufschlusspuffer für die Herz- und Muskelverdauung auf und stellen Sie sie unter leichtem Drehen und Schütteln wieder auf 37 °C.
  7. Wiederholen Sie die Schritte 3.5 bis 3.6 noch einmal nach weiteren 20 Minuten. Geben Sie den Überstand in das jeweilige 50 mL Zentrifugenröhrchen aus Schritt 3.5.
  8. Stoppen Sie den Aufschluss nach 60 min, indem Sie den Aufschlusspuffer mit eiskaltem FACS-Puffer abschrecken.
  9. Die Aufschlusssuspension, die Suspension und der Überstand werden durch ein 40-μm-Zellsieb auf 50-ml-Zentrifugenröhrchen filtriert. Füllen Sie bis zu 40 mL mit FACS-Puffer auf.
  10. Die Zellsuspension bei 500 x g für 8 min bei 4 °C zentrifugieren. Dekantieren Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet in 3 mL ACK-Lysepuffer. 5 min auf Eis inkubieren und mit FACS-Puffer auf bis zu 40 mL auffüllen.
  11. Zentrifugieren Sie bei 500 x g für 5 min bei 4 °C. Dekantieren Sie den Überstand.
  12. Resuspendieren Sie in 0,5 ml FACS-Puffer und pipetieren Sie auf und ab, um sicherzustellen, dass die Zellen gleichmäßig verteilt sind.
  13. Die Suspension wird durch einen 40-μm-Filter auf 5 mL Polystyrol-Rundbodenröhrchen mit Zellsiebkappe filtriert.

4. Färbung für die fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS)

  1. Für Einzelfarben- und Fluoreszenz-Minus-Eins-Kontrollen (FMO) bereiten Sie 30 μl Färbepuffer (Antikörper in FACS-Puffer verdünnt) bei 2-facher Arbeitskonzentration in vormarkierten 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen vor. In Tabelle 1 finden Sie Informationen zur Einrichtung des Antikörperfärbepuffers.
  2. Bereiten Sie Einzelfarben und FMO-Kontrollen für Muskeln und Herz separat vor.
  3. Übertragen Sie 30 μl einfarbigen und FMO-Kontrollfärbepuffer auf eine 96-Well-Platte. Mit 20 μl FACS-Puffer auffüllen.
  4. Für die FACS-Färbung der Probe sind 0,5 ml Färbepuffer (Antikörper in FACS-Puffer verdünnt) bei 2-facher Arbeitskonzentration in 1,5 ml-Zentrifugenröhrchen vorzubereiten.
  5. Geben Sie 10 μl der Zellsuspension in einfarbige und FMO-Kontrollvertiefungen. Fügen Sie dem Rest der Zellsuspension Färbepuffer hinzu und resuspendieren Sie.
  6. Bei 4 °C inkubieren, 30 min vor Licht geschützt.
  7. Füllen Sie die Wells mit 100 μl FACS-Puffer und das Probenröhrchen mit 2 mL FACS-Puffer auf.
  8. Bei 500 x g für 5 min bei 4 °C zentrifugieren und den Überstand entfernen.
  9. Wiederholen Sie die Schritte 4.7 und 4.8.
  10. Resuspendieren Sie das Zellpellet im Viabilitätspuffer. 100 μl für Einfarb- und FMO-Kontrollen, 1 mL für FACS-Sortierproben.
  11. Bereiten Sie die Entnahmeröhrchen vor, indem Sie 300 μl Proliferationsmedium in 1,7-ml-Zentrifugenröhrchen geben.

5. Fluoreszenzaktivierte Zellsortierung

  1. Gating-Strategie: Verwenden Sie FSC vs. SSC (Log) zum Entfernen von Ablagerungen. Verwenden Sie FSC-H vs. FSC-A zum Anschnitt von Singuletts. Verwenden Sie CD31 vs. PI zum Gate auf lebensfähigen und liniennegativen Zellen. Verwenden Sie PDGFRα zum Gate für FAPs (Abbildung 2).
  2. In zuvor vorbereitete Auffangröhrchen sortieren.

6. Gewebekultur

  1. Die gesammelten Zellen werden bei 800 x g für 10 min bei 4 °C zentrifugiert.
  2. Entfernen Sie den Überstand mit einer P1000-Pipette. Achten Sie darauf, das Zellpellet nicht zu stören.
  3. Resuspendieren Sie das Pellet in Kulturmedien (250 μl/Well) und säen Sie es mit 25 k/Well in einer 48-Well-Gewebekulturplatte.
  4. Kultur in einem Inkubator (37 °C, 5 % CO2). Wechseln Sie das Medium alle 3 Tage, bis die Zellen eine Konfluenz von 80 % erreichen.

7. Fibrogene Differenzierung

  1. Sobald die Zellen zur Behandlung bereit sind, legen Sie basische Medien und 1x DPBS in ein warmes Bad oder bei Raumtemperatur, bevor Sie sie verwenden.
  2. Aspirieren Sie den Nährboden.
  3. Zweimal mit 200 μL 1x DPBS spülen.
  4. Einmal mit 200 μl basischem Medium spülen.
  5. Geben Sie 250 μl fibrogenes oder basisches Medium in die jeweiligen Vertiefungen.
  6. Die Zellen werden wieder in den Inkubator (37 °C, 5 % CO2) gestellt.
  7. Stoppen Sie die Differenzierung nach 48 h.

8. Adipogene Differenzierung

  1. Sobald die Zellen bereit für die Behandlung sind, legen Sie basische Medien, adipogene Medien und 1x DPBS in ein warmes Bad oder bei Raumtemperatur, bevor Sie sie verwenden.
  2. Aspirieren Sie den Nährboden.
  3. Zweimal mit 200 μL 1x DPBS spülen.
  4. Einmal mit 200 μl basischem Medium spülen.
  5. Geben Sie 400 μl adipogenes oder basisches Medium in die entsprechenden Vertiefungen.
  6. Rückkehr in den Inkubator (37 °C, 5 % CO2).
  7. Entfernen Sie alle 2 Tage 200 μl Medien mit einer Pipette aus den Vertiefungen und fügen Sie 200 μl frisches adipogenes oder basisches Medium hinzu.
  8. Stoppen Sie die Differenzierung am 6. Tag für Skelettmuskel-FAPs und am 14. Tag für kardiale FAPs.

9. Immunfärbung

  1. Stoppen Sie den Differenzierungsassay, indem Sie Medien aspirieren und zweimal mit 250 μl 1x PBS spülen. Führen Sie alle Wäschen mit einer 18-G-Nadel durch, die an einer 3-ml-Spritze befestigt ist, um eine Zellablösung zu vermeiden.
  2. 250 μl 4 % PFA pro Vertiefung zugeben und 7 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.
  3. Entfernen Sie das PFA und spülen Sie es 3 Mal für jeweils 5 Minuten mit 250 μL 1x PBS.
  4. Bei der letzten Wäsche 1x PBS aspirieren und 250 μl Donkey + MOM Blockierungspuffer hinzufügen.
  5. Bei Raumtemperatur 60 min inkubieren.
  6. Bereiten Sie die primäre Antikörper-Färbelösung in Esel-Blockierungspuffer (Anti-SMA und Anti-Perilipin) für ein Endvolumen von 100 μl pro Vertiefung vor.
  7. Aspirieren Sie die Färbevertiefungen. Lassen Sie den Donkey + MOM-Blockierungspuffer ggf. gut unter Kontrolle.
  8. Geben Sie die primäre Antikörper-Färbelösung in die jeweiligen Vertiefungen.
  9. Über Nacht bei 4 °C inkubieren.
  10. Am nächsten Tag 3 Mal für jeweils 5 min mit 1x PBS waschen.
  11. Bereiten Sie die Sekundärantikörper-Färbelösung in einem Esel-Blockierungspuffer mit einem Endvolumen von 100 μl pro Vertiefung vor.
  12. Aspirieren Sie die letzte Wäsche und fügen Sie sekundäre Antikörper-Färbelösung in alle Vertiefungen hinzu.
  13. 45 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren (ab diesem Zeitpunkt sollten die Proben vor Licht geschützt werden).
  14. 3 Mal für jeweils 5 min mit 1x PBS waschen.
  15. Aspirieren Sie die letzte Wäsche und fügen Sie 250 μl DAPI-Färbelösung hinzu.
  16. 5 min bei Raumtemperatur inkubieren.
  17. Entfernen Sie die DAPI-Färbelösung und waschen Sie sie einmal für 5 min mit 1x PBS.
  18. Geben Sie 100 μl Fluoromount-G in jede Vertiefung.
  19. Verschließen Sie die Platte mit dem Deckel und der Paraffinfolie, um die Verdunstung zu minimieren. Bis zur Aufnahme bei 4 °C lichtgeschützt lagern.
  20. Aufnahme mit einem Mikroskop (Abbildung 3 und Abbildung 4).
    HINWEIS: Donkey Serum wird als Blockierungspuffer als speziesspezifischer Block gegen die mit Esel aufgezogenen Sekundärantikörper verwendet, die in diesem Protokoll verwendet werden. Das Maus-auf-Maus-Blockierungsreagenz wird gegen den Anti-SMA-Primärantikörper verwendet, der in der Maus aufgebracht wird.

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Ergebnisse

Das Schema dieses Protokolls zur Isolierung und Kultivierung von Skelettmuskel- und Herz-FAPs ist in Abbildung 1 zusammengefasst. Bei der Gewebeentnahme ist die Verfärbung der Leber von dunkelrot zu blassgelb in der Regel ein Hinweis auf eine erfolgreiche Durchblutung. In den angegebenen Altersgruppen der Stachelmaus liegt das Herzgewicht typischerweise bei etwa 200 mg, während der Quadrizepsmuskel bei etwa 350 mg liegt.

Bei jeder Änderung des Verdauungspuffers in...

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Diskussion

Stachelmausgewebe reagiert empfindlicher auf die Spannungen bei der Dissoziation des Gewebes, und es gibt mehrere Aspekte dieses Protokolls, die darauf abzielen, Stress zu minimieren, um die Lebensfähigkeit der Zellen zu verbessern. Für die Probenvorbereitung wird die serielle enzymatische Dissoziationstechnik eingesetzt, um die Konzentration des erforderlichen Enzyms zu senken. Mit fortschreitender enzymatischer Verdauung nimmt die enzymatische Aktivität ab. Durch den Ersatz durch frisc...

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Offenlegungen

Die Autoren haben keinen Interessenkonflikt offenzulegen.

Danksagungen

Wir danken Andy Johnson und Justin Wong, UBC flow core, für ihre Expertise und Hilfe bei der Optimierung des FACS-Protokolls sowie den Mitarbeitern der Tiereinrichtung des UBC Biomedical Research Center für die Pflege von Stachelmäusen. Abbildung 1 wurde mit Biorender erstellt. Abbildung 2 wurde mit der FlowJo-Software erstellt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
0,5 M EDTAInvitrogen15575 038
1,7 mL MikrozentrifugenröhrchenVWR87003-294
15  mL ZentrifugenröhrchenFalcon352096
1x Dulbecco' s Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (DPBS)Gibco14190-144
20 mL SpritzeBD309661
4′,6-diamidino-2-phenylindol (DAPI)InvitrogenD3571
40  μ m ZellsiebFalcon352340
48 Well Gewebekulturplatte mit flachem BodenFalcon53078
5 mL PolypropylenFalcon352063
5 mL Polystyrol-Rundbodenröhrchen mit ZellsiebkappeFalcon352235
5 mL SpritzeBD309646
50  mL ZentrifugenröhrchenFalcon352070
60 mm PetrischaleFalcon353002
96 Well V-Boden GewebekulturplatteCorning3894
Acomys dimidiatus Mäuse (stachelige Mäuse)freundlicherweise geschenkt von Dr. Ashley W. Seifert (University of Kentucky).
Ammoniumchlorid-Kalium (ACK) LysingpufferGibcoA10492-01
Anti-Perilpin (1:100)SigmaP1873
Anti-SMA (1:100)Invitrogen14-9760-82
APC PDGFRa (1:800)Abcamab270085
BD PrecisionGlide Nadel 18 GBD305195
BD PrecisionGlide Nadel 23 GBD305145
RinderserumalbuminSigmaA7906-100g
BV605 CD31 (1:500)BD biosciences744359
CaCl2Sigma-AldrichC4901
ZentrifugeEppendorf5810R
DMEM/F12Gibco11320033
Esel Anti-Maus Alexa 555 (1:1000)InvitrogenA31570
Esel Anti-Kaninchen Alexa 647 (1:1000)InvitrogenA31573
EselserumSigmaS30-100ML
FACS Sortierer - MoFlo Astrios 5 LaserBeckman ScharB52102
Fötales RinderserumGemini100-500
Feine SchereFST14058-11
Fluoromount-GSouthernBiotech0100-01
PinzetteFST11051-10
HämostatFST91308-12
Humanes FGF-basisches rekombinantes Protein (bFGF)Gibco13256029
humanes TGF beta 1 rekombinantes Protein (TGFb1)eBiosciences14-8348-62
Inkubator - Heracell 160i CO2ThermoFisher51033557
Inverses Mikroskop - RevolveECHOn/a
LiberaseRoche5401127001
Maus MesenCult Adipogene Differenzierung 10x ErgänzungSTEMCELL technologies5507
Maus auf Maus (MOM) blockierendes ReagenzVector LaboratoriesMKB-2213
ParaformaldehydSigmaP1648-500g
Penicillin-StreptomycinGibco15140 122
PicoLab Mouse Diet 20LabDiet3005750-220
Propidiumiodid (PI)InvitrogenP3566
Transportfläschchen 5mL RöhrchenCaplugs Evergreen222-3005-080
Triton X-100Sigma9036-19-5

Referenzen

  1. Gaire, J., et al. Spiny mouse (Acomys): An emerging research organism for regenerative medicine with applications beyond the skin. NPJ Regen Med. 6, 1(2021).
  2. Sandoval, A. G. W., Maden, M. Regeneration in the spiny mouse, Acomys, a new mammalian model. Curr. Opin. Genet. Dev. 64, 31-36 (2020).
  3. Judson, R. N., Zhang, R. H., Rossi, F. M. A. Tissue-resident mesenchymal stem/progenitor cells in skeletal muscle: Collaborators or saboteurs. FEBS J. 280 (17), 4100-4108 (2013).
  4. Uezumi, A., et al. Fibrosis and adipogenesis originate from a common mesenchymal progenitor in skeletal muscle. J Cell Sci. 124, 3654-3664 (2011).
  5. Joe, A. W. B., et al. Muscle injury activates resident fibro/adipogenic progenitors that facilitate myogenesis. Nat Cell Biol. 12, 153-163 (2010).
  6. Uezumi, A., Fukada, S. I., Yamamoto, N., Takeda, S., Tsuchida, K. Mesenchymal progenitors distinct from satellite cells contribute to ectopic fat cell formation in skeletal muscle. Nat Cell Biol. 122 (12), 143-152 (2010).
  7. Soliman, H., et al. Pathogenic Potential of Hic1-Expressing Cardiac Stromal Progenitors. Cell Stem Cell. 26 (2), 205-220 (2020).
  8. Hall, C., Gehmlich, K., Denning, C., Pavlovic, D. Complex relationship between cardiac fibroblasts and cardiomyocytes in health and disease. J Am Heart Assoc. 10, 1-15 (2021).
  9. Gawriluk, T. R., et al. Comparative analysis of ear-hole closure identifies epimorphic regeneration as a discrete trait in mammals. Nat Commun. 71 (7), 1-16 (2016).
  10. Seifert, A. W. Skin shedding and tissue regeneration in African spiny mice (Acomys). Nature. 489, 561(2012).
  11. Koopmans, T., et al. Ischemic tolerance and cardiac repair in the spiny mouse (Acomys). NPJ Regen Med. 6, 78(2021).
  12. Peng, H., et al. Adult spiny mice (Acomys) exhibit endogenous cardiac recovery in response to myocardial infarction. NPJ Regen Med. 6, 74(2021).
  13. Maden, M., et al. Perfect chronic skeletal muscle regeneration in adult spiny mice, Acomys cahirinus. Sci Rep. 8, 8920(2018).
  14. Riparini, G., Simone, J. M., Sartorelli, V. FACS-isolation and culture of fibro-adipogenic progenitors and muscle stem cells from unperturbed and injured mouse skeletal muscle. J Vis Exp. (184), e63983(2022).
  15. Low, M., Eisner, C., Rossi, F. Fibro/adipogenic progenitors (FAPs): Isolation by FACS and culture. Methods Mol Biol. 1556, 179-189 (2017).
  16. Molina, T., Fabre, P., Dumont, N. A. Fibro-adipogenic progenitors in skeletal muscle homeostasis, regeneration and diseases. Open Biol. 11 (12), 210110(2021).
  17. Contreras, O., Rossi, F. M. V., Theret, M. Origins, potency, and heterogeneity of skeletal muscle fibro-adipogenic progenitors-time for new definitions. Skelet Muscle. 111 (11), 1-25 (2021).
  18. Fitzgerald, G., et al. MME+ fibro-adipogenic progenitors are the dominant adipogenic population during fatty infiltration in human skeletal muscle. Commun Biol. 61 (6), 1-21 (2023).
  19. Babaeijandaghi, F., et al. DPPIV+ fibro-adipogenic progenitors form the niche of adult skeletal muscle self-renewing resident macrophages. Nat Commun. 141 (14), 1-10 (2023).
  20. Schutz, P. W., Cheung, S., Yi, L., Rossi, F. M. V. Cellular activation patterns of CD10+ fibro-adipogenic progenitors across acquired disease states in human skeletal muscle biopsies. Free Neuropathol. 5, 3-3 (2024).

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