Isolierung, Expansion und Differenzierung von fibro-adipogenen Vorläuferzellen aus dem Modell der stacheligen Maus

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt die Isolierung von fibro-adipogenen Vorläuferzellen (FAPs) des Skelett- und Herzmuskels aus stacheligen Mäusen (Acomys) durch enzymatische Dissoziation und fluoreszenzaktivierte Zellsortierung. Die aus diesem Protokoll gewonnenen FAPs können effektiv zu Myofibroblasten und Adipozyten erweitert und differenziert werden.

Zusammenfassung

Aufgrund ihres außergewöhnlichen Reparaturprogramms ist die Stachelmaus ein aufstrebendes Forschungsmodell für die regenerative Medizin. Fibro-adipogene Vorläuferzellen sind geweberesidente Zellen, die in der Lage sind, sich in Adipozyten, Fibroblasten und Chondrozyten zu differenzieren. Fibro-adipogene Vorläuferzellen sind von grundlegender Bedeutung für die Orchestrierung der Geweberegeneration, da sie für den Umbau der extrazellulären Matrix nach Verletzungen verantwortlich sind. Diese Studie konzentriert sich auf die Untersuchung der spezifischen Rolle von fibro-adipogenen Vorläuferzellen bei der Herzreparatur und der Regeneration der Skelettmuskulatur der Stachelmaus. Zu diesem Zweck wurde ein Protokoll für die Aufreinigung von fibro-adipogenen Vorläuferzellen der Stachelmaus mittels Durchflusszytometrie aus enzymatisch dissoziierten Skelett- und Herzmuskeln optimiert. Die aus diesem Protokoll erhaltene Population ist in der Lage, sich in vitro zu vermehren und kann zu Myofibroblasten und Adipozyten differenziert werden. Dieses Protokoll bietet Forschern ein wertvolles Werkzeug, um die charakteristischen Eigenschaften der Stachelmaus zu untersuchen und sie mit dem Mus musculus zu vergleichen. Dies wird Erkenntnisse liefern, die das Verständnis der regenerativen Mechanismen in diesem faszinierenden Modell voranbringen könnten.

Einleitung

Ursprünglich für ihre außergewöhnlich empfindliche Haut und ihre bemerkenswerte Fähigkeit, Hautverletzungen zu reparieren, bekannt, hat die Stachelmaus im Vergleich zu Mus musculus^eine überlegene Regenerationsfähigkeit in verschiedenen Organsystemen wie Bewegungsapparat, Nieren, Zentralnervensystem und Herz-Kreislauf gezeigt ^1,2.

Fibro-adipogene Vorläuferzellen (FAPs) sind eine Untergruppe von Stromazellen, die in verschiedenen Geweben beheimatet sind, einschließlich Skelett- und Herzmuskeln. Diese Zellen besitzen eine einzigartige Fähigkeit, sich in vivo und in vitro an fibrogene und adipogene Linien zu binden ^3,4. FAPs spielen eine entscheidende Rolle bei der Geweberegeneration, indem sie die extrazelluläre Matrix modulieren und die Funktionen anderer Zelltypen unterstützen, die am Reparaturprozess beteiligt sind. In der Skelettmuskulatur werden FAPs als Reaktion auf Verletzungen aktiviert und erleichtern die Differenzierung von Muskelstammzellen und die Myogenese ^5,6. Bei ischämischen Verletzungen des Herzens legen FAPs Narbengewebe ab, um die Integrität des Myokards zu erhalten. Im Gegensatz zu Muskeln werden kardiale FAPs chronisch aktiviert und tragen zum pathologischen Umbau bei ^7,8.

Frühere Studien haben gezeigt, dass die extrazelluläre Matrix der Stachelmaus im Vergleich zu Mus musculus eine andere Zusammensetzung, Struktur und Eigenschaften aufweist, die die Regeneration unterstützen. Bei Muskel- und Herzverletzungen wurde festgestellt, dass FAPs zu einer überlegenen Heilung bei Stachelmäusen beitragen 11,12,13. Das Verständnis des Verhaltens und der regulatorischen Kontrolle von stacheligen Maus-FAPs und Stroma könnte Aufschluss über den Mechanismus hinter ihren regenerativen Fähigkeiten geben. Während FAPs in anderen Tiermodellen, wie z. B. in Mus musculus^14,15, ausführlich untersucht werden, gibt es derzeit keine veröffentlichten Protokolle für die Isolierung von stacheligen Maus-FAPs. Die Entwicklung eines solchen Protokolls würde eine bedeutende Lücke auf diesem Gebiet schließen und es den Forschern ermöglichen, die zellulären und molekularen Mechanismen zu untersuchen, die dem regenerativen Potenzial der Stachelmaus zugrunde liegen.

Dieses Protokoll beschreibt ein robustes und reproduzierbares Protokoll zur Isolierung, Erweiterung und Differenzierung von Skelett- und Herzmuskel-FAPs aus stacheligen Mäusen. Das hier beschriebene Protokoll liefert qualitativ hochwertige Einzelzellsuspensionen, die für die fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS) geeignet sind. Durch die Verwendung von rh-TGFβ1 oder einem kompatiblen kommerziell erhältlichen Medium, zwei Methoden, die häufig zur Differenzierung von Mus musculus FAPs¹⁶ verwendet werden, behalten die sortierten stacheligen FAPs ihre Fähigkeit zur Differenzierung entlang der fibrogenen bzw. adipogenen Linie bei (Abbildung 1).

Protokoll

Alle Tierhaltungs- und Versuchsverfahren wurden in Übereinstimmung mit der Genehmigung des Tierpflegeausschusses der University of British Columbia und den Vorschriften der University of British Columbia durchgeführt. Die Tiere wurden in einer geschlossenen pathogenfreien Anlage unter Standardbedingungen (12:12 Hell-Dunkel-Zyklus, 21-23 °C und 40%-60% Luftfeuchtigkeit) untergebracht und erhielten eine proteinreiche Mausnahrung und Wasser ad libitum. Für diese Studie wurden adulte (4 bis 6 Monate alte, 50-60 g) weibliche und männliche Acomys dimidiatus-Mäuse verwendet. Die Details zu allen verwendeten Reagenzien und Geräten sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Vorbereitung der Lösung und des Puffers

1. Bereiten Sie 1x Phosphatpuffer Kochsalzlösung (PBS) vor.
2. Bereiten Sie PBS-EDTA vor, indem Sie 4 mL 0,5 M EDTA (2 mM) und 996 mL 1x PBS, pH = 7,4, mischen.
3. Bereiten Sie 250 mM CaCl₂ vor, indem Sie 2,7745 g CaCl₂ zu 100 mL nukleasefreiem Wasser hinzufügen.
4. Aufschlusspuffer vorbereiten: Mischen Sie 50 μg/ml Liberase, 2,5 mM CaCl₂ und 5 % fötales Rinderserum (FBS) in DMEM/F12.
5. Bereiten Sie den FACS-Puffer vor, indem Sie 488 ml 1x PBS, 2 ml 0,5 m EDTA und 10 ml FBS mischen.
6. Bereiten Sie den Viabilitätspuffer vor, indem Sie FACS-Puffer mit Propidiumiodid (PI; 1 μg/ml) mischen.
7. Bereiten Sie Basismedien vor, indem Sie DMEM/F12 mit 5 % FBS und 1 % (v/v) Stift/Streptokokken mischen.
8. Bereiten Sie das Proliferationsmedium vor, indem Sie DMEM/F12 mit 10 % FBS, 1 % (v/v) Pen/Strep und 2,5 ng/ml bFGF mischen.
9. Herstellung fibrogener Medien durch Mischen von basischen Medien und 10 ng/ml rh-TGFβ1,
10. Bereiten Sie adipogenes Medium (1x) vor, indem Sie DMEM/F12 mit 1% Stift/Streptokokken und einem im Handel erhältlichen 10x Maus-Adipogen-Differenzierungszusatz mischen.
11. Bereiten Sie 4% PFA vor, indem Sie 4% Paraformaldehyd (w/v) zu 1x PBS hinzufügen.
12. Bereiten Sie 0,3% PBS-Triton vor, indem Sie 498,5 mL 1x PBS und 1,5 mL TritonX-100 mischen.
13. Bereiten Sie den Eselblockierungspuffer vor, indem Sie 5 % (v/v) Eselserum, 1 % BSA (w/v) und 0,3 % PBS-Triton mischen.
14. Bereiten Sie Donkey + MOM Blockierungspuffer vor, indem Sie 2,5 ml Donkey Blocking-Puffer und 2 Tropfen MOM Block mischen.
15. Bereiten Sie die DAPI-Färbelösung vor, indem Sie 600 nM 4′,6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) in 1x PBS mischen.

2. Entnahme von Gewebe

1. Euthanasieren Sie das Tier gemäß den Richtlinien des Institutional Animal Care and Use Committee. Für stachelige Mäuse wird Isofluran gefolgt von CO₂ (20 % des Käfigvolumens/min) und Wirbelsäulenluxation empfohlen, um den Tod sicherzustellen.
2. Legen Sie die Maus in Rückenlage auf den Seziertisch und besprühen Sie sie gründlich mit 70%igem Ethanol, um eine Kontamination mit Mäusefell zu vermeiden.
3. Machen Sie einen 2-3 cm langen vertikalen Schnitt an der ventralen Mittellinie und legen Sie den Brustkorb und die Bauchmuskulatur frei. Den Muskel am Xiphoid-Prozess mit einer Gewebeschere durchtrennen und das Zwerchfell freilegen. Schneiden Sie das Zwerchfell und den Brustkorb auf beiden Seiten ab. Verwenden Sie ein Blutstillungsmittel, um die abgeschnittenen Rippen festzuklemmen und zurückzuschälen.
4. Schneiden Sie den rechten Vorhof mit einer Gewebeschere ein, platzieren Sie eine 23-g-Nadel, die an einer 20-ml-Spritze befestigt ist, in der Spitze des Herzens und perfundieren Sie sie, indem Sie langsam 20 ml 2 mM PBS-EDTA INJIZIEREN.
5. Schneiden Sie das Herz heraus, spülen Sie es in kaltem 1x PBS in einer 60 mm Petrischale auf Eis, entfernen Sie die Vorhöfe und reinigen Sie das Blut so weit wie möglich.
6. Entfernen Sie die Haut oberhalb des Kniegelenks. Entfernen Sie mit einer feinen Pinzette die Faszie und isolieren Sie den Quadrizepsmuskel mit einer Schere, indem Sie den Oberschenkelknochen als Führung verwenden. In eine separate Petrischale mit kaltem 1x PBS geben.
7. Wiederholen Sie Schritt 2.6 für das andere Bein.

3. Verdauung des Gewebes

1. Geben Sie 2 ml Verdauungspuffer in ein 5-ml-Transportfläschchen für das Herz und 4 ml Verdauungspuffer in ein 15-ml-Zentrifugenröhrchen für zwei Quadrizepsmuskeln.
2. Das Gewebe mit einer Gewebeschere am Deckel der Petrischale in kleinere als 1 mm³ Stücke zerkleinern.
3. Geben Sie gehacktes Gewebe in die entsprechenden Verdauungsröhrchen. 2 s bei niedriger Geschwindigkeit zum Mischen vortexen.
4. Inkubieren Sie bei 37 °C unter leichtem Drehen und Schütteln.
5. Nehmen Sie nach 20 Minuten die Schläuche vom Rotator und lassen Sie die Gewebestücke absetzen. Nehmen Sie den Überstand mit einer P1000-Pipette ab und geben Sie ihn in 20 mL eiskalten FACS-Puffer in 50-ml-Zentrifugenröhrchen.
6. Füllen Sie die Aufschlussröhrchen mit 2 mL bzw. 4 mL Aufschlusspuffer für die Herz- und Muskelverdauung auf und stellen Sie sie unter leichtem Drehen und Schütteln wieder auf 37 °C.
7. Wiederholen Sie die Schritte 3.5 bis 3.6 noch einmal nach weiteren 20 Minuten. Geben Sie den Überstand in das jeweilige 50 mL Zentrifugenröhrchen aus Schritt 3.5.
8. Stoppen Sie den Aufschluss nach 60 min, indem Sie den Aufschlusspuffer mit eiskaltem FACS-Puffer abschrecken.
9. Die Aufschlusssuspension, die Suspension und der Überstand werden durch ein 40-μm-Zellsieb auf 50-ml-Zentrifugenröhrchen filtriert. Füllen Sie bis zu 40 mL mit FACS-Puffer auf.
10. Die Zellsuspension bei 500 x g für 8 min bei 4 °C zentrifugieren. Dekantieren Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet in 3 mL ACK-Lysepuffer. 5 min auf Eis inkubieren und mit FACS-Puffer auf bis zu 40 mL auffüllen.
11. Zentrifugieren Sie bei 500 x g für 5 min bei 4 °C. Dekantieren Sie den Überstand.
12. Resuspendieren Sie in 0,5 ml FACS-Puffer und pipetieren Sie auf und ab, um sicherzustellen, dass die Zellen gleichmäßig verteilt sind.
13. Die Suspension wird durch einen 40-μm-Filter auf 5 mL Polystyrol-Rundbodenröhrchen mit Zellsiebkappe filtriert.

4. Färbung für die fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS)

1. Für Einzelfarben- und Fluoreszenz-Minus-Eins-Kontrollen (FMO) bereiten Sie 30 μl Färbepuffer (Antikörper in FACS-Puffer verdünnt) bei 2-facher Arbeitskonzentration in vormarkierten 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen vor. In Tabelle 1 finden Sie Informationen zur Einrichtung des Antikörperfärbepuffers.
2. Bereiten Sie Einzelfarben und FMO-Kontrollen für Muskeln und Herz separat vor.
3. Übertragen Sie 30 μl einfarbigen und FMO-Kontrollfärbepuffer auf eine 96-Well-Platte. Mit 20 μl FACS-Puffer auffüllen.
4. Für die FACS-Färbung der Probe sind 0,5 ml Färbepuffer (Antikörper in FACS-Puffer verdünnt) bei 2-facher Arbeitskonzentration in 1,5 ml-Zentrifugenröhrchen vorzubereiten.
5. Geben Sie 10 μl der Zellsuspension in einfarbige und FMO-Kontrollvertiefungen. Fügen Sie dem Rest der Zellsuspension Färbepuffer hinzu und resuspendieren Sie.
6. Bei 4 °C inkubieren, 30 min vor Licht geschützt.
7. Füllen Sie die Wells mit 100 μl FACS-Puffer und das Probenröhrchen mit 2 mL FACS-Puffer auf.
8. Bei 500 x g für 5 min bei 4 °C zentrifugieren und den Überstand entfernen.
9. Wiederholen Sie die Schritte 4.7 und 4.8.
10. Resuspendieren Sie das Zellpellet im Viabilitätspuffer. 100 μl für Einfarb- und FMO-Kontrollen, 1 mL für FACS-Sortierproben.
11. Bereiten Sie die Entnahmeröhrchen vor, indem Sie 300 μl Proliferationsmedium in 1,7-ml-Zentrifugenröhrchen geben.

5. Fluoreszenzaktivierte Zellsortierung

1. Gating-Strategie: Verwenden Sie FSC vs. SSC (Log) zum Entfernen von Ablagerungen. Verwenden Sie FSC-H vs. FSC-A zum Anschnitt von Singuletts. Verwenden Sie CD31 vs. PI zum Gate auf lebensfähigen und liniennegativen Zellen. Verwenden Sie PDGFRα zum Gate für FAPs (Abbildung 2).
2. In zuvor vorbereitete Auffangröhrchen sortieren.

6. Gewebekultur

1. Die gesammelten Zellen werden bei 800 x g für 10 min bei 4 °C zentrifugiert.
2. Entfernen Sie den Überstand mit einer P1000-Pipette. Achten Sie darauf, das Zellpellet nicht zu stören.
3. Resuspendieren Sie das Pellet in Kulturmedien (250 μl/Well) und säen Sie es mit 25 k/Well in einer 48-Well-Gewebekulturplatte.
4. Kultur in einem Inkubator (37 °C, 5 % CO₂). Wechseln Sie das Medium alle 3 Tage, bis die Zellen eine Konfluenz von 80 % erreichen.

7. Fibrogene Differenzierung

1. Sobald die Zellen zur Behandlung bereit sind, legen Sie basische Medien und 1x DPBS in ein warmes Bad oder bei Raumtemperatur, bevor Sie sie verwenden.
2. Aspirieren Sie den Nährboden.
3. Zweimal mit 200 μL 1x DPBS spülen.
4. Einmal mit 200 μl basischem Medium spülen.
5. Geben Sie 250 μl fibrogenes oder basisches Medium in die jeweiligen Vertiefungen.
6. Die Zellen werden wieder in den Inkubator (37 °C, 5 % CO₂) gestellt.
7. Stoppen Sie die Differenzierung nach 48 h.

8. Adipogene Differenzierung

1. Sobald die Zellen bereit für die Behandlung sind, legen Sie basische Medien, adipogene Medien und 1x DPBS in ein warmes Bad oder bei Raumtemperatur, bevor Sie sie verwenden.
2. Aspirieren Sie den Nährboden.
3. Zweimal mit 200 μL 1x DPBS spülen.
4. Einmal mit 200 μl basischem Medium spülen.
5. Geben Sie 400 μl adipogenes oder basisches Medium in die entsprechenden Vertiefungen.
6. Rückkehr in den Inkubator (37 °C, 5 % CO₂).
7. Entfernen Sie alle 2 Tage 200 μl Medien mit einer Pipette aus den Vertiefungen und fügen Sie 200 μl frisches adipogenes oder basisches Medium hinzu.
8. Stoppen Sie die Differenzierung am 6^. Tag für Skelettmuskel-FAPs und am 14^. Tag für kardiale FAPs.

9. Immunfärbung

1. Stoppen Sie den Differenzierungsassay, indem Sie Medien aspirieren und zweimal mit 250 μl 1x PBS spülen. Führen Sie alle Wäschen mit einer 18-G-Nadel durch, die an einer 3-ml-Spritze befestigt ist, um eine Zellablösung zu vermeiden.
2. 250 μl 4 % PFA pro Vertiefung zugeben und 7 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.
3. Entfernen Sie das PFA und spülen Sie es 3 Mal für jeweils 5 Minuten mit 250 μL 1x PBS.
4. Bei der letzten Wäsche 1x PBS aspirieren und 250 μl Donkey + MOM Blockierungspuffer hinzufügen.
5. Bei Raumtemperatur 60 min inkubieren.
6. Bereiten Sie die primäre Antikörper-Färbelösung in Esel-Blockierungspuffer (Anti-SMA und Anti-Perilipin) für ein Endvolumen von 100 μl pro Vertiefung vor.
7. Aspirieren Sie die Färbevertiefungen. Lassen Sie den Donkey + MOM-Blockierungspuffer ggf. gut unter Kontrolle.
8. Geben Sie die primäre Antikörper-Färbelösung in die jeweiligen Vertiefungen.
9. Über Nacht bei 4 °C inkubieren.
10. Am nächsten Tag 3 Mal für jeweils 5 min mit 1x PBS waschen.
11. Bereiten Sie die Sekundärantikörper-Färbelösung in einem Esel-Blockierungspuffer mit einem Endvolumen von 100 μl pro Vertiefung vor.
12. Aspirieren Sie die letzte Wäsche und fügen Sie sekundäre Antikörper-Färbelösung in alle Vertiefungen hinzu.
13. 45 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren (ab diesem Zeitpunkt sollten die Proben vor Licht geschützt werden).
14. 3 Mal für jeweils 5 min mit 1x PBS waschen.
15. Aspirieren Sie die letzte Wäsche und fügen Sie 250 μl DAPI-Färbelösung hinzu.
16. 5 min bei Raumtemperatur inkubieren.
17. Entfernen Sie die DAPI-Färbelösung und waschen Sie sie einmal für 5 min mit 1x PBS.
18. Geben Sie 100 μl Fluoromount-G in jede Vertiefung.
19. Verschließen Sie die Platte mit dem Deckel und der Paraffinfolie, um die Verdunstung zu minimieren. Bis zur Aufnahme bei 4 °C lichtgeschützt lagern.
20. Aufnahme mit einem Mikroskop (Abbildung 3 und Abbildung 4).
    HINWEIS: Donkey Serum wird als Blockierungspuffer als speziesspezifischer Block gegen die mit Esel aufgezogenen Sekundärantikörper verwendet, die in diesem Protokoll verwendet werden. Das Maus-auf-Maus-Blockierungsreagenz wird gegen den Anti-SMA-Primärantikörper verwendet, der in der Maus aufgebracht wird.

Ergebnisse

Das Schema dieses Protokolls zur Isolierung und Kultivierung von Skelettmuskel- und Herz-FAPs ist in Abbildung 1 zusammengefasst. Bei der Gewebeentnahme ist die Verfärbung der Leber von dunkelrot zu blassgelb in der Regel ein Hinweis auf eine erfolgreiche Durchblutung. In den angegebenen Altersgruppen der Stachelmaus liegt das Herzgewicht typischerweise bei etwa 200 mg, während der Quadrizepsmuskel bei etwa 350 mg liegt.

Bei jeder Änderung des Verdauungspuffers in den Schritten 3.5-3.7 erscheint der Verdauungspuffer in den Verdauungsröhrchen undurchsichtig, wenn Zellen aus dem Gewebe freigesetzt werden. Am Ende der Faulung muss die Lösung eine relativ homogene Aufschlämmung sein, in der einige Gewebestücke übrig bleiben. Achten Sie darauf, den Verdau zu beenden, bevor alle Gewebe vollständig verdaut sind, um eine Überverdauung zu vermeiden, die sich negativ auf die Lebensfähigkeit der Zellen und die Kulturergebnisse auswirkt.

Die erwarteten Flussdiagramme für FACS sind in Abbildung 2 dargestellt. Es wird erwartet, dass FAPs etwa 2 % der lebenden und LIN-Zellen ausmachen. Der Prozentsatz der PI+-Ereignisse ist ein Indikator für die Qualität der Probenvorbereitung und sollte unter 10 % liegen. In dieser Studie werden typischerweise 150k FAPs pro Herz (nur Ventrikel) und 100k FAPs von zwei Quadrizepsmuskeln erhalten.

Einmal in der Platte, heften sich die Zellen in der Regel innerhalb von 72 Stunden an, erreichen innerhalb von 5 Tagen eine Konfluenz von 80 % und zeigen eine typische Fibroblastenmorphologie mit Projektionen (Abbildung 5).

Abbildung 1: Schematische Darstellung des Protokolls und des ungefähren Zeitaufwands für jeden Schritt. Gewebeentnahme: 10 min pro Maus. Verdauung des Gewebes: 1,5-2 h. Zellfärbung: 45 min-75 min. Fluoreszenzaktivierte Zellsortierung: 2 h. Expansion der fibro-adipogenen Vorläuferzellen (FAP): 4 Tage. FAP-Differenzierung: 48 h für die fibrogene Differenzierung, 6 Tage für die adipogene Differenzierung für Skelettmuskel-FAPs und 14 Tage für kardiale FAPs. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Repräsentative FACS-Diagramme für die FAP-Isolierung der Skelettmuskulatur (oben) und des Herzens (unten). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: FAP-Differenzierung des Skelettmuskels der Stachelmaus. (A) Kontrolle der fibrogenen Differenzierung. (B) Fibrogene Differenzierung. (C) Kontrolle der adipogenen Differenzierung. (D) Adipogene Differenzierung. Perilipin (grün), SMA (magenta), DAPI (blau), Maßstabsbalken = 100 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4: Kardiale FAP-Differenzierung der Stachelmaus. (A) Kontrolle der fibrogenen Differenzierung. (B) Fibrogene Differenzierung. (C) Kontrolle der adipogenen Differenzierung. (D) Adipogene Differenzierung. Perilipin (grün), SMA (magenta), DAPI (blau), Maßstabsbalken = 100 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 5: Hellfeldbilder von FAPs des Skelettmuskels (A) und des Herzens (B) der Stachelmaus nach 5 Tagen Kultur, vor der Differenzierung. Maßstabsleiste = 360 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Steuerung	CD31 SC	PDGFRα SC	CD31 FMO	PDGFRα FMO	Probe
CD31-Antikörper	+	-	-	+	+
PDGFRα-Antikörper	-	+	+	-	+

Tabelle 1: Schematische Anleitung zum Einrichten von Antikörper-Färbecocktails für Kontrollen und Proben. SC = einfarbige Kontrolle, FMO = Fluoreszenz minus eine Kontrolle, + = mit dem entsprechenden Antikörper, - = ohne den entsprechenden Antikörper.

Diskussion

Stachelmausgewebe reagiert empfindlicher auf die Spannungen bei der Dissoziation des Gewebes, und es gibt mehrere Aspekte dieses Protokolls, die darauf abzielen, Stress zu minimieren, um die Lebensfähigkeit der Zellen zu verbessern. Für die Probenvorbereitung wird die serielle enzymatische Dissoziationstechnik eingesetzt, um die Konzentration des erforderlichen Enzyms zu senken. Mit fortschreitender enzymatischer Verdauung nimmt die enzymatische Aktivität ab. Durch den Ersatz durch frische Enzyme kann eine gleichmäßige enzymatische Aktivität über den gesamten Aufschluss hinweg besser erreicht und hohe Konzentrationen des Enzyms vermieden werden. Darüber hinaus wird ein Wechsel des Verdauungspuffers vermieden, um die bereits freigesetzten Zellen in der Lösung zu überverdauen. Zweitens wird ACK-Lysepuffer verwendet, um rote Blutkörperchen zu entfernen. Obwohl das Herz ausgeblutet und durchblutet ist, enthält es immer noch rote Blutkörperchen, da es ein stark vaskularisiertes Organ ist. Durch die Entfernung kontaminierender roter Blutkörperchen wird die für FACS erforderliche Zeit minimiert, um einen Zellabbau zu vermeiden. Schließlich ist es wichtig, schnell und gewissenhaft von Schritt 2.1 bis Schritt 6.4 zu arbeiten und die Best Practices für die Arbeit mit Zellen zu befolgen, wie z. B. sanftes Pipettieren und so viel wie möglich auf Eis zu halten. Einige Details sind selbst im audiovisuellen Format schwer darzustellen und erfordern möglicherweise ein gewisses Maß an Erfahrung.

In der Zellkultur ist die anfängliche Aussaatdichte entscheidend für eine optimale Zellexpansion. FAPs in der Schale kommunizieren auf parakrine Weise und stimulieren das Wachstum über sezernierte Wachstumsfaktoren. Unter Bedingungen mit niedriger Aussaatdichte erhalten die Zellen keine ausreichenden Signale für das Wachstum und expandieren entweder nicht oder benötigen zusätzliche Kultivierungszeit, um geeignete Konfluenzniveaus für nachgelagerte Anwendungen zu erreichen. Dies ist auch die Begründung dafür, dass bei jedem Medienwechsel in der adipogenen Differenzierung nur die Hälfte des Mediums verändert wird. Es ist wichtig, einige konditionierte Medien zu belassen, die die Wachstumsfaktoren aus Präadipozyten enthalten, die für ihre Differenzierung entscheidend sind.

Während der Immunfärbung ist es wichtig, beim Hinzufügen oder Entfernen von Puffern vorsichtig vorzugehen, um die Zellablösung zu minimieren. Insbesondere in Schritt 9.1 sind die Zellen am anfälligsten dafür, sich vor der Fixierung abzulösen. Eine manuelle Aspiration, z. B. mit einer Pipette oder einer Nadel und Spritze, wird empfohlen, aber die Verwendung von leistungsstarken Vakuumsaugern wird nicht empfohlen.

Eine Einschränkung dieses Protokolls besteht darin, dass PDGFRα ein allgemeiner Marker für die FAPs ist und mehr Marker erforderlich sind, um die einzigartigen Subtypen der FAPs zu unterscheiden¹⁷. Subtypen wie DPP4+-Vorläufer wie FAPs und CD10+ adipogene FAPs wurden sowohl im Krankheitskontext als auch im homöostatischen Kontext in Betracht gezogen 18,19,20. FAP-Untergruppen gibt es wahrscheinlich auch bei Stachelmäusen. Sie können in unterschiedlichen Anteilen existieren, ein anderes zelluläres Verhalten aufweisen oder andere physiologische Funktionen haben als die entsprechenden Mus musculus FAP-Untergruppen. Eine weitere Optimierung der FAP-Subtyp-spezifischen Marker in der Stachelmaus ist erforderlich, um die Details der FAPs der Stachelmaus zu untersuchen.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass dieses Protokoll eine robuste und reproduzierbare Methode zur Isolierung, Kultivierung und Differenzierung von Skelettmuskel- und Herz-FAPs von Stachelmäusen beschreibt. Die Stachelmaus gewinnt als neues hyperregeneratives Tiermodell an Fahrt. FAPs und das Stroma sind in hohem Maße an der Aufrechterhaltung der Muskel- und Herzhomöostase beteiligt und tragen bei mehreren chronischen Krankheitsmodellen zu Organfunktionsstörungen bei ^5,7. Die Charakterisierung von FAPs für stachelige Mäuse könnte den Mechanismus hinter ihrer bemerkenswerten Regenerationsfähigkeit aufklären und den Weg für neue Strategien in der regenerativen Medizin ebnen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
0,5 M EDTA	Invitrogen	15575 038
1,7 mL Mikrozentrifugenröhrchen	VWR	87003-294
15  mL Zentrifugenröhrchen	Falcon	352096
1x Dulbecco' s Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (DPBS)	Gibco	14190-144
20 mL Spritze	BD	309661
4′,6-diamidino-2-phenylindol (DAPI)	Invitrogen	D3571
40  μ m Zellsieb	Falcon	352340
48 Well Gewebekulturplatte mit flachem Boden	Falcon	53078
5 mL Polypropylen	Falcon	352063
5 mL Polystyrol-Rundbodenröhrchen mit Zellsiebkappe	Falcon	352235
5 mL Spritze	BD	309646
50  mL Zentrifugenröhrchen	Falcon	352070
60 mm Petrischale	Falcon	353002
96 Well V-Boden Gewebekulturplatte	Corning	3894
Acomys dimidiatus Mäuse (stachelige Mäuse)			freundlicherweise geschenkt von Dr. Ashley W. Seifert (University of Kentucky).
Ammoniumchlorid-Kalium (ACK) Lysingpuffer	Gibco	A10492-01
Anti-Perilpin (1:100)	Sigma	P1873
Anti-SMA (1:100)	Invitrogen	14-9760-82
APC PDGFRa (1:800)	Abcam	ab270085
BD PrecisionGlide Nadel 18 G	BD	305195
BD PrecisionGlide Nadel 23 G	BD	305145
Rinderserumalbumin	Sigma	A7906-100g
BV605 CD31 (1:500)	BD biosciences	744359
CaCl2	Sigma-Aldrich	C4901
Zentrifuge	Eppendorf	5810R
DMEM/F12	Gibco	11320033
Esel Anti-Maus Alexa 555 (1:1000)	Invitrogen	A31570
Esel Anti-Kaninchen Alexa 647 (1:1000)	Invitrogen	A31573
Eselserum	Sigma	S30-100ML
FACS Sortierer - MoFlo Astrios 5 Laser	Beckman Schar	B52102
Fötales Rinderserum	Gemini	100-500
Feine Schere	FST	14058-11
Fluoromount-G	SouthernBiotech	0100-01
Pinzette	FST	11051-10
Hämostat	FST	91308-12
Humanes FGF-basisches rekombinantes Protein (bFGF)	Gibco	13256029
humanes TGF beta 1 rekombinantes Protein (TGFb1)	eBiosciences	14-8348-62
Inkubator - Heracell 160i CO2	ThermoFisher	51033557
Inverses Mikroskop - Revolve	ECHO	n/a
Liberase	Roche	5401127001
Maus MesenCult Adipogene Differenzierung 10x Ergänzung	STEMCELL technologies	5507
Maus auf Maus (MOM) blockierendes Reagenz	Vector Laboratories	MKB-2213
Paraformaldehyd	Sigma	P1648-500g
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140 122
PicoLab Mouse Diet 20	LabDiet	3005750-220
Propidiumiodid (PI)	Invitrogen	P3566
Transportfläschchen 5mL Röhrchen	Caplugs Evergreen	222-3005-080
Triton X-100	Sigma	9036-19-5