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Methodenartikel

Ein effizienter Transgenese-Ansatz für die Genübertragung im embryonalen Herzen der Maus

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DOI:

10.3791/66754

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24. Mai 2024

 ,  ,  , 
1Tissue and Organ Homeostasis Program, Severo Ochoa Center for Molecular Biology (CBMSO), 2Cardiovascular Regeneration Program, National Cardiovascular Research Center (CNIC), 3Centro de Investigación Biomédica en Red de Enfermedades Cardiovasculares (CIBERCV), 4Department of Experimental Biology, Faculty of Experimental Sciences, University of Jaén

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Protokoll stellt einen detaillierten methodischen Rahmen für die Elektroporations-basierte Transgenese von Herzzellen in sich entwickelnden Mausherzen dar. Die hier bereitgestellten Video-Assets erleichtern das Erlernen dieser vielseitigen Technik.

Zusammenfassung

Das Säugetierherz ist ein komplexes Organ, das während der Entwicklung über sehr unterschiedliche Populationen von Vorläuferzellen gebildet wird. Die Herkunft, der Zeitpunkt der Rekrutierung und das Schicksal dieser Vorläuferzellen sind entscheidend für die richtige Entwicklung dieses Organs. Die molekularen Mechanismen, die die Morphogenese des Herzens steuern, sind essentiell für das Verständnis der Pathogenese angeborener Herzfehler und der embryonalen Herzregeneration. Klassische Ansätze zur Untersuchung dieser Mechanismen nutzten die Erzeugung transgener Mäuse, um die Funktion bestimmter Gene während der kardialen Entwicklung zu beurteilen. Die Transgenese der Maus ist jedoch ein komplexer, zeitaufwändiger Prozess, der oft nicht durchgeführt werden kann, um die Rolle bestimmter Gene während der Herzentwicklung zu beurteilen. Um dies zu beheben, haben wir ein Protokoll für die effiziente Elektroporation und Kultur von embryonalen Herzen von Mäusen entwickelt, das eine transiente Transgenese ermöglicht, um die Auswirkungen des Funktionsgewinns oder -verlusts von Genen, die an der kardialen Entwicklung beteiligt sind, schnell zu beurteilen. Mit dieser Methode haben wir erfolgreich Meis1 im embryonalen Herzen überexprimiert, mit einer Präferenz für die Epikardzelltransfektion, was die Fähigkeiten der Technik demonstriert.

Einleitung

Das Herz ist das erste Organ, das während der Embryonalentwicklung gebildet wird. Dieser Prozess beinhaltet die räumlich-zeitliche Koordination verschiedener Populationen von Vorläuferzellen aus unterschiedlichen Bereichen des Embryos. All dies geschieht, während das sich entwickelnde Herz weiter schlägt und funktioniert, was die bemerkenswerte Koordination unterstreicht, die für seine Bildung erforderlich ist 1,2,3. Angesichts der entscheidenden Rolle des Herzens ist eine strenge Regulierung auf zellulärer und molekularer Ebene für seine ordnungsgemäße Bildung unerlässlich 4,5. Die Identifizierung der Mechanismen, die die Herzentwicklung steuern, war von großem Interesse, da sie für die Entschlüsselung angeborener Herzfehler von entscheidender Bedeutung sind, von denen eine beträchtliche Anzahl von Patienten weltweit betroffen ist6. Darüber hinaus ist das Verständnis der Herzentwicklung entscheidend für die Entschlüsselung der kardialen Regeneration, da postnatale Säugetierherzen eine Regenerationsfähigkeit behalten, die im Erwachsenenalter verloren geht oder behindert wird 7,8. Daher ist die Entschlüsselung molekularer Regulatoren der Herzentwicklung unerlässlich, um die Forschung zu angeborenen Herzfehlern und Herzregeneration voranzutreiben.

Um dieses Ziel zu erreichen, wurde die Rolle des Epikards bei der kardialen Entwicklung und Regeneration zunehmend in den Fokus gerückt9. Das Epikard ist eine dünne Schicht aus mesothelialem Gewebe, die die äußerste Schicht des Säugetierherzens bildet (Abbildung 1). Jüngste Studien haben die Bedeutung des Epikards bei Herzverletzungen gezeigt und gezeigt, dass dieses Gewebe in der Lage ist, Proliferationssignale an Kardiomyozyten im betroffenen Bereich zu senden, um den Schaden zu mildern10,11. Trotz der Bedeutung des Epikards wurde die Durchführung weiterer molekularer Untersuchungen durch seine immense Heterogenität erschwert. Einzelzell-RNAseq-Experimente haben die Heterogenität des Epikards gezeigt, das mehrere Zellsubpopulationen mit unterschiedlichen transkriptomischen Signaturen beherbergt 12,13,14,15,16. Daher sollte eine Strategie zum Screening potenzieller Regulatoren der kardialen Entwicklung die Vielfalt der epikardialen Vorläuferzellen berücksichtigen.

In diesem Sinne hat die Zugänglichkeit des Mausmodells für genetische Veränderungen die Identifizierung zahlreicher Gene erleichtert, die für die Herzentwicklung entscheidend sind, und die Erzeugung von Mutantenlinien mit Funktionsgewinn (GOF) oder Funktionsverlust (LOF) spezifischer Gene ermöglicht. Diese Ansätze erfordern jedoch einen erheblichen Aufwand an Zeit und experimentellen Ressourcen; Daher sind sie unpraktisch, wenn es darum geht, die Rolle einer großen Anzahl von Kandidatengenen zu beurteilen. Darüber hinaus üben Entwicklungsgene oft pleiotrope Funktionen in verschiedenen Geweben aus oder werden für die frühe Embryonalentwicklung benötigt, was die Interpretation ihres Beitrags zur Entwicklung in einem bestimmten Prozess erschwert. Es ist zwar möglich, die Genfunktion zu bestimmten Strukturen oder Zeitpunkten der Entwicklung zu steuern, aber dies erfordert in der Regel die Verwendung komplexerer genetischer Konstruktionen, die schwer zu generieren oder im Allgemeinen nicht verfügbar sind.

Um diese Einschränkungen zu überwinden, stellen wir eine Methode zur Elektroporation embryonaler Mausherzen für die transiente Transgenese vor (Abbildung 2). In Kombination mit ex vivo-Kultur und fluoreszenzaktivierter Zellsortierung (FACS) demonstriert diese Strategie ihre Fähigkeiten durch die transiente GOF von Meis1, einem gut charakterisierten Gen, das an der Herzentwicklung und -regeneration beteiligt ist 17,18,19. In diesem Artikel werden auch andere potenzielle Anwendungen dieser Methodik untersucht, ihre Vorteile und Grenzen diskutiert sowie mit bestehenden Protokollen zur transienten Modulation der Genexpression verglichen. Wir glauben, dass der Rahmen und die vorgestellten visuellen Beispiele das Verständnis der Epikardbiologie während der Entwicklung und Krankheit verbessern werden.

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Abbildung 1: Embryonale Herzschichten der Maus. Schematische Darstellung einer koronalen Ansicht eines embryonalen Herzens einer E13-14-Maus. Die drei Hauptzellschichten des Herzens werden in Gelb (Endokard), Rot (Myokard) und Blau (Epikard) dargestellt. Das Perikard ist in einer braunen Linie dargestellt. Die vier Kammern des Herzens werden als LV, linker Ventrikel, abgekürzt; RV, rechter Ventrikel; LA, linkes Atrium; RA, rechter Vorhof. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 2: Schematische Übersicht des Herzelektroporationsprotokolls. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Protokoll

Alle Tierversuche wurden von der CNIC-Ethikkommission für Tierversuche genehmigt und entsprechen den geltenden Rechtsvorschriften, einschließlich der EU-Richtlinie 2010/63EU und der Empfehlung 2007/526/EG, wie sie nach spanischem Recht unter dem Real Decreto 53/2013 durchgesetzt sind. Für dieses Protokoll wurden weibliche Wildtyp-CD-1-Mäuse im Alter von 15-21 Wochen verwendet. Einzelheiten zu den verwendeten Tieren, Reagenzien und Geräten sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Plasmid- und Werkzeugvorbereitung

  1. Bereiten Sie zunächst die Elektroporationsmischung vor, indem Sie die gewünschte Plasmid-DNA in Eis in einer Endkonzentration von 1 μg/μl hinzufügen. Vervollständigen Sie dann die Mischung, indem Sie Saccharose in einer Endkonzentration von 6 % (gelöst in PBS), einen biokompatiblen Farbstoff in Höhe von 0,01 % und vervollständigen Sie sie mit PBS bis zu einem Endvolumen von 30 μl.
    HINWEIS: Pro Probe werden ca. 1-2 μl der Elektroporationsmischung verwendet. Skalieren Sie die Anteile der Elektroporationsmischung entsprechend der Anzahl der Proben im Versuch. Bitte denken Sie daran, dass die DNA für die Elektroporation aus der Bakterienkultur gereinigt werden sollte, um eine optimale Stabilität und minimale Verunreinigungen zu gewährleisten. Weitere Einzelheiten zu den für diese Studie verwendeten Plasmiden finden Sie im Abschnitt Repräsentative Ergebnisse.
  2. Bereiten Sie das Wachstumsmedium vor, indem Sie das modifizierte Eagle-Medium (DMEM) von Dulbecco mit 10 % fötalem Rinderserum (FBS), 2 % Hepespuffer und 1 % Penicillin/Streptomycin ergänzen. Bewahren Sie das Medium bis zur Verwendung in einem Inkubator bei 37 °C auf. Zusätzlich 1x PBS bei 37 °C erwärmen, zusammen mit dem Wachstumsmedium.
  3. Bereiten Sie die Nadeln vor, indem Sie eine Glaskapillare mit einem Durchmesser von 20 μm mit einem Pipettenabzieher unter folgenden Bedingungen dehnen: Hitze = 550; Zug = 100; Geschwindigkeit = 250; Zeit = 120. Der Enddurchmesser nach dem Ziehen sollte ca. zwischen 5-8 μm liegen.
  4. Stellen Sie die Elektroporatorparameter auf fünf 50-ms-Zyklen bei 40 V mit Intervallen von 900 ms ein. Bereiten Sie die Elektroden, die Mundpipette und die stumpfe Nadel vor (Abbildung 3A). Rüsten Sie die Pipette mit der Nadel aus, um die DNA zu laden (Abbildung 3A).

2. Embryonensektion und Herzentnahme

  1. Richten Sie eine Kreuzung zwischen Wildtyp-CD-1-Mäusen ein. Am nächsten Morgen wählen Sie die Weibchen aus, die einen Vaginalpfropfen aufweisen, und notieren Sie diese Zeit als embryonalen Tag E0.5. Die Tiere am Embryonaltag E12-12,5 durch Zervixluxation einschläfern (nach institutionell anerkannten Protokollen).
  2. Entnehmen Sie vorsichtig die Gebärmutter aus der Maus und legen Sie sie in ein trockenes Papiertuch. Schneiden Sie anschließend die Gebärmutter mit einer feinen Schere ein, indem Sie die Spitze der Schere in die mesometrische Seite einführen und die Schneide der Klinge langsam über die gesamte Länge führen. Legen Sie die Deziduen frei und übertragen Sie sie auf das Wachstumsmedium. Für weitere Details siehe die Arbeit von Behringer et al.20.
  3. Präparieren Sie die Deziven, um die Embryonen zu extrahieren, und legen Sie die Embryonen dann in eine 60-mm-Petrischale mit warmem Wachstumsmedium. Schneiden Sie mit einer feinen Pinzette vorsichtig den Schwanz und den Kopf des Embryos ab, so dass nur der Rumpf des Körpers übrig bleibt. Das Stadium der Embryonen kann durch die Beurteilung anatomischer Merkmale überprüft werden, wie von Wong et al.21 beschrieben.
  4. Entfernen Sie dann mit Vorsicht so viel Gewebe wie möglich aus dem Rumpf des Embryos, ohne das Herz oder die Lungen- und Aortaarterien zu schädigen. Sobald das Herz freigelegt wurde, legen Sie es sofort in ein neues, warmes Wachstumsmedium und bewahren Sie es in einem Inkubator bei 37 °C bis zur Elektroporation auf.
    HINWEIS: Die Aufrechterhaltung der Herztemperatur ist entscheidend für sein Überleben. Stellen Sie sicher, dass das Medium immer warm ist und wechseln Sie es alle 5-10 Minuten. Andererseits können Proben ohne Aufrechterhaltung der Sterilität gehandhabt werden, da dies die Effizienz des Verfahrens nicht beeinträchtigt. Bitte beachten Sie, dass das Nährmedium Antibiotika enthält.

3. Elektroporation des Herzens und Ex-vivo-Kultur

  1. Es werden ca. 10 μl Plasmidmischung (hergestellt in Schritt 1.1) in die Nadel geladen, indem mit der Mundpipette vorsichtig nach oben gesaugt wird.
  2. Bereiten Sie ein einzelnes Herz für die Elektroporation vor, indem Sie es in eine saubere 60 mm Petrischale mit sterilem 1x PBS legen, das auf 37 °C erwärmt wurde. Stellen Sie die Schale unter das Präpariermikroskop (Abbildung 3A).
  3. Bereiten Sie die Elektroden vor, indem Sie den Abstand zwischen dem Plus- und Minuspol auf ca. 4 mm einstellen (Abbildung 3B).
    HINWEIS: 4 mm ist der Öffnungsabstand, in den E12,5-Mausherzen in die in dieser Arbeit verwendeten Elektroden passen. Bitte erwägen Sie, diesen Abstand basierend auf unterschiedlichen Probengrößen oder Elektrodenspezifikationen zu ändern.
  4. Stechen Sie vorsichtig mit der Nadel in der Mundpipette in die oberflächlichste Schicht des Herzens. Pipettieren Sie vorsichtig 1-2 μl des Plasmidmixes und entfernen Sie die Nadel. Es können mehrere Injektionen durchgeführt werden, um eine optimale Penetration zu gewährleisten und die Anzahl der elektroporierten Zellen zu erhöhen.
  5. Halten Sie die Elektroden so fest, dass sich das Herz zwischen beiden Polen befindet (Abbildung 3C). Elektroporate dann das Herz unter den oben genannten Bedingungen.
    HINWEIS: Um einen maximalen Wirkungsgrad der Elektroporation zu gewährleisten, ist es möglich, die Polarität der Elektroden umzuschalten und einen weiteren Impuls abzugeben.
  6. Übertragen Sie das elektroporierte Herz in eine neue 12-Well-Platte mit 1 ml Wachstumsmedium und stellen Sie es auf 37 °C, 5 % CO2.
  7. Die Schritte 3.1 bis 3.6 werden so lange wiederholt, bis alle Proben des Versuchs elektroporiert sind. Zum Schluss werden alle Herzen in einem Inkubator bei 37 °C und 5 % CO2 24  Stunden lang oder bis zur Analyse inkubiert.
    HINWEIS: In unseren Händen konnten Herzen bis zu 48 Stunden in Kultur belassen werden, ohne dass es zu offensichtlichen Anzeichen einer Verschlechterung kam (Ergänzungsfilm 1; Ergänzender Film 2; Ergänzende Abbildung 1).

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Abbildung 3: Aufbau der Elektroporation. (A) Aufbau für die Elektroporation. Rote Pfeile zeigen den Elektroporator, die Elektroden und die Petrischale an, in der die Herzen elektroporiert werden. (A') Nahaufnahme der Elektroporationsnadel, wie in (A) durch das weiße Rechteck hervorgehoben. (B) Detaillierte Angaben zum eingestellten Abstand der Elektroden, die in E12.5-Herzen verwendet werden. (C) Schematische Darstellung der Elektroporation. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

4. Zellsortierung und immunhistochemische Analyse

  1. Für die Zellsortieranalyse der Proben wird ein Verdauungsmedium zur Dissoziation des Gewebes hergestellt, indem 400 μl Liberase (5 mg/ml), 300 μl Dispase (0,1 g/ml), 4 μl CaCl2 (0,4 μM), 50 μl MgCl2 (5 μM) gemischt und bis 10 ml DMEM vervollständigt werden. Bis zur Verwendung auf Eis aufbewahren. Jedes Herz benötigt ca. 1 ml Verdauungsmedium. Passen Sie die Lautstärke entsprechend der Anzahl der Proben an.
    HINWEIS: Für die Immunhistochemie fixieren Sie die Herzen direkt in 1,5 ml 4% PFA für 2 h bei RT oder über Nacht bei 4 °C. Waschen Sie die Herzen am nächsten Tag 3x mit PBS und fahren Sie mit nachgeschalteten histologischen und immunfärblichen Verfahren fort. Für ein detailliertes immunhistochemisches Protokoll siehe Morris et al.22.
  2. Übertragen Sie jedes Herz in Kultur in ein neues Röhrchen mit 1 ml eiskaltem Aufschlussmedium.
  3. Um die Dissoziation zu erleichtern, hacken Sie das Gewebe durch sanftes Auftragen von Pleasure mit einer Spritze 3-4 Mal und inkubieren Sie es sofort in einer heißen Platte bei 37 °C, 600 U/min für 45 Minuten.
  4. Filtrieren Sie das Aufschlussgemisch durch ein 70 μm Zellsieb in ein neues Röhrchen und lassen Sie es durch Schwerkraft entleeren. Retten Sie dann das Durchlaufvolumen und filtern Sie es erneut mit einem 40-μm-Zellsieb in ein neues 50-ml-Röhrchen.
  5. Fügen Sie 500 μl fötales Rinderserum (FBS) hinzu und vervollständigen Sie die Gabe mit kaltem DMEM auf bis zu 30 ml.
  6. Zentrifugieren Sie die Mischung bei 240 x g für 10 min bei Raumtemperatur.
  7. Entsorgen Sie den Überstand und legen Sie das 50-ml-Röhrchen kopfüber auf ein Papiertuch, um es vollständig zu trocknen.
    HINWEIS: Dies ist ein praktischer Punkt, um das Experiment durch Einfrieren des Zellpellets zu unterbrechen. Wenn ja, resuspendieren Sie die Zellen mit 10% DMSO in FBS und lagern Sie sie bei -80 °C.
  8. Für die Zellsortierung resuspendieren Sie die Zellen in 300 μl Sortierpuffer (1 % FBS, 1 % Penicillin/Streptomycin in PBS) und fügen Sie 0,3 μl DAPI (1000x) hinzu. Führen Sie eine Zellsortierung durch.

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Ergebnisse

Um die Wirksamkeit dieser Technik bei der Durchführung von Gain-of-Function (GOF)-Experimenten für relevante Herzentwicklungsregulatoren zu demonstrieren, wurde ein Konstrukt elektroporiert, das den Transkriptionsfaktor Meis1 überexprimiert. Um dies zu erreichen, wurde RNA aus E9,5-Embryonen extrahiert und eine reverse Transkription durchgeführt, um komplementäre DNA (cDNA) zu erhalten. Unter Verwendung der cDNA als Template wurde die Meis1-kodierende Sequenz in ein pCAG-Expressionsplasm...

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Diskussion

Insgesamt bietet die hier beschriebene Methodik einen robusten Rahmen für die Expression transgener Konstrukte im sich entwickelnden Epikard (Abbildung 4B), wie die Überexpression von Meis1 zeigt (Abbildung 4C). Mit den entsprechenden Konstrukten kann dieses Protokoll verwendet werden, um die Auswirkungen eines bestimmten Gens auf den Funktionsgewinn (GOF) oder den Funktionsverlust (LOF) vorübergehend zu bewerten. LOF kann in die Technik implementiert werden, in...

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Offenlegungen

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Danksagungen

Diese Studie wurde unterstützt durch das Stipendium RTI2018-097617-J-I00 des spanischen Ministerio de Ciencia e Innovación und Acción 9 der Universidad de Jaén an das O.H.O. Stipendium PGC2018-096486-B-I00 des spanischen Ministerio de Ciencia e Innovación und das Stipendium H2020-MSCA-ITN-2016-722427 aus dem EU Horizon 2020-Programm an M.T. JMG wurde durch ein PhD-Stipendium des spanischen Wissenschaftsministeriums und der Fundación Severo Ochoa (PRE2022-101884) unterstützt. Sowohl das CNIC als auch das CBMSO werden vom spanischen Wissenschaftsministerium unterstützt, und das CNIC wird von der ProCNIC-Stiftung unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
#55 PinzetteDumont 11295-51
12-Well-Multiwell-Zellkulturplatte mit klarem FlachbodenBD Falcon353043
35-mm-SchraubstocktischGrandadoSKU 8798771617573
40 & micro; m ZellsiebFischer Scientific08-771-1
50 mL RöhrchenBD Falcon352070
70 µ m ZellsiebCorningCLS431751
Anti-GFP Policlonal AntikörperInvitrogenA102621:1000 Verdünnung verwendet
Anti-Myosin 4 (MF20) Monoklonaler AntikörperInvitrogen14-6503-821:500 Verdünnung verwendet
CD1 Wildtyp-MäuseBereitgestellt von Animalary Unit (CNIC)
Gespaltene Caspase-3 (Asp175) AntikörperZellsignalisierung Technologien96611:400 Verdünnung verwendet
DAPICell Signalling Technologies40831:1000 Verdünnung verwendet
Dispase/KollagenaseRoche10269638001
Destilliertes Wasser
DMEM - Dulbecco's Modified Eagle MediumGibco10313021
fötales RinderserumInvitrogen10438-026
Heracell 150i CO2-InkubatorThermo Scientific51032720
Leica Stereomikroskop S8AP0Leica11524102
LiberaseRoche5401119001
Mikropipettenabzieher Modell P-97Sutter InstrumentSU-P-97
pCAG-ExpressionsplasmidAddgene#89689
Penicillin-StreptomycinInvitrogen15070-063
Petrischalen 35 & 10 mmBD Falcon351008
Petrischalen 60&15 mmBD Falcon353002
PhenolrotMerckP3532
PipettenspitzenAus alten Laborgeräten
wiederverwendetRatte Serumkultur Embryo, männliche Ratten SPRAGUE DAWLEY RjHan SDJanvier Labs9979
Rekombinantes Anti-Wilms Tumorprotein 1 (WT1) AntikörperAbcamab899011:300 Verdünnung verwendet
Rechteck-Elektroporator CUY21SCNepa-GenCUY664-10X15
steriles PBSBereitgestellt und autoklaviert von der technischen Einheit
Saccharose Millipore84100
Pinzettenelektroden mit variabler LückeNepa GenCUY650P5

Referenzen

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