Ein effizienter Transgenese-Ansatz für die Genübertragung im embryonalen Herzen der Maus

Zusammenfassung

Dieses Protokoll stellt einen detaillierten methodischen Rahmen für die Elektroporations-basierte Transgenese von Herzzellen in sich entwickelnden Mausherzen dar. Die hier bereitgestellten Video-Assets erleichtern das Erlernen dieser vielseitigen Technik.

Zusammenfassung

Das Säugetierherz ist ein komplexes Organ, das während der Entwicklung über sehr unterschiedliche Populationen von Vorläuferzellen gebildet wird. Die Herkunft, der Zeitpunkt der Rekrutierung und das Schicksal dieser Vorläuferzellen sind entscheidend für die richtige Entwicklung dieses Organs. Die molekularen Mechanismen, die die Morphogenese des Herzens steuern, sind essentiell für das Verständnis der Pathogenese angeborener Herzfehler und der embryonalen Herzregeneration. Klassische Ansätze zur Untersuchung dieser Mechanismen nutzten die Erzeugung transgener Mäuse, um die Funktion bestimmter Gene während der kardialen Entwicklung zu beurteilen. Die Transgenese der Maus ist jedoch ein komplexer, zeitaufwändiger Prozess, der oft nicht durchgeführt werden kann, um die Rolle bestimmter Gene während der Herzentwicklung zu beurteilen. Um dies zu beheben, haben wir ein Protokoll für die effiziente Elektroporation und Kultur von embryonalen Herzen von Mäusen entwickelt, das eine transiente Transgenese ermöglicht, um die Auswirkungen des Funktionsgewinns oder -verlusts von Genen, die an der kardialen Entwicklung beteiligt sind, schnell zu beurteilen. Mit dieser Methode haben wir erfolgreich Meis1 im embryonalen Herzen überexprimiert, mit einer Präferenz für die Epikardzelltransfektion, was die Fähigkeiten der Technik demonstriert.

Einleitung

Das Herz ist das erste Organ, das während der Embryonalentwicklung gebildet wird. Dieser Prozess beinhaltet die räumlich-zeitliche Koordination verschiedener Populationen von Vorläuferzellen aus unterschiedlichen Bereichen des Embryos. All dies geschieht, während das sich entwickelnde Herz weiter schlägt und funktioniert, was die bemerkenswerte Koordination unterstreicht, die für seine Bildung erforderlich ist ^1,2,3. Angesichts der entscheidenden Rolle des Herzens ist eine strenge Regulierung auf zellulärer und molekularer Ebene für seine ordnungsgemäße Bildung unerlässlich ^4,5. Die Identifizierung der Mechanismen, die die Herzentwicklung steuern, war von großem Interesse, da sie für die Entschlüsselung angeborener Herzfehler von entscheidender Bedeutung sind, von denen eine beträchtliche Anzahl von Patienten weltweit betroffen ist⁶. Darüber hinaus ist das Verständnis der Herzentwicklung entscheidend für die Entschlüsselung der kardialen Regeneration, da postnatale Säugetierherzen eine Regenerationsfähigkeit behalten, die im Erwachsenenalter verloren geht oder behindert wird ^7,8. Daher ist die Entschlüsselung molekularer Regulatoren der Herzentwicklung unerlässlich, um die Forschung zu angeborenen Herzfehlern und Herzregeneration voranzutreiben.

Um dieses Ziel zu erreichen, wurde die Rolle des Epikards bei der kardialen Entwicklung und Regeneration zunehmend in den Fokus gerückt⁹. Das Epikard ist eine dünne Schicht aus mesothelialem Gewebe, die die äußerste Schicht des Säugetierherzens bildet (Abbildung 1). Jüngste Studien haben die Bedeutung des Epikards bei Herzverletzungen gezeigt und gezeigt, dass dieses Gewebe in der Lage ist, Proliferationssignale an Kardiomyozyten im betroffenen Bereich zu senden, um den Schaden zu mildern^10,11. Trotz der Bedeutung des Epikards wurde die Durchführung weiterer molekularer Untersuchungen durch seine immense Heterogenität erschwert. Einzelzell-RNAseq-Experimente haben die Heterogenität des Epikards gezeigt, das mehrere Zellsubpopulationen mit unterschiedlichen transkriptomischen Signaturen beherbergt 12,13,14,15,16. Daher sollte eine Strategie zum Screening potenzieller Regulatoren der kardialen Entwicklung die Vielfalt der epikardialen Vorläuferzellen berücksichtigen.

In diesem Sinne hat die Zugänglichkeit des Mausmodells für genetische Veränderungen die Identifizierung zahlreicher Gene erleichtert, die für die Herzentwicklung entscheidend sind, und die Erzeugung von Mutantenlinien mit Funktionsgewinn (GOF) oder Funktionsverlust (LOF) spezifischer Gene ermöglicht. Diese Ansätze erfordern jedoch einen erheblichen Aufwand an Zeit und experimentellen Ressourcen; Daher sind sie unpraktisch, wenn es darum geht, die Rolle einer großen Anzahl von Kandidatengenen zu beurteilen. Darüber hinaus üben Entwicklungsgene oft pleiotrope Funktionen in verschiedenen Geweben aus oder werden für die frühe Embryonalentwicklung benötigt, was die Interpretation ihres Beitrags zur Entwicklung in einem bestimmten Prozess erschwert. Es ist zwar möglich, die Genfunktion zu bestimmten Strukturen oder Zeitpunkten der Entwicklung zu steuern, aber dies erfordert in der Regel die Verwendung komplexerer genetischer Konstruktionen, die schwer zu generieren oder im Allgemeinen nicht verfügbar sind.

Um diese Einschränkungen zu überwinden, stellen wir eine Methode zur Elektroporation embryonaler Mausherzen für die transiente Transgenese vor (Abbildung 2). In Kombination mit ex vivo-Kultur und fluoreszenzaktivierter Zellsortierung (FACS) demonstriert diese Strategie ihre Fähigkeiten durch die transiente GOF von Meis1, einem gut charakterisierten Gen, das an der Herzentwicklung und -regeneration beteiligt ist 17,18,19. In diesem Artikel werden auch andere potenzielle Anwendungen dieser Methodik untersucht, ihre Vorteile und Grenzen diskutiert sowie mit bestehenden Protokollen zur transienten Modulation der Genexpression verglichen. Wir glauben, dass der Rahmen und die vorgestellten visuellen Beispiele das Verständnis der Epikardbiologie während der Entwicklung und Krankheit verbessern werden.

Abbildung 1: Embryonale Herzschichten der Maus. Schematische Darstellung einer koronalen Ansicht eines embryonalen Herzens einer E13-14-Maus. Die drei Hauptzellschichten des Herzens werden in Gelb (Endokard), Rot (Myokard) und Blau (Epikard) dargestellt. Das Perikard ist in einer braunen Linie dargestellt. Die vier Kammern des Herzens werden als LV, linker Ventrikel, abgekürzt; RV, rechter Ventrikel; LA, linkes Atrium; RA, rechter Vorhof. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Schematische Übersicht des Herzelektroporationsprotokolls. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Protokoll

Alle Tierversuche wurden von der CNIC-Ethikkommission für Tierversuche genehmigt und entsprechen den geltenden Rechtsvorschriften, einschließlich der EU-Richtlinie 2010/63EU und der Empfehlung 2007/526/EG, wie sie nach spanischem Recht unter dem Real Decreto 53/2013 durchgesetzt sind. Für dieses Protokoll wurden weibliche Wildtyp-CD-1-Mäuse im Alter von 15-21 Wochen verwendet. Einzelheiten zu den verwendeten Tieren, Reagenzien und Geräten sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Plasmid- und Werkzeugvorbereitung

1. Bereiten Sie zunächst die Elektroporationsmischung vor, indem Sie die gewünschte Plasmid-DNA in Eis in einer Endkonzentration von 1 μg/μl hinzufügen. Vervollständigen Sie dann die Mischung, indem Sie Saccharose in einer Endkonzentration von 6 % (gelöst in PBS), einen biokompatiblen Farbstoff in Höhe von 0,01 % und vervollständigen Sie sie mit PBS bis zu einem Endvolumen von 30 μl.
   HINWEIS: Pro Probe werden ca. 1-2 μl der Elektroporationsmischung verwendet. Skalieren Sie die Anteile der Elektroporationsmischung entsprechend der Anzahl der Proben im Versuch. Bitte denken Sie daran, dass die DNA für die Elektroporation aus der Bakterienkultur gereinigt werden sollte, um eine optimale Stabilität und minimale Verunreinigungen zu gewährleisten. Weitere Einzelheiten zu den für diese Studie verwendeten Plasmiden finden Sie im Abschnitt Repräsentative Ergebnisse.
2. Bereiten Sie das Wachstumsmedium vor, indem Sie das modifizierte Eagle-Medium (DMEM) von Dulbecco mit 10 % fötalem Rinderserum (FBS), 2 % Hepespuffer und 1 % Penicillin/Streptomycin ergänzen. Bewahren Sie das Medium bis zur Verwendung in einem Inkubator bei 37 °C auf. Zusätzlich 1x PBS bei 37 °C erwärmen, zusammen mit dem Wachstumsmedium.
3. Bereiten Sie die Nadeln vor, indem Sie eine Glaskapillare mit einem Durchmesser von 20 μm mit einem Pipettenabzieher unter folgenden Bedingungen dehnen: Hitze = 550; Zug = 100; Geschwindigkeit = 250; Zeit = 120. Der Enddurchmesser nach dem Ziehen sollte ca. zwischen 5-8 μm liegen.
4. Stellen Sie die Elektroporatorparameter auf fünf 50-ms-Zyklen bei 40 V mit Intervallen von 900 ms ein. Bereiten Sie die Elektroden, die Mundpipette und die stumpfe Nadel vor (Abbildung 3A). Rüsten Sie die Pipette mit der Nadel aus, um die DNA zu laden (Abbildung 3A).

2. Embryonensektion und Herzentnahme

1. Richten Sie eine Kreuzung zwischen Wildtyp-CD-1-Mäusen ein. Am nächsten Morgen wählen Sie die Weibchen aus, die einen Vaginalpfropfen aufweisen, und notieren Sie diese Zeit als embryonalen Tag E0.5. Die Tiere am Embryonaltag E12-12,5 durch Zervixluxation einschläfern (nach institutionell anerkannten Protokollen).
2. Entnehmen Sie vorsichtig die Gebärmutter aus der Maus und legen Sie sie in ein trockenes Papiertuch. Schneiden Sie anschließend die Gebärmutter mit einer feinen Schere ein, indem Sie die Spitze der Schere in die mesometrische Seite einführen und die Schneide der Klinge langsam über die gesamte Länge führen. Legen Sie die Deziduen frei und übertragen Sie sie auf das Wachstumsmedium. Für weitere Details siehe die Arbeit von Behringer et ^al.20.
3. Präparieren Sie die Deziven, um die Embryonen zu extrahieren, und legen Sie die Embryonen dann in eine 60-mm-Petrischale mit warmem Wachstumsmedium. Schneiden Sie mit einer feinen Pinzette vorsichtig den Schwanz und den Kopf des Embryos ab, so dass nur der Rumpf des Körpers übrig bleibt. Das Stadium der Embryonen kann durch die Beurteilung anatomischer Merkmale überprüft werden, wie von Wong et ^al.21 beschrieben.
4. Entfernen Sie dann mit Vorsicht so viel Gewebe wie möglich aus dem Rumpf des Embryos, ohne das Herz oder die Lungen- und Aortaarterien zu schädigen. Sobald das Herz freigelegt wurde, legen Sie es sofort in ein neues, warmes Wachstumsmedium und bewahren Sie es in einem Inkubator bei 37 °C bis zur Elektroporation auf.
   HINWEIS: Die Aufrechterhaltung der Herztemperatur ist entscheidend für sein Überleben. Stellen Sie sicher, dass das Medium immer warm ist und wechseln Sie es alle 5-10 Minuten. Andererseits können Proben ohne Aufrechterhaltung der Sterilität gehandhabt werden, da dies die Effizienz des Verfahrens nicht beeinträchtigt. Bitte beachten Sie, dass das Nährmedium Antibiotika enthält.

3. Elektroporation des Herzens und Ex-vivo-Kultur

1. Es werden ca. 10 μl Plasmidmischung (hergestellt in Schritt 1.1) in die Nadel geladen, indem mit der Mundpipette vorsichtig nach oben gesaugt wird.
2. Bereiten Sie ein einzelnes Herz für die Elektroporation vor, indem Sie es in eine saubere 60 mm Petrischale mit sterilem 1x PBS legen, das auf 37 °C erwärmt wurde. Stellen Sie die Schale unter das Präpariermikroskop (Abbildung 3A).
3. Bereiten Sie die Elektroden vor, indem Sie den Abstand zwischen dem Plus- und Minuspol auf ca. 4 mm einstellen (Abbildung 3B).
   HINWEIS: 4 mm ist der Öffnungsabstand, in den E12,5-Mausherzen in die in dieser Arbeit verwendeten Elektroden passen. Bitte erwägen Sie, diesen Abstand basierend auf unterschiedlichen Probengrößen oder Elektrodenspezifikationen zu ändern.
4. Stechen Sie vorsichtig mit der Nadel in der Mundpipette in die oberflächlichste Schicht des Herzens. Pipettieren Sie vorsichtig 1-2 μl des Plasmidmixes und entfernen Sie die Nadel. Es können mehrere Injektionen durchgeführt werden, um eine optimale Penetration zu gewährleisten und die Anzahl der elektroporierten Zellen zu erhöhen.
5. Halten Sie die Elektroden so fest, dass sich das Herz zwischen beiden Polen befindet (Abbildung 3C). Elektroporate dann das Herz unter den oben genannten Bedingungen.
   HINWEIS: Um einen maximalen Wirkungsgrad der Elektroporation zu gewährleisten, ist es möglich, die Polarität der Elektroden umzuschalten und einen weiteren Impuls abzugeben.
6. Übertragen Sie das elektroporierte Herz in eine neue 12-Well-Platte mit 1 ml Wachstumsmedium und stellen Sie es auf 37 °C, 5 % CO₂.
7. Die Schritte 3.1 bis 3.6 werden so lange wiederholt, bis alle Proben des Versuchs elektroporiert sind. Zum Schluss werden alle Herzen in einem Inkubator bei 37 °C und 5 % CO_{2 24}  Stunden lang oder bis zur Analyse inkubiert.
   HINWEIS: In unseren Händen konnten Herzen bis zu 48 Stunden in Kultur belassen werden, ohne dass es zu offensichtlichen Anzeichen einer Verschlechterung kam (Ergänzungsfilm 1; Ergänzender Film 2; Ergänzende Abbildung 1).

Abbildung 3: Aufbau der Elektroporation. (A) Aufbau für die Elektroporation. Rote Pfeile zeigen den Elektroporator, die Elektroden und die Petrischale an, in der die Herzen elektroporiert werden. (A') Nahaufnahme der Elektroporationsnadel, wie in (A) durch das weiße Rechteck hervorgehoben. (B) Detaillierte Angaben zum eingestellten Abstand der Elektroden, die in E12.5-Herzen verwendet werden. (C) Schematische Darstellung der Elektroporation. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

4. Zellsortierung und immunhistochemische Analyse

1. Für die Zellsortieranalyse der Proben wird ein Verdauungsmedium zur Dissoziation des Gewebes hergestellt, indem 400 μl Liberase (5 mg/ml), 300 μl Dispase (0,1 g/ml), 4 μl CaCl₂ (0,4 μM), 50 μl MgCl₂ (5 μM) gemischt und bis 10 ml DMEM vervollständigt werden. Bis zur Verwendung auf Eis aufbewahren. Jedes Herz benötigt ca. 1 ml Verdauungsmedium. Passen Sie die Lautstärke entsprechend der Anzahl der Proben an.
   HINWEIS: Für die Immunhistochemie fixieren Sie die Herzen direkt in 1,5 ml 4% PFA für 2 h bei RT oder über Nacht bei 4 °C. Waschen Sie die Herzen am nächsten Tag 3x mit PBS und fahren Sie mit nachgeschalteten histologischen und immunfärblichen Verfahren fort. Für ein detailliertes immunhistochemisches Protokoll siehe Morris et ^al.22.
2. Übertragen Sie jedes Herz in Kultur in ein neues Röhrchen mit 1 ml eiskaltem Aufschlussmedium.
3. Um die Dissoziation zu erleichtern, hacken Sie das Gewebe durch sanftes Auftragen von Pleasure mit einer Spritze 3-4 Mal und inkubieren Sie es sofort in einer heißen Platte bei 37 °C, 600 U/min für 45 Minuten.
4. Filtrieren Sie das Aufschlussgemisch durch ein 70 μm Zellsieb in ein neues Röhrchen und lassen Sie es durch Schwerkraft entleeren. Retten Sie dann das Durchlaufvolumen und filtern Sie es erneut mit einem 40-μm-Zellsieb in ein neues 50-ml-Röhrchen.
5. Fügen Sie 500 μl fötales Rinderserum (FBS) hinzu und vervollständigen Sie die Gabe mit kaltem DMEM auf bis zu 30 ml.
6. Zentrifugieren Sie die Mischung bei 240 x g für 10 min bei Raumtemperatur.
7. Entsorgen Sie den Überstand und legen Sie das 50-ml-Röhrchen kopfüber auf ein Papiertuch, um es vollständig zu trocknen.
   HINWEIS: Dies ist ein praktischer Punkt, um das Experiment durch Einfrieren des Zellpellets zu unterbrechen. Wenn ja, resuspendieren Sie die Zellen mit 10% DMSO in FBS und lagern Sie sie bei -80 °C.
8. Für die Zellsortierung resuspendieren Sie die Zellen in 300 μl Sortierpuffer (1 % FBS, 1 % Penicillin/Streptomycin in PBS) und fügen Sie 0,3 μl DAPI (1000x) hinzu. Führen Sie eine Zellsortierung durch.

Ergebnisse

Um die Wirksamkeit dieser Technik bei der Durchführung von Gain-of-Function (GOF)-Experimenten für relevante Herzentwicklungsregulatoren zu demonstrieren, wurde ein Konstrukt elektroporiert, das den Transkriptionsfaktor Meis1 überexprimiert. Um dies zu erreichen, wurde RNA aus E9,5-Embryonen extrahiert und eine reverse Transkription durchgeführt, um komplementäre DNA (cDNA) zu erhalten. Unter Verwendung der cDNA als Template wurde die Meis1-kodierende Sequenz in ein pCAG-Expressionsplasmid (im Folgenden als pCAG::Meis1 bezeichnet) kloniert, während ein konstitutives GFP-exprimierendes Plasmid (pCAG::GFP) als Kontrolle verwendet wurde. Die Herzen wurden dann entweder nur mit pCAG::GFP oder in Kombination mit pCAG::Meis1 elektroporiert.

Nach 24 Stunden nach der Elektroporation (hpe) schlugen die Herzen und schienen in gutem Zustand zu sein (Abbildung 4A; Ergänzender Film 1; Ergänzender Film 2). Um die Lebensfähigkeit der elektroporierten Zellen zu beurteilen, wurde die Apoptose durch immunhistochemische Färbung von Caspase 3 analysiert. Obwohl einige positive Zellen im Herzen nachgewiesen wurden, wurde festgestellt, dass weder das Myokard noch das Epikard, wo sich die meisten elektroporierten Zellen befinden, von der Apoptose betroffen sind (Ergänzende Abbildung 1C). Bei der Beurteilung der Fluoreszenzaktivität wurde in fast allen vier Herzkammern ein Mosaik-GFP-Signal beobachtet, was darauf hindeutet, dass dieses Protokoll in der Lage ist, die meisten Herzstrukturen zu erreichen (Abbildung 4A). Um zu bestimmen, welche kardialen Zelltypen elektroporiert wurden, wurden pCAG::GFP-elektroporierte Herzen gegen Marker des Epikards WT1² und des Myokards MF20²³ immungefärbt und dann mit einem konfokalen Mikroskop abgebildet (Abbildung 4B). Die meisten GFP+-Zellen befanden sich bevorzugt in der äußeren Region des Herzens, was weitgehend mit dem WT1-Signal übereinstimmte, was darauf hindeutet, dass diese Methode am effizientesten ist, um Epikardzellen zu erreichen (Abbildung 4B, weiße Pfeilspitzen).

Auf der anderen Seite wurden pCAG::Meis1-elektroporierte oder Kontrollherzen (nur pCAG::GFP) dissoziiert, und die Zellen wurden einer fluoreszenzaktivierten Zellsortierung (FACS) unterzogen, um GFP+-Zellen aus dem gesamten Organ zu isolieren, wie in Schritt 4 des Protokolls beschrieben. Aus den sortierten Zellen wurde RNA extrahiert und eine quantitative PCR der reversen Transkription (RT-qPCR) durchgeführt, um die Expressionsniveaus von Meis1 in den transfizierten Zellen zu beurteilen (Abbildung 4C, Ergänzende Tabelle 1). Die Gesamtexpression des Meis1-Gens wurde unter Verwendung der Expressionsniveaus des Maus-Housekeeping-Gens Eef2²⁴ normalisiert, und die relative Genexpression wurde mit der ΔΔCt-Methode²⁵ berechnet. Eine signifikante Hochregulation der Meis1-RNA-Spiegel wurde in den Herzen beobachtet, die mit dem pCAG::Meis1-Plasmid elektroporiert wurden, verglichen mit denen, die nur das pCAG::GFP-Plasmid erhielten (Abbildung 4C). Dies zeigt somit das Potenzial der Technik, interessante Gene zu überexprimieren und das molekulare Ergebnis zu beeinflussen.

Abbildung 4: Molekulare Analyse von elektroporierten E12,5-Herzen . (A) GFP-Fluoreszenz eines CAG::GFP-elektroporierten Herzens 24 h nach der Elektroporation. Das untere Bild zeigt die GFP-Fluoreszenz, während das obere Bild eine Verschmelzung von GFP und einem hellen Feld desselben Herzens zeigt. (B) Immunfluoreszenz von elektroporierten E12,5-Herzschnitten in histologischen Schnitten. MF20 markiert Kardiomyozyten, während WT1 Epikardzellen markiert. Die Bilder auf der rechten Seite entsprechen den Vergrößerungen des weißen Rechtecks. Weiße Pfeilspitzen zeigen GFP+-Zellen an, die sich im Epikard befinden und grob durch eine gestrichelte weiße Linie begrenzt sind. (C) RT-qPCR-Analyse von Herzen, die mit pCAG::Meis1 oder pCAG::GFP elektroporiert wurden (Kontrolle). Jeder Punkt stellt ein biologisches Replikat dar, das aus der Zusammenlegung von drei Herzen gewonnen wurde. Insgesamt wurde die qPCR-Analyse in dreifacher Ausführung mit drei verschiedenen biologischen Replikaten durchgeführt. Die statistische Analyse wurde mit dem Student's t-Test (*P < 0,05) durchgeführt. Maßstabsleisten: 200 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Ergänzende Abbildung 1: Effizienz der Elektroporation des Herzens und Zellviabilität. (A) Expression von GFP in zwei verschiedenen E12.5-Herzen, die mit dem Kontrollplasmid pCAG::GFP nach 24 h oder 48 h nach der Elektroporation (hpe) elektroporiert wurden. Das GFP-Signalbild wurde über ein Hellfeldbild desselben Herzens gelegt. (B) Quantifizierung von GFP+-Zellen in 24 hpe- und 48 hpe-Herzen, die mit der Kontrolle pCAG::GFP elektroporiert wurden. Punkte zeigen unterschiedliche Stichproben an; Durchgezogene Linien geben den Mittelwert an, während Fehlerbalken die Standardabweichung anzeigen. Es wurde kein signifikanter Unterschied zwischen beiden Bedingungen beobachtet (nicht-parametrischer t-Test; P > 0,9). (C) Konfokales Bild eines E12.5-Herzens, das mit pCAG::GFP elektroporiert und gegen gespaltene Caspase 3 und MF20 immungefärbt wurde. Die gestrichelte Linie stellt die Myokardschicht des Herzens dar. Die Bilder auf der rechten Seite werden aus dem weißen Rechteck vergrößert. Maßstab: 100 μm. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Tabelle 1: Zusammenfassung der Primer und Sequenzen. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzender Film 1: pCAG::GFP-elektroporiertes Herz nach 24 h. Der Film zeigt ein Herz, das 24 Stunden nach dem Eingriff mit pCAG::GFP-Kontrollplasmid elektroporiert wurde. Das Herz schlägt weiter, und elektroporierte Zellen exprimieren GFP-Signale. Bitte klicken Sie hier, um diesen Film herunterzuladen.

Ergänzender Film 2: pCAG::GFP-elektroporiertes Herz nach 48 h. Film zeigt ein elektroporiertes Herz mit Kontrolle pCAG::GFP, 48 h nach Elektroporation. Bitte klicken Sie hier, um diesen Film herunterzuladen.

Diskussion

Insgesamt bietet die hier beschriebene Methodik einen robusten Rahmen für die Expression transgener Konstrukte im sich entwickelnden Epikard (Abbildung 4B), wie die Überexpression von Meis1 zeigt (Abbildung 4C). Mit den entsprechenden Konstrukten kann dieses Protokoll verwendet werden, um die Auswirkungen eines bestimmten Gens auf den Funktionsgewinn (GOF) oder den Funktionsverlust (LOF) vorübergehend zu bewerten. LOF kann in die Technik implementiert werden, indem ein Plasmid transfiziert wird, das durch RNA-Interferenz auf ein Kandidatengen abzielt²⁶. Die schnelle Bestimmung des Gens GOF oder LOF ist besonders vorteilhaft, insbesondere angesichts der großen transkriptomischen Heterogenität der Epikardzellen¹², die es unpraktisch macht, transgene Tiere zu erzeugen, um jedes Kandidatengen einzeln zu bewerten.

Da dieses Protokoll eine ex vivo-Kultur verwendet, bietet es die Möglichkeit, das Schicksal von Epikardzellen innerhalb eines zeitlichen Fensters zu untersuchen. Das sich entwickelnde Epikard spielt eine zentrale Rolle bei der Gestaltung unterschiedlicher Regionen im erwachsenen Herzen 13,27,28; Daher ist das Verständnis seines Beitrags zur Herzentwicklung von entscheidender Bedeutung, um die Grundlagen angeborener Herzfehlbildungen zu entschlüsseln. Obwohl dieser Artikel nicht auf diese Anwendung eingeht, könnten die im Protokoll skizzierten Richtlinien möglicherweise hilfreich für zukünftige Schicksalskartierungsstudien des Epikards sein

Trotz des praktischen Nutzens der derzeitigen Methode müssen gewisse Einschränkungen anerkannt werden. Da diese Methode auf einer transienten Transgenese beruht, kann die Plasmidexpression im Laufe der Zeit verloren gehen oder abnehmen, was den Bereich des Protokolls zur Untersuchung eines bestimmten Entwicklungsfensters einschränkt²⁹. In dieser Studie blieb die GFP-Überexpression jedoch über die gesamte Dauer der Post-Elektroporationskulturen (48 hpe) erhalten. Darüber hinaus behindern potenzielle Einschränkungen bei den derzeitigen Ex-vivo-Kulturtechnologien die Anwendbarkeit der Methode für die Beurteilung spätembryonaler oder postnataler Entwicklungsstadien, insbesondere dort, wo die Ex-vivo-Kultur nach der Elektroporation eine Herausforderung darstellt³⁰. Obwohl es ausgefeiltere Methoden der Ex-vivo-Embryokultur gibt^31,32, erfordern sie möglicherweise die Verwendung von Geräten, die für Forscher weniger zugänglich sind und das Überleben der Probe möglicherweise nicht garantieren.

Obwohl das hier vorgestellte Protokoll so einfach wie möglich gestaltet ist, um die Reproduzierbarkeit zu verbessern, enthält es kritische Schritte, die für den Erfolg entscheidend sind. Erstens muss die Embryonendissektion sorgfältig und schnell durchgeführt werden, um Herzschäden zu minimieren, die das Überleben des Organs nach der Elektroporation gefährden könnten. Besondere Sorgfalt bei diesem Schritt, zusammen mit der Verwendung optimaler Präpariergeräte, wird dringend empfohlen. Ein weiterer kritischer Aspekt des Protokolls ist die Durchführung der Elektroporation selbst, da eine unzureichende Plasmidinjektion zu unerwünschten Ergebnissen führen kann. Daher ist es ratsam, mehrere Injektionen an einem einzigen Herzen durchzuführen, und eine eher oberflächliche Injektion der Probe kann für das Überleben der Organe von Vorteil sein. Schließlich muss die Zelldissoziation während der Herzverarbeitung rigoros durchgeführt werden, wobei die im Protokoll angegebenen Zeiten eingehalten werden müssen, um die Lebensfähigkeit der Zellen zu maximieren.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Identifizierung von Schlüsselgenen bei der Herzbildung entscheidend für das Verständnis der zugrunde liegenden Mechanismen von angeborenen Herzerkrankungen und der Regeneration ist. Die hier etablierte Methodik ermöglicht ein schnelles Screening von Gen-Gain-of-Function- (GOF) und Lost-of-Function-Effekten (LOF) im sich entwickelnden Herzen. Diese Methode weist zwar gewisse Einschränkungen an, birgt aber ein erhebliches Potenzial für die Extrapolation auf verschiedene Entwicklungsstadien oder für die Kartierung des Schicksals embryonaler Epikardzellen. Mit den visuellen Richtlinien in diesem Artikel möchten wir einen wertvollen Werkzeugkasten zur Beurteilung der immensen Komplexität und des Potenzials des sich entwickelnden Epikards anbieten.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
#55 Pinzette	Dumont	11295-51
12-Well-Multiwell-Zellkulturplatte mit klarem Flachboden	BD Falcon	353043
35-mm-Schraubstocktisch	Grandado	SKU 8798771617573
40 & micro; m Zellsieb	Fischer Scientific	08-771-1
50 mL Röhrchen	BD Falcon	352070
70 µ m Zellsieb	Corning	CLS431751
Anti-GFP Policlonal Antikörper	Invitrogen	A10262	1:1000 Verdünnung verwendet
Anti-Myosin 4 (MF20) Monoklonaler Antikörper	Invitrogen	14-6503-82	1:500 Verdünnung verwendet
CD1 Wildtyp-Mäuse			Bereitgestellt von Animalary Unit (CNIC)
Gespaltene Caspase-3 (Asp175) Antikörper	Zellsignalisierung Technologien	9661	1:400 Verdünnung verwendet
DAPI	Cell Signalling Technologies	4083	1:1000 Verdünnung verwendet
Dispase/Kollagenase	Roche	10269638001
Destilliertes Wasser
DMEM - Dulbecco's Modified Eagle Medium	Gibco	10313021
fötales Rinderserum	Invitrogen	10438-026
Heracell 150i CO2-Inkubator	Thermo Scientific	51032720
Leica Stereomikroskop S8AP0	Leica	11524102
Liberase	Roche	5401119001
Mikropipettenabzieher Modell P-97	Sutter Instrument	SU-P-97
pCAG-Expressionsplasmid	Addgene	#89689
Penicillin-Streptomycin	Invitrogen	15070-063
Petrischalen 35 & 10 mm	BD Falcon	351008
Petrischalen 60&15 mm	BD Falcon	353002
Phenolrot	Merck	P3532
Pipettenspitzen			Aus alten Laborgeräten
wiederverwendetRatte Serumkultur Embryo, männliche Ratten SPRAGUE DAWLEY RjHan SD	Janvier Labs	9979
Rekombinantes Anti-Wilms Tumorprotein 1 (WT1) Antikörper	Abcam	ab89901	1:300 Verdünnung verwendet
Rechteck-Elektroporator CUY21SC	Nepa-Gen	CUY664-10X15
steriles PBS			Bereitgestellt und autoklaviert von der technischen Einheit
Saccharose	Millipore	84100
Pinzettenelektroden mit variabler Lücke	Nepa Gen	CUY650P5