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Isolierung von hypothalamischen Mikroglia aus frisch perfundiertem adulten Mausgehirn durch magnetisch aktivierte Zellsortierung

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DOI:

10.3791/66769

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6. September 2024

 ,  ,  , 
1University of Bordeaux, INSERM, Neurocentre Magendie

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Wir beschreiben ein Protokoll zur Isolierung von Mikrogliazellen aus dem Hypothalamus der Maus (oder gleichwertigen kleinen Gehirnstrukturen) mittels magnetisch aktivierter Zellsortierung (MACS) in relativ kurzer Zeit. Die MACS-sortierten hypothalamischen Mikroglia können für die ex vivo-Analyse verwendet werden und können für die Durchführung von In-vitro-Assays plattiert werden.

Zusammenfassung

Mikroglia, als die ansässigen Makrophagen des Gehirns, sind für die Aufrechterhaltung der Homöostase des Gehirns unerlässlich. Sie formen neuronale Schaltkreise während der Entwicklung, untersuchen ihre Umgebung nach Ablagerungen oder abgestorbenen Zellen und reagieren auf Infektionen und Verletzungen im Gehirn, um nur einige Funktionen zu nennen. Ihre wichtige Rolle in der Neuroentwicklung und der synaptischen Plastizität und Pathophysiologie ist jedoch noch nicht vollständig definiert, was den Bedarf an weiteren Untersuchungen unterstreicht. Um ein umfassenderes Verständnis der Rolle von Mikroglia in diesen Prozessen zu erlangen, müssen wir Mikroglia isolieren und sie genetisch, metabolisch und funktionell charakterisieren. Die Isolierung von Mikroglia aus erwachsenen Mäusen, insbesondere aus kleinen Gehirnstrukturen, ist jedoch eine Herausforderung, da sie einen kleinen Prozentsatz der gesamten Gehirnzellen ausmachen und die Ausbeute an isolierten Mikroglia oft zu gering ist. Hier ermöglicht uns die magnetische Isolierung von Mikroglia mit CD11b+ -Mikrokügelchen, Mikrogliazellen aus dem Hypothalamus eines frisch durchbluteten adulten Mausgehirns zu sortieren. Die derzeitige Methode ermöglicht es uns, in kurzer Zeit eine relativ hohe Reinheit und Ausbeute zu erreichen und gleichzeitig die Lebensfähigkeit der Zellen zu erhalten.

Einleitung

Mikroglia machen 5-20% der gesamten Nervenzellen aus und sind die einzigen Gliazellen, die von erythromyeloiden Vorläuferzellen im Dottersack abstammen und um den embryonalen Tag herum beginnen, das sich entwickelnde Gehirn zu besiedeln E9.5 1,2. Sie sind langlebige Zellen mit der Fähigkeit, sich langsam und unabhängig von Zellen aus dem Knochenmark zu erneuern3. Als einige der hochdynamischsten Zellen sind sie in der Lage, als Reaktion auf Kontext- und Umweltreize verschiedene Phänotypen anzunehmen 2,4. Unter den Signalen, die in der Lage sind, ihre Aktivität zu modulieren, sind die Schädigung des Zentralnervensystems (ZNS), die neuronale Aktivität sowie die Nährstoffe am stärksten. Eine zunehmende Zahl von Forschungsarbeiten hat die zentrale Rolle von Mikroglia bei Verletzungen, neurodegenerativen Erkrankungen und Fettleibigkeit gezeigt 2,5,6. Nichtsdestotrotz bedarf die genaue Rolle der Mikroglia sowohl in physiologischen Prozessen als auch in der Pathophysiologie weiterer Untersuchungen. Daher ist ihre transkriptionelle, metabolische und funktionelle Charakterisierung unter verschiedenen Bedingungen von großer Bedeutung und erfordert ihre Isolierung, da in situ Studien für die DNA-, RNA- und Proteinlokalisierung und qualitative Vergleiche sowie die morphologische Charakterisierung von Mikroglia geeignet sind.

Für die Isolierung von Mikroglia werden verschiedene Techniken beschrieben, darunter die Percoll-Gradientenmethode7, die Durchflusszytometrie-Zellsortierung (FACS)8 und die magnetisch aktivierte Zellsortierung (MACS). Die Auswahl der geeigneten Methode hängt von den Zielen der Studie und dem für nachgelagerte Anwendungen erforderlichen Reinheitsgrad ab. Die Isolierung reiner Mikroglia aus dem erwachsenen Mausgehirn, insbesondere aus kleinen Hirnstrukturen wie dem Hypothalamus, ist aufgrund der begrenzten Anzahl von Mikrogliazellen eine Herausforderung. Die automatisierte sanfte Dissoziation des Hypothalamus mit Hilfe der Miltenyi-Technologie ermöglicht die Aufreinigung einer relativ hohen Mikroglia-Ausbeute in kurzer Zeit mit der Möglichkeit, bis zu acht Proben gleichzeitig mit einem schonenden MACS Octo Dissoziator zu verarbeiten.

Auf die Gewebehomogenisierung folgt die Aufreinigung der Mikroglia mit der säulenbasierten MACS-Technologie und den supermagnetischen CD11b+-Kügelchen in Nanogröße. Daher werden alle Proben auf genau die gleiche Weise verarbeitet, wodurch intakte CD11b+-Zellen erhalten werden. Bemerkenswert ist, dass CD11b nicht ausschließlich in Mikroglia vorkommt, sondern auch auf anderen Zellen der myeloischen Linie, einschließlich Makrophagen und Monozyten, exprimiertwird 9. Um dies zu begrenzen, gewährleistet die Perfusion des Gehirns mit eiskalter Kochsalzlösung vor der Hypothalamusextraktion (siehe Protokollschritt 2.6) die Eliminierung der meisten myeloischen Zellen, so dass nur ein potenziell kleiner Teil der residenten Makrophagen oder derjenigen, die an Blutgefäßen haften, übrig bleibt. Die residenten Makrophagen und Monozyten eines gesunden Steady-State-ZNS machen einen geringen Prozentsatz der gesamten Immunzellen des Gehirns aus (~10% bzw. <2%)10,11. Wenn Gehirnzellen mit CD11b+-Kügelchen sortiert werden, können daher sowohl Mikroglia als auch Makrophagen isoliert werden, obwohl die überwiegende Mehrheit Mikroglia sind.

Die Endausbeute von Mikroglia und die Aufrechterhaltung ihrer Lebensfähigkeit ermöglichen es uns, sowohl ex vivo als auch in vitro Assays durchzuführen, mit dem Vorteil, dass bestimmte Hirnregionen von Interesse analysiert werden können. Die neuesten Erkenntnisse haben gezeigt, dass die Mikroglia-Population sehr heterogen ist und die regionsspezifische Genexpression sowie morphologische Merkmale und Funktionen repräsentiert 2,12,13. Daher zielt das aktuelle Protokoll darauf ab, adulte Mikroglia regionenspezifisch zu isolieren und zu analysieren. In der Tat können wir die genetischen, transkriptionellen und translationalen Profile adulter hypothalamischer Mikroglia mit Methoden wie RT-qPCR und RNA-Sequenzierung sowie mit in vitro-Funktionsanalysen charakterisieren.

Protokoll

Alle beschriebenen Tierversuche wurden in strikter Übereinstimmung mit den Empfehlungen der Europäischen Union (2013/63/EU) durchgeführt und von der lokalen Ethikkommission der Universität Bordeaux (CEEA50) und dem französischen Ministerium für Hochschulbildung, Forschung und Innovation genehmigt (nicht-technische Zusammenfassung des genehmigten Projekts NTS-FR-619193 v.1 vom 23.12.2022).

Das folgende Protokoll wird an adulten C57BL/6-Mäusen mit einem Durchschnittsalter von 2-4 Monaten durchgeführt. Sie könnte jedoch bei allen Mäusen durchgeführt werden, wobei zu berücksichtigen ist, dass die Immunzelllandschaft des ZNS verändert und der Prozentsatz der ansässigen Makrophagen und Monozyten erhöht sein kann (z. B. bei Alterung und Neurodegeneration).

1. Herstellung von Lösungen

HINWEIS: Die folgenden Volumina und Lösungen beziehen sich ausschließlich auf die Isolierung von Cd11b+-Zellen.

  1. Bestimmen Sie das erforderliche Gesamtvolumen von D-PBS/0,5 % Rinderserumalbumin (BSA) basierend auf der Anzahl der Proben. Bereiten Sie die Lösung mit dem handelsüblichen D-PBS mit Calcium- und Magnesium- und BSA-Pulver vor (siehe Materialtabelle).
  2. Bereiten Sie markierte Dissoziationsröhrchen (C-Röhrchen) vor und füllen Sie jedes mit 1.900 μl Puffer Z, der im Dissoziationskit für das Gehirn für Erwachsene enthalten ist (siehe Materialtabelle). Tauen Sie die Enzyme auf und bewahren Sie sie zusammen mit allen Puffern, die in den folgenden Schritten benötigt werden, auf Eis auf.
  3. Bereiten Sie das entsprechende Volumen von 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) (siehe Materialtabelle), das für die Perfusion (Schritt 2.6) benötigt wird, vor und legen Sie es auf Eis. Berechnen Sie 10 ml für jedes Tier plus 10 % Überschuss.
  4. Für die RT-qPCR-Analyse bereiten Sie einen qPCR-Puffer pro Probe vor: 2,5 μl Thioglycerin + 250 μl Lysepuffer unter Verwendung eines im Handel erhältlichen Kits zur Aufreinigung von RNA (siehe Materialtabelle).
  5. Für die Proteinquantifizierung bereiten Sie einen Lysepuffer her, indem Sie den Phosphatase-Inhibitor-Cocktail und den Protease-Inhibitor-Cocktail 1:100 in einem Säugetier-Extraktionspuffer verdünnen (siehe Materialtabelle).
  6. Für den Nachweis von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) und den Phagozytose-Assay ist 1x HBSS aus dem kommerziell erhältlichen 10x HBSS herzustellen (siehe Materialtabelle). Bereiten Sie dann den FACS-Puffer vor, indem Sie 0,2 % BSA zu 1x HBSS hinzufügen.

2. Entfernung des Gehirns

  1. Betäuben Sie das Tier mit einer Dosis von 20 mg/kg Xylazin; Dann wird die Maus mit einer Überdosis von 400 mg/kg Pentobarbital eingeschläfert und in Rückenlage in eine Präparierschale gelegt.
    HINWEIS: Andere Anästhesiekombinationen zur Einschläferung des Tieres können ebenfalls wirken.
  2. Füllen Sie eine 10 mL Spritze mit 10 mL eiskaltem 1x PBS und befestigen Sie diese an einer Butterfly 21 G Nadel.
  3. Sobald die Maus vollständig betäubt ist (überprüfen Sie dies durch Kneifen der Pfoten, um sicherzustellen, dass keine Reaktion erfolgt), die Atmung aufgehört hat und das Herz flimmert, legen Sie die Haut mit einer Zange fest und öffnen Sie die Brusthöhle mit einer Schere auf Höhe der letzten Rippen und des Brustbeins.
  4. Mache mit der Schere einen tiefen Schnitt entlang der Seiten des Brustkorbs in Richtung der Oberseite des Brustkorbs, um das Herz freizulegen.
  5. Führen Sie die 21 G Nadel in den distalen Teil des linken Ventrikels ein (achten Sie darauf, dass sich etwa 1/3 der Nadel im Ventrikel befindet). Machen Sie sofort mit der Schere einen Schnitt durch den rechten Vorhof.
  6. Infizieren Sie 10 ml eiskaltes 1x PBS, um das Gehirn von zirkulierenden Immunzellen zu reinigen.
    HINWEIS: Überprüfen Sie das Gehirn visuell, um sicherzustellen, dass es sauber und gut durchblutet ist.
  7. Schneiden Sie den Mäusekopf ab, extrahieren Sie vorsichtig das Gehirn und legen Sie es auf eine mit Eis gefüllte und mit Alufolie bedeckte Petrischale.
    HINWEIS: Die Petrischale und die Folie helfen dabei, die Gehirnteile zu sehen. Es ist von Vorteil, eine kühle Umgebung während des Zerkleinerns der Gehirnteile aufrechtzuerhalten, um die Stoffwechselaktivitäten zu begrenzen.
  8. Isolieren Sie den Hypothalamus mit einer Pinzette und schneiden Sie ihn mit Rasierklingen in kleine Stücke.
    1. Um den Hypothalamus zu identifizieren und zu präparieren, stellen Sie das Gehirn auf den Kopf, so dass der Kortex ventral und der Hypothalamus dorsal auf der oberen Oberfläche sichtbar ist. Trennen Sie den Hypothalamus, der sich am unteren Ende des Gehirns auf beiden Seiten des dritten Ventrikels befindet, mit einer gekrümmten Pinzette. Das durchschnittliche Gewicht des Hypothalamus von adulten C57BL/6-Mäusen beträgt 15 mg.
      HINWEIS: Die Hirnteile müssen so klein wie möglich sein (<0,5 mm). Das Schneiden in kleine Stücke ist ein kritischer Schritt, da es eine bessere Dissoziation und eine höhere Ausbeute an Zellen ermöglicht.
  9. Die Stücke des Hypothalamus werden in Dissoziationsröhrchen (C-Röhrchen) gesammelt, die zuvor mit 1.900 μl Puffer Z gefüllt waren (Schritt 1.2).
    HINWEIS: Um eine gute Ausbeute an Mikrogliazellen zu erhalten, die für die Durchführung von Assays ausreicht, sollten mindestens zwei (für die Proteinquantifizierung) oder drei (für qPCR und RNAseq) Hypothalami pro Röhrchen gepoolt werden.

3. Dissoziation des Gewebes

HINWEIS: Alle Schritte müssen auf Eis durchgeführt werden. Verwirbeln Sie die Zellsuspension in keinem Schritt; Nur vorsichtig mit einer 1.000 μL Pipette mischen.

  1. Bereiten Sie die Enzymmischung 2 gemäß Tabelle 1 vor (Berechnung des Gesamtvolumens für alle Röhrchen + 10 % Überschuss). In jedes C-Röhrchen werden 50 μl des in Mischung 1 enthaltenen Enzyms (siehe Tabelle 1) und 30 μl der Enzymmischung 2 gegeben. Alle Enzyme sind im Dissoziationskit für das Gehirngewebe für Erwachsene enthalten (siehe Materialtabelle).
  2. Verschließen Sie die C-Rohre und legen Sie sie kopfüber mit den Heizhalterungen nach Herstellerangaben in den Dissoziator. Führen Sie das Programm 37C_ABDK_02 aus.
  3. Bereiten Sie 15 mL Schnappröhrchen (siehe Materialtabelle) mit 70 μm Sieben darauf vor. Befeuchten Sie das Sieb mit 2 mL D-PBS.
  4. Wenn das Dissoziations-/Aufschlussprogramm beendet ist, entleeren Sie das C-Röhrchen auf das Sieb und kratzen Sie es mit einer 200-μl-Spitze, um den Zellverlust zu reduzieren, indem Sie die Zellfiltration erhöhen und die Anhaftung von Gewebehomogenat auf dem Filter verringern.
  5. Waschen Sie die Tube mit 2 x 5 mL D-PBS, leeren Sie die Waschungen auf das Sieb und kratzen Sie mit einer 200 μL Spitze zwischen den Waschgängen.
  6. Bei 300 × g 10 min bei 4 °C zentrifugieren und den Überstand vollständig absaugen. Das Küvettenpellet wird vorsichtig mit dem entsprechenden Volumen kaltem D-PBS gemäß Tabelle 1 resuspendiert.
  7. Sofort vorsichtig mit 450 μl Dichtegradientenreagenz (Debris Removal Solution, siehe Materialtabelle) mischen und sehr vorsichtig mit 2 mL kaltem D-PBS überlagern (siehe Tabelle 1).
    HINWEIS: Um die verschiedenen Dichtegradientenschichten zu erhalten, muss das D-PBS vorsichtig Tropfen für Tropfen und mit so wenig "Störung" wie möglich 1 mL auf einmal mit einer 1 mL-Pipette überlagert werden.
  8. Zentrifugieren Sie bei 3.000 × g für 10 min bei 4 °C mit langsamer Beschleunigung und langsamer Bremse (wenn 9 voll ist, verwenden Sie 5).
  9. Es bilden sich drei Phasen. Aspirieren Sie die beiden oberen Phasen vollständig und verwerfen Sie sie. Achten Sie darauf, dass Sie die dritte untere Phase nicht ansaugen.
  10. Füllen Sie 1800 μL kaltes D-PBS auf und drehen Sie das Röhrchen 3 Mal vorsichtig um.
  11. Bei 1.000 × g für 10 min bei 4 °C bei voller Beschleunigung und Vollbremsung zentrifugieren und den Überstand vollständig ansaugen. Resuspendieren Sie das Zellpellet vorsichtig, indem Sie langsam mit 2 mL D-PBS/BSA auf und ab pipettieren.

4. Magnetische Isolierung von CD11b+ -Zellen

  1. Bei 300 × g für 10 min bei 4 °C zentrifugieren und den Überstand vollständig absaugen. Das Zellpellet wird vorsichtig in 90 μl Puffer D-PBS/BSA resuspendiert.
  2. 10 μl der CD11b-Mikrokügelchenmischung zugeben und mit der Pipette gut vermischen.
  3. 15 min bei 2-8 °C im Kühlschrank inkubieren, nicht auf Eis; Waschen Sie die Zellen durch Zugabe von 1 ml D-PBS/BSA und zentrifugieren Sie sie 10 Minuten lang bei 4 °C bei 300 × g . Saugen Sie den Überstand vollständig ab. Vorsichtig in 500 μl D-PBS/BSA resuspendieren.
  4. Starten Sie das POSSEL2 Programm auf dem Trennzeichen und befolgen Sie die Anweisungen auf dem Bildschirm. Platzieren Sie die kleinen Säulen (siehe Materialtabelle) in das Magnetfeld.
    HINWEIS: Für die magnetische Zellsortierung können entweder kleine oder große Säulen gewählt werden, je nach der durchschnittlich erwarteten Anzahl von Zellen. Kleine Spalten haben eine Kapazität von bis zu 1 × 107 beschrifteten Zellen und große Spalten bis zu 1 × 108. Bei der Isolierung von Zellen aus kleinen Strukturen, wie z. B. dem Hypothalamus, wird empfohlen, kleine Säulen zu verwenden. Die Volumina der Reagenzien sind bei Verwendung großer Säulen unterschiedlich (siehe Anweisungen des Herstellers).
  5. Benetzen Sie die Säulen (siehe Materialtabelle) mit 500 μl D-PBS/BSA. Wenn die negative Fraktion der Zellen (CD11b-) für die weitere Analyse benötigt wird, legen Sie eine Auffangplatte unter die Säulen und tragen Sie dann die Zellsuspension in die Säulen auf.
  6. Führen Sie drei Waschschritte durch, indem Sie jeweils 500 μl D-PBS/BSA in die Säule geben und jedes Mal darauf warten, dass der Puffer die Säule passiert.
    HINWEIS: Es ist wichtig, dass der obere Teil der Säule nicht austrocknet, daher wird empfohlen, nicht zu warten, bis der gesamte Puffer durchlaufen ist.
  7. Das Gesamtabwasser der CD11b-Fraktion aus den Vertiefungen der Auffangplatte wird in 15-Milliliter-Röhrchen überführt.
  8. Nehmen Sie die Säule aus dem Separator, stellen Sie sie auf ein 5-ml-Röhrchen und pipettieren Sie 1 ml D-PBS/BSA in die Säule.
  9. Spülen Sie die magnetisch markierte Zellfraktion sofort aus, indem Sie den mit der Säule gelieferten Kolben fest ansetzen.
  10. Zählen Sie schließlich CD11b+ -Zellen mit einem Hämazytometer oder einer anderen Methode; Erwarten Sie ~15.000 Zellen pro Hypothalamus.
  11. Die Zellsuspension wird bei 300 ×g 10 min bei 4 ΰC zentrifugiert und der Überstand verworfen.

5. Analysen

  1. Für die RT-qPCR-Analyse resuspendieren Sie die Zellpellets mit qPCR-Puffer (zur Vorbereitung siehe Schritt 1.3) und lagern Sie die Röhrchen bis zur mRNA-Extraktion bei - 80 °C. Isolieren Sie die Gesamt-RNA, verarbeiten und analysieren Sie sie gemäß den MIQE-Richtlinien14. Synthetisieren Sie abschließend cDNA und führen Sie die qPCR mit einem RT-PCR-Gerät durch. In der Materialtabelle finden Sie alle im Handel erhältlichen Kits, die verwendet werden.
  2. Zur Proteinquantifizierung waschen Sie die Zellpellets mindestens 2x mit D-PBS (ohne BSA), um BSA zu eliminieren. Dann resuspendieren Sie die Zellpellets von zwei Hypothalamis mit 20 μl Lysepuffer. Fahren Sie mit der Proteinquantifizierung mit einem Protein-Assay-Kit fort (siehe Materialtabelle).
    HINWEIS: Wir befolgten die Anweisungen des Herstellers15 zur Quantifizierung von Proteinen zur Durchführung des Serin/Threonin-Kinasen-Aktivitätsassays.
  3. Für den Nachweis von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) in Mikrogliazellen resuspendieren Sie das Pellet in 1x HBSS. Behandeln Sie die Zellen gemäß dem Herstellerprotokoll des Kits für den Durchflusszytometrie-Assay (siehe Materialtabelle). Dann resuspendieren Sie die behandelten Zellen in 200 μl FACS-Puffer (zur Vorbereitung siehe Schritt 1.5) und führen Sie FACS durch, um oxidativ gestresste Zellen nachzuweisen.
  4. Für den Phagozytose-Assay inkubieren Sie die sortierten Zellen in D-PBS/BSA mit fluoreszierenden Latexkügelchen (siehe Materialtabelle) für 30 Minuten. Passen Sie die Anzahl der Kügelchen so an, dass sie durchschnittlich 4 Kügelchen pro Zelle haben. Anschließend wird bei 300 × g für 7 min bei 4 °C zentrifugiert, in 200 μl FACS-Puffer resuspendiert und die Fluoreszenzemission mittels FACS (λex 575 nm; λem 610 nm) abgelesen.

Ergebnisse

Die Bewertung der Endausbeute hängt vom Reinheitsgrad und der Menge der isolierten Zellen ab und kann durch RT-qPCR, Zellzählung und Proteinquantifizierung bestimmt werden. Die Reinheit der isolierten magnetischen Zellen aus dem Hypothalamus wurde durch die Genexpressionsanalyse von CD11b, C1qa, Gad1 und GFAP mittels RT-qPCR bestätigt (Abbildung 1). CD11b und C1qa werden überwiegend von Mikroglia im Steady State exprimiert, CNS16 und Gad1 und GFAP dienen als neuronaler bzw. astrozytärer Marker. Die Gesamt-cDNA eines Hypothalamus reichte von 55 bis 98 ng. Es ist bemerkenswert, dass nur die positive Fraktion eine CD11b- und C1qa-Expression aufwies, was darauf hindeutet, dass in der negativen Fraktion kein potenzieller Verlust von Mikrogliazellen vorhanden war. Die Grundierungen sind in Tabelle 2 aufgeführt.

Darüber hinaus stellen die geringen Konzentrationen der neuronalen und astrozytären Marker sicher, dass es sich bei der überwiegenden Mehrheit der isolierten Zellen um Mikroglia handelt, da residente Makrophagen und Monozyten nur 10 % der gesamten Immunzelllandschaft eines gesunden Gehirns ausmachen10,11. Diese Ergebnisse belegen die Wirksamkeit der magnetischen Selektion und ebnen den Weg für die Anwendung der RT-qPCR zur Beurteilung der Expressionsniveaus aller interessierenden Gene in frisch sortierten hypothalamischen Mikrogliazellen. In ähnlicher Weise kann eine RNAseq-Analyse an hypothalamussortierten Mikroglia durchgeführt werden, um einen umfassenden Überblick über ihr Transkriptom zu erhalten.

Die Menge der isolierten Zellen wurde durch Zellzählung bestimmt und betrug ~15.000 Zellen pro Hypothalamus (erwähnt in Protokollschritt 4.10). Zusätzlich wurde die Proteinkonzentration in sortierten Mikroglia quantifiziert, wobei eine durchschnittliche Konzentration von 0,5 μg/μl in CD11b+ -Zellen festgestellt wurde, die aus zwei gepoolten Hypothalami isoliert wurden (Abbildung 2). Dieses Wissen ermöglicht es, verschiedene Assays in Abhängigkeit von einer minimalen Proteinschwelle durchzuführen. Darüber hinaus kann durch die Bündelung von mehr Hypothalamis eine höhere Konzentration erreicht werden, was den Umfang der Potenzialanalysen erweitert. Die extrahierten Proteine aus hypothalamischen Mikroglia ermöglichen verschiedene Techniken, darunter AlphaLISA-Immunoassays und Kinase-Aktivitätsassays.

Darüber hinaus ermöglicht das beschriebene Protokoll den Forschern, mehrere ex vivo-Analysen durchzuführen, die die Erforschung der Mikrogliaaktivität und ihrer Rolle im Hypothalamus sowohl in physiologischen als auch in pathologischen Kontexten ermöglichen. Die Quantifizierung der ROS-Produktion stellt einen entscheidenden Aspekt der mikroglialen Immunantwortdar 17. Daher können Mikroglia nach der Trennung mit kommerziell erhältlichen Reagenzien behandelt werden, die den Nachweis von ROS in lebenden Zellen ermöglichen, indem sie bei der Oxidation ein erhöhtes Fluoreszenzsignal aufweisen. Mikroglia, die magnetisch aus drei gepoolten Hypothalamis isoliert wurden, reichen aus, um ROS durch FACS zu detektieren, wie in Abbildung 3A gezeigt, obwohl unsere Ergebnisse eine recht hohe Variabilität der Zell-ROS-Produktion unter den von uns analysierten Bedingungen zeigen. Es ist erwähnenswert, dass wir mit dem oben erwähnten kommerziellen Kit (siehe Materialtabelle) auch in der Lage waren, die Lebensfähigkeit von sortierten Cd11b+-Zellen zu beurteilen, dank einer zellunbelasteten Färbung toter Zellen, die eine Zunahme der Fluoreszenz bei der Bindung von DNA zeigt. Konkret zeigen unsere Daten, dass 99 % der Zellen am Leben sind (Abbildung 3B). Gating-Strategien wurden verwendet, um zwischen lebenden und toten Zellen sowie oxidativ gestressten und nicht gestressten Zellen anhand ihrer Fluoreszenzeigenschaften zu unterscheiden.

Ein weiteres Hauptmerkmal der Mikrogliaaktivität ist die Phagozytose, ein dynamischer und streng regulierter Prozess, der eine Schlüsselrolle bei der Immunüberwachung, der Gewebereparatur und der allgemeinen Homöostase des Zentralnervensystems spielt18. Bemerkenswert ist, dass Cd11b+ -Zellen, die mit magnetisch gekoppelten Kügelchen sortiert wurden, 24 Stunden lang kultiviert und dann zu verschiedenen Zeitpunkten mit fluoreszierenden Latex-Mikrokügelchen inkubiert werden können, um entweder durch FACS oder durch Fluoreszenzmikroskopie Veränderungen in der phagozytischen Aktivität unter verschiedenen Bedingungen zu bewerten. Frisch sortierte Mikroglia können auch fluoreszierenden Kügelchen oder jeder Art von pHrodo-gekoppelten Partikeln (z. B. Synaptosomen) direkt im Röhrchen ausgesetzt werden, und die Phagozytose kann durch FACS-Analyse beurteilt werden.

Konkret inkubierten wir direkt in das Röhrchen mit sortierter Zellsuspension, Mikroglia, die aus zwei gepoolten Hypothalamis isoliert wurden, oder ein ganzes Gehirn mit fluoreszierenden Latexkügelchen. Mikroglia, die mindestens einen fluoreszierenden Kügelchen phagozytiert haben, können durch Durchflusszytometrie von nicht-phagozytären Zellen unterschieden werden, da phagozytäre Mikroglia eine erhöhte Fluoreszenz aufweisen. Negativkontrollen, die nicht mit Kügelchen inkubiert wurden, wurden für das Gating verwendet. Unter unseren beiden Versuchsbedingungen (Mäuse, die mit Futter gefüttert wurden, vs. fettreiche Diät (HFD)) beobachteten wir einen sehr geringen Prozentsatz an phagozytären Mikroglia (Abbildung 4A). Dieses Ergebnis wird jedoch hier gezeigt, um die Wirksamkeit dieser Methode zu demonstrieren, die bemerkenswerterweise auch die Unterscheidung zwischen Zellen ermöglicht, die 1 Kügelchen, 2 Kügelchen, 3 Kügelchen usw. phagozytieren (Abbildung 4B). Schließlich konnten alle Omics-Ansätze auf isolierte hypothalamische Mikroglia angewendet werden. Wir empfehlen, drei Hypothalamis zu poolen, um genügend Zellen für die Durchführung dieser Assays zu haben.

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Abbildung 1: Bewertung der CD11b+ -Zellreinheit mittels RT-qPCR. Quantifizierung der mRNA-Expression des Integrins CD11b, der Komplement-C1q-Unterkomponente Untereinheit A C1q, der Glutaminsäure-Decarboxylase Gad1 und des sauren Gliafaserproteins GFAP in sortierten Zellen, die auf mRNA-Spiegeln der Housekeeping-Gene Eef1a1 und Sdha normalisiert sind. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 2: Proteinquantifizierung aus Hypothalamuszellen nach Zellsortierung. Quantifizierung der Proteinkonzentration in CD11b+ und CD11b- Zellen. Sowohl CD11b+- als auch CD11b-Zellen wurden in 20 μl Lysepuffer lysiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 3: Nachweis von ROS in lebenden Mikrogliazellen. Quantifizierung von (A) oxidativ gestressten Zellen und (B) lebenden Zellen in einer Population von sortierten Cd11b+ -Zellen mit relativen FACS-Konturdiagrammen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 4: Quantifizierung der phagozytären Aktivität der Mikroglia. (A) Quantifizierung phagozytärer Zellen in Cd11b+ -Zellen, sortiert aus zwei Hypothalami- oder einem Gehirn, mit relativem FACS-Konturdiagramm. (B) Prozentsatz der phagozytären Zellen entsprechend der Anzahl der Kügelchen, die mit dem relativen FACS-Konturdiagramm phagozytiert wurden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Enzym-Mix 2
Enzym APuffer YEnzym P
10 μLca. 20 μl50 μL
D-PBSLösung zur Entfernung von SchmutzOverlay D-PBS
15-100 mg Struktur1000 μL450 μL2 mL

Tabelle 1: Herstellung des Dissoziationsgemisches (Volumina beziehen sich auf eine einzelne Probe) und der Gradientenüberlagerungen.

GeneProteinVorwärtsRückwärts
ItgamIntegrin alpha M (CD11b)CTCATCACTGCTGGCCTATACAAGCAGCTTCATTCATCATGTCCTT
SdhaSuccinat-Dehydrogenase-Komplex Flavoprotein-Untereinheit ACCCTCTCATATGTGGACATCAACAAGGTCTTGTCGATAACAGGT
C1qaKomplementkomponente 1, q-Unterkomponente, alpha-PolypeptidCGAGGTGTGGATCGAAAAGGGAAGATGCTGTCGGCTTCAGT
Gad1Glutamat-Decarboxylase 1GACCAATCTCTGTGACTCGCTTAGCTGGTCAGTGTATCGGAGGTCTT
GfapGliafibrilläres saures ProteinAGGTCCGCTTCCTGGAACAGGGCTCCTTGGCTCGAA

Tabelle 2: RT-qPCR-Primersequenzen.

Durchflusszytometrische Zellsortierung (FACS)Magnetisch aktivierte Zellsortierung (MACS)
Fluoreszenzmarkierte biochemische AntikörperMagnetische Kügelchen, die an Antikörper konjugiert sind
Differenzierung über Zelloberflächenmarker hinausDifferenzierung nur nach Zelloberflächenmarkern
Beträchtliche AnfangsrenditeBescheidener Anfangsertrag
Langsamer als MACS für die gleichzeitige Verarbeitung vieler ProbenSchneller als FACS für die gleichzeitige Handhabung vieler Proben
Weniger schonend als MACSSchonender als FACS

Tabelle 3: Darstellung der Merkmale und Einschränkungen von FACS und MACS

Diskussion

Das aktuelle Protokoll stellt die Isolierung von hypothalamischen Mikroglia aus frisch perfundierten adulten Mausgehirnen durch magnetaktivierte Zellsortierung dar. Die oben vorgestellten Ergebnisse bestätigen die Reinheit und Lebensfähigkeit isolierter Zellen sowie die Wirksamkeit dieser Methode zur funktionellen Charakterisierung von Mikroglia ex vivo, z.B. durch phagozytäre Aktivität und Quantifizierung der ROS-Produktion. Klassische Methoden zur Isolierung einer bestimmten Zellpopulation könnten auch für Mikrogliazellen eingesetzt werden. Die Dichtegradientenfraktionierung ist eine bekannte Methode zur Trennung verschiedener Zellen und ihrer Partikel nach ihrer Größe und/oder Dichte. Diese Technik könnte für die Isolierung und Kultivierung von primären Mikroglia eingesetzt werden. Die Reinigung adulter Mikroglia erfordert jedoch eine weitere Sortierung der isolierten Gehirnzellen mittels fluoreszenzaktivierter oder immunomagnetischer Zellsortierung.

Konkret stützt sich FACS auf fluoreszenzmarkierte biochemische Antikörper, um die Zellen zu markieren und sie anhand einer Vielzahl von Variablen zu unterscheiden, die über Oberflächenmarker hinausgehen, wie z. B. ihre Größe und ihr Stoffwechselstatus. Dennoch könnte der Prozess der Zellreinigung langsamer und weniger schonend ablaufen, was die Anzahl der abgestorbenen Zellen erhöhen und eine erhebliche Anfangsausbeute erfordern würde. Daher ist die geringe Anzahl hypothalamischer Mikroglia bereits ein limitierender Faktor. MACS verwendet magnetische Beads, die an bestimmte Antikörper gegen spezifische Zellepitope konjugiert sind, und könnte mit einer bescheidenen Anfangsausbeute arbeiten, was die regionsspezifischen Studien zur Mikrogliadynamik erleichtert. Aufgrund des starken Magnetfeldes der Mikrokügelchen ist eine minimale Beschriftung erforderlich; daher ist es schonender als FACS und gewährleistet die Aufrechterhaltung der Zellintegrität. Darüber hinaus ist MACS schneller als FACS, wenn die gleichzeitige Handhabung mehrerer Proben erforderlich ist. Dies bietet den entscheidenden Vorteil, dass eine hohe Zellviabilität erhalten bleibt, die auch aus einer geringen Anfangsausbeute resultieren kann (Tabelle 3).

Zu den größten Herausforderungen bei der Isolierung von Mikroglia aus dem Hypothalamus, die durch die MACS-Technologie effektiv angegangen werden können, gehören das Erreichen einer ausreichenden Endausbeute und die Sicherstellung der Erhaltung der Zellintegrität. Die erforderliche Zellmenge hängt von der Art der gewählten Analyse nach der Isolierung ab. Zum Beispiel erfordert die Untersuchung der funktionellen Rolle von Mikroglia in vitro eine beträchtliche Anzahl von Zellen. Dies unterstreicht, wie wichtig es ist, dass ein anfänglicher Pool derselben Gehirnregion von unterschiedlichen Mäusen mit identischen Bedingungen erstellt wird, bevor mit dem Isolationsprozess fortgefahren wird. Umgekehrt ist für Techniken wie die hochpräzise Einzelzellsequenzierung keine große Zellpopulation erforderlich, so dass das Pooling mehrerer Mäuse nicht erforderlich ist.

Um die Zellausbeute zu maximieren, ist es entscheidend, bestimmte Schritte im Protokoll einzuhalten. Eine effektive Dissoziation wird eingeleitet, indem der Hypothalamus in kleine Stücke geschnitten und dann sichergestellt wird, dass sie während des Prozesses im Puffer am Boden des Röhrchens gehalten werden. Dann sorgt eine Kombination aus mechanischer Dissoziation mit enzymatischem Abbau der extrazellulären Matrix für eine signifikant hohe Zellausbeute. Wir sollten jedoch bei der Interpretation der Ergebnisse äußerst vorsichtig sein, da die enzymatische Dissoziation, die bei 37 °C durchgeführt wird, transkriptionelle und translationale Veränderungen induzieren könnte19. Um technisch vermittelte Veränderungen zu verhindern, könnten die entsprechenden Kontrollen mit transkriptionellen und translationalen Inhibitoren eingesetzt werden19. Es ist auch möglich, die enzymatische Dissoziation bei einer niedrigeren Temperatur, wie z.B. in einem Kühlraum, durchzuführen (die Wirksamkeit kann verringert sein), obwohl die Dissoziation mehr auf mechanischer als auf enzymatischer Wirkung beruhen kann. Nach der Dissoziation wird die Zellsuspension vorgewaschen und in die Siebe überführt, und es werden zwei weitere gründliche Waschungen der Röhrchen durchgeführt, um Zellverlust zu verhindern. Ein weiterer kritischer Schritt ist die Entfernung von Ablagerungen und Myelin, die durch die Dichtegradientenzentrifugation und die Bildung verschiedener Schichten erreicht wird. Um eine beträchtliche Endausbeute zu erzielen, ist daher ein sorgfältiger Umgang sowohl mit dem hypothalamischen Gewebe als auch mit der Zellsuspension erforderlich, wobei sie immer auf Eis gehalten werden müssen, um den Stoffwechsel zu verlangsamen und ihren In-vivo-Phänotyp zu erhalten.

Darüber hinaus gibt es bestimmte Punkte, bei denen wir äußerst vorsichtig sein sollten, um die höchste Reinheit der Mikroglia zu erreichen und den Phänotyp der Mikrogliazellen zu erhalten. Zu Beginn ist die Perfusion bei 4 °C entscheidend für die Eliminierung aller zirkulierenden CD11b+ -Zellen, um die höchste potenzielle Reinheit der Mikroglia zu gewährleisten. Im Falle einer Störung der Blut-Hirn-Schranke kann jedoch ein höherer Prozentsatz zirkulierender Immunzellen das Gehirn besiedeln, was die Erforschung der Mikroglia selbst stört. Um dieses Problem zu entschärfen, besteht ein alternativer Ansatz darin, eine zweite Runde der magnetischen Isolierung mit Mikrokügelchen zu implementieren, die an den CD45-Antikörper konjugiert sind. CD45 ist ein Zelloberflächenmarker, der eine hohe Expression in Makrophagen20 aufweist und der anschließende Durchfluss dieser Runde umfasst nur die Mikrogliazellen. Diese Strategie, zwei Runden magnetischer Isolierung zu verwenden, erhöht die Spezifität des Prozesses; Dennoch nimmt es zusätzliche Zeit in Anspruch, was ein potenzielles Risiko für eine Unterbrechung der zellulären Integrität und/oder des Mikroglia-Phänotyps darstellt. Ein entscheidender Faktor für die Erhaltung der funktionellen Eigenschaften und Integrität der Zellen besteht daher darin, das Hirngewebe schnell zu isolieren und auf Eis zu halten, bis der Dissoziationsprozess eingeleitet wird. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass dieser analytische Ansatz das Verständnis der Funktion und des Verhaltens der Mikroglia verbessert und wertvolle Einblicke in ihre dynamischen Reaktionen im Hypothalamus liefert.

Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass sie keine Interessenkonflikte haben.

Danksagungen

AN wird unterstützt vom Institut Universitaire de France (IUF), der Universität Bordeaux, der französischen Stiftung für Hirnforschung (FRC), der GLN (Lipid-Nutrition Group) und der Nationalen Forschungsagentur (ANR, PRC 2023-MicroNRJ). CA wurde unterstützt von der Fondation pour la Recherche Médicale (FRM-ARF201809006962). Dieses Projekt wurde durch das Forschungs- und Innovationsprogramm Horizon Europe der Europäischen Union im Rahmen der MSCA Doctoral Networks 2021, Nr. 101072759 (FuElThEbRaiNIn healtThYaging and age-related diseases, ETERNITY.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Dissoziationskit für ErwachseneMiltenyi130-107-677Das Kit enthält Puffer Z, Puffer Y, Enzyme A und P, Debris Removal Solution, Puffer A (zum Auflösen von Enzym A).
Albumin Rind FrV BSAEuroMedex04-100-812-C
CD11b (Mikroglia) MikroKügelchen, Mensch und Maus - kleine GrößeMiltenyi130-093-636
CellROX Green Durchflusszytometrie-Assay-KitInvitrogenC10492
Zentrifugenröhrchen, Snap-Pop-Deckel 15 mLCellTreat978449
DPBS, Calcium, Magnesium, Glukose, PyruvatGibco14287-072
gentleMACS C TubesMiltenyi130-093-237
gentleMACS Octo Dissoziator mit HeizernMiltenyi130-096-427
Halt Phosphatase Inhibitor Cocktail (100x)Thermofisher78420
Halt Protease Inhibitor Cocktail, EDTA frei (100x)Thermofisher78437
HBSS (10x), Calcium, Magnesium, kein PhenolrotThermofisher14065056
Latexkügelchen, carboxylatmodifiziertes Polystyrol, fluoreszierend rotSigma-AldrichL3280
LightCycler  480 SYBR Grün I MasterRoche 4707516001Dieses Reagenz wurde zur Durchführung der PCR verwendet.
MACS SmartSeveners (70 & Mikro; m)Miltenyi130-110-916
Micro BCA Protein Assay KitThermofisher23235
m-PER Säugetier-ExtraktionspufferThermofisher78503
MS SäulenMiltenyi130-042-201Im Protokoll als kleine Säulen bezeichnet.
MultiMACS Cell24 Separator PlusMiltenyi130-098-637
PBSS, pH 7,4 Thermofisher10010023
qScript XLT cDNA SuperMixQuanta biosciences733-1177Das Kit wurde zur Syntesize von cDNA verwendet.
ReliaPrep RNA Miniprep SystemsPromegaZ6011Das Kit enthält 1-Thioglycerol und BL-Puffer (im Protokoll als Lysepuffer bezeichnet) und wurde zur Isolierung von Gesamt-RNA verwendet.
Vacutainer safety-lok 21 GBecton Dickinson367282

Referenzen

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Nachdrucke und Genehmigungen

Schlagwörter

Isolierung von Mikrogliamagnetische ZellsortierungCD11b MicrobeadsHom ostase des GehirnsKommunikation zwischen Mikroglia und NeuronenFressverhaltenmetabolische BedingungenZellviabilit t
Isolierung von hypothalamischen Mikroglia aus frisch perfundiertem adulten Mausgehirn durch magnetisch aktivierte Zellsortierung
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