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Methodenartikel

Isolierung von hypothalamischen Mikroglia aus frisch perfundiertem adulten Mausgehirn durch magnetisch aktivierte Zellsortierung

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DOI:

10.3791/66769

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6. September 2024

 ,  ,  , 
1University of Bordeaux, INSERM, Neurocentre Magendie

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Wir beschreiben ein Protokoll zur Isolierung von Mikrogliazellen aus dem Hypothalamus der Maus (oder gleichwertigen kleinen Gehirnstrukturen) mittels magnetisch aktivierter Zellsortierung (MACS) in relativ kurzer Zeit. Die MACS-sortierten hypothalamischen Mikroglia können für die ex vivo-Analyse verwendet werden und können für die Durchführung von In-vitro-Assays plattiert werden.

Zusammenfassung

Mikroglia, als die ansässigen Makrophagen des Gehirns, sind für die Aufrechterhaltung der Homöostase des Gehirns unerlässlich. Sie formen neuronale Schaltkreise während der Entwicklung, untersuchen ihre Umgebung nach Ablagerungen oder abgestorbenen Zellen und reagieren auf Infektionen und Verletzungen im Gehirn, um nur einige Funktionen zu nennen. Ihre wichtige Rolle in der Neuroentwicklung und der synaptischen Plastizität und Pathophysiologie ist jedoch noch nicht vollständig definiert, was den Bedarf an weiteren Untersuchungen unterstreicht. Um ein umfassenderes Verständnis der Rolle von Mikroglia in diesen Prozessen zu erlangen, müssen wir Mikroglia isolieren und sie genetisch, metabolisch und funktionell charakterisieren. Die Isolierung von Mikroglia aus erwachsenen Mäusen, insbesondere aus kleinen Gehirnstrukturen, ist jedoch eine Herausforderung, da sie einen kleinen Prozentsatz der gesamten Gehirnzellen ausmachen und die Ausbeute an isolierten Mikroglia oft zu gering ist. Hier ermöglicht uns die magnetische Isolierung von Mikroglia mit CD11b+ -Mikrokügelchen, Mikrogliazellen aus dem Hypothalamus eines frisch durchbluteten adulten Mausgehirns zu sortieren. Die derzeitige Methode ermöglicht es uns, in kurzer Zeit eine relativ hohe Reinheit und Ausbeute zu erreichen und gleichzeitig die Lebensfähigkeit der Zellen zu erhalten.

Einleitung

Mikroglia machen 5-20% der gesamten Nervenzellen aus und sind die einzigen Gliazellen, die von erythromyeloiden Vorläuferzellen im Dottersack abstammen und um den embryonalen Tag herum beginnen, das sich entwickelnde Gehirn zu besiedeln E9.5 1,2. Sie sind langlebige Zellen mit der Fähigkeit, sich langsam und unabhängig von Zellen aus dem Knochenmark zu erneuern3. Als einige der hochdynamischsten Zellen sind sie in der Lage, als Reaktion auf Kontext- und Umweltreize verschiedene Phänotypen anzunehmen 2,4. Unter den Signalen, die in der Lage sind, ihre Aktivität zu modulieren, sind die Schädigung des Zentralnervensystems (ZNS), die neuronale Aktivität sowie die Nährstoffe am stärksten. Eine zunehmende Zahl von Forschungsarbeiten hat die zentrale Rolle von Mikroglia bei Verletzungen, neurodegenerativen Erkrankungen und Fettleibigkeit gezeigt 2,5,6. Nichtsdestotrotz bedarf die genaue Rolle der Mikroglia sowohl in physiologischen Prozessen als auch in der Pathophysiologie weiterer Untersuchungen. Daher ist ihre transkriptionelle, metabolische und funktionelle Charakterisierung unter verschiedenen Bedingungen von großer Bedeutung und erfordert ihre Isolierung, da in situ Studien für die DNA-, RNA- und Proteinlokalisierung und qualitative Vergleiche sowie die morphologische Charakterisierung von Mikroglia geeignet sind.

Für die Isolierung von Mikroglia werden verschiedene Techniken beschrieben, darunter die Percoll-Gradientenmethode7, die Durchflusszytometrie-Zellsortierung (FACS)8 und die magnetisch aktivierte Zellsortierung (MACS). Die Auswahl der geeigneten Methode hängt von den Zielen der Studie und dem für nachgelagerte Anwendungen erforderlichen Reinheitsgrad ab. Die Isolierung reiner Mikroglia aus dem erwachsenen Mausgehirn, insbesondere aus kleinen Hirnstrukturen wie dem Hypothalamus, ist aufgrund der begrenzten Anzahl von Mikrogliazellen eine Herausforderung. Die automatisierte sanfte Dissoziation des Hypothalamus mit Hilfe der Miltenyi-Technologie ermöglicht die Aufreinigung einer relativ hohen Mikroglia-Ausbeute in kurzer Zeit mit der Möglichkeit, bis zu acht Proben gleichzeitig mit einem schonenden MACS Octo Dissoziator zu verarbeiten.

Auf die Gewebehomogenisierung folgt die Aufreinigung der Mikroglia mit der säulenbasierten MACS-Technologie und den supermagnetischen CD11b+-Kügelchen in Nanogröße. Daher werden alle Proben auf genau die gleiche Weise verarbeitet, wodurch intakte CD11b+-Zellen erhalten werden. Bemerkenswert ist, dass CD11b nicht ausschließlich in Mikroglia vorkommt, sondern auch auf anderen Zellen der myeloischen Linie, einschließlich Makrophagen und Monozyten, exprimiertwird 9. Um dies zu begrenzen, gewährleistet die Perfusion des Gehirns mit eiskalter Kochsalzlösung vor der Hypothalamusextraktion (siehe Protokollschritt 2.6) die Eliminierung der meisten myeloischen Zellen, so dass nur ein potenziell kleiner Teil der residenten Makrophagen oder derjenigen, die an Blutgefäßen haften, übrig bleibt. Die residenten Makrophagen und Monozyten eines gesunden Steady-State-ZNS machen einen geringen Prozentsatz der gesamten Immunzellen des Gehirns aus (~10% bzw. <2%)10,11. Wenn Gehirnzellen mit CD11b+-Kügelchen sortiert werden, können daher sowohl Mikroglia als auch Makrophagen isoliert werden, obwohl die überwiegende Mehrheit Mikroglia sind.

Die Endausbeute von Mikroglia und die Aufrechterhaltung ihrer Lebensfähigkeit ermöglichen es uns, sowohl ex vivo als auch in vitro Assays durchzuführen, mit dem Vorteil, dass bestimmte Hirnregionen von Interesse analysiert werden können. Die neuesten Erkenntnisse haben gezeigt, dass die Mikroglia-Population sehr heterogen ist und die regionsspezifische Genexpression sowie morphologische Merkmale und Funktionen repräsentiert 2,12,13. Daher zielt das aktuelle Protokoll darauf ab, adulte Mikroglia regionenspezifisch zu isolieren und zu analysieren. In der Tat können wir die genetischen, transkriptionellen und translationalen Profile adulter hypothalamischer Mikroglia mit Methoden wie RT-qPCR und RNA-Sequenzierung sowie mit in vitro-Funktionsanalysen charakterisieren.

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Protokoll

Alle beschriebenen Tierversuche wurden in strikter Übereinstimmung mit den Empfehlungen der Europäischen Union (2013/63/EU) durchgeführt und von der lokalen Ethikkommission der Universität Bordeaux (CEEA50) und dem französischen Ministerium für Hochschulbildung, Forschung und Innovation genehmigt (nicht-technische Zusammenfassung des genehmigten Projekts NTS-FR-619193 v.1 vom 23.12.2022).

Das folgende Protokoll wird an adulten C57BL/6-Mäusen mit einem Durchschnittsalter von 2-4 Monaten durchgeführt. Sie könnte jedoch bei allen Mäusen durchgeführt werden, wobei zu berücksichtigen ist, dass die Immunzelllandschaft des ZNS verändert und der Prozentsatz der ansässigen Makrophagen und Monozyten erhöht sein kann (z. B. bei Alterung und Neurodegeneration).

1. Herstellung von Lösungen

HINWEIS: Die folgenden Volumina und Lösungen beziehen sich ausschließlich auf die Isolierung von Cd11b+-Zellen.

  1. Bestimmen Sie das erforderliche Gesamtvolumen von D-PBS/0,5 % Rinderserumalbumin (BSA) basierend auf der Anzahl der Proben. Bereiten Sie die Lösung mit dem handelsüblichen D-PBS mit Calcium- und Magnesium- und BSA-Pulver vor (siehe Materialtabelle).
  2. Bereiten Sie markierte Dissoziationsröhrchen (C-Röhrchen) vor und füllen Sie jedes mit 1.900 μl Puffer Z, der im Dissoziationskit für das Gehirn für Erwachsene enthalten ist (siehe Materialtabelle). Tauen Sie die Enzyme auf und bewahren Sie sie zusammen mit allen Puffern, die in den folgenden Schritten benötigt werden, auf Eis auf.
  3. Bereiten Sie das entsprechende Volumen von 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) (siehe Materialtabelle), das für die Perfusion (Schritt 2.6) benötigt wird, vor und legen Sie es auf Eis. Berechnen Sie 10 ml für jedes Tier plus 10 % Überschuss.
  4. Für die RT-qPCR-Analyse bereiten Sie einen qPCR-Puffer pro Probe vor: 2,5 μl Thioglycerin + 250 μl Lysepuffer unter Verwendung eines im Handel erhältlichen Kits zur Aufreinigung von RNA (siehe Materialtabelle).
  5. Für die Proteinquantifizierung bereiten Sie einen Lysepuffer her, indem Sie den Phosphatase-Inhibitor-Cocktail und den Protease-Inhibitor-Cocktail 1:100 in einem Säugetier-Extraktionspuffer verdünnen (siehe Materialtabelle).
  6. Für den Nachweis von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) und den Phagozytose-Assay ist 1x HBSS aus dem kommerziell erhältlichen 10x HBSS herzustellen (siehe Materialtabelle). Bereiten Sie dann den FACS-Puffer vor, indem Sie 0,2 % BSA zu 1x HBSS hinzufügen.

2. Entfernung des Gehirns

  1. Betäuben Sie das Tier mit einer Dosis von 20 mg/kg Xylazin; Dann wird die Maus mit einer Überdosis von 400 mg/kg Pentobarbital eingeschläfert und in Rückenlage in eine Präparierschale gelegt.
    HINWEIS: Andere Anästhesiekombinationen zur Einschläferung des Tieres können ebenfalls wirken.
  2. Füllen Sie eine 10 mL Spritze mit 10 mL eiskaltem 1x PBS und befestigen Sie diese an einer Butterfly 21 G Nadel.
  3. Sobald die Maus vollständig betäubt ist (überprüfen Sie dies durch Kneifen der Pfoten, um sicherzustellen, dass keine Reaktion erfolgt), die Atmung aufgehört hat und das Herz flimmert, legen Sie die Haut mit einer Zange fest und öffnen Sie die Brusthöhle mit einer Schere auf Höhe der letzten Rippen und des Brustbeins.
  4. Mache mit der Schere einen tiefen Schnitt entlang der Seiten des Brustkorbs in Richtung der Oberseite des Brustkorbs, um das Herz freizulegen.
  5. Führen Sie die 21 G Nadel in den distalen Teil des linken Ventrikels ein (achten Sie darauf, dass sich etwa 1/3 der Nadel im Ventrikel befindet). Machen Sie sofort mit der Schere einen Schnitt durch den rechten Vorhof.
  6. Infizieren Sie 10 ml eiskaltes 1x PBS, um das Gehirn von zirkulierenden Immunzellen zu reinigen.
    HINWEIS: Überprüfen Sie das Gehirn visuell, um sicherzustellen, dass es sauber und gut durchblutet ist.
  7. Schneiden Sie den Mäusekopf ab, extrahieren Sie vorsichtig das Gehirn und legen Sie es auf eine mit Eis gefüllte und mit Alufolie bedeckte Petrischale.
    HINWEIS: Die Petrischale und die Folie helfen dabei, die Gehirnteile zu sehen. Es ist von Vorteil, eine kühle Umgebung während des Zerkleinerns der Gehirnteile aufrechtzuerhalten, um die Stoffwechselaktivitäten zu begrenzen.
  8. Isolieren Sie den Hypothalamus mit einer Pinzette und schneiden Sie ihn mit Rasierklingen in kleine Stücke.
    1. Um den Hypothalamus zu identifizieren und zu präparieren, stellen Sie das Gehirn auf den Kopf, so dass der Kortex ventral und der Hypothalamus dorsal auf der oberen Oberfläche sichtbar ist. Trennen Sie den Hypothalamus, der sich am unteren Ende des Gehirns auf beiden Seiten des dritten Ventrikels befindet, mit einer gekrümmten Pinzette. Das durchschnittliche Gewicht des Hypothalamus von adulten C57BL/6-Mäusen beträgt 15 mg.
      HINWEIS: Die Hirnteile müssen so klein wie möglich sein (<0,5 mm). Das Schneiden in kleine Stücke ist ein kritischer Schritt, da es eine bessere Dissoziation und eine höhere Ausbeute an Zellen ermöglicht.
  9. Die Stücke des Hypothalamus werden in Dissoziationsröhrchen (C-Röhrchen) gesammelt, die zuvor mit 1.900 μl Puffer Z gefüllt waren (Schritt 1.2).
    HINWEIS: Um eine gute Ausbeute an Mikrogliazellen zu erhalten, die für die Durchführung von Assays ausreicht, sollten mindestens zwei (für die Proteinquantifizierung) oder drei (für qPCR und RNAseq) Hypothalami pro Röhrchen gepoolt werden.

3. Dissoziation des Gewebes

HINWEIS: Alle Schritte müssen auf Eis durchgeführt werden. Verwirbeln Sie die Zellsuspension in keinem Schritt; Nur vorsichtig mit einer 1.000 μL Pipette mischen.

  1. Bereiten Sie die Enzymmischung 2 gemäß Tabelle 1 vor (Berechnung des Gesamtvolumens für alle Röhrchen + 10 % Überschuss). In jedes C-Röhrchen werden 50 μl des in Mischung 1 enthaltenen Enzyms (siehe Tabelle 1) und 30 μl der Enzymmischung 2 gegeben. Alle Enzyme sind im Dissoziationskit für das Gehirngewebe für Erwachsene enthalten (siehe Materialtabelle).
  2. Verschließen Sie die C-Rohre und legen Sie sie kopfüber mit den Heizhalterungen nach Herstellerangaben in den Dissoziator. Führen Sie das Programm 37C_ABDK_02 aus.
  3. Bereiten Sie 15 mL Schnappröhrchen (siehe Materialtabelle) mit 70 μm Sieben darauf vor. Befeuchten Sie das Sieb mit 2 mL D-PBS.
  4. Wenn das Dissoziations-/Aufschlussprogramm beendet ist, entleeren Sie das C-Röhrchen auf das Sieb und kratzen Sie es mit einer 200-μl-Spitze, um den Zellverlust zu reduzieren, indem Sie die Zellfiltration erhöhen und die Anhaftung von Gewebehomogenat auf dem Filter verringern.
  5. Waschen Sie die Tube mit 2 x 5 mL D-PBS, leeren Sie die Waschungen auf das Sieb und kratzen Sie mit einer 200 μL Spitze zwischen den Waschgängen.
  6. Bei 300 × g 10 min bei 4 °C zentrifugieren und den Überstand vollständig absaugen. Das Küvettenpellet wird vorsichtig mit dem entsprechenden Volumen kaltem D-PBS gemäß Tabelle 1 resuspendiert.
  7. Sofort vorsichtig mit 450 μl Dichtegradientenreagenz (Debris Removal Solution, siehe Materialtabelle) mischen und sehr vorsichtig mit 2 mL kaltem D-PBS überlagern (siehe Tabelle 1).
    HINWEIS: Um die verschiedenen Dichtegradientenschichten zu erhalten, muss das D-PBS vorsichtig Tropfen für Tropfen und mit so wenig "Störung" wie möglich 1 mL auf einmal mit einer 1 mL-Pipette überlagert werden.
  8. Zentrifugieren Sie bei 3.000 × g für 10 min bei 4 °C mit langsamer Beschleunigung und langsamer Bremse (wenn 9 voll ist, verwenden Sie 5).
  9. Es bilden sich drei Phasen. Aspirieren Sie die beiden oberen Phasen vollständig und verwerfen Sie sie. Achten Sie darauf, dass Sie die dritte untere Phase nicht ansaugen.
  10. Füllen Sie 1800 μL kaltes D-PBS auf und drehen Sie das Röhrchen 3 Mal vorsichtig um.
  11. Bei 1.000 × g für 10 min bei 4 °C bei voller Beschleunigung und Vollbremsung zentrifugieren und den Überstand vollständig ansaugen. Resuspendieren Sie das Zellpellet vorsichtig, indem Sie langsam mit 2 mL D-PBS/BSA auf und ab pipettieren.

4. Magnetische Isolierung von CD11b+ -Zellen

  1. Bei 300 × g für 10 min bei 4 °C zentrifugieren und den Überstand vollständig absaugen. Das Zellpellet wird vorsichtig in 90 μl Puffer D-PBS/BSA resuspendiert.
  2. 10 μl der CD11b-Mikrokügelchenmischung zugeben und mit der Pipette gut vermischen.
  3. 15 min bei 2-8 °C im Kühlschrank inkubieren, nicht auf Eis; Waschen Sie die Zellen durch Zugabe von 1 ml D-PBS/BSA und zentrifugieren Sie sie 10 Minuten lang bei 4 °C bei 300 × g . Saugen Sie den Überstand vollständig ab. Vorsichtig in 500 μl D-PBS/BSA resuspendieren.
  4. Starten Sie das POSSEL2 Programm auf dem Trennzeichen und befolgen Sie die Anweisungen auf dem Bildschirm. Platzieren Sie die kleinen Säulen (siehe Materialtabelle) in das Magnetfeld.
    HINWEIS: Für die magnetische Zellsortierung können entweder kleine oder große Säulen gewählt werden, je nach der durchschnittlich erwarteten Anzahl von Zellen. Kleine Spalten haben eine Kapazität von bis zu 1 × 107 beschrifteten Zellen und große Spalten bis zu 1 × 108. Bei der Isolierung von Zellen aus kleinen Strukturen, wie z. B. dem Hypothalamus, wird empfohlen, kleine Säulen zu verwenden. Die Volumina der Reagenzien sind bei Verwendung großer Säulen unterschiedlich (siehe Anweisungen des Herstellers).
  5. Benetzen Sie die Säulen (siehe Materialtabelle) mit 500 μl D-PBS/BSA. Wenn die negative Fraktion der Zellen (CD11b-) für die weitere Analyse benötigt wird, legen Sie eine Auffangplatte unter die Säulen und tragen Sie dann die Zellsuspension in die Säulen auf.
  6. Führen Sie drei Waschschritte durch, indem Sie jeweils 500 μl D-PBS/BSA in die Säule geben und jedes Mal darauf warten, dass der Puffer die Säule passiert.
    HINWEIS: Es ist wichtig, dass der obere Teil der Säule nicht austrocknet, daher wird empfohlen, nicht zu warten, bis der gesamte Puffer durchlaufen ist.
  7. Das Gesamtabwasser der CD11b-Fraktion aus den Vertiefungen der Auffangplatte wird in 15-Milliliter-Röhrchen überführt.
  8. Nehmen Sie die Säule aus dem Separator, stellen Sie sie auf ein 5-ml-Röhrchen und pipettieren Sie 1 ml D-PBS/BSA in die Säule.
  9. Spülen Sie die magnetisch markierte Zellfraktion sofort aus, indem Sie den mit der Säule gelieferten Kolben fest ansetzen.
  10. Zählen Sie schließlich CD11b+ -Zellen mit einem Hämazytometer oder einer anderen Methode; Erwarten Sie ~15.000 Zellen pro Hypothalamus.
  11. Die Zellsuspension wird bei 300 ×g 10 min bei 4 ΰC zentrifugiert und der Überstand verworfen.

5. Analysen

  1. Für die RT-qPCR-Analyse resuspendieren Sie die Zellpellets mit qPCR-Puffer (zur Vorbereitung siehe Schritt 1.3) und lagern Sie die Röhrchen bis zur mRNA-Extraktion bei - 80 °C. Isolieren Sie die Gesamt-RNA, verarbeiten und analysieren Sie sie gemäß den MIQE-Richtlinien14. Synthetisieren Sie abschließend cDNA und führen Sie die qPCR mit einem RT-PCR-Gerät durch. In der Materialtabelle finden Sie alle im Handel erhältlichen Kits, die verwendet werden.
  2. Zur Proteinquantifizierung waschen Sie die Zellpellets mindestens 2x mit D-PBS (ohne BSA), um BSA zu eliminieren. Dann resuspendieren Sie die Zellpellets von zwei Hypothalamis mit 20 μl Lysepuffer. Fahren Sie mit der Proteinquantifizierung mit einem Protein-Assay-Kit fort (siehe Materialtabelle).
    HINWEIS: Wir befolgten die Anweisungen des Herstellers15 zur Quantifizierung von Proteinen zur Durchführung des Serin/Threonin-Kinasen-Aktivitätsassays.
  3. Für den Nachweis von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) in Mikrogliazellen resuspendieren Sie das Pellet in 1x HBSS. Behandeln Sie die Zellen gemäß dem Herstellerprotokoll des Kits für den Durchflusszytometrie-Assay (siehe Materialtabelle). Dann resuspendieren Sie die behandelten Zellen in 200 μl FACS-Puffer (zur Vorbereitung siehe Schritt 1.5) und führen Sie FACS durch, um oxidativ gestresste Zellen nachzuweisen.
  4. Für den Phagozytose-Assay inkubieren Sie die sortierten Zellen in D-PBS/BSA mit fluoreszierenden Latexkügelchen (siehe Materialtabelle) für 30 Minuten. Passen Sie die Anzahl der Kügelchen so an, dass sie durchschnittlich 4 Kügelchen pro Zelle haben. Anschließend wird bei 300 × g für 7 min bei 4 °C zentrifugiert, in 200 μl FACS-Puffer resuspendiert und die Fluoreszenzemission mittels FACS (λex 575 nm; λem 610 nm) abgelesen.

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Ergebnisse

Die Bewertung der Endausbeute hängt vom Reinheitsgrad und der Menge der isolierten Zellen ab und kann durch RT-qPCR, Zellzählung und Proteinquantifizierung bestimmt werden. Die Reinheit der isolierten magnetischen Zellen aus dem Hypothalamus wurde durch die Genexpressionsanalyse von CD11b, C1qa, Gad1 und GFAP mittels RT-qPCR bestätigt (Abbildung 1). CD11b und C1qa werden überwiegend von Mikroglia im Steady State exprimiert, CNS16 und Gad1 und GFAP dienen als neuronale...

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Diskussion

Das aktuelle Protokoll stellt die Isolierung von hypothalamischen Mikroglia aus frisch perfundierten adulten Mausgehirnen durch magnetaktivierte Zellsortierung dar. Die oben vorgestellten Ergebnisse bestätigen die Reinheit und Lebensfähigkeit isolierter Zellen sowie die Wirksamkeit dieser Methode zur funktionellen Charakterisierung von Mikroglia ex vivo, z.B. durch phagozytäre Aktivität und Quantifizierung der ROS-Produktion. Klassische Methoden zur Isolierung einer bestimmten Zellpopulation könnten auch für Mik...

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Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass sie keine Interessenkonflikte haben.

Danksagungen

AN wird unterstützt vom Institut Universitaire de France (IUF), der Universität Bordeaux, der französischen Stiftung für Hirnforschung (FRC), der GLN (Lipid-Nutrition Group) und der Nationalen Forschungsagentur (ANR, PRC 2023-MicroNRJ). CA wurde unterstützt von der Fondation pour la Recherche Médicale (FRM-ARF201809006962). Dieses Projekt wurde durch das Forschungs- und Innovationsprogramm Horizon Europe der Europäischen Union im Rahmen der MSCA Doctoral Networks 2021, Nr. 101072759 (FuElThEbRaiNIn healtThYaging and age-related diseases, ETERNITY.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Dissoziationskit für ErwachseneMiltenyi130-107-677Das Kit enthält Puffer Z, Puffer Y, Enzyme A und P, Debris Removal Solution, Puffer A (zum Auflösen von Enzym A).
Albumin Rind FrV BSAEuroMedex04-100-812-C
CD11b (Mikroglia) MikroKügelchen, Mensch und Maus - kleine GrößeMiltenyi130-093-636
CellROX Green Durchflusszytometrie-Assay-KitInvitrogenC10492
Zentrifugenröhrchen, Snap-Pop-Deckel 15 mLCellTreat978449
DPBS, Calcium, Magnesium, Glukose, PyruvatGibco14287-072
gentleMACS C TubesMiltenyi130-093-237
gentleMACS Octo Dissoziator mit HeizernMiltenyi130-096-427
Halt Phosphatase Inhibitor Cocktail (100x)Thermofisher78420
Halt Protease Inhibitor Cocktail, EDTA frei (100x)Thermofisher78437
HBSS (10x), Calcium, Magnesium, kein PhenolrotThermofisher14065056
Latexkügelchen, carboxylatmodifiziertes Polystyrol, fluoreszierend rotSigma-AldrichL3280
LightCycler  480 SYBR Grün I MasterRoche 4707516001Dieses Reagenz wurde zur Durchführung der PCR verwendet.
MACS SmartSeveners (70 & Mikro; m)Miltenyi130-110-916
Micro BCA Protein Assay KitThermofisher23235
m-PER Säugetier-ExtraktionspufferThermofisher78503
MS SäulenMiltenyi130-042-201Im Protokoll als kleine Säulen bezeichnet.
MultiMACS Cell24 Separator PlusMiltenyi130-098-637
PBSS, pH 7,4 Thermofisher10010023
qScript XLT cDNA SuperMixQuanta biosciences733-1177Das Kit wurde zur Syntesize von cDNA verwendet.
ReliaPrep RNA Miniprep SystemsPromegaZ6011Das Kit enthält 1-Thioglycerol und BL-Puffer (im Protokoll als Lysepuffer bezeichnet) und wurde zur Isolierung von Gesamt-RNA verwendet.
Vacutainer safety-lok 21 GBecton Dickinson367282

Referenzen

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