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Methodenartikel

Isolierung, Reinigung und Identifizierung von Bacitracin-produzierenden Bacillus licheniformis aus frischem Kot gesunder Schweine

1.3K Aufrufe

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DOI:

10.3791/66777

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31. Mai 2024

 , 
1College of Biotechnology and Pharmaceutical Engineering, Nanjing Tech University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Protokoll bietet eine vollständige und umfassende Beschreibung des detaillierten Prozesses zur Isolierung, Reinigung und Identifizierung von Bacitracin-produzierenden Bacillus licheniformis aus gesundem Schweinekot.

Zusammenfassung

Bacillus licheniformis und Bacitracin haben einen riesigen Anwendungsmarkt und Wert in den Bereichen Medizin, Chemie, Aquakultur, Landwirtschaft und Nebenprodukte. Daher ist die Selektion von B. licheniformis mit hoher Produktion von Bacitracin von großer Bedeutung. In diesem Versuchsprotokoll wurde Bacillus mit einer hohen Ausbeute an Bacitracin isoliert, gereinigt und aus dem frischen Kot gesunder Schweine identifiziert. Die hemmende Wirkung des Sekundärmetaboliten Bacitracin auf Micrococcus luteus wurde ebenfalls getestet. Für den qualitativen und quantitativen Nachweis von Bacitracin wurden die Dünnschichtchromatographie und die Hochleistungsflüssigkeitschromatographie eingesetzt. Die physiologischen und biochemischen Eigenschaften von B. licheniformis wurden mit entsprechenden Kits bestimmt. Die phylogenetischen Verwandtschaftsverhältnisse von B. licheniformis wurden mittels Gensequenzdetektion bestimmt und konstruiert. Dieses Protokoll beschreibt und stellt den standardmäßigen Isolierungs-, Reinigungs- und Identifizierungsprozess von B. licheniformis aus tierischem Frischkot aus mehreren Perspektiven vor und bietet eine Methode für den großflächigen Einsatz von B. licheniformis und Bacitracin in Fabriken.

Einleitung

Bacillus licheniformis ist eine Bacillus-Art aus der Familie der Firmicutes, die in verschiedenen Umgebungen wie Wasser, Boden und Tierdärmen weit verbreitet ist1. B. licheniformis hat eine kurze und kräftige, stäbchenartige Struktur und bewegt sich einzeln2. Die Kolonie ist fast rund und stumpf, mit einer mittleren Wölbung und sauberen Rändern von grauweißer3. Es hat eine starke Wachstums- und Fortpflanzungsfähigkeit und kann Nährstoffe aus verschiedenen Kohlenstoffquellen wie Monosacchariden, Polysacchariden, Ketose und organischen Säuren aufnehmen und verwerten4. In der späteren Wachstums- und Entwicklungsphase kann B. licheniformis in Form von ruhenden Sporen existieren und antibakterielle Substanzen wie Bacitracin, Lichenysin und Surfactin produzieren. Es kann auch Nährstoffmangel und extremen äußeren Einflüssen widerstehen5. Es gibt keine offensichtliche Codon-Präferenz, und das effiziente Sekretionssystem bestimmt die heterologe Proteinsekretion von B. licheniformis, die doppelt so hoch ist wie die von Bacillus subtilis6. Es wird häufig zur Herstellung von Enzympräparaten wie Protease, Amylase und Cellulase7 verwendet. Aufgrund seines Mangels an endogenen Toxinen ist er als lebensmittelechter Stamm zertifiziert und von der EFSA8 im QPS aufgeführt. Daher gibt es mehrere potenzielle Anwendungen, einschließlich der Herstellung bioaktiver Verbindungen, die ein breites Anwendungsspektrum in der Aquakultur, Landwirtschaft, Lebensmittel-, Biomedizin- und Pharmaindustrie haben. Außerdem ist B. licheniformis ein wichtiger Bestandteil der tierischen Darmflora, der Tiere dazu ermutigen kann, die Produktionsleistung zu verbessern, das Gleichgewicht der Darmflora zu verbessern und Krankheiten vorzubeugen. Das gesamte Genom von B. licheniformis ATCC14580 wurde 2004 analysiert, und die Hintergrundinformationen zur Transkriptionstranslation, zur Proteinfaltung und zum Sekretionsmechanismus wurden nach und nach verstanden9. Diese genetische Information begünstigt die genetische Veränderung auf molekularer Ebene und trägt dazu bei, die großflächige Produktion von B. licheniformis zu erleichtern.

Bacitracin ist ein dodekacyclisches Peptidantibiotikum, das durch nicht-ribosomale Peptidsynthetase durch Sekundärstoffwechsel in B. subtilis und B. licheniformis produziert wird. Bacitracin ist eine Mischung, die aus verschiedenen Komponenten wie Bacitracin A, B und C besteht, wobei sich eine oder zwei Aminosäuren zwischen jeder Komponente unterscheiden. Unter diesen hat Bacitracin A die stärkste biologische Aktivität10. Bacitracin kann grampositive Bakterien wie Staphylococcus und Micrococcus luteus sowie einige gramnegative Bakterien hemmen, indem es die Zellwandbildung hemmt und mit membranbindenden Proteinen interagiert11. In der Zwischenzeit ist Bacitracin sicher und stabil, es ist nicht leicht, Arzneimittelresistenzen zu erzeugen, und kann mit anderen antibakteriellen Arzneimitteln kompatibel sein12. Daher wird Bacitracin in der medizinischen und veterinärmedizinischen Praxis eingesetzt. Darüber hinaus kann es aufgrund seiner schnellen Eliminationsrate und seiner geringen Absorptionsrate auch als Zusatzstoff für Tierfutter verwendet werden13.

B. licheniformis kann den Darm besiedeln und das gastrointestinale Mikromilieu verbessern. Die Adhäsions- und Fortpflanzungsfähigkeit und die damit verbundenen physiologischen Funktionen von Bacillus aus verschiedenen Quellen im Magen-Darm-Trakt verschiedener Tiere sind unterschiedlich. Vom Schwein abgeleitete B. licheniformis ist förderlicher für die Besiedlung des Darms von Schweinen und anderen Nutztieren. Es besteht ein enger Zusammenhang zwischen der relativen Häufigkeit von intestinalen Probiotika und dem Gesundheitszustand von Wirt14. Die Nahrungsergänzung mit B. licheniformis-Mix bei abgesetzten Ferkeln verbessert das Darmökosystem durch Veränderung der Zusammensetzung der Mikrobiota und der Stoffwechselaktivität und wirkt sich auch auf die Darmschleimhautaus 15. Tierischer Kot kann die Art und Menge der tierischen Darmflora widerspiegeln. Dieses Protokoll beschreibt die Isolierung und Reinigung von Bacitracin-produzierenden Bacillus spp. aus gesundem Schweinekot. Der Kot stammt von Taihu-Sauen, die nicht mit Mischfutter gefüttert werden und in Schweinefarmen eine hervorragende Produktionsleistung aufweisen. Die Isolate wurden aufgrund ihrer morphologischen Eigenschaften, ihrer physikalisch-chemischen Eigenschaften und ihrer biochemischen Identifizierung als B. licheniformis identifiziert.

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Protokoll

Alle experimentellen Verfahren wurden von der Ethikkommission der Nanjing Tech University dokumentiert und genehmigt. Der Kot stammt von Taihu-Sauen, die etwa 2 Jahre alt sind (siehe Materialtabelle), die auf professionellen und Standard-Schweinefarmen aufgezogen wurden.

1. Vorbereitung der Medien

  1. Luria-Bertani (LB) Flüssigmedium: 10 g NaCl, 5 g Hefeextraktpulver und 10 g Trypton in eine konische Flasche geben, destilliertes Wasser auf 1 l geben, umrühren und mit einem Glasstab auflösen. Füllen Sie 100 mL Medium in eine konische 500-ml-Flasche und binden Sie sie fest mit atmungsaktiver Siegelfolie. Bei 121 °C im Autoklaven für 20 min sterilisieren (siehe Materialtabelle).
  2. LB Festmedium: 10 g NaCl, 5 g Hefeextraktpulver, 10 g Trypton und 20 g Agarpulver in eine konische Flasche geben, destilliertes Wasser auf 1 l geben, mit einem Glasstab auflösen und mit einer atmungsaktiven Dichtungsfolie fest binden. Bei 121 °C im Autoklaven für 20 min sterilisieren. Wenn das Medium auf 50 °C abgekühlt ist, gießen Sie 20 ml des Mediums in Petrischale, lassen Sie sie abkühlen und lagern Sie sie dann auf dem Kopf.
  3. Bacitracin-Fermentationsmedium: Geben Sie 8 g Sojaschrot, 4 g lösliche Stärke, 0,1 g (NH4)2SO4, 0,6 g CaCO3 und 100 ml destilliertes Wasser in eine konische 500-ml-Flasche, rühren Sie mit einem Glasstab um, um es gründlich aufzulösen, und binden Sie es mit einer atmungsaktiven Dichtungsfolie fest. Bei 121 °C im Autoklaven für 20 min sterilisieren (siehe Materialtabelle).
  4. M. luteus-Suspension : Wählen Sie einen Ring aus M. luteus und inokulieren Sie auf einer LB-Kulturplatte, die in Schritt 1.2 hergestellt wurde (siehe Materialtabelle). In einem Inkubator mit konstanter Temperatur bei 37 °C für 16 h kultivieren (siehe Materialtabelle). Geben Sie 5 ml normale Kochsalzlösung in die Platte und schütteln Sie sie leicht, um die Kolonien zu eluieren. Messen Sie den OD600 und verdünnen Sie die Lösung in einem Reagenzglas, um eine Suspension mit OD600 von 0,3-0,7 zu erhalten. Die Suspension von M. luteus zur späteren Verwendung bei 4 °C lagern.
  5. Testmedium für antibakterielle Aktivität: 1 ml M . luteus-Suspension , hergestellt in Schritt 1.4, zu 100 ml flüssigem LB-Festmedium, hergestellt in Schritt 1.2, geben und leicht schütteln. Nehmen Sie sofort 5 ml dieser Lösung, die M. luteus enthält, und verteilen Sie sie gleichmäßig auf der LB-Kulturplatte.

2. Isolierung und Reinigung von Bacillus aus frischem Kot gesunder Schweine

  1. 9 ml normale Kochsalzlösung und 1,0 g frischen Schweinekot in einen 150 ml Erlenmeyerkolben geben. Mit einem Magnetrührer (siehe Materialtabelle) bei Raumtemperatur bei 60 U/min/min 15 min rühren.
  2. Geben Sie den Stuhlextrakt für 20 Minuten in ein 80 °C warmes Thermostat-Wasserbad (siehe Materialtabelle), um nicht sporenproduzierende Bakterien abzutöten.
  3. Die Suspension in 100 mL flüssiges LB-Medium in einen 250-ml-Erlenmeyerkolben geben und in einem Schüttler (siehe Materialtabelle) bei 180 U/min/min bei 37 °C für 8 h kultivieren.
  4. Führen Sie eine serielle Verdünnung der kultivierten Bakterienlösung mit normaler Kochsalzlösung von 10-1 bis 10-8 durch. Tragen Sie 0,1 ml 10-6, 10-7 und 10-8 bakterielles Verdünnungsmittel auf einzelne LB-Kulturplatten auf und lassen Sie es trocknen. Nach 10 min die Platten kopfüber in einen Inkubator mit konstanter Temperatur bei 37 °C für 48 h stellen.
  5. Verwenden Sie den Impfring, um die Kolonien auszuwählen, die B. licheniformis ähnlich sehen (cremeweiße Farbe, weiche Konsistenz, mukoides Aussehen, konvexe und flache Erhebung und unregelmäßige Form)16, und streifen Sie sie mit einem Zickzackmuster auf dem in Schritt 1.5 hergestellten Assay-Medium für die antibakterielle Aktivität (siehe Abbildung 1).
  6. Legen Sie die Platten für 48 h bei 37 °C in den Inkubator und beobachten Sie, ob sich um das Volk herum eine Hemmzone befindet.

3. Screening auf Hemmung der Aktivität von M. luteus

  1. Wählen Sie eine einzelne Kolonie aus, die eine inhibitorische Zone erzeugt hat, und geben Sie 100 ml LB flüssiges Medium in den Shaker, kultivieren Sie sie im Schüttler bei 37 °C und 180 U/min für 12 Stunden.
  2. 5 ml des Nährmediums werden in das in Schritt 1.3 hergestellte Bacitracin-Fermentationsmedium inokuliert und 48 h lang bei 37 °C kultiviert.
  3. Die Fermentationsbrühe in einem Zentrifugenröhrchen auffangen und bei 13.400 x g bei 4 °C für 15 min zentrifugieren und anschließend mit einer 0,22 μm mikroporösen Filtermembran filtrieren (siehe Materialtabelle).
  4. Geben Sie einen Oxford-Becher in eine frische Platte mit antibakterieller Aktivität und geben Sie dann 50 μl Filtrat (Fermentationsüberstand) in den Oxford-Becher (siehe Materialtabelle). Kultur im Inkubator bei 37 °C für 12 h. Nach der Inkubation ist der Durchmesser der Hemmzone mit einem Messschieber zu messen (siehe Materialtabelle).
  5. Für nachfolgende Versuche werden die Stämme und der entsprechende Fermentationsüberstand mit einem Hemmzonendurchmesser von mehr als 15 mm ausgewählt.

4. Identifizierung von Bacitracin durch Dünnschichtchromatographie

  1. Fügen Sie 60 mg Bacitracin-Standard hinzu und lösen Sie es in 1 % EDTA-2Na (siehe Materialtabelle) in einer volumetrischen 10-ml-Flasche auf, um eine 6,0 mg/ml-Bacitracinlösung herzustellen.
  2. 1 mL des Fermentationsüberstands auf 10 mL mit 1 % EDTA-2Na verdünnen. 5 μl der Probe und 5 μl Bacitracin-Standardlösung auf die aktivierte Kieselgel-Dünnschichtplatte auftragen (siehe Materialtabelle).
  3. Geben Sie 100 ml n-Butanol-essigsäure-Wasser-Pyridin-Ethanol (60:15:10:6:5) in den chromatographischen Tank (siehe Materialtabelle). Legen Sie die dünnschichtige Platte mit Kieselgel in den chromatographischen Tank. Zugedeckt 30 min bei Raumtemperatur ziehen lassen.
  4. Nehmen Sie die Kieselgel-Dünnschichtplatte heraus, sprühen Sie Butanol-Pyridin-Lösung (99:1) mit 1 % Ninhydrin (siehe Materialtabelle) und erhitzen Sie sie 5 Minuten lang bei 105 °C, bis bräunlich-rote Flecken erscheinen. Berechnen Sie Rf (Retentionsfaktorwert) für das Normal und die Probe nach folgender Formel:
    Rf = Spot-Verfahrweg/Lösungsmittel-Verfahrweg.

5. Nachweis von Bacitracin mittels HPLC

  1. 0,3 mL Fermentationsüberstand und 1,2 mL 50%iges Ethanol in ein 2 mL Mikrozentrifugenröhrchen geben, 5 min von Hand schütteln und 12 h bei 4 °C stehen lassen.
  2. Zentrifugieren Sie 15 min lang bei 13.400 x g und filtrieren Sie in eine Probenflasche, die als S1 mit einer 0,22 μm mikroporösen Filtermembran gekennzeichnet ist (siehe Materialtabelle).
  3. Herstellung der Bacitracin-Mutterlösung: Geben Sie 0,4 g Bacitracin-Standard (60 U/mg; siehe Materialtabelle), 100 ml 40 g/l EDTA-2Na (siehe Materialtabelle) in einen 100-ml-Messkolben, um 240 U/ml Bacitracin-Mutterlösung herzustellen.
  4. Geben Sie 3 ml Bacitracin-Mutterlösung und 21, 9, 3, 1 und 0 ml Reinstwasser in Reagenzgläser mit den Bezeichnungen A1, B1, C1, D1 bzw. E1. Nach der Filtration mit einer mikroporösen 0,22-μm-Filtermembran wird das Filtrat in Probenflaschen mit den Aufschriften A2, B2, C2, D2 und E2 gegeben.
    HINWEIS: Die Konzentrationen der Bacitracin-Standardlösung betragen 30, 60, 120, 180 und 240 U/ml.
  5. Legen Sie A2, B2, C2, D2, E2 und S1 in das Testtablett des HPLC-Geräts. Geben Sie 1000 mL 50 mM/L Ammoniumformiat und 1000 mL Acetonitril in das Tablett für die mobile Phase und stellen Sie sie als mobile Phasen A bzw. B ein.
    HINWEIS: Der pH-Wert von Ammoniumformiat sollte mit Ameisensäure auf 4,0 eingestellt werden.
  6. Installieren Sie die C18 (5 μm, 4,6 mm x 250 mm) HPLC-Säule in der auf der Säule angegebenen Richtung (siehe Materialtabelle).
  7. Stellen Sie die Parameter der mobilen Phase auf 0 min, 77 % A und 23 % B ein. 30 min, 70% A und 30% B; 40 min, 60% A und 40% B; 50 min, 60% A und 40% B; 51 min, 77 % A und 23 % B; 58 min, 77 % A und 23 % B. Stellen Sie die Probengröße auf 100 μl ein; Durchflussrate, 1,0 mL/min; Temperatur der Säule, 30 °C.
  8. Klicken Sie auf die Schaltfläche Ausführen , um das Programm auszuführen.

6. Morphologische Identifizierung

  1. Den Stamm verdünnen und mit dem höchsten Bacitracin-Titer auf einer LB-Kulturplatte beschichten und in einem Inkubator bei 37 °C für 48 h kultivieren. Färben und beobachten Sie die Morphologie der Kolonie, wie unten beschrieben.
  2. Geben Sie einen Tropfen steriles, gereinigtes Wasser auf den Objektträger, nehmen Sie eine kleine Menge Kolonien auf und geben Sie es zum Wassertropfen. Gleichmäßig verschmieren, den Objektträger natürlich trocknen lassen und dann über einer Flamme fixieren.
  3. Fügen Sie 1 Minute lang Kristallviolett hinzu, um die Probe zu färben, und spülen Sie sie dann mit Leitungswasser ab. Fügen Sie 1 Minute lang Jod hinzu, um die Probe zu färben, und spülen Sie sie dann mit destilliertem Wasser ab.
  4. Fügen Sie 95% Alkohol hinzu, schütteln Sie den Objektträger, um ihn 1 Minute lang zu entfärben, und spülen Sie ihn dann mit destilliertem Wasser ab.
  5. Fügen Sie 1 Minute lang Safran hinzu, um die Probe zu färben, und spülen Sie sie dann mit destilliertem Wasser ab. Lassen Sie den Objektträger natürlich trocknen und beobachten Sie die Morphologie der Kolonie unter einem Mikroskop mit Öltauchen (siehe Materialtabelle).

7. Physiologische und biochemische Identifizierung

  1. Geben Sie 2 ml sterile Kochsalzlösung in das Reagenzglas und inokulieren Sie eine einzelne Kolonie von der Platte in die sterile Kochsalzlösung mit einem Impfring, um eine Bakteriensuspension zu erhalten.
  2. Geben Sie 100 μl der bakteriellen Suspension in jedes Loch zur Messung von V-P, Citrat, Gelatine, 7 % Natriumchlorid, pH 5,7, Nitratreduktion und Stärkehydrolyse auf dem biochemischen Identifizierungsstreifen von Bacillus (siehe Materialtabelle).
  3. Verwenden Sie den Impfring, um eine weitere einzelne Kolonie auszuwählen und sie im Zickzackmuster auf der biochemischen Röhre des biochemischen Bacillus-Identifikationsstreifens zu streifen.
  4. Verwenden Sie den Impfring, um die anderen Kolonien auszuwählen und sie vertikal in die Poren zu stechen, um Propionat, D-Xylose, L-Arabinose und D-Mannitol auf dem biochemischen Identifizierungsstreifen von Bacillus zu identifizieren.

8. Bestimmung der Stammgensequenz

  1. Extrahieren Sie die DNA des Stammes mit einem Bakterien-DNA-Extraktionskit (siehe Materialtabelle): Geben Sie 2 mL Samenflüssigkeit in ein 5 mL Mikrozentrifugenröhrchen und zentrifugieren Sie 1 Minute lang bei 11.500 x g . Entsorgen Sie den Überstand und geben Sie 110 μl Puffer (enthalten 20 mM Tris, pH8,0; 2 mM Na2-EDTA und 1,2 % Triton) und 70 μl 50 mg/ml Lysozymlösung in das Pellet und inkubieren Sie es 30 Minuten lang bei 37 °C.
  2. 4 μl 100 mg/ml RNase A für 15 s zugeben und 5 min bei Raumtemperatur ruhen lassen. 20 μl Proteinase-K-Lösung zugeben und gut vermischen.
  3. 220 μl Puffer GB zugeben, 15 s schütteln, bis das Pellet suspendiert ist, 10 min bei 70 °C erhitzen, um die Lösung klar zu machen, und eine kurze Drehung durchführen, um die Wasserperlen an der Tubenwand zu entfernen.
  4. 220 μl wasserfreies Ethanol zugeben, 15 s lang vollständig schockieren, kurze Trennung. Die Lösung und die Flockungsfällung werden in die Adsorptionssäule CB3 des Sammelröhrchens überführt, bei 13.400 x g für 30 s zentrifugiert und der Überstand verworfen.
  5. 500 μl Puffer GD in die Adsorptionssäule geben, 30 s bei 13.400 x g zentrifugieren und den Überstand verwerfen. Geben Sie 600 μl PW in die Säule, zentrifugieren Sie 30 s lang bei 13.400 x g und verwerfen Sie den Überstand.
  6. Die Adsorptionssäule wird wieder in das Entnahmeröhrchen eingesetzt, 2 min bei 13.400 x g zentrifugiert und der Überstand verworfen.
  7. Stellen Sie die Adsorptionssäule zum Trocknen 10 Minuten lang bei Raumtemperatur auf. Übertragen Sie die Säule in das Zentrifugenröhrchen und geben Sie 100 μl Eluierungspuffer TE in die Mitte der Adsorptionsmembran.
  8. 5 min bei Raumtemperatur ruhen lassen, um den Durchfluss in das Zentrifugenröhrchen zu sammeln, und 2 min bei 13.400 x g zentrifugieren.
  9. Geben Sie 25 μl 2x Mastermix (siehe Materialtabelle), 2,5 μl DNA-Probe aus Schritt 8.8, 2 μl 27F Forward Primer, 2 μl 1492R Reverse Primer und 18,5 μl doppelt destilliertes H2O in ein 0,1 mL PCR-Röhrchen.
    HINWEIS: Die Gensequenzen der Primer sind 27F: 5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3' und 1492R: 5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'.
  10. Legen Sie das PCR-Röhrchen unter folgenden Bedingungen in die PCR-Maschine (siehe Materialtabelle): Vordenaturierung bei 95 °C für 10 min, Denaturierung bei 95 °C für 30 s, Glühen bei 55 °C für 30 s, Verlängern bei 72 °C für 90 s, Verlängern bei 72 °C für 7 min. Führen Sie den Drei-Schritte-Zyklus Denaturierung, Glühen und Verlängern 32x lang durch.
  11. Nehmen Sie 5 μl des Produkts und führen Sie eine Elektrophorese mit 1% Agarosegel bei 120 V für 30 min durch.
    1. 500 mg Agarose in 50 mL 1x TAE-Puffer auflösen. Die Lösung 1-2 min in der Mikrowelle erhitzen, bis sich die Agarose vollständig aufgelöst hat. Fügen Sie 5 μl DNA-Färbefarbstoff hinzu, gießen Sie es in eine Gelschale und setzen Sie die Blende ein. 30 Minuten bei Raumtemperatur stehen lassen, bis es fest wird; Geben Sie das Gel in den Elektrophoresetank und fügen Sie 1x TAE-Puffer hinzu, um das Gel einzutauchen. Geben Sie 2 μl 2 kb DNA-Leiter (10 mg/μl) in die erste Vertiefung und 5 μl PCR-Produkt, gemischt mit 1 μl Ladefarbstoff, in die verbleibenden Vertiefungen im Gel.
  12. Legen Sie das Gel in das Gel-Imaging-System und machen Sie ein Foto. Schneiden Sie die DNA-Streifen schnell unter ultraviolettem Licht ab und wiegen Sie sie.
  13. Geben Sie Streifen in ein Mikrozentrifugenröhrchen und fügen Sie ein gleiches Volumen PN-Lösung hinzu. Halten Sie die Tube im Wasserbad bei 50 °C, bis sich das Gel vollständig aufgelöst hat.
  14. 500 μl Gleichgewichtsflüssigkeit BL in die Adsorptionssäule CA2 geben, 1 min bei 13.400 x g zentrifugieren und den Überstand verwerfen.
  15. Geben Sie die gelöste Gellösung in die Adsorptionssäule CA2 und stellen Sie sie 2 Minuten lang bei Raumtemperatur, zentrifugieren Sie sie 30 s lang bei 13.400 x g und verwerfen Sie den Überstand.
  16. 600 μl PW in die Adsorptionssäule CA2 geben, 1 min bei 13.400 x g zentrifugieren, den Überstand verwerfen und 1x wiederholen.
  17. Die Adsorptionssäule CA2 wird in ein Sammelröhrchen gegeben, 2 min lang bei 13.400 x g zentrifugiert und der Überstand verworfen.
  18. Stellen Sie die Adsorptionssäule CA2 10 Minuten lang bei Raumtemperatur auf, um sie gründlich zu trocknen, und legen Sie sie dann in ein sauberes Zentrifugenröhrchen.
  19. Geben Sie 50 μl Eluierungspuffer EB zu dem Adsorptionsfilm, der 2 Minuten lang bei Raumtemperatur suspendiert ist, und sammeln Sie die DNA-Lösung durch Zentrifugation bei 13.400 x g für 2 Minuten.
    HINWEIS: Die oben genannten Lösungen oder Reagenzien sind im Reinigungskit enthalten (siehe Materialtabelle).
    1. Senden Sie die gesammelte DNA-Lösung zur Sequenzierung an ein professionelles Sequenzierungsunternehmen (siehe Materialtabelle). Vergleichen Sie die Sequenzierungsergebnisse von Blast in der GenBank-Datenbank von NCBI. Entsprechend der Sequenzhomologie wählen Sie verschiedene Stämme aus und konstruieren phylogenetische Bäume mit der Maximum-Likelihood-Methode in MEGA-X, um die Artbeziehungen der Stämme zu bestimmen.

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Ergebnisse

In diesem Experiment wurden 48 Bacillus-Stämme aus frischem Kot gesunder Schweine isoliert, die von 1001 bis 1048 nummeriert waren. Darunter zeigten 15 Stämme eine antibakterielle Wirkung gegen M. luteus. Von den 15 Stämmen wurden die Titer von Bacitracin mittels Hochleistungsflüssigkeitschromatographie gemessen, wie in Tabelle 1 dargestellt. Unter ihnen hatte B. licheniformis Nr. 1026 mit 456,35 ± 21,75 U/ml den höchsten Bacitracin-Titer, so dass Nr. 1026 für nachfolgende Expe...

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Diskussion

B. licheniformis wächst schnell unter einfachen Kulturbedingungen und schnellem Zuckerverbrauch, und die ausgereifte Fermentationstechnologie ist hilfreich bei der Einsparung von industriellen Produktionskosten13. Die breite Anwendung von B. licheniformis und seinen Sekreten, Bacitracin, hat seinen vielversprechenden Marktwert bestimmt. In der Landwirtschaft wird B. licheniformis als Biodünger eingesetzt, um das Pflanzenwachstum und die ...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

Diese Studie wurde vom National Key Research and Development Program of China (Nr. 2022YFC2104800) und dem Six Talent Peaks Project in der Provinz Jiangsu (Nr. 2019-NY-058) unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
2 & mal; Phanta Flash Master MixNanjing Vazyme Biotechnology Co., Ltd., Nanjing, ChinaP252-01
2kb DNA-MarkerBeijing Trans Biotechnology Co., Ltd., Peking, ChinaBM121-01
AcetonitrilShanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd., Shanghai, ChinaA104443
AgarpulverShanghai Macklin Biochemical Technology Co., Ltd., Shanghai, ChinaA800730
AgaroseShanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd., Shanghai, ChinaA104062
Ammoniumsulfat ((NH4)2SO4)Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd., Shanghai, China10002917
Autoklaven-SterilisatorZealway Instrument Inc., Xiamen, ChinaGI36DWS
Bacillus biochemischer IdentifikationsstreifenQingdao Haibo Biotechnology Co., Ltd., Qingdao, ChinaHBIG14
BacitracinShanghai Yuanye Bio-Technology Co., Ltd., Shanghai, ChinaB65740
Bakterien-DNA-ExtraktionskitTiangen Biochemical Technology Co., Ltd., Peking, ChinaDP209
Atmungsaktive DichtungsfolieBeijing Leiborun Biotechnology Co., Ltd.BS-QM-01A
ButanolShanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd., Shanghai, ChinaB433378
C18 (5 μ m, 4,6 & mal; 250 mm) HPLC-SäuleRizhao Kepuno New Material Co., Ltd., Rizhao, ChinaC1805-462510
Calciumcarbonat (CaCO3)Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd., Shanghai, China10005717
ZentrifugeNew Brunswick Scientific Co., Inc., UK5452
Chromatographischer TankNanjing Tenghui Experimental Technology Co., Ltd., Nanjing, ChinaP-1
Konische FlascheSichuan Shubo  Co., Ltd., Chengdu, China18012
Inkubator mit konstanter TemperaturTaist Instrument Co., Ltd., Tianjin, ChinaGH4500
Dikaliumphosphat (K2HPO4)Xilong Chemical Co., Ltd., Guangdong, ChinaXL0015
EDTA-2NaShanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd., Shanghai, ChinaE397526
Elektronische WaageMettler Toledo International Co., Ltd.FA2104
EthylalkoholShanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd., Shanghai, ChinaE130059
Gel Midi AufreinigungskitTiangen Biochemical Technology Co., Ltd., Peking, ChinaDP302
GlasstabChengdu Yibang Kexi Instrument Co., Ltd.1294
GlukoseShanghai Macklin Biochemical Technology Co., Ltd., Shanghai, ChinaD823520
Gram's FärbelösungskitQingdao Haibo Biotechnology Co., Ltd., Qingdao, ChinaHB8278
Hochleistungs-FlüssigkeitschromatographAgilent Technologies, Inc., Kalifornien, Amerika1260
Horizontale Elektrophorese-VorrichtungBeijing Liuyi Biotechnology Co., Ltd., Peking, ChinaDYCP-31DN BIOMATE
ImpfringShanghai Muchen Biotechnology Co., Ltd., Shanghai, China3171026
MagnetrührerWiggens GmbH Co., Ltd., DeutschlandWH220 PLUS
MethylalkoholShanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd., Shanghai, ChinaM116115
MikrozentrifugenröhrchenShanghai Muchen Biotechnology Co., Ltd., Shanghai, China1351171
Micrococcus luteusBena Culture Collection, Suzhou, ChinaBNCC102589
Mikroporöse FiltermembranNantong Suri Experimental Equipment Co., Ltd.PES0.22
NinhydrinShanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd., Shanghai, ChinaN105629
Optisches MikroskopFabrik für optische Instrumente, Shanghai, ChinaDYS-108
SchweinekotNanjing Quanfu Schweinefarm, Nanjing, China
Polymerase-Kettenreaktion (PCR) VerstärkerSuzhou Dongsheng Xingye Scientific Instrument Co., Ltd., Suzhou, ChinaETC811
Professionelles SequenzierungsunternehmenGeneral Biology (Anhui) Co., Ltd., Anhui, China
PyridinShanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd., Shanghai, ChinaP111516
ShakerTaicang Qiangle Experimental Equipment Co., Ltd., Taicang, ChinaHYL-C
Kieselgel GF254 DünnschichtplatteYantai Huayang New Material Co., Ltd., Yantai, ChinaHPT-HSGF5025023
Natriumchlorid (NaCl)Shanghai Macklin Biochemical Technology Co., Ltd., Shanghai, ChinaS805275
NatriumcitratSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd., Shanghai, ChinaC39197100001
lösliche StärkeShanghai Macklin Biochemical Technology Co., Ltd., Shanghai, ChinaS817547
Thermostat-WasserbadShanghai Heheng Instrument Equipment Co., Ltd., Shanghai, ChinaDK-8D
TryptonShanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd., Shanghai, ChinaT139519
Ultra GelRedNanjing Vazyme Biotechnology Co., Ltd., Nanjing, ChinaGR501-01
Reinstwasser-InstrumentMerck KGaA Co., Ltd., DeutschlandMilli Direct-Q8
UltraschallreinigerJiangsu Huaguan Electric Appliance Group Co., Ltd., Jiangsu, ChinaSB-100DT
MessschieberSanfeng Company, JapanN20P
HefeextraktpulverVicbio Biotechnology Co., Ltd., Peking, ChinaLP0021

Referenzen

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