Isolierung, Reinigung und Identifizierung von Bacitracin-produzierenden Bacillus licheniformis aus frischem Kot gesunder Schweine

Zusammenfassung

Dieses Protokoll bietet eine vollständige und umfassende Beschreibung des detaillierten Prozesses zur Isolierung, Reinigung und Identifizierung von Bacitracin-produzierenden Bacillus licheniformis aus gesundem Schweinekot.

Zusammenfassung

Bacillus licheniformis und Bacitracin haben einen riesigen Anwendungsmarkt und Wert in den Bereichen Medizin, Chemie, Aquakultur, Landwirtschaft und Nebenprodukte. Daher ist die Selektion von B. licheniformis mit hoher Produktion von Bacitracin von großer Bedeutung. In diesem Versuchsprotokoll wurde Bacillus mit einer hohen Ausbeute an Bacitracin isoliert, gereinigt und aus dem frischen Kot gesunder Schweine identifiziert. Die hemmende Wirkung des Sekundärmetaboliten Bacitracin auf Micrococcus luteus wurde ebenfalls getestet. Für den qualitativen und quantitativen Nachweis von Bacitracin wurden die Dünnschichtchromatographie und die Hochleistungsflüssigkeitschromatographie eingesetzt. Die physiologischen und biochemischen Eigenschaften von B. licheniformis wurden mit entsprechenden Kits bestimmt. Die phylogenetischen Verwandtschaftsverhältnisse von B. licheniformis wurden mittels Gensequenzdetektion bestimmt und konstruiert. Dieses Protokoll beschreibt und stellt den standardmäßigen Isolierungs-, Reinigungs- und Identifizierungsprozess von B. licheniformis aus tierischem Frischkot aus mehreren Perspektiven vor und bietet eine Methode für den großflächigen Einsatz von B. licheniformis und Bacitracin in Fabriken.

Einleitung

Bacillus licheniformis ist eine Bacillus-Art aus der Familie der Firmicutes, die in verschiedenen Umgebungen wie Wasser, Boden und Tierdärmen weit verbreitet ist¹. B. licheniformis hat eine kurze und kräftige, stäbchenartige Struktur und bewegt sich einzeln². Die Kolonie ist fast rund und stumpf, mit einer mittleren Wölbung und sauberen Rändern von grauweißer³. Es hat eine starke Wachstums- und Fortpflanzungsfähigkeit und kann Nährstoffe aus verschiedenen Kohlenstoffquellen wie Monosacchariden, Polysacchariden, Ketose und organischen Säuren aufnehmen und verwerten⁴. In der späteren Wachstums- und Entwicklungsphase kann B. licheniformis in Form von ruhenden Sporen existieren und antibakterielle Substanzen wie Bacitracin, Lichenysin und Surfactin produzieren. Es kann auch Nährstoffmangel und extremen äußeren Einflüssen widerstehen⁵. Es gibt keine offensichtliche Codon-Präferenz, und das effiziente Sekretionssystem bestimmt die heterologe Proteinsekretion von B. licheniformis, die doppelt so hoch ist wie die von Bacillus subtilis⁶. Es wird häufig zur Herstellung von Enzympräparaten wie Protease, Amylase und Cellulase⁷ verwendet. Aufgrund seines Mangels an endogenen Toxinen ist er als lebensmittelechter Stamm zertifiziert und von der EFSA⁸ im QPS aufgeführt. Daher gibt es mehrere potenzielle Anwendungen, einschließlich der Herstellung bioaktiver Verbindungen, die ein breites Anwendungsspektrum in der Aquakultur, Landwirtschaft, Lebensmittel-, Biomedizin- und Pharmaindustrie haben. Außerdem ist B. licheniformis ein wichtiger Bestandteil der tierischen Darmflora, der Tiere dazu ermutigen kann, die Produktionsleistung zu verbessern, das Gleichgewicht der Darmflora zu verbessern und Krankheiten vorzubeugen. Das gesamte Genom von B. licheniformis ATCC14580 wurde 2004 analysiert, und die Hintergrundinformationen zur Transkriptionstranslation, zur Proteinfaltung und zum Sekretionsmechanismus wurden nach und nach verstanden⁹. Diese genetische Information begünstigt die genetische Veränderung auf molekularer Ebene und trägt dazu bei, die großflächige Produktion von B. licheniformis zu erleichtern.

Bacitracin ist ein dodekacyclisches Peptidantibiotikum, das durch nicht-ribosomale Peptidsynthetase durch Sekundärstoffwechsel in B. subtilis und B. licheniformis produziert wird. Bacitracin ist eine Mischung, die aus verschiedenen Komponenten wie Bacitracin A, B und C besteht, wobei sich eine oder zwei Aminosäuren zwischen jeder Komponente unterscheiden. Unter diesen hat Bacitracin A die stärkste biologische Aktivität¹⁰. Bacitracin kann grampositive Bakterien wie Staphylococcus und Micrococcus luteus sowie einige gramnegative Bakterien hemmen, indem es die Zellwandbildung hemmt und mit membranbindenden Proteinen interagiert¹¹. In der Zwischenzeit ist Bacitracin sicher und stabil, es ist nicht leicht, Arzneimittelresistenzen zu erzeugen, und kann mit anderen antibakteriellen Arzneimitteln kompatibel sein¹². Daher wird Bacitracin in der medizinischen und veterinärmedizinischen Praxis eingesetzt. Darüber hinaus kann es aufgrund seiner schnellen Eliminationsrate und seiner geringen Absorptionsrate auch als Zusatzstoff für Tierfutter verwendet werden¹³.

B. licheniformis kann den Darm besiedeln und das gastrointestinale Mikromilieu verbessern. Die Adhäsions- und Fortpflanzungsfähigkeit und die damit verbundenen physiologischen Funktionen von Bacillus aus verschiedenen Quellen im Magen-Darm-Trakt verschiedener Tiere sind unterschiedlich. Vom Schwein abgeleitete B. licheniformis ist förderlicher für die Besiedlung des Darms von Schweinen und anderen Nutztieren. Es besteht ein enger Zusammenhang zwischen der relativen Häufigkeit von intestinalen Probiotika und dem Gesundheitszustand von Wirt¹⁴. Die Nahrungsergänzung mit B. licheniformis-Mix bei abgesetzten Ferkeln verbessert das Darmökosystem durch Veränderung der Zusammensetzung der Mikrobiota und der Stoffwechselaktivität und wirkt sich auch auf die Darmschleimhaut^{aus 15}. Tierischer Kot kann die Art und Menge der tierischen Darmflora widerspiegeln. Dieses Protokoll beschreibt die Isolierung und Reinigung von Bacitracin-produzierenden Bacillus spp. aus gesundem Schweinekot. Der Kot stammt von Taihu-Sauen, die nicht mit Mischfutter gefüttert werden und in Schweinefarmen eine hervorragende Produktionsleistung aufweisen. Die Isolate wurden aufgrund ihrer morphologischen Eigenschaften, ihrer physikalisch-chemischen Eigenschaften und ihrer biochemischen Identifizierung als B. licheniformis identifiziert.

Protokoll

Alle experimentellen Verfahren wurden von der Ethikkommission der Nanjing Tech University dokumentiert und genehmigt. Der Kot stammt von Taihu-Sauen, die etwa 2 Jahre alt sind (siehe Materialtabelle), die auf professionellen und Standard-Schweinefarmen aufgezogen wurden.

1. Vorbereitung der Medien

1. Luria-Bertani (LB) Flüssigmedium: 10 g NaCl, 5 g Hefeextraktpulver und 10 g Trypton in eine konische Flasche geben, destilliertes Wasser auf 1 l geben, umrühren und mit einem Glasstab auflösen. Füllen Sie 100 mL Medium in eine konische 500-ml-Flasche und binden Sie sie fest mit atmungsaktiver Siegelfolie. Bei 121 °C im Autoklaven für 20 min sterilisieren (siehe Materialtabelle).
2. LB Festmedium: 10 g NaCl, 5 g Hefeextraktpulver, 10 g Trypton und 20 g Agarpulver in eine konische Flasche geben, destilliertes Wasser auf 1 l geben, mit einem Glasstab auflösen und mit einer atmungsaktiven Dichtungsfolie fest binden. Bei 121 °C im Autoklaven für 20 min sterilisieren. Wenn das Medium auf 50 °C abgekühlt ist, gießen Sie 20 ml des Mediums in Petrischale, lassen Sie sie abkühlen und lagern Sie sie dann auf dem Kopf.
3. Bacitracin-Fermentationsmedium: Geben Sie 8 g Sojaschrot, 4 g lösliche Stärke, 0,1 g (NH₄)₂SO₄, 0,6 g CaCO₃ und 100 ml destilliertes Wasser in eine konische 500-ml-Flasche, rühren Sie mit einem Glasstab um, um es gründlich aufzulösen, und binden Sie es mit einer atmungsaktiven Dichtungsfolie fest. Bei 121 °C im Autoklaven für 20 min sterilisieren (siehe Materialtabelle).
4. M. luteus-Suspension : Wählen Sie einen Ring aus M. luteus und inokulieren Sie auf einer LB-Kulturplatte, die in Schritt 1.2 hergestellt wurde (siehe Materialtabelle). In einem Inkubator mit konstanter Temperatur bei 37 °C für 16 h kultivieren (siehe Materialtabelle). Geben Sie 5 ml normale Kochsalzlösung in die Platte und schütteln Sie sie leicht, um die Kolonien zu eluieren. Messen Sie den OD600 und verdünnen Sie die Lösung in einem Reagenzglas, um eine Suspension mit OD600 von 0,3-0,7 zu erhalten. Die Suspension von M. luteus zur späteren Verwendung bei 4 °C lagern.
5. Testmedium für antibakterielle Aktivität: 1 ml M . luteus-Suspension , hergestellt in Schritt 1.4, zu 100 ml flüssigem LB-Festmedium, hergestellt in Schritt 1.2, geben und leicht schütteln. Nehmen Sie sofort 5 ml dieser Lösung, die M. luteus enthält, und verteilen Sie sie gleichmäßig auf der LB-Kulturplatte.

2. Isolierung und Reinigung von Bacillus aus frischem Kot gesunder Schweine

1. 9 ml normale Kochsalzlösung und 1,0 g frischen Schweinekot in einen 150 ml Erlenmeyerkolben geben. Mit einem Magnetrührer (siehe Materialtabelle) bei Raumtemperatur bei 60 U/min/min 15 min rühren.
2. Geben Sie den Stuhlextrakt für 20 Minuten in ein 80 °C warmes Thermostat-Wasserbad (siehe Materialtabelle), um nicht sporenproduzierende Bakterien abzutöten.
3. Die Suspension in 100 mL flüssiges LB-Medium in einen 250-ml-Erlenmeyerkolben geben und in einem Schüttler (siehe Materialtabelle) bei 180 U/min/min bei 37 °C für 8 h kultivieren.
4. Führen Sie eine serielle Verdünnung der kultivierten Bakterienlösung mit normaler Kochsalzlösung von ^10-1 bis ^10-8 durch. Tragen Sie 0,1 ml 10-6, ^10-7 und ^10-8 bakterielles Verdünnungsmittel auf einzelne ^{LB-Kulturplatten} auf und lassen Sie es trocknen. Nach 10 min die Platten kopfüber in einen Inkubator mit konstanter Temperatur bei 37 °C für 48 h stellen.
5. Verwenden Sie den Impfring, um die Kolonien auszuwählen, die B. licheniformis ähnlich sehen (cremeweiße Farbe, weiche Konsistenz, mukoides Aussehen, konvexe und flache Erhebung und unregelmäßige Form)¹⁶, und streifen Sie sie mit einem Zickzackmuster auf dem in Schritt 1.5 hergestellten Assay-Medium für die antibakterielle Aktivität (siehe Abbildung 1).
6. Legen Sie die Platten für 48 h bei 37 °C in den Inkubator und beobachten Sie, ob sich um das Volk herum eine Hemmzone befindet.

3. Screening auf Hemmung der Aktivität von M. luteus

1. Wählen Sie eine einzelne Kolonie aus, die eine inhibitorische Zone erzeugt hat, und geben Sie 100 ml LB flüssiges Medium in den Shaker, kultivieren Sie sie im Schüttler bei 37 °C und 180 U/min für 12 Stunden.
2. 5 ml des Nährmediums werden in das in Schritt 1.3 hergestellte Bacitracin-Fermentationsmedium inokuliert und 48 h lang bei 37 °C kultiviert.
3. Die Fermentationsbrühe in einem Zentrifugenröhrchen auffangen und bei 13.400 x g bei 4 °C für 15 min zentrifugieren und anschließend mit einer 0,22 μm mikroporösen Filtermembran filtrieren (siehe Materialtabelle).
4. Geben Sie einen Oxford-Becher in eine frische Platte mit antibakterieller Aktivität und geben Sie dann 50 μl Filtrat (Fermentationsüberstand) in den Oxford-Becher (siehe Materialtabelle). Kultur im Inkubator bei 37 °C für 12 h. Nach der Inkubation ist der Durchmesser der Hemmzone mit einem Messschieber zu messen (siehe Materialtabelle).
5. Für nachfolgende Versuche werden die Stämme und der entsprechende Fermentationsüberstand mit einem Hemmzonendurchmesser von mehr als 15 mm ausgewählt.

4. Identifizierung von Bacitracin durch Dünnschichtchromatographie

1. Fügen Sie 60 mg Bacitracin-Standard hinzu und lösen Sie es in 1 % EDTA-2Na (siehe Materialtabelle) in einer volumetrischen 10-ml-Flasche auf, um eine 6,0 mg/ml-Bacitracinlösung herzustellen.
2. 1 mL des Fermentationsüberstands auf 10 mL mit 1 % EDTA-2Na verdünnen. 5 μl der Probe und 5 μl Bacitracin-Standardlösung auf die aktivierte Kieselgel-Dünnschichtplatte auftragen (siehe Materialtabelle).
3. Geben Sie 100 ml n-Butanol-essigsäure-Wasser-Pyridin-Ethanol (60:15:10:6:5) in den chromatographischen Tank (siehe Materialtabelle). Legen Sie die dünnschichtige Platte mit Kieselgel in den chromatographischen Tank. Zugedeckt 30 min bei Raumtemperatur ziehen lassen.
4. Nehmen Sie die Kieselgel-Dünnschichtplatte heraus, sprühen Sie Butanol-Pyridin-Lösung (99:1) mit 1 % Ninhydrin (siehe Materialtabelle) und erhitzen Sie sie 5 Minuten lang bei 105 °C, bis bräunlich-rote Flecken erscheinen. Berechnen Sie R_f (Retentionsfaktorwert) für das Normal und die Probe nach folgender Formel:
   R_f = Spot-Verfahrweg/Lösungsmittel-Verfahrweg.

5. Nachweis von Bacitracin mittels HPLC

1. 0,3 mL Fermentationsüberstand und 1,2 mL 50%iges Ethanol in ein 2 mL Mikrozentrifugenröhrchen geben, 5 min von Hand schütteln und 12 h bei 4 °C stehen lassen.
2. Zentrifugieren Sie 15 min lang bei 13.400 x g und filtrieren Sie in eine Probenflasche, die als S1 mit einer 0,22 μm mikroporösen Filtermembran gekennzeichnet ist (siehe Materialtabelle).
3. Herstellung der Bacitracin-Mutterlösung: Geben Sie 0,4 g Bacitracin-Standard (60 U/mg; siehe Materialtabelle), 100 ml 40 g/l EDTA-2Na (siehe Materialtabelle) in einen 100-ml-Messkolben, um 240 U/ml Bacitracin-Mutterlösung herzustellen.
4. Geben Sie 3 ml Bacitracin-Mutterlösung und 21, 9, 3, 1 und 0 ml Reinstwasser in Reagenzgläser mit den Bezeichnungen A1, B1, C1, D1 bzw. E1. Nach der Filtration mit einer mikroporösen 0,22-μm-Filtermembran wird das Filtrat in Probenflaschen mit den Aufschriften A2, B2, C2, D2 und E2 gegeben.
   HINWEIS: Die Konzentrationen der Bacitracin-Standardlösung betragen 30, 60, 120, 180 und 240 U/ml.
5. Legen Sie A2, B2, C2, D2, E2 und S1 in das Testtablett des HPLC-Geräts. Geben Sie 1000 mL 50 mM/L Ammoniumformiat und 1000 mL Acetonitril in das Tablett für die mobile Phase und stellen Sie sie als mobile Phasen A bzw. B ein.
   HINWEIS: Der pH-Wert von Ammoniumformiat sollte mit Ameisensäure auf 4,0 eingestellt werden.
6. Installieren Sie die C18 (5 μm, 4,6 mm x 250 mm) HPLC-Säule in der auf der Säule angegebenen Richtung (siehe Materialtabelle).
7. Stellen Sie die Parameter der mobilen Phase auf 0 min, 77 % A und 23 % B ein. 30 min, 70% A und 30% B; 40 min, 60% A und 40% B; 50 min, 60% A und 40% B; 51 min, 77 % A und 23 % B; 58 min, 77 % A und 23 % B. Stellen Sie die Probengröße auf 100 μl ein; Durchflussrate, 1,0 mL/min; Temperatur der Säule, 30 °C.
8. Klicken Sie auf die Schaltfläche Ausführen , um das Programm auszuführen.

6. Morphologische Identifizierung

1. Den Stamm verdünnen und mit dem höchsten Bacitracin-Titer auf einer LB-Kulturplatte beschichten und in einem Inkubator bei 37 °C für 48 h kultivieren. Färben und beobachten Sie die Morphologie der Kolonie, wie unten beschrieben.
2. Geben Sie einen Tropfen steriles, gereinigtes Wasser auf den Objektträger, nehmen Sie eine kleine Menge Kolonien auf und geben Sie es zum Wassertropfen. Gleichmäßig verschmieren, den Objektträger natürlich trocknen lassen und dann über einer Flamme fixieren.
3. Fügen Sie 1 Minute lang Kristallviolett hinzu, um die Probe zu färben, und spülen Sie sie dann mit Leitungswasser ab. Fügen Sie 1 Minute lang Jod hinzu, um die Probe zu färben, und spülen Sie sie dann mit destilliertem Wasser ab.
4. Fügen Sie 95% Alkohol hinzu, schütteln Sie den Objektträger, um ihn 1 Minute lang zu entfärben, und spülen Sie ihn dann mit destilliertem Wasser ab.
5. Fügen Sie 1 Minute lang Safran hinzu, um die Probe zu färben, und spülen Sie sie dann mit destilliertem Wasser ab. Lassen Sie den Objektträger natürlich trocknen und beobachten Sie die Morphologie der Kolonie unter einem Mikroskop mit Öltauchen (siehe Materialtabelle).

7. Physiologische und biochemische Identifizierung

1. Geben Sie 2 ml sterile Kochsalzlösung in das Reagenzglas und inokulieren Sie eine einzelne Kolonie von der Platte in die sterile Kochsalzlösung mit einem Impfring, um eine Bakteriensuspension zu erhalten.
2. Geben Sie 100 μl der bakteriellen Suspension in jedes Loch zur Messung von V-P, Citrat, Gelatine, 7 % Natriumchlorid, pH 5,7, Nitratreduktion und Stärkehydrolyse auf dem biochemischen Identifizierungsstreifen von Bacillus (siehe Materialtabelle).
3. Verwenden Sie den Impfring, um eine weitere einzelne Kolonie auszuwählen und sie im Zickzackmuster auf der biochemischen Röhre des biochemischen Bacillus-Identifikationsstreifens zu streifen.
4. Verwenden Sie den Impfring, um die anderen Kolonien auszuwählen und sie vertikal in die Poren zu stechen, um Propionat, D-Xylose, L-Arabinose und D-Mannitol auf dem biochemischen Identifizierungsstreifen von Bacillus zu identifizieren.

8. Bestimmung der Stammgensequenz

1. Extrahieren Sie die DNA des Stammes mit einem Bakterien-DNA-Extraktionskit (siehe Materialtabelle): Geben Sie 2 mL Samenflüssigkeit in ein 5 mL Mikrozentrifugenröhrchen und zentrifugieren Sie 1 Minute lang bei 11.500 x g . Entsorgen Sie den Überstand und geben Sie 110 μl Puffer (enthalten 20 mM Tris, pH8,0; 2 mM Na_2-EDTA und 1,2 % Triton) und 70 μl 50 mg/ml Lysozymlösung in das Pellet und inkubieren Sie es 30 Minuten lang bei 37 °C.
2. 4 μl 100 mg/ml RNase A für 15 s zugeben und 5 min bei Raumtemperatur ruhen lassen. 20 μl Proteinase-K-Lösung zugeben und gut vermischen.
3. 220 μl Puffer GB zugeben, 15 s schütteln, bis das Pellet suspendiert ist, 10 min bei 70 °C erhitzen, um die Lösung klar zu machen, und eine kurze Drehung durchführen, um die Wasserperlen an der Tubenwand zu entfernen.
4. 220 μl wasserfreies Ethanol zugeben, 15 s lang vollständig schockieren, kurze Trennung. Die Lösung und die Flockungsfällung werden in die Adsorptionssäule CB3 des Sammelröhrchens überführt, bei 13.400 x g für 30 s zentrifugiert und der Überstand verworfen.
5. 500 μl Puffer GD in die Adsorptionssäule geben, 30 s bei 13.400 x g zentrifugieren und den Überstand verwerfen. Geben Sie 600 μl PW in die Säule, zentrifugieren Sie 30 s lang bei 13.400 x g und verwerfen Sie den Überstand.
6. Die Adsorptionssäule wird wieder in das Entnahmeröhrchen eingesetzt, 2 min bei 13.400 x g zentrifugiert und der Überstand verworfen.
7. Stellen Sie die Adsorptionssäule zum Trocknen 10 Minuten lang bei Raumtemperatur auf. Übertragen Sie die Säule in das Zentrifugenröhrchen und geben Sie 100 μl Eluierungspuffer TE in die Mitte der Adsorptionsmembran.
8. 5 min bei Raumtemperatur ruhen lassen, um den Durchfluss in das Zentrifugenröhrchen zu sammeln, und 2 min bei 13.400 x g zentrifugieren.
9. Geben Sie 25 μl 2x Mastermix (siehe Materialtabelle), 2,5 μl DNA-Probe aus Schritt 8.8, 2 μl 27F Forward Primer, 2 μl 1492R Reverse Primer und 18,5 μl doppelt destilliertes H₂O in ein 0,1 mL PCR-Röhrchen.
   HINWEIS: Die Gensequenzen der Primer sind 27F: 5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3' und 1492R: 5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'.
10. Legen Sie das PCR-Röhrchen unter folgenden Bedingungen in die PCR-Maschine (siehe Materialtabelle): Vordenaturierung bei 95 °C für 10 min, Denaturierung bei 95 °C für 30 s, Glühen bei 55 °C für 30 s, Verlängern bei 72 °C für 90 s, Verlängern bei 72 °C für 7 min. Führen Sie den Drei-Schritte-Zyklus Denaturierung, Glühen und Verlängern 32x lang durch.
11. Nehmen Sie 5 μl des Produkts und führen Sie eine Elektrophorese mit 1% Agarosegel bei 120 V für 30 min durch.
    1. 500 mg Agarose in 50 mL 1x TAE-Puffer auflösen. Die Lösung 1-2 min in der Mikrowelle erhitzen, bis sich die Agarose vollständig aufgelöst hat. Fügen Sie 5 μl DNA-Färbefarbstoff hinzu, gießen Sie es in eine Gelschale und setzen Sie die Blende ein. 30 Minuten bei Raumtemperatur stehen lassen, bis es fest wird; Geben Sie das Gel in den Elektrophoresetank und fügen Sie 1x TAE-Puffer hinzu, um das Gel einzutauchen. Geben Sie 2 μl 2 kb DNA-Leiter (10 mg/μl) in die erste Vertiefung und 5 μl PCR-Produkt, gemischt mit 1 μl Ladefarbstoff, in die verbleibenden Vertiefungen im Gel.
12. Legen Sie das Gel in das Gel-Imaging-System und machen Sie ein Foto. Schneiden Sie die DNA-Streifen schnell unter ultraviolettem Licht ab und wiegen Sie sie.
13. Geben Sie Streifen in ein Mikrozentrifugenröhrchen und fügen Sie ein gleiches Volumen PN-Lösung hinzu. Halten Sie die Tube im Wasserbad bei 50 °C, bis sich das Gel vollständig aufgelöst hat.
14. 500 μl Gleichgewichtsflüssigkeit BL in die Adsorptionssäule CA2 geben, 1 min bei 13.400 x g zentrifugieren und den Überstand verwerfen.
15. Geben Sie die gelöste Gellösung in die Adsorptionssäule CA2 und stellen Sie sie 2 Minuten lang bei Raumtemperatur, zentrifugieren Sie sie 30 s lang bei 13.400 x g und verwerfen Sie den Überstand.
16. 600 μl PW in die Adsorptionssäule CA2 geben, 1 min bei 13.400 x g zentrifugieren, den Überstand verwerfen und 1x wiederholen.
17. Die Adsorptionssäule CA2 wird in ein Sammelröhrchen gegeben, 2 min lang bei 13.400 x g zentrifugiert und der Überstand verworfen.
18. Stellen Sie die Adsorptionssäule CA2 10 Minuten lang bei Raumtemperatur auf, um sie gründlich zu trocknen, und legen Sie sie dann in ein sauberes Zentrifugenröhrchen.
19. Geben Sie 50 μl Eluierungspuffer EB zu dem Adsorptionsfilm, der 2 Minuten lang bei Raumtemperatur suspendiert ist, und sammeln Sie die DNA-Lösung durch Zentrifugation bei 13.400 x g für 2 Minuten.
    HINWEIS: Die oben genannten Lösungen oder Reagenzien sind im Reinigungskit enthalten (siehe Materialtabelle).
    1. Senden Sie die gesammelte DNA-Lösung zur Sequenzierung an ein professionelles Sequenzierungsunternehmen (siehe Materialtabelle). Vergleichen Sie die Sequenzierungsergebnisse von Blast in der GenBank-Datenbank von NCBI. Entsprechend der Sequenzhomologie wählen Sie verschiedene Stämme aus und konstruieren phylogenetische Bäume mit der Maximum-Likelihood-Methode in MEGA-X, um die Artbeziehungen der Stämme zu bestimmen.

Ergebnisse

In diesem Experiment wurden 48 Bacillus-Stämme aus frischem Kot gesunder Schweine isoliert, die von 1001 bis 1048 nummeriert waren. Darunter zeigten 15 Stämme eine antibakterielle Wirkung gegen M. luteus. Von den 15 Stämmen wurden die Titer von Bacitracin mittels Hochleistungsflüssigkeitschromatographie gemessen, wie in Tabelle 1 dargestellt. Unter ihnen hatte B. licheniformis Nr. 1026 mit 456,35 ± 21,75 U/ml den höchsten Bacitracin-Titer, so dass Nr. 1026 für nachfolgende Experimente ausgewählt wurde.

Die Identifizierungsergebnisse durch TLC sind in Abbildung 2A dargestellt. Die Position der Hauptflecken in der Fermentationsbrühe des Stammes Nr. 1026 und der Bacitracin-Standardlösung war die gleiche, und der Rf-Wert betrug 0,61. Für die HPLC-Analyse lautet die Standardkurvengleichung von Bacitracin y = 50,287x - 250,55 und der Korrelationskoeffizient R² = 0,9968 (Abbildung 2B). Die Spitzenzeit des Fermentationsüberstands stimmte mit dem Bacitracin-Standard überein (Abbildung 2C), so dass die bakteriostatische Substanz als Bacitracin identifiziert wurde, und der Titer von Bacitracin betrug 456,35 ± 21,75 U/ml.

Die Kolonie des Stammes Nr. 1026 wurde 12 Stunden lang auf LB-Medium kultiviert, wie in Abbildung 3A gezeigt. Die Kolonie war rund und durchsichtig in Form von Wassertropfen, mit vollen Vorsprüngen und sauberen Rändern. Von 12 bis 24 Uhr traten die Bakterien in die späteren Wachstumsstadien ein. Wie in Abbildung 3B zu sehen ist, breiteten sich die Kolonien pflaumenförmig aus, die zentrierte Form faltete sich und die Farbe vertiefte sich allmählich zu milchig-weiß. Sie stimmt mit der Beschreibung der Koloniemorphologie von B. licheniformis^{überein 16}. Am Rand befand sich ein durchsichtiger Schleim. Nach der Gram-Färbung wurde der Stamm Nr. 1026 unter dem Mikroskop beobachtet, wie in Abbildung 3C gezeigt. Bei den Zellen handelte es sich um violette Stäbchen, die auf grampositive Bakterien hindeuteten.

Wie in Tabelle 2 gezeigt, könnte der Stamm Nr. 1026 in einer anaeroben Umgebung wachsen. Der Stamm wurde positiv auf den V-P-Test, die Citratverwertung, die Nitratreduktion und die Stärkehydrolyse getestet. Der Stamm war in der Lage, die meisten Kohlenstoffquellen zu zersetzen und zu nutzen. Es hatte die gleichen physiologischen und biochemischen Eigenschaften wie B. licheniformis.

Die Größe des 16S rDNA-Fragments des Stammes Nr. 1026 betrug etwa 1400 bp (Abbildung 4A). Die Sequenzierungsergebnisse des Stammes Nr. 1026 zeigten eine Ähnlichkeit von 99,58 % mit denen von B. licheniformis DSM 13 in GenBank. Anschließend wurde der phylogenetische Baum konstruiert, wie in Abbildung 4B dargestellt. Die evolutionäre Astlänge von B. licheniformis DSM 13 beträgt 0,000, was darauf hindeutet, dass es sich um B. licheniformis handelt.

Basierend auf den morphologischen, physiologischen und biochemischen Eigenschaften des Stammes Nr. 1026 und der Homologieanalyse der 16S rDNA-Gensequenz wurde der Stamm Nr. 1026 als B. licheniformis identifiziert.

Abbildung 1: Schematische Darstellung der Inokulation des Stammes. Der Impfring wurde verwendet, um die Kolonien auszuwählen und sie in einem Zickzackmuster auf dem Assay-Medium für die antibakterielle Aktivität zu markieren. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Identifizierung bakteriostatischer Substanzen. (A) Dünnschichtchromatographie. (B) HPLC-Standardkurve von Bacitracin. (C) HPLC-Chromatogramm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Morphologische Merkmale und Gram-Färbung des Stammes Nr. 1026. Morphologie der Kolonie bei (A) 12 h und (B) 24 h. (C) Gram-Färbung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4: Molekularbiologische Identifizierung des Stammes Nr. 1026. (A) Genamplifikation des Stammes Nr. 1026 16S rDNA. (B) Phylogenetischer Stammbaum des Stammes Nr. 1026. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

NEIN.	Bacitracin-Titer (U/ml)	NEIN.	Bacitracin-Titer (U/ml)
1003	Tel.: 423.57±18.62 kg	1021	317.46±13.46 Uhr
1004	325.82±13.23 kg	1026	456.35±21.75 kg
1009	326.26±14.52 kg	1027	Tel.: 435.57±19.18
1011	Artikel-Nr.: 376.65±16.11	1030	382.48±17.64 kg
1015	325.27±12.37	1031	215.37±11.73 kg
1016	256.56±15.37 kg	1039	Artikel-Nr.: 353.67±16.16
1017	352.47±16.47 kg	1041	342.36±14.36
1018	328.73±16.12

Tabelle 1: Der Bacitracin-Titer von Stämmen mit antibakterieller Aktivität.

Artikel	Befund	Artikel	Befund
Anaerober Wachstumstest	+	D-Mannitol-Test	+
V.P-Assay	+	Gelatine-Test	+
Test zur Citratnutzung	+	7%NaCl-Test	+
Propionat-Test	+	pH5,7-Test	+
D-Xylose-Test	+	Test zur Nitratreduktion	+
L-Arabinose	+	Stärke-Hydrolyse-Test	+

Tabelle 2: Physiologische und biochemische Identifizierung des Stammes Nr. 1026.

Diskussion

B. licheniformis wächst schnell unter einfachen Kulturbedingungen und schnellem Zuckerverbrauch, und die ausgereifte Fermentationstechnologie ist hilfreich bei der Einsparung von industriellen Produktionskosten¹³. Die breite Anwendung von B. licheniformis und seinen Sekreten, Bacitracin, hat seinen vielversprechenden Marktwert bestimmt. In der Landwirtschaft wird B. licheniformis als Biodünger eingesetzt, um das Pflanzenwachstum und die Nährstoffaufnahme zu verbessern, indem es die Bodenfruchtbarkeit verbessert, die Wurzelentwicklung fördert und den Abbau organischer Substanz unterstützt¹⁵. Für die industrielle Enzymproduktion produziert B. licheniformis eine Reihe von Enzymen wie Proteasen, Amylasen, Cellulasen und Lipasen, was seinen unersetzlichen Marktwert in der Lebensmittelverarbeitung, Waschmittelherstellung, Lederverarbeitung und Textilindustrie bestimmt¹⁶. Angesichts der überlegenen antibakteriellen pharmakologischen Aktivität von B. licheniformis und Bacitracin wurde es im medizinischen Bereich zur Behandlung einer Vielzahl von Infektionskrankheiten eingesetzt, die durch Bakterien und Pilze induziert werden¹. In Anbetracht des Wachstums pflanzlicher Pflanzen sowie der Akkumulation pharmakologisch aktiver Wirkstoffe in Pflanzen ist B. licheniformis ein potenzieller Verstärker des Pflanzenwachstums sowie nützlich für die Produktion von Verbindungen wie dem von Rhodiola abgeleiteten Salidrosid^17,18. Die oben genannten Vorteile von B. licheniformis und Bacitracin machen sie in der Industrie, Landwirtschaft, Aquakultur, Biotechnologie und Medizintechnik weit verbreitet. Daher ist die Abtrennung und Reinigung von B. licheniformis mit einer hohen Ausbeute an Bacitracin ein entscheidender Faktor, um eine spätere großtechnische Produktion und Anwendung zu gewährleisten.

Obwohl Bacitracin durch chemische Synthese hergestellt werden kann, sind die Schritte umständlich und es gibt viele Nebenprodukte. In der Industrie wird Bacitracin hauptsächlich durch den sekundären Stoffwechselprozess von Maismehl und Sojaschrot hergestellt, das von B. licheniformis fermentiert wird. In der modernen industriellen Produktion von Bacitracin behindern hohe Kosten und geringe Ausbeute die weitere Anwendung¹⁰. Daher sind das Screening von Bacitracinstämmen mit hoher Ausbeute und die Verbesserung der Verwertungsrate von Rohstoffen der Schlüssel zur Verbesserung der Produktion von Bacitracin.

Gegenwärtig erfolgt die Züchtung von ertragsstarken Bacitracinstämmen hauptsächlich durch natürliche Züchtung aus dem Boden und anderen Umgebungen, durch Mutationszüchtung unter Verwendung vorhandener Bacitracin-produzierender Stämme oder durch gentechnikbasierte Züchtung. Der natürliche Züchtungsvorgang ist einfach, und die gesiebten Stämme haben eine stabile Produktionskapazität, aber der Prozess dauert lange und der Arbeitsaufwand ist groß. Die Mutationszucht hat eine hohe Mutationsrate und verkürzt die Brutzeit, aber die Mutation kann in den nachfolgenden Generationen möglicherweise nicht stabil vererbt werden¹⁶. Die auf Gentechnik basierende Züchtung zielt eher auf die Gewinnung ertragreicher Stämme ab¹⁰, aber es gibt Sicherheitsbedenken, die durch die Einführung exogener Gene verursacht werden. Gesunder Kot von erwachsenen Tieren enthält reichlich probiotische Ressourcen, die das Gleichgewicht der Flora aufrechterhalten können.

In dieser Arbeit, basierend auf den Eigenschaften von B. licheniformis , ruhende Sporen in extremen Umgebungen^{zu produzieren 19}, wurde eine gesunde Schweinekotverdünnung in einer Hochtemperaturumgebung platziert, um die hitzeresistenten, nicht sporenproduzierenden Bakterien und Pilze abzutöten. Da M. luteus empfindlich auf die Produktion von bakteriostatischen Peptiden durch B. licheniformis im späten Wachstumsstadium reagiert und ein gelbes Pigment zur einfachen Beobachtung produziert, wird es verwendet, um die antibakterielle Aktivität auf der Grundlage der Bewertung der Inhibitionszone zu screenen. Gemäß der Koloniemorphologie, die der Morphologie von B. licheniformis ähnelt, ist die Zellmorphologie kurzstäbchenförmig, grampositiv, physiologische und biochemische Eigenschaften von B. licheniformis, 16 s RNA ist eng mit B. licheniformis verwandt, so dass festgestellt werden kann, dass es sich bei dem Stamm Nr. 1026 um B. licheniformis handelt. Die bakteriostatische Substanz wurde durch TLC und HPLC als Bacitracin identifiziert. So wurde Bacitracin-produzierendes B. licheniformis erhalten. Diese Methode hat auch Mängel, wie z.B. dass der Screening-Prozess lange dauert und die Operation etwas Erfahrung erfordert.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass dieses Versuchsprotokoll umfassend und detailliert in den Erwerb und den routinemäßigen Laboridentifizierungsprozess von Bacitracin-produzierenden B. licheniformis eingeführt wurde, der eine breite Anwendungsperspektive und einen unschätzbaren Marktwert hat²⁰. Diese Methoden sind einfach, durchführbar und leicht umzusetzen und werden zweifellos eine effektive Referenz für die großtechnische Produktion von B. licheniformis sein. Diese Arbeit bietet auch eine Screening-Idee für die Herstellung von Stämmen für andere antimikrobielle Peptide.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
2 & mal; Phanta Flash Master Mix	Nanjing Vazyme Biotechnology Co., Ltd., Nanjing, China	P252-01
2kb DNA-Marker	Beijing Trans Biotechnology Co., Ltd., Peking, China	BM121-01
Acetonitril	Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd., Shanghai, China	A104443
Agarpulver	Shanghai Macklin Biochemical Technology Co., Ltd., Shanghai, China	A800730
Agarose	Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd., Shanghai, China	A104062
Ammoniumsulfat ((NH4)2SO4)	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd., Shanghai, China	10002917
Autoklaven-Sterilisator	Zealway Instrument Inc., Xiamen, China	GI36DWS
Bacillus biochemischer Identifikationsstreifen	Qingdao Haibo Biotechnology Co., Ltd., Qingdao, China	HBIG14
Bacitracin	Shanghai Yuanye Bio-Technology Co., Ltd., Shanghai, China	B65740
Bakterien-DNA-Extraktionskit	Tiangen Biochemical Technology Co., Ltd., Peking, China	DP209
Atmungsaktive Dichtungsfolie	Beijing Leiborun Biotechnology Co., Ltd.	BS-QM-01A
Butanol	Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd., Shanghai, China	B433378
C18 (5 μ m, 4,6 & mal; 250 mm) HPLC-Säule	Rizhao Kepuno New Material Co., Ltd., Rizhao, China	C1805-462510
Calciumcarbonat (CaCO3)	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd., Shanghai, China	10005717
Zentrifuge	New Brunswick Scientific Co., Inc., UK	5452
Chromatographischer Tank	Nanjing Tenghui Experimental Technology Co., Ltd., Nanjing, China	P-1
Konische Flasche	Sichuan Shubo  Co., Ltd., Chengdu, China	18012
Inkubator mit konstanter Temperatur	Taist Instrument Co., Ltd., Tianjin, China	GH4500
Dikaliumphosphat (K2HPO4)	Xilong Chemical Co., Ltd., Guangdong, China	XL0015
EDTA-2Na	Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd., Shanghai, China	E397526
Elektronische Waage	Mettler Toledo International Co., Ltd.	FA2104
Ethylalkohol	Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd., Shanghai, China	E130059
Gel Midi Aufreinigungskit	Tiangen Biochemical Technology Co., Ltd., Peking, China	DP302
Glasstab	Chengdu Yibang Kexi Instrument Co., Ltd.	1294
Glukose	Shanghai Macklin Biochemical Technology Co., Ltd., Shanghai, China	D823520
Gram's Färbelösungskit	Qingdao Haibo Biotechnology Co., Ltd., Qingdao, China	HB8278
Hochleistungs-Flüssigkeitschromatograph	Agilent Technologies, Inc., Kalifornien, Amerika	1260
Horizontale Elektrophorese-Vorrichtung	Beijing Liuyi Biotechnology Co., Ltd., Peking, China	DYCP-31DN BIOMATE
Impfring	Shanghai Muchen Biotechnology Co., Ltd., Shanghai, China	3171026
Magnetrührer	Wiggens GmbH Co., Ltd., Deutschland	WH220 PLUS
Methylalkohol	Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd., Shanghai, China	M116115
Mikrozentrifugenröhrchen	Shanghai Muchen Biotechnology Co., Ltd., Shanghai, China	1351171
Micrococcus luteus	Bena Culture Collection, Suzhou, China	BNCC102589
Mikroporöse Filtermembran	Nantong Suri Experimental Equipment Co., Ltd.	PES0.22
Ninhydrin	Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd., Shanghai, China	N105629
Optisches Mikroskop	Fabrik für optische Instrumente, Shanghai, China	DYS-108
Schweinekot	Nanjing Quanfu Schweinefarm, Nanjing, China
Polymerase-Kettenreaktion (PCR) Verstärker	Suzhou Dongsheng Xingye Scientific Instrument Co., Ltd., Suzhou, China	ETC811
Professionelles Sequenzierungsunternehmen	General Biology (Anhui) Co., Ltd., Anhui, China
Pyridin	Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd., Shanghai, China	P111516
Shaker	Taicang Qiangle Experimental Equipment Co., Ltd., Taicang, China	HYL-C
Kieselgel GF254 Dünnschichtplatte	Yantai Huayang New Material Co., Ltd., Yantai, China	HPT-HSGF5025023
Natriumchlorid (NaCl)	Shanghai Macklin Biochemical Technology Co., Ltd., Shanghai, China	S805275
Natriumcitrat	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd., Shanghai, China	C39197100001
lösliche Stärke	Shanghai Macklin Biochemical Technology Co., Ltd., Shanghai, China	S817547
Thermostat-Wasserbad	Shanghai Heheng Instrument Equipment Co., Ltd., Shanghai, China	DK-8D
Trypton	Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd., Shanghai, China	T139519
Ultra GelRed	Nanjing Vazyme Biotechnology Co., Ltd., Nanjing, China	GR501-01
Reinstwasser-Instrument	Merck KGaA Co., Ltd., Deutschland	Milli Direct-Q8
Ultraschallreiniger	Jiangsu Huaguan Electric Appliance Group Co., Ltd., Jiangsu, China	SB-100DT
Messschieber	Sanfeng Company, Japan	N20P
Hefeextraktpulver	Vicbio Biotechnology Co., Ltd., Peking, China	LP0021