PyOKR: Eine halbautomatische Methode zur Quantifizierung der Fähigkeit zur Verfolgung optokinetischer Reflexe

Zusammenfassung

Wir beschreiben hier PyOKR, eine halbautomatische quantitative Analysemethode, die Augenbewegungen direkt misst, die sich aus visuellen Reaktionen auf zweidimensionale Bildbewegungen ergeben. Eine Python-basierte Benutzeroberfläche und ein Analysealgorithmus ermöglichen einen höheren Durchsatz und genauere quantitative Messungen von Eye-Tracking-Parametern als bisherige Methoden.

Zusammenfassung

Die Untersuchung von Verhaltensreaktionen auf visuelle Reize ist eine Schlüsselkomponente für das Verständnis der Funktion des visuellen Systems. Eine bemerkenswerte Reaktion ist der optokinetische Reflex (OKR), ein hochkonserviertes angeborenes Verhalten, das für die Bildstabilisierung auf der Netzhaut notwendig ist. Das OKR bietet eine robuste Auslesung der Bildverfolgungsfähigkeit und wurde ausgiebig untersucht, um die Schaltkreise und Funktionen des visuellen Systems bei Tieren mit unterschiedlichem genetischem Hintergrund zu verstehen. Das OKR besteht aus zwei Phasen: einer langsamen Tracking-Phase, in der das Auge einem Reiz bis zum Rand der visuellen Ebene folgt, und einer kompensatorischen Fast-Phase-Sakkade, die die Position des Auges in der Augenhöhle zurücksetzt. Bisherige Methoden zur Quantifizierung des Gewinns sind zwar zuverlässig, aber arbeitsintensiv und können subjektiv oder willkürlich abgeleitet werden. Um eine schnellere und reproduzierbare Quantifizierung der Eye-Tracking-Fähigkeit zu erhalten, haben wir ein neuartiges halbautomatisches Analyseprogramm, PyOKR, entwickelt, das die Quantifizierung der zweidimensionalen Eye-Tracking-Bewegung als Reaktion auf jeden Richtungsreiz ermöglicht und an jede Art von Video-Okulographie-Gerät angepasst werden kann. Diese Methode bietet eine automatisierte Filterung, die Auswahl langsamer Tracking-Phasen, die Modellierung vertikaler und horizontaler Augenvektoren, die Quantifizierung von Augenbewegungsgewinnen im Verhältnis zur Reizgeschwindigkeit und die Organisation der resultierenden Daten in einer nutzbaren Tabelle für statistische und grafische Vergleiche. Diese quantitative und optimierte Analysepipeline, die über den PyPI-Import leicht zugänglich ist, ermöglicht eine schnelle und direkte Messung von OKR-Antworten und erleichtert so die Untersuchung visueller Verhaltensreaktionen.

Einleitung

Die Bildstabilisierung beruht auf präzisen okulomotorischen Reaktionen, um den globalen optischen Fluss zu kompensieren, der während der Selbstbewegung auftritt. Diese Stabilisierung wird hauptsächlich durch zwei motorische Reaktionen angetrieben: den optokinetischen Reflex (OKR) und den vestibulo-okulären Reflex (VOR)^1,2,3. Eine langsame globale Bewegung über die Netzhaut induziert das OKR, das eine reflexive Augenrotation in die entsprechende Richtung hervorruft, um das Bild^zu stabilisieren ^1,2. Diese Bewegung, die als langsame Phase bezeichnet wird, wird durch Ausgleichssakkaden unterbrochen, die als schnelle Phase bezeichnet werden, in der sich das Auge schnell in die entgegengesetzte Richtung zurücksetzt, um eine neue langsame Phase zu ermöglichen. Hier definieren wir diese Schnellphasesakkaden als Eye-Tracking-Bewegungen (ETMs). Während das VOR auf das vestibuläre System angewiesen ist, um Augenbewegungen auszulösen, um Kopfbewegungen zu kompensieren³, wird das OKR in der Netzhaut durch das Abfeuern von ON und die anschließende Signalisierung an das Accessory Optic System (AOS) im Mittelhirn initiiert ^4,5. Aufgrund seiner direkten Abhängigkeit von retinalen Schaltkreisen wurde das OKR sowohl in der Forschung als auch im klinischen Umfeld häufig zur Bestimmung der visuellen Tracking-Fähigkeit verwendet ^6,7.

Das OKR wurde ausgiebig als Instrument zur Beurteilung der grundlegenden visuellen Fähigkeiten ^2,6,8, der DSGC-Entwicklung ^9,10,11,12, der okulomotorischen Reaktionen¹³ und physiologischer Unterschiede zwischen den genetischen Hintergründen⁷ untersucht. Die OKR wird an Tieren mit fixiertem Kopf bewertet, denen ein beweglicher Reiz präsentiert wird¹⁴. Okulomotorische Reaktionen werden in der Regel mit einer Vielzahl von Videotools erfasst, und Eye-Tracking-Bewegungen werden als OKR-Wellenformen in horizontaler und vertikaler Richtung erfasst⁹. Um die Tracking-Fähigkeit zu quantifizieren, wurden zwei primäre Metriken beschrieben: die Tracking-Verstärkung (die Geschwindigkeit des Auges im Verhältnis zur Geschwindigkeit des Stimulus) und die ETM-Frequenz (die Anzahl der schnellen Phasenakkaden über einen bestimmten Zeitraum). Die Berechnung der Verstärkung wurde in der Vergangenheit verwendet, um die Winkelgeschwindigkeit des Auges direkt zu messen und die Verfolgungsfähigkeit abzuschätzen. Diese Berechnungen sind jedoch arbeitsintensiv und können auf der Grundlage von Video-Okulographie-Erhebungsmethoden und anschließender Quantifizierung beliebig abgeleitet werden. Für eine schnellere OKR-Bewertung wurde die Zählung der ETM-Häufigkeit als alternative Methode zur Messung der Tracking-Schärfe⁷ verwendet. Obwohl dies eine ziemlich genaue Schätzung der Tracking-Fähigkeit ermöglicht, stützt sich diese Methode auf eine indirekte Metrik zur Quantifizierung der langsamen Phasenreaktion und führt zu einer Reihe von Verzerrungen. Dazu gehören eine Beobachterverzerrung bei der Sakkadenbestimmung, ein Vertrauen auf zeitlich konsistente sakkadische Reaktionen über eine festgelegte Epoche und die Unfähigkeit, das Ausmaß der langsamen Phasenreaktion zu beurteilen.

Um diese Bedenken mit aktuellen OKR-Assessment-Ansätzen auszuräumen und eine tiefgehende Quantifizierung von OKR-Parametern mit hohem Durchsatz zu ermöglichen, haben wir eine neue Analysemethode zur Quantifizierung von OKR-Wellenformen entwickelt. Unser Ansatz verwendet eine zugängliche Python-basierte Softwareplattform namens "PyOKR". Mit dieser Software kann die Modellierung und Quantifizierung von OKR-Slow-Phase-Antworten tiefer und mit erhöhter Parametrisierung untersucht werden. Die Software bietet zugängliche und reproduzierbare quantitative Bewertungen der Reaktionen auf eine Vielzahl von visuellen Reizen sowie zweidimensionales visuelles Tracking als Reaktion auf horizontale und vertikale Bewegungen.

Protokoll

Alle Tierversuche, die an der Johns Hopkins University School of Medicine (JHUSOM) durchgeführt wurden, wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) an der JHUSOM genehmigt. Alle Experimente, die an der University of California, San Francisco (UCSF) durchgeführt wurden, wurden in Übereinstimmung mit Protokollen durchgeführt, die vom UCSF Institutional Animal Care and Use Program genehmigt wurden.

1. Erhebung von Verhaltensdaten

1. Zeichnen Sie OKR-Augenbewegungen mit der Video-Okulographie-Methode der Wahl auf, um Wellendaten zu generieren (d. h. eine Zeitreihe des Blickwinkels des Auges in sphärischen Koordinaten).
   HINWEIS: Repräsentative Daten, die am JHUSOM erhoben wurden, wurden mittels Kopfpostimplantation und Video-Okulographie gewonnen, wie zuvor beschrieben ^9,13 (Abbildung 1). Repräsentative Daten, die von der UCSF erhoben wurden, wurden durch die Kopfimplantationschirurgie und die Video-Okulographie-Methode gewonnen, wie in zuvor¹⁰ beschrieben (Abbildung 7).
   1. Notieren Sie sich die Stimulus- und Aufnahmeparameter: Aufnahmebildrate, Stimulusgeschwindigkeit und -richtung sowie Zeiträume zwischen und nach den Stimulusepochen. Bei sinusförmigen Reizen ist auch die Amplitude und Frequenz der Reizwelle zu beachten.
2. Exportieren Sie gesammelte Wellendaten als . CSV-Datei mit horizontalen und vertikalen (Azimut und Höhe) Wellendaten.
   1. Organisieren Sie Wellendaten als tabulatorgetrennte . CSV-Datei mit zwei Spalten mit horizontalen Daten (epxWave) und vertikalen Daten (epyWave).

2. Installation der Analysesoftware

1. Laden Sie Python herunter und installieren Sie es.
   1. Für die Graphenüberwachung installieren Sie Spyder über Anaconda.
   2. Um sicherzustellen, dass Diagramme in Spyder korrekt funktionieren, gehen Sie zu Tools > Einstellungen > Ipython-Konsole > Grafik > Grafik-Backend. Legen Sie Inline auf Automatisch fest.
2. Erstellen Sie eine neue Anaconda-Umgebung mit Python.
3. Installieren Sie PyOKR über PyPi mit pip install PyOKR , um die neueste Version zusammen mit den Paketabhängigkeiten (Supplementary Coding File 1 und Supplementary Coding File 2) zu installieren.
4. Wenn ein Windows-Computer verwendet wird, führen Sie aus dem PyOKR-Import OKR_win als o und dann o.run() aus.
5. Wenn ein Mac-Computer verwendet wird, führen Sie aus dem PyOKR-Import OKR_osx als o und dann o.run() aus.

3. Analyse der Wellendaten

1. Initialisierung von Analysen und Dateiimporten
   1. Führen Sie o.run() in einem .py Skript aus, um die Benutzeroberfläche zu öffnen.
   2. Verwenden Sie unter Datei die Funktion Öffnen oder den Befehl Strg+O [iOS-Befehl], um einen Browser zu öffnen, der es dem Benutzer ermöglicht, die gewünschte Wave-Datei auszuwählen.
   3. Unter Datei öffnen Sie mit der Schaltfläche Ordner exportieren oder mit dem Befehl Strg+E einen Ordnerbrowser, der die Auswahl eines Ausgabeordners ermöglicht, in den die endgültigen Analysen exportiert werden sollen.
   4. Geben Sie den Namen der endgültigen Analysedatei unter der Ausgabedatei in einem empfohlenen Format ein , z. B. AnimalGenotype_AnimalNumber_Analysis.
   5. Stellen Sie das Programm für ein einzelnes Tier ein, indem Sie den Befehl Betreff unter Datei setzen oder den Befehl Strg+S verwenden, um den Datensatz für ein einzelnes Tier zu initialisieren.
2. Definition von Wavefile-Parametern
   1. Um mit dem Einstellen von Stimulusparametern zu beginnen, definieren Sie die Richtungsabhängigkeit unter Stimulusrichtung auswählen , indem Sie eine der vier Himmelsrichtungen auswählen. Wählen Sie für sinusförmige Stimuli einen Stimulus aus, der entsprechend (Horizontal) oder (Vertikal) enthält, wobei die Himmelsrichtung die Anfangsrichtung der sinusförmigen Welle definiert.
   2. Legen Sie den Stimulus-Typ unter "Stimulus-Typ auswählen " auf "Unidirektional", "Oszillatorisch" oder "Schräg" fest.
   3. Nach dem Einstellen der Richtungsabhängigkeit wird entweder der eigene Stimuluspositionsdatensatz importiert (Eigene Stimulusvektordaten importieren) oder automatisch ein Vektor auf Basis von Parametern generiert (Stimulusvektor aus Parametern generieren). Wenn Sie einen Stimulusvektor importieren, fahren Sie mit 3.2.3.1 fort und fahren Sie dann mit Schritt 3.3 fort. Wenn Sie einen Stimulusvektor erzeugen, fahren Sie mit den nächsten Schritten fort.
      1. Wenn Sie Ihre eigenen Vektordaten importieren, importieren Sie die Entfernungswerte des Stimulus (d.h. eine Zeitreihe, die beschreibt, wie weit sich der Stimulus zwischen den einzelnen benachbarten Erfassungsrahmen bewegt) in dem Format, das in Schritt 3.2.1 beschrieben wurde. Darüber hinaus können Sie den gesamten Datensatz als eine Epoche analysieren, anstatt ihn in einzelne Epochen aufzuteilen, da die Funktion zum Unterteilen des importierten Stimuluswerts ab PyOKR v1.1.2 nicht mehr hinzugefügt wurde.
   4. Legen Sie unter Stimulus-Parameter die Parameter des Stimulus fest, der für die Datenerfassung verwendet wird.
      1. Legen Sie die Zeitdauer fest, in der am Anfang (Kopf) und Ende (Schwanz) eines bestimmten Versuchs kein Stimulus vorhanden ist, mit Kopf und Schwanz.
      2. Legen Sie die Zeitspanne fest, in der ein Stimulus angezeigt wird, die Zeit, in der kein Stimulus danach erfolgt, und die Anzahl der Gesamtepochen innerhalb eines bestimmten Versuchs mit der Länge der Epoche, der Länge des Nachstimulus bzw. der Anzahl der Epochen.
      3. Für unidirektionale und schräge Stimuli stellen Sie die Stimulusgeschwindigkeit in Grad pro Sekunde mit "Horizontale Geschwindigkeit " und "Vertikale Geschwindigkeit" ein.
      4. Legen Sie die Aufnahmerate der Erfassungskamera mit der Bildrate für die Aufnahme fest.
      5. Erzeugen Sie für sinusförmige Stimuli die sinusförmige Welle zur Modellierung oszillatorischer Stimuli mit Frequenz und Amplitude.
   5. Erstellen Sie nach der Parametrisierung das entsprechende Modell aus den oben eingegebenen Stimulusinformationen mit Stimulusvektor aus Parametern generieren.
   6. Wählen Sie eine bestimmte Epoche für den eingegebenen Stimulus aus, indem Sie Epoche auswählen verwenden, um die gesamte Wave-Datei zu durchsuchen.
3. Überwachte Auswahl von Tracking-Phasen
   1. Um Bereiche mit langsamer Verfolgung zu identifizieren, wählen Sie automatisch Sakkaden für schnelle Phasen mit Vorabanpassung aus, indem Sie entweder auf Ungefilterte Daten oder Gefilterte Daten klicken, wodurch potenzielle Sakkaden basierend auf maximalen Geschwindigkeitsänderungen beschriftet werden.
   2. Vergewissern Sie sich unter Ungefilterte Daten, dass Sakkaden korrekt ausgewählt sind, mit einem blauen Punkt. Wenn die automatische Auswahl nicht genau ist, entfernen Sie Punkte manuell mit der linken Maustaste (LMT) oder fügen Sie Punkte mit der rechten Maustaste (RMB) hinzu. Wenn die Sakkaden der schnellen Phase ausreichend ausgewählt sind, speichern Sie die Punkte mit der mittleren Maustaste (MMB) und schließen Sie das Diagramm.
   3. Wenn eine automatische Filterung gewünscht ist, legen Sie einen Z-Score-Schwellenwert fest und klicken Sie auf Gefilterte Daten , um Sakkaden automatisch zu filtern. Verwenden Sie bei Bedarf die gleiche manuelle Aufsicht wie in Schritt 3.3.2 beschrieben, um Geräusche zu entfernen.
   4. Nachdem Sie die Sakkade richtig ausgewählt haben, drücken Sie die Punktanpassung, um den zu entfernenden Bereich auszuwählen. Ändern Sie die oberen und unteren Punkte durch ein ähnliches Steuerungsschema, wie zuvor in Schritt 3.3.2 beschrieben. Bearbeiten Sie die oberen (grünen) Punkte mit der LMT oder der RMB und bearbeiten Sie die unteren (roten) Punkte mit der Umschalt+LMT oder Umschalt+RMB. Wenn die Punkte richtig platziert sind, verwenden Sie die MMB , um die Punkte zu speichern.
      HINWEIS: Wenn Sie einen Mac verwenden, befinden sich die Einstellung des unteren und oberen Punktes über zwei separate Tasten und folgen dem gleichen Steuerungsschema wie in Schritt 3.3.2 beschrieben.
4. Analyse von Slow-Tracking-Phasen
   1. Legen Sie die Reihenfolge des Polynommodells mit Polynomreihenfolge festlegen fest, um das Polynommodell zu definieren, das an einzelne langsame Phasen angepasst wird.
      HINWEIS: Für unidirektionale oder schräge Stimuli ist der Standardwert 1, da Linearität zur Berechnung der Tracking-Verstärkung erforderlich ist. Für sinusförmige Stimuli wird eine höhere Ordnung benötigt, um die Kurve der Welle zu modellieren, mit einem Standardwert von 15.
   2. Um die Kurve zu analysieren, wählen Sie Abschließende Analyse, um die Modelle für langsame Phasen (Abbildung 2) für die ausgewählten langsamen Phasen zu generieren (siehe Abbildung 2A-D) und die Entfernungen, Geschwindigkeiten und Verfolgungsgewinne zu berechnen, die über die Epoche gemittelt werden (Abbildung 2E).
   3. Um das zweidimensionale (2D) oder dreidimensionale (3D) Diagramm der ausgewählten Bereiche anzuzeigen, wählen Sie 2D-Diagramm anzeigen bzw. 3D-Diagramm anzeigen .
   4. Wählen Sie Epoche hinzufügen aus, um die in Schritt 3.4.2 generierten gesammelten Werte zu speichern. Um alle Mehrwerte für ein bestimmtes Tier sowie die Durchschnittswerte für gesammelte Versuche anzuzeigen, wählen Sie Aktuellen Datensatz anzeigen aus.
   5. Nachdem Sie eine Epoche hinzugefügt haben, durchlaufen Sie den Rest der Datei mit Epoche auswählen, indem Sie die Schritte 3.3.1 bis 3.4.4 ausführen.
   6. Sobald eine Wellendatei vollständig analysiert ist, wiederholen Sie diesen Vorgang für alle anderen Dateien für ein bestimmtes Tier, indem Sie neue Dateien öffnen, geeignete Parameter festlegen und sie entsprechend analysieren. Indem Sie die Schritte 3.2.1 bis 3.4.5 für jede Datei wiederholen, generieren Sie einen endgültigen Datensatz, der alle Wellendaten für ein bestimmtes Tier enthält.
5. Endgültiger Export der Daten
   1. Nachdem die Datenanalyse für ein bestimmtes Tier abgeschlossen ist und alle Richtungen oder Reize analysiert wurden, exportieren Sie den Datensatz über Daten exportieren.
      HINWEIS: Der Rohdatensatz wird basierend auf dem Namen der Ausgabedatei exportiert und entlang des vom Ausgabeordner festgelegten Pfads als CSV gespeichert, die einzelne Epochendaten mit dem Gesamtmittelwert für jeden Stimulusparameter enthält.
   2. Nachdem Sie ein einzelnes Tier exportiert haben, initialisieren Sie das Dataset mit Strg+S neu, und wiederholen Sie dann alle vorherigen Schritte, um ein neues Tier zu analysieren.
   3. Bei Bedarf können Sie alle Ausgabedaten, die für mehrere Tiere gesammelt wurden, neu organisieren, um die Analyse zu erleichtern, indem Sie den Befehl Daten sortieren auf der Registerkarte Analyse verwenden.
      HINWEIS: Diese Funktion kompiliert und sortiert alle Durchschnittswerte für alle analysierten Tierdateien, die im Ausgabeordner gespeichert sind, um die Erstellung von Diagrammen und statistischen Vergleichen zu erleichtern. Die Sortierung hängt von der Benennung der Dateien ab v1.1.2 ab. Verwenden Sie das empfohlene Benennungsschema, wie in Schritt 3.1.4 beschrieben, für jede Datei (z. B. WT_123_Analysis).

Ergebnisse

Um die oben beschriebene Analysemethode zu validieren, quantifizierten wir den OKR-Tracking-Gewinn auf Wellenspuren, die von Wildtyp-Mäusen und einer bedingten Knockout-Mutante mit bekanntem Tracking-Defizit gesammelt wurden. Um die breitere Anwendbarkeit unserer Analysemethode zu testen, analysierten wir außerdem Spuren aus einer separaten Kohorte von Wildtyp-Mäusen, die mit einer anderen Video-Okulographie-Erfassungsmethode gewonnen wurden. Die automatische Filterung von Sakkaden erleichtert die OKR-Datenverarbeitung und -analyse (Abbildung 3). Anhand von Aufzeichnungen von unidirektionalen und sinusförmigen Stimuli (Abbildung 1D) berechneten wir die OKR-Tracking-Verstärkungen in den vier Himmelsrichtungen (Abbildung 2F) für Wildtyp-Tiere (n = 13) zu unidirektionalen Stimuli und auch die Tracking-Gewinne als Reaktion auf horizontale und vertikale sinusförmige Stimuli (Abbildung 4). Die Diskrepanz in der Tracking-Fähigkeit in Bezug auf die Stimulusrichtung sowohl für unidirektionale als auch für sinusförmige Stimuli wird konsistent bei allen Wildtyp-Mäusen beobachtet, mit gleich robusten horizontalen Reaktionen, die signifikant höhere Tracking-Gewinne aufweisen als vertikale Reaktionen, wie beschrieben wurde². Darüber hinaus werden asymmetrische Tracking-Gewinne zwischen Aufwärts- und Abwärtsreaktionen auch bei Wildtyp-Mäusen beobachtet, die beide Video-Okulographie-Erfassungsmethoden verwenden, wie bereits berichtet wurde ^2,10. Die relativen Größenordnungen und die Konsistenz der Tracking-Gewinne im Vergleich zur veröffentlichten Charakterisierung von OKR-Antworten deuten darauf hin, dass die mit der Software berechneten Tracking-Gewinne die Tracking-Fähigkeit genau widerspiegeln. Zusätzlich zu den unidirektionalen Verstärkungsberechnungen können horizontale und vertikale Augenbewegungen gleichzeitig modelliert werden (Abbildung 5), was eine dreidimensionale Rekonstruktion der Augenbewegung als Reaktion auf einen gegebenen Reiz ermöglicht. Dies bietet eine zusätzliche Quantifizierungsmöglichkeit, die für zukünftige Studien zur Untersuchung kreuzgekoppelter horizontaler und vertikaler Reaktionen nützlich ist⁹.

Um den Nutzen der Software für die Identifizierung signifikanter Verhaltensänderungen unter verschiedenen experimentellen Bedingungen zu validieren, analysierten wir unsere veröffentlichten Daten⁹ erneut, um zu bestätigen, dass Defizite im vertikalen Tracking, die in dieser Studie durch manuelles Zählen von Fast-Phase-Sakkaden bewertet wurden, sich in den Tracking-Gewinnen unter Verwendung der hier vorgestellten Methodik widerspiegeln. Frühere Arbeiten zeigen, dass die genetische Inaktivierung des Transkriptionsfaktors T-Box Transcription Factor 5 (Tbx5) in der Netzhaut durch bedingten Knockout mit Protocadherin 9-Cre (Pcdh9-Cre) einen spezifischen Verlust von nach oben abgestimmten ON Direction-Selective Ganglion Cells (up-oDSGCs) verursacht, und dass Tbx5 Flox/Flox (Tbx5f/f) ist; Pcdh9-Cre-Mutanten weisen einen spezifischen Verlust des vertikalen OKR-Trackings^{auf 9}. Die quantitative Analyse mit der hier beschriebenen Methode zeigt, dass Tbx5f/f; Pcdh9-Cre-Tiere behalten normale horizontale Verfolgungsgewinne bei (Abbildung 6A), ähnlich denen, die zuvor beschrieben wurden und durch manuelle Zählung von Schnellphasesakkaden (ETMs) erzielt wurden (Abbildung 2F); Diese Mäuse zeigen jedoch einen signifikanten Verlust der vertikalen Nachführung, mit nahezu null Gewinnen als Reaktion auf Aufwärts- und Abwärtsreize (Abbildung 6B,C). Darüber hinaus bestätigt die Analyse sinusförmiger Reaktionen, dass Tbx5 cKO-Tiere größere horizontale Tracking-Gewinne aufweisen, während sie eine signifikant verringerte vertikale Tracking aufweisen (Abbildung 6D-F). Eine Reanalyse dieses zuvor beschriebenen Phänotyps mit PyOKR zeigt die Präzision und Sensitivität dieser neuen Methodik, die quantitative Vergleiche von OKR-Antworten bei Mäusen verschiedener genetischer Stämme ermöglicht.

Schließlich analysierten wir vertikale OKR-Traces vom Wildtyp, die an der UCSF gesammelt wurden, um die Nützlichkeit der Softwareanwendung mit verschiedenen Video-Okulographie-Methoden und Stimulusparametern zu validieren. Die Daten von UCSF wurden mit einem hemisphärischen Projektionssystem gesammelt, bei dem der Maus bewegliche Gitter durch die Reflexion eines Projektors mit einer Wellenlänge von 405 nm auf eine Hemisphäre präsentiert werden, die das kopffixierte Tier¹⁰ umgibt (Abbildung 7A). Unidirektionale vertikale Gitter wurden Mäusen mit einer Geschwindigkeit von 10 Grad pro Sekunde präsentiert, und die OKR-Antworten wurden über 60-s-Intervalle aufgezeichnet (Abbildung 7B,C). Vertikale Traces wurden über den PyOKR quantitativ analysiert und Aufwärtsreaktionen mit Abwärtsantworten verglichen (Abbildung 7D). Die Reaktionen nach oben waren erwartungsgemäß signifikant stärker als nach unten¹⁰; Die Tracking-Gewinne waren jedoch im Vergleich zu den bei JHUSOM aufgezeichneten Spuren leicht geringer (Abbildung 2F). Darüber hinaus wurde die Quantifizierung sinusförmiger Reaktionen mittels PyOKR analysiert (Abbildung 7E), und eine signifikante Asymmetrie in den vertikalen Antworten auf sinusförmig bewegte Reize spiegelt sich in den berechneten Verstärkungen wider (Abbildung 7F). Unterschiede zwischen den bei JHUSOM und UCSF gesammelten Verstärkungswerten können auf Unterschiede zwischen Stimulusparametern zurückgeführt werden, einschließlich unterschiedlicher Stimulusgeschwindigkeiten, -typen und -wellenlängen; Die Gesamtkonsistenz, die wir bei unserer Analyse der mit den einzelnen Erfassungsmethoden gewonnenen Daten beobachten, zeigt jedoch, dass unser PyOKR leicht über unser JHUSOM OKR-Datenerfassungssystem hinaus angepasst und auf andere OKR-Aufzeichnungen angewendet werden kann, unabhängig von Video-Okulographie-Methoden. Diese Ergebnisse zeigen, dass die hier beschriebene Softwareplattform genau ist und allgemein auf die Untersuchung okulomotorischer Reaktionen angewendet werden kann, was präzise quantitative Vergleiche zwischen Tieren verschiedener Gruppen ermöglicht, um die Untersuchung der visuellen Bildstabilisierungsschaltkreise voranzutreiben.

Abbildung 1: Sammlung von OKR-Antwortdaten. (A) OKR-Virtual-Arena-Apparatur zur Verhaltensstimulation, wie zuvor beschrieben ^9,13. Vier Monitore umgeben ein kopffestes Tier (1) und zeigen einen sich kontinuierlich bewegenden Schachbrettreiz (2). Die virtuelle Trommel kann unidirektionale Bewegungen in alle vier Himmelsrichtungen sowie oszillierende sinusförmige Reize darstellen. Das linke Auge der Maus wird von einem Infrarotlicht (IR) beleuchtet und mit einer Kamera (3) aufgezeichnet, um visuelle Systemreaktionen aufzuzeichnen, die sich in der Augenverfolgung widerspiegeln. (B) Die Analyse des Eye-Trackings erfolgt durch Erfassung der Pupille und einer durch IR-Licht erzeugten Hornhautreflexion. Die Datenerfassung und Berechnung der Augenbewegungen als Reaktion auf die virtuelle Trommel erfolgte^{wie zuvor beschrieben 9,13}. (C) Schematische Darstellung von Augenvektoren, die sich vertikal (Y-Welle) und horizontal (X-Welle) bewegen. (D) Probenspuren der Nachführreaktion eines Auges auf unidirektionale Aufwärts- und Rückwärtsbewegungen sowie auf vertikale und horizontale sinusförmige Bewegungen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Tracking-Analyse unidirektionaler visueller Reaktionen. (A-D) Identifizierung und Auswahl von langsamen Tracking-Phasen für die Verstärkungsanalyse. Es werden unidirektionale Beispielspuren mit visuellen Reaktionen auf Vorwärts- (A), Rückwärts- (B), Aufwärts- (C) und Abwärtsbewegungen (D) in Bezug auf das Auge der Maus angezeigt. Langsame Phasen werden durch die Hinzufügung von roten und grünen Punkten, die in Schritt 3 beschrieben wurden, zum Entfernen von Sakkaden gekennzeichnet, und die ausgewählten langsamen Phasen werden gelb hervorgehoben. Polynomiale Regressionen werden den Leiterbahnen als Linien überlagert. (E) Quantifizierung der Sample-Traces (A-D), wie sie in der PyOKR-Auslesung organisiert sind. Für jede Kurve werden die gesamten XY-Geschwindigkeiten und die entsprechenden Verstärkungen berechnet, unabhängig von der Richtungsabhängigkeit. Bei unidirektionalen Reaktionen spiegeln diese Gesamtgeschwindigkeiten in der Regel die individuelle Geschwindigkeit in eine bestimmte Richtung wider. Bei sinusförmigen Reaktionen spiegelt dieser Wert jedoch die durchschnittliche Gesamtgeschwindigkeit des Auges wider. Horizontale und vertikale Geschwindigkeitskomponenten werden aufgeschlüsselt, um die Geschwindigkeit in die jeweilige Richtung anzuzeigen. Die Verstärkung wird dann basierend auf den dargestellten Stimulusgeschwindigkeiten berechnet. (F) Berechnete Verfolgungsgewinne von Wildtyp-Tieren (n = 13) in den vier Himmelsrichtungen im Vergleich zur zugehörigen ETM-Quantifizierung. Die Daten werden als mittlere ± SD dargestellt. Die Daten wurden mit einer unidirektionalen ANOVA mit mehreren Vergleichen analysiert. *p<0.05, **p<0.01, ****p<0.005, ****p<0.0001. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Die automatische Filterung von Sakkaden erleichtert die Verarbeitung und Analyse von OKR-Daten. (A-D) Die automatische Filterung von Traces aus Abbildung 2A-D entfernt Sakkaden und modelliert nur langsame Phasenbewegungen, indem schnelle Geschwindigkeitsänderungen entfernt und langsame Phasen zusammengefügt werden. Die letzte Steigung stellt die gesamte Augenbewegung über die gegebene Epoche dar. (E) Quantifizierung der Gewinne aus gefilterten Stichprobendaten, wie in der PyOKR-Auslesung organisiert. (F) Der Vergleich der Verstärkungswerte zwischen ungefilterten und gefilterten Probenaugenspuren zeigt keine signifikanten Unterschiede. Die Daten werden als mittlere ± SD dargestellt. Daten, die mit einem Mann-Whitney U-Test zwischen ungefilterten und gefilterten Ergebnissen analysiert wurden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4: Ableitung der Tracking-Verstärkungen als Reaktion auf oszillatorische visuelle Reize. (A,B) Vertikale (A) und horizontale (B) Augenbewegungsreaktionen auf sinusförmig bewegte Stimuli können relativ zu definierten oszillatorischen Reizparametern modelliert werden. Ausgewählte Bereiche werden gelb beschriftet, wobei die polynomiale Approximation über der Kurve überlagert wird. Ein Modell des Stimulus wird als orangefarbene Sinuswelle hinter der Spur dargestellt, um einen Verweis darauf zu ermöglichen, was der Stimulus an jedem Punkt ist. (C) Verstärkungsberechnungen von sinusförmigen Wildtyp-Reaktionen (n = 7) spiegeln asymmetrische Reaktionen zwischen horizontaler und vertikaler Nachführfähigkeit wider. Die Daten werden als mittlere ± SD dargestellt. Die Daten wurden mit einer unidirektionalen ANOVA mit mehreren Vergleichen analysiert. **p<0.01,**p<0.005. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 5: Die Richtungsverfolgung kann in ihrer horizontalen und vertikalen Komponente modelliert werden. (A) Vertikale Komponente einer Eye-Tracking-Welle als Reaktion auf einen Aufwärtsreiz. (B) Horizontale Komponente einer Eye-Tracking-Welle als Reaktion auf einen Aufwärtsreiz. (C) Gesamtflugbahn des Auges sowohl in vertikaler als auch in horizontaler Richtung. (D) Dreidimensionales Modell des Bewegungsvektors des Auges im Laufe der Zeit als Reaktion auf eine Abwärtsbewegung. Rohdaten der Leiterbahn werden in Rot und das Regressionsmodell der Trajektorie in Blau angezeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 6: Analyse des OKR in Tbx5f/f; Pcdh9-Cre-Mäuse zeigen signifikante Defizite bei unidirektionalen vertikalen Tracking-Verstärkungen. (A) Tbx5f/f; Pcdh9-Cre-Tiere zeigen keine signifikante Veränderung des horizontalen Tracking-Gewinns. (B,C) Tbx5f/f; Pcdh9-Cre-Tiere zeigen eine signifikante Verringerung des Gewinns in ihren vertikalen Reaktionen: nach oben (B) und nach unten (C). (D,E) Sinusförmige Reaktionen von Tbx5f/f; Pcdh9-Cre Tiere als Reaktion auf horizontale (D) und vertikale (E) oszillatorische Reize. f) Quantifizierung von Tbx5f/f; Die oszillatorischen Reaktionen von Pcdh9-Cre zeigen eine signifikante Zunahme der horizontalen Tracking-Verstärkungen, aber eine Abnahme der vertikalen Antworten. Die Daten werden als mittlere ± SD dargestellt. Die Daten wurden mit Mann-Whitney U-Tests analysiert. *p<0.05, **p<0.01, ****p<0.0001. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 7: Anwendung von PyOKR auf Daten, die mit alternativen Video-Okulographie-Methoden gewonnen wurden. (A) Gerät zur Stimulation virtueller OKR-Trommeln, wie beschrieben¹⁰. Ein DLP-Projektor mit einer Wellenlänge von 405 nm wird über einen konvexen Spiegel auf eine Halbkugel reflektiert, um eine virtuelle Trommel zu erzeugen, die das Sichtfeld des Tieres umgibt. Die Augenbewegungen werden mit einer NIR-Kamera gemessen, die außerhalb der Hemisphäre positioniert ist. Unidirektionale und sinusförmige Stabgitter werden einem kopffesten Tier in vertikaler Richtung gezeigt. (B,C) Die Tracking-Phasen nach oben (B) und nach unten (C) werden identifiziert und für die quantitative Analyse ausgewählt. Langsame Phasen sind gelb hervorgehoben. (D) Verfolgungsgewinne, die aus der vertikalen Verfolgung von Wildtyp-Tieren (n=5) unter Verwendung der hier beschriebenen Methoden berechnet wurden. Es wird eine asymmetrische Nachführfähigkeit beobachtet, mit einer signifikanten Abnahme der Abwärtsverfolgung. (E) Oszillatorische Reaktion auf sinusförmige Stimuli, modelliert zur Quantifizierung von Tracking-Gewinnen bei Wildtyp-Tieren (n=8). Langsame Phasen sind gelb hervorgehoben. (F) Die Quantifizierung der sinusförmigen Gewinne zeigt verringerte Abwärtsgewinne im Vergleich zu Aufwärtsgewinnen. Die Daten werden als mittlere ± SD dargestellt. Die Daten wurden mit Mann-Whitney U-Tests analysiert. *S<0,05. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Ergänzende Codierungsdatei 1: PyOKR Windows Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Codierungsdatei 2: PyOKR Mac Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Diskussion

PyOKR bietet mehrere Vorteile für die Untersuchung visueller Reaktionen, die sich in Augenbewegungen widerspiegeln. Dazu gehören Genauigkeit, Zugänglichkeit und Datenerfassungsoptionen sowie die Möglichkeit, Parametrisierung und variable Stimulusgeschwindigkeiten zu integrieren.

Die direkte Bewertung des Eye-Tracking-Gain bietet eine genaue Charakterisierung der Augenbewegung, die eine direktere quantitative Metrik darstellt als die herkömmliche manuelle Zählung von schnellen Phasenakkaden (ETMs). Die Sakkadenzählung ist zwar nützlich, bietet aber eine indirekte Bewertung der tatsächlichen Verfolgungsbewegung. Die PyOKR-Softwareplattform ermöglicht eine direkte Quantifizierung der Tracking-Geschwindigkeiten unter Berücksichtigung zusätzlicher Parameter wie Sakkadenamplituden und der Länge langsamer Phasen. Darüber hinaus beruht die Schnellphasen-Sakkadenzählung auf der Bewertung der Sakkadenfrequenz über einen festgelegten Zeitraum, wobei jede Spur wenig bis gar kein Rauschen aufweisen muss, einschließlich zufälliger Sakkaden durch Tierstress. Diese Faktoren führen dazu, dass viele gesammelte Spuren unbrauchbar sind und daher viel Zeit für die Datenerfassung benötigen, um das Eye-Tracking genau zu bewerten. Die hier beschriebene Software löst dieses Problem jedoch, indem sie einzelne langsame Phasen innerhalb einer gegebenen Kurve direkt quantifiziert und die Verstärkung an momentanen Punkten entlang der Kurve berechnet. Dies wird erreicht, indem die Geschwindigkeit der Augenbewegung mit der Geschwindigkeit des Stimulus an einem bestimmten Punkt verglichen wird. Da die sakkadische Frequenz nicht mehr der bestimmende Parameter für die Analyse ist, kann das Rauschen durch die Aufsicht des Benutzers leicht entfernt werden, wodurch die Auswirkungen des Rauschens auf die Qualität der Analyse reduziert werden. Dies ermöglicht eine besser nutzbare gesammelte Daten und eine höhere statistische Aussagekraft bei der Analyse dieser Daten, eine Erhöhung der Genauigkeit und Reproduzierbarkeit bei der Quantifizierung des Eye-Trackings und der Charakterisierung von OKR-Parametern für einzelne Mäuse und verschiedene Gruppen von Mäusen. Die automatisierte Filterung von Sakkaden auf der Grundlage schneller Änderungen der Augengeschwindigkeit, die über eine Z-Score-Methode gefunden wurden, wurde auch zur Charakterisierung der Tracking-Verstärkung¹⁰ verwendet. Um diese Filtermethode in die Software zu integrieren, haben wir diese Art der Geschwindigkeitsfilterung integriert, jedoch mit zusätzlichen Tools wie Schwellenwertparametrisierung und manueller sakkadischer Überwachung, um potenzielle Fehler zu reduzieren, die durch diesen Ansatz erzeugt werden. Wenn rohe Spuren für die Analyse verwendet werden, anstatt eine automatische Filterung zu verwenden, werden schnelle Änderungen der Augenbewegungen, die durch Sakkaden, Blinzeln oder Mausstress verursacht werden, durch maximale Geschwindigkeitsänderungen über eine Gaußsche Kerndichteschätzung der Spurengeschwindigkeit identifiziert. Dies ermöglicht die automatische Auswahl von Segmentierungsbereichen und schließlich die Entfernung auf der Grundlage einer manuellen Benutzerüberwachung. Die manuelle Überwachung bietet eine höhere Toleranz gegenüber verrauschten Spuren und ermöglicht es dem Benutzer, falsch positive oder falsch negative Markierungen schnell zu korrigieren, um schnelle Augenveränderungen zu ermöglichen. Da PyOKR polynomiale Approximationen verwendet, um die allgemeine Augenbewegung in eine bestimmte Richtung zu modellieren, wird das Rauschen an einzelnen Punkten geglättet, sodass die Bahngeschwindigkeiten mit einer gewissen Toleranz für das Rauschen in der Spur bewertet werden können. Nur im Falle einer extrem schlechten Datenqualität über den gesamten Trace oder einer unsachgemäßen Kalibrierung während der Datenerfassung ist die Software nicht in der Lage, eine genaue Datenanalyse zu erstellen. Zusammengenommen generiert die hier beschriebene PyOKR-Softwareanwendung durch die Integration von Benutzerüberwachung, Filterung und sofortiger Gewinnberechnung Tracking-Gewinne mit hoher Genauigkeit und direkteren Metriken als frühere Methoden.

PyOKR verfügt außerdem über viele Funktionen, die es ermöglichen, OKR-Analysen an die Bedürfnisse der Benutzer anzupassen. Die Eingabe von Stimulusparametern sowie von rohen Stimulusvektoren ermöglicht es dem Benutzer, jeden gewünschten Stimulus genau zu definieren. Dazu können unidirektionale, sinusförmige oder schräge Reize gehören, die die Software verwenden kann, um genaue Tracking-Verstärkungen für die zugehörigen visuellen Reaktionen zu generieren. Mit der Stimulus-Parametrisierung dieser Methode können die bei jedem Frame berechneten Momentangewinne unabhängig vom eingegebenen Stimulus zuverlässig und mit hoher Genauigkeit erzeugt werden. Obwohl die Daten zu schrägen Stimuli hier nicht analysiert wurden, können genaue Verstärkungen durch zerlegte XY-Geschwindigkeitsvektoren berechnet werden, um einen Schrägwinkel zu rekonstruieren, was eine genaue Verstärkungsberechnung von schrägen Stimuli ermöglicht. Durch die zugängliche Parametrisierung von Reizeinstellungen ist unser Tool breit anwendbar für die Wellenverfolgung als Reaktion auf jeden visuellen Reiz. Darüber hinaus ermöglicht die Software einen höheren Durchsatz und eine reproduzierbare Quantifizierung im Vergleich zu bisherigen Methoden. Das Sortieren von OKR-Traces ist zeit- und arbeitsintensiv; Die optimierte Benutzeroberfläche von PyOKR ist jedoch in der Lage, viele Traces mit einer höheren Geschwindigkeit als bisher zu durchsuchen. Dies ermöglicht nicht nur eine schnellere Trace-Quantifizierung, sondern zeigt auch zusätzliche OKR-Parameter auf, einschließlich der direkten Quantifizierung von Augengeschwindigkeiten, gerichteten Vektorkomponenten der Augenbewegung und momentanen Verstärkungen relativ zum Stimulus sowohl in den horizontalen als auch in den vertikalen Komponenten des Bewegungsvektors. Darüber hinaus ist angesichts der automatisierten Identifizierung von Sakkaden und der Berechnung der Tracking-Geschwindigkeiten, die unsere Methode ermöglicht, die potenzielle Verzerrung des Experimentators bei der Datenanalyse im Vergleich zu anderen Quantifizierungsmethoden, wie z. B. manueller ETM-Zählung oder automatisierter Trace-Filterung, die falsch negative Ergebnisse erzeugen können, stark reduziert. Darüber hinaus können große Mengen an Verhaltensdaten generiert und automatisch für eine vereinfachte nachgelagerte Analyse zusammengestellt werden. Durch die in PyOKR verfügbaren Datenexport- und Sortierfunktionen können Tracking-Daten über mehrere Tiere und Bedingungen hinweg automatisch verarbeitet werden, um eine organisierte Datenspeicherung sowie eine schnelle statistische Analyse zu ermöglichen. Für die Durchführung von Experimenten, die mehrere Bedingungen während derselben Aufnahmesitzung verwenden, wie z. B. Schaltungsmanipulation oder visuelle Reaktionen, empfehlen wir, Daten in diskreten Wellendateien oder untergeordneten Epochen zu sammeln, die die Speicherung separater Datensätze basierend auf den unabhängigen Variablen von Interesse ermöglichen, die aus dieser einzelnen Aufnahmesitzung abgeleitet wurden. Ein Beispiel wäre, wenn man Unterschiede in den Reaktionen auf verschiedene sinusförmige Wellenfrequenzen innerhalb eines experimentellen Paradigmas testet, würden wir empfehlen, verschiedene Parameter in verschiedenen Wellendateien für separate Analysen zu speichern, wie z. B. WT_1_Freq0.1Analysis, WT_1_Freq0.2Analysis und WT_1_Freq0.3Analysis. In der aktuellen Version gibt es nach der Analyse von Epochen keine Funktion zur Auswahl einzelner Epochenwerte innerhalb des Datensatzes, obwohl dies in Zukunft bei Bedarf hinzugefügt werden könnte.

Schließlich ist unsere Methode an mehrere Video-Okulographie-Erfassungsmethoden anpassbar und bietet eine robuste Analyseplattform, die leicht an die spezifischen Bedürfnisse eines Labors angepasst werden kann. Durch die Analyse von Wildtyp- und vorhandenen mutierten OKR-Daten, aber auch von Wildtyp-OKR-Daten, die mit unterschiedlichen Methoden und Stimuli erhoben wurden, zeigen wir hier, dass unser Analysetool in der Lage ist, a) das OKR-Tracking von beliebigen Richtungsreizen mit hoher Genauigkeit und hohem Durchsatz zu quantifizieren; b) Identifizierung von Verhaltensunterschieden im visuellen System, die sich aus genetischer Störung ergeben; und c) Auswertung von visuellen Tracking-Daten aus verschiedenen Video-Okulographie-Methoden. Die Zugänglichkeit und allgemeine Anpassungsfähigkeit unserer Analyseplattform erleichtern die weitere Untersuchung von OKR-Antworten und werden Verhaltensstudien verbessern, die den Aufbau und die Dynamik neuronaler Schaltkreise im Kontext okulomotorischer Reaktionen charakterisieren.

Um genaue Messungen und anschließende nützliche Datenanalysen zu erhalten, sind mehrere Schritte der Datenerfassung notwendig. Wir empfehlen, OKR-Daten über mehrere Sitzungen zu sammeln, damit sich das Tier an das Verhaltenstestgerät gewöhnen kann und die Auswirkungen von Stress der Tiere auf die Verhaltensreaktionen reduziert werden. eine übermäßige Aufzeichnung kann jedoch zu einer Potenzierung der OKR-Antwort^{führen 13}, so dass Vorsicht bei der Gestaltung von Testregimen empfohlen wird. Bei der OKR-Datenerfassung ist die richtige Kalibrierung der Video-Okulographie-Ausrüstung entscheidend für eine genaue Quantifizierung, da die Qualität der analysierten Daten eine direkte Funktion der verarbeiteten Spur ist. Wichtig ist, dass die Verwendung der Spyder-IDE für die Graphenüberwachung durch Matplotlib erforderlich ist. Angesichts der Zugänglichkeit und des Framework-Designs unserer Plattform stehen allen notwendigen Tools zur Verfügung, um die Fähigkeiten der Software zu erweitern und diese Plattform auf unterschiedliche verhaltensexperimentelle Paradigmen zuzuschneiden.

Abschließend beschreiben wir hier ein neues, zugängliches und vielseitiges Werkzeug zur Analyse von OKR-Verhaltensantworten in einer tieferen und quantitativen Aussagekraft, als es derzeit mit bestehenden Methoden verfügbar ist. PyOKR kann von Python-Anfängern einfach verwendet werden und enthält eine etablierte Analyse-Pipeline und Schnittstelle für die schnelle und genaue Analyse von OKR-Wellen mit erhöhter Strenge und Reproduzierbarkeit. Die Anpassungsfähigkeit dieser Software bietet ein flexibles Framework, das Benutzer leicht an ihre spezifischen Bedürfnisse und Datenerfassungsverfahren anpassen können. Wir gehen davon aus, dass diese quantitative Methode die Untersuchung der okulomotorischen Reaktionen voranbringen und unser Verständnis der Entwicklung und Funktion der neuronalen Schaltkreise, die das Verhalten des visuellen Systems steuern, verbessern wird.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
C57BL/6J  Mäuse	Jackson Labs	664
Igor Pro	WaveMetrics	RRID: SCR_000325
MATLAB	MathWorks	RRID: SCR_001622
Optokinetische Reflexaufzeichnungskammer - JHUSOM	Custom-built	N/A	Wie beschrieben in Al-Khindi et al.(2022)9 und Kodama et al. (2016)13
Optokinetische Reflexaufzeichnungskammer - UCSF	Custom-built	N/A	Wie beschrieben in Harris and Dunn, 201510
Python	Python Software Foundation	RRID: SCR_008394
Tbx5 flox/+ mice	Geschenk von B. Bruneau	N/A	Wie beschrieben in Al-Khindi et al.(2022)9
Tg(Pcdh9-cre)NP276Gsat/MMUCD	MMRRC	MMRRC Lager # 036084-UCD; RRID: MMRRC_036084-UCD