Dynamische Multiparameter-Bewertung der Thrombozytenfunktion mit einem kapazitiven Biosensor

Summary

Hier wird ein Protokoll für einen neuartigen dynamischen Multiparameter-Thrombozyten-Funktionsassay unter Verwendung eines kapazitiven Biosensors vorgestellt. Dieser Ansatz, der in einer halbstarren Mikroumgebung entwickelt wurde, um die physiologische Relevanz zu erhöhen, bietet drei Ausgangsparameter, die für die Thrombozytenzahl, die Stimulationsstärke und die Aktivierungswege empfindlich sind.

Abstract

Blutplättchen spielen eine grundlegende Rolle bei der Blutgerinnung durch eine Reihe von regulierten Reaktionen, einschließlich Adhäsion, Ausbreitung, körniger Sekretion, Aggregation und Kontraktion des Zytoskeletts. Die derzeitigen Assays beschränken sich jedoch auf die partielle Analyse der Thrombozytenfunktion unter nicht-physiologischen Bedingungen. Daher ist ein verbesserter Assay erforderlich, der die dynamische und facettenreiche Natur der Thrombozytenfunktion in physiologischen Umgebungen widerspiegelt. In diesem Zusammenhang wird ein neuartiger Ansatz eingeführt, um mehrere Schlüsselparameter im Zusammenhang mit der Thrombozytenfunktion in einer physiologisch relevanteren ex vivo halbstarren Mikroumgebung im Vergleich zu herkömmlichen Assays zu messen. Bei dieser Methode wird ein fortschrittlicher elektrischer Biosensor, der Membrankapazitätssensor (MCS), verwendet, der durch drei verschiedene Auslesungen einzigartige Einblicke in den Gerinnungsprozess bietet. Diese Messwerte sind sehr empfindlich gegenüber Schwankungen der Thrombozytenzahl, der Stimulationsintensität und der spezifischen Aktivierungswege. Als rein elektrische Sensorplattform zeigt das MCS ein erhebliches Potenzial als diagnostisches Werkzeug zur Erkennung primärer hämostatischer Funktionsstörungen, zur Bewertung der Wirksamkeit therapeutischer Behandlungen und zur Förderung des breiteren Verständnisses der Rolle von Blutplättchen bei Blutstillung und Thrombose.

Introduction

Blutplättchen, spezialisierte Blutzellen, sind entscheidend für die Orchestrierung der hämostatischen Reaktion, um Blutungen nach einer Verletzung zu stoppen und die Heilung von Blutgefäßen zu erleichtern¹. Darüber hinaus dienen sie auch als wichtige Mediatoren bei Thrombosen, einer der Hauptursachen für Todesfälle im Zusammenhang mit thromboembolischen Erkrankungen^weltweit 2,3,4,5,6. Wenn eine Gefäßverletzung auftritt, durchlaufen Blutplättchen eine....

Protocol

Der Studienantrag wurde von der Human Subjects Division (HSD) des Internal Review Board der University of Washington (UW-IRB; Studien-ID: STUDY00005211). Alle freiwilligen Probanden, die an der Studie teilnahmen, gaben eine schriftliche Einverständniserklärung ab. Die Einzelheiten zu den in dieser Studie verwendeten Reagenzien und Geräten sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Fertigungsschritte für den membran-kapazitiven Sensor (MCS)

HINWEIS: Der MCS-Sensor wurde unter Verwendung traditioneller Mikrofabrikationstechniken hergestellt. Dieser B....

Results

Ziel dieser Studie ist es, eine dynamische Bewertung der Thrombozytenfunktion durchzuführen. Gemäß dem oben beschriebenen Protokoll wurde die c-PRP-Lösung hergestellt und die Thrombozyten auf die Fn-beschichtete Elektrode in T-MCC ausgesät. Die frei schwebenden Blutplättchen wurden durch den Waschschritt ausgewaschen und mit einem Agonisten versetzt, um die angehängten Blutplättchen zu aktivieren. Detaillierte Ergebnisse und Diskussionen finden Sie in unserem vorherigen Bericht²⁸.

Discussion

Diese Studie leistete Pionierarbeit für eine neuartige kapazitätsbasierte Methode zur Beurteilung der Thrombozytenfunktion, die sowohl die Adhäsion als auch die Thrombozytendynamik nach der Aktivierung innerhalb eines einzigen Geräts bewertet, und markierte damit das erste berichtete Beispiel für einen solchen Ansatz. Das neuartige Versuchsprotokoll führt eine relativ einfache Technik ein, um den Auswirkungen der Fibrinbildung und der Plasmagerinnungsfaktoren durch ein Auswaschverfahren .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-Dodecanthiol	Sigma-Aldrich, MO, U.S.A	471364-100ML	1 mM
200-proof Ethanol	Sigma-Aldrich, MO, U.S.A	EX0276-1
3D-Drucker	Shenzhen Creality 3D Technology Co, Ltd.	Ender-3 V3
3D-Druckmaterial	HATCHBOX 3D, CA, U.S.A	3D PLA-1KG-1.75
Adenosin 5′-diphosphat	Sigma Aldrich, U.S.A	01905-250MG-F	ADP
Aspirin	Sigma-Aldrich, MO, U.S.A	A2093-100G
Tiefes reaktives Ionenätzen	Omega Engineering, Inc.	SPTS Rapier DRIE
Dimethylsulfoxid	Sigma-Aldrich, MO, U.S.A	D8418-50ML	DMSO
Hochvakuum-Abscheidungssysteme	CHA	SEC-600
Humanes Fibronektin	Sigma-Aldrich, MO, U.S.A	CLS356008-1EA	Fn
KOH	Sigma-Aldrich, MO, U.S.A	P1767-250G
LCR-Messgerät	Keithley Instruments, Inc., OH, U.S.A	Keithley EL 4980AL
LCR-Messgerätehalter	Signatone Corporation, CA, U.S.A	SCA-50-4
Mask Aligner System	ABM, U.S.A, Inc.	ABM/6/350/NUV/DCCD/SA
Mikropositionierer	Signatone, CA, U.S.A	S-725
Nadelsonde	Signatone Corporation, CA, U.S.A	SCAT5T-4	12,5 μ m
radius Phosphatgepufferte Kochsalzlösung	Sigma-Aldrich, MO, U.S.A	P4474-1L	PBS, pH 7,4
Reaktives Ionenätzen	Plasma-Therm, U.S.A	RIE Vision 320
Siliziumsubstrat	Wafer World Inc	SKU# 1766
Standard 3,2% Citratröhrchen	Tiger Medical, NJ, U.S.A.	Covidien / Cardinal Health 8881340478 Monoject
Thrombin	Enzyme Research Laboratories, USA	HT 1002a
Ticagrelor	Sigma-Aldrich, MO, U.S.A	PHR2788-400MG
Tyrode' s Puffer	Boston Bioproducts, U.S.A	BSS-375
UV-Fotolack	AZ electronic materials, NC, U.S.A.	AZ 9260	15um