Diese Studie beschreibt ein kombiniertes Protokoll für Magnetresonanztomographie (MRT) und gepulsten fokussierten Ultraschall (FUS) mit niedriger Intensität, bei dem lebende Ratten mit Jugularvenenkatheterisierung verwendet werden, um die Öffnung der Blut-Hirn-Schranke (BHS) zu überwachen.
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Methodenartikel
Überwachung der Öffnung der Blut-Hirn-Schranke bei Ratten mit einem präklinischen fokussierten Ultraschallsystem
* These authors contributed equally
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Das Gehirn hat eine hochselektive semipermeable Blutschranke, die als Blut-Hirn-Schranke (BHS) bezeichnet wird und die Abgabe von therapeutischen makromolekularen Wirkstoffen an das Gehirn verhindert. Die Integration von MRT-gesteuertem gepulstem fokussiertem Ultraschall (FUS) mit niedriger Intensität und Mikroblasen-Vorinjektion ist eine vielversprechende Technik für die nicht-invasive und nicht-toxische BHS-Modulation. Die MRT bietet einen überlegenen Weichteilkontrast und verschiedene quantitative Beurteilungen, wie z. B. die Gefäßpermeabilität, die Perfusion und die räumlich-zeitliche Verteilung von MRT-Kontrastmitteln. Insbesondere haben sich kontrastmittelverstärkte MRT-Techniken mit Gadolinium-basierten MRT-Kontrastmitteln als Goldstandard für die Erkennung von BHS-Öffnungen erwiesen. Diese Studie skizziert eine umfassende Methodik, die MRT-Protokolle und tierexperimentelle Verfahren zur Überwachung der BHS-Öffnung in einem Rattenmodell umfasst. Das Rattenmodell bietet den zusätzlichen Vorteil der Verwendung von Jugularvenenkathetern, was eine schnelle Verabreichung von Medikamenten ermöglicht. Ein stereotaktisch gesteuerter präklinischer FUS-Schallkopf erleichtert die Verfeinerung und Rationalisierung von Tierverfahren und MRT-Protokollen. Die daraus resultierenden Methoden zeichnen sich durch Reproduzierbarkeit und Einfachheit aus, so dass keine spezielle chirurgische Expertise erforderlich ist. Diese Forschung zielt darauf ab, einen Beitrag zur Optimierung präklinischer Verfahren mit Rattenmodellen zu leisten und weitere Untersuchungen zur Modulation der BHS zu fördern, um therapeutische Interventionen bei neurologischen Erkrankungen zu verbessern.
Einleitung
Die BHS reguliert die Bewegung von Ionen, Molekülen und Zellen zwischen den Blutgefäßen und dem Gehirngewebe1. Diese Funktion ermöglicht die Aufrechterhaltung der neuronalen Funktion und Gesundheit und verhindert gleichzeitig die Abgabe von therapeutischen makromolekularen Wirkstoffen an das Gehirngewebe. Die begrenzte Permeabilität der BHS kann dazu führen, dass die Wirksamkeit und Wirksamkeit von Behandlungen für Hirntumoren und neurodegenerative Erkrankungen wie Parkinson, amyotrophe Lateralsklerose und Alzheimer verringert wird2. Daher wurden verschiedene Ansätze, wie z. B. konvektionsverstärkte Verabreichung, direkte intrakranielle Injektionen, osmotische Disruption und verbessertes Wirkstoffdesign, untersucht, um die BHS für die kontrollierte Verabreichung von Therapeutika zu umgehen3,4,5.
Diese Ansätze haben jedoch intrinsische Einschränkungen wie Invasivität, Infektionsrisiko, Blutungsrisiko, Heterogenität und schnelles Ausfließen von Medikamenten. Der gepulste fokussierte Ultraschall (FUS) mit niedriger Intensität mit der Injektion von Mikrobläschen ist eine vielversprechende nicht-invasive Technik, die eine lokalisierte und reversible BHS-Störung ermöglicht. Die mechanischen Effekte von Ultraschall in Verbindung mit Mikrobläschen können die Permeabilität der BHS (d. h. die BHS-Öffnung) vorübergehend verändern6,7. Für weitere Fortschritte bei Behandlungsanwendungen, bei denen die BHS-Öffnung genutzt wird, sind in vivo Kleintierversuche unerlässlich.
In dieser Studie führten wir MRT-Protokolle und tierische Verfahren zur Überwachung der BHS-Öffnung in einem Rattenmodell ein. Das Protokoll umfasste ein Rattenmodell mit einem Jugularvenenkatheter, der von einer kommerziellen Organisation kanüliert wurde (siehe Materialtabelle). Ein Rattenmodell der Jugularvenenkatheterisierung hat die potenziellen Vorteile einer schnellen Medikamentenverabreichung, hämodynamischer Überwachungstests und einer stabilen Katheterisierung. Die BHS-Öffnung wurde mit einem präklinischen FUS-System durchgeführt. Dieses System wurde speziell für die BHS-Öffnung in Kleintiermodellen wie Ratten und Mäusen entwickelt und umfasst wesentliche Komponenten wie ein Tischsystem, einen Steuercomputer, einen Wandler, einen Wasserentgaser und das zugehörige Zubehör. Der Einsatz dieses stereotaktisch gesteuerten präklinischen FUS-Systems verbessert nicht nur die Präzision, sondern rationalisiert auch Tierverfahren und MRT-Protokolle, was zur Reproduzierbarkeit und Einfachheit des gesamten experimentellen Protokolls beiträgt.
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Protokoll
Alle Tierversuche in dieser Studie wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der University of California, San Francisco (UCSF) genehmigt. In dieser Studie wurden männliche Sprague-Dawley-Ratten (200-250 g) verwendet. Ratten wurden gemäß den Richtlinien des National Institutes of Health Office of Animal Care and Use bei Mäusen und Ratten untergebracht und gepflegt. Die Details zu den Reagenzien und den verwendeten Geräten sind in der Materialtabelle aufgeführt.
1. Vorbereitung von Tieren
HINWEIS: Für interne Eingriffe wurden die Tiere in den Vorbereitungsraum transportiert und die Eingriffe wurden wie folgt durchgeführt:
- Setzen Sie die Ratten einzeln in eine Lucite-Kammer und setzen Sie Isofluran (2%-3%) gemischt mit Sauerstoff aus, der aus einem medizinischen Sauerstofftank entnommen wird, bis sie bewusstlos sind (gemäß institutionell anerkannten Protokollen).
HINWEIS: Die Anästhesie mit Isofluran ermöglicht die Implementierung eines Langzeit-MRT-Protokolls. - Nehmen Sie die Ratten aus der Kammer und rasieren Sie die Haare im vorderen und hinteren Bereich des Halses mit einer Haarentfernungscreme (Enthaarungscreme).
- Tragen Sie Gleitsalbe auf die Augen auf.
- Setzen Sie die Nase in den Nasenkonus ein, um die Anästhesie mit Spontanatmung aufrechtzuerhalten (Isofluran-Verdampfer zwischen 2 % und 2,5 %, Sauerstoffdurchflussmesser bis 1-1,5 l/min).
- Legen Sie die anästhesierte Ratte auf einen beheizten Operationstisch und bestätigen Sie mit einem Zehenkneifen.
HINWEIS: Das MRT-Protokoll umfasste kontrastverstärkte Sequenzen, wie z. B. T1-gewichtete Gradientenecho-Bildgebung und T2-gewichtete Spin-Echo-Bildgebung. Diese Sequenzen wurden sowohl vor als auch nach der Injektion von Gadolinium (GAD)-basierten Kontrastmitteln durchgeführt, um die Permeabilität der Blut-Hirn-Schranke (BHS) zu beurteilen. Dabei werden GAD-Kontrastmittel verabreicht, während sich die Ratte in einem MRT-Scanner befindet7. Um diesen Prozess zu erleichtern, wurde ein Katheterschlauch verwendet, der von dem bei der Ratte kanülierten Katheter ausging. Die Erweiterung umfasste einen Katheteranschluss und einen 30 cm langen Polyethylenschlauch. Um die Durchgängigkeit zu gewährleisten und ein Auslaufen zu verhindern, wurde der Verlängerungsschlauch mit heparinisiertem Glycerin (250 IE Heparin/1 mL Glycerin) gespült.
2. Stereotaktisch geführtes fokussiertes Ultraschallsystem
HINWEIS: Die Tiere wurden übertragen und auf einen Tisch in einem stereotaktischen FUS-System gelegt. Die Nase der Ratte wurde in den Nasenkegel eingesetzt, um die Narkose aufrechtzuerhalten. Das FUS-System besteht aus einem Funktionsgenerator, einem HF-Verstärker und einem Oszilloskop. Vor dem Einrichten des Wandlers haben wir die ordnungsgemäße Verbindung aller Geräte mit dem System sichergestellt. Die Einrichtung des Schallkopfs wurde mit den folgenden Schritten abgeschlossen:
- Platzieren Sie einen spitzen Zeiger auf die Position des Bregmas im Schädel und speichern Sie die Position. Die Position von Bregma kann identifiziert werden, indem die Position von 9,0 mm vor Lambda auf der Mittellinie 8 gezeigt wird. Das Lambda befindet sich in der Mitte der Linie zwischen bilateralen Trommelfellen9.
- Geben Sie das Ultraschallgel auf den Kopf der Ratte, den Wasserkupplungsbeutel und den Schallkopf (Frequenz 1 MHz). Stellen Sie sicher, dass sich keine Luftblasen zwischen der Haut der Ratte, dem Wasserkupplungsbeutel und dem Geber befinden.
- Verbinden Sie ein koaxiales BNC-Kabel des Wandlers mit dem Eingang des FUS-Systemmoduls.
- In einem Steuerrechner) Klicken Sie auf Laden für vorregistrierte Rattenbilder; Es werden eine Reihe von Brennpunkten und Schalldruck gewählt.
- In einem Steuerrechner) Klicken Sie auf den Bewegungstest im Behandlungsmodul, um sicherzustellen, dass der Schallkopf innerhalb einer Burst-Periode zwischen den Spots wechseln kann.
- Stellen Sie die in Schritt 3 beschriebenen Beschallungsparameter ein.
3. Mikrobläscheninfusion und Beschallung
- Aktivieren Sie die Mikroblase.
HINWEIS: Die in dieser Studie verwendete Mikroblase zeichnete sich durch einen Durchmesser von 1,7 μm und eine Konzentration von 0,2 × 109 Partikeln pro Milliliter aus10. Das Mikroblasenfläschchen wurde auf der Grundlage der vom Anbieter bereitgestellten Verschreibungsanweisungen und eines zuvor veröffentlichten Berichts aktiviert11.- Bereiten Sie eine 5-ml-Spritze mit einer Luer-Lock-Spitze vor und füllen Sie sie mit 5 mL additivfreier 0,9%iger Natriumchlorid-Injektion.
- Entfernen Sie die grüne Kappe und verbinden Sie die Spritze mit dem belüfteten Abgabestift (siehe Materialtabelle), indem Sie ihn im Uhrzeigersinn festschrauben.
- Entfernen Sie den Stiftschutz und platzieren Sie ihn in der Mitte des Gummistopfens des Fläschchens. Drücken Sie fest nach unten, bis der Dorn vollständig in den Stopfen eingeführt ist.
- Entleeren Sie die gesamte 5-ml-Spritze in die Durchstechflasche, indem Sie auf die Kolbenstange drücken.
- Schütteln Sie das Fläschchen 20 s lang kräftig, um den gesamten Inhalt zu vermischen. Eine gleichbleibend weiße, milchige Flüssigkeit zeigt, dass sich Schwefelhexafluorid-Lipid-Mikrosphären gebildet haben.
- Um die erforderliche Dosis zu erhalten, drehen Sie die Spritze um und ziehen Sie langsam das vorgesehene Volumen der Suspension in eine 5-ml-Spritze zurück.
- Verwenden Sie eine Infusionspumpe.
HINWEIS: Der Infusionsansatz 12 wurde verwendet, um Mikrobläschen an Ratten mit einer Spritzenpumpe zu verabreichen. Eine Spritze mit Mikrobläschen wurde mit einem Katheterkonnektor verbunden, der in die Ratte eingeführt wurde. Mikrobläschen wurden durch Polyethylenschläuche übertragen und die Durchflussrate der Infusionspumpe auf 0,66 ml/min eingestellt. Diese Infusionsrate ermöglicht die Injektion von 2 mL Mikrobläschen aus einer 3 mL Spritze über einen Zeitraum von 3 Minuten. Die Infusion begann 1 Minute vor der Beschallung und wurde während der gesamten 2-minütigen Beschallungsphase fortgesetzt. - Führen Sie eine Beschallung durch.
HINWEIS: In dieser Studie wurden FUS-Pulse mit den folgenden Parametern ausgewählt: (1) Zielregion: linker Hippocampus; (2) Anzahl der Spots: 6 zur Abdeckung des Hippocampus im Gehirn; (3) Länge der Burst-Wiedergabe: 10 ms; (4) Burst-Periode: 1200 ms; (5) Schalldruck: 0,65 MPa; (6) "Burst-Modus" im Menü für den Beschallungsmodus des FUS-Systems; (7) Beschallungszeit: 120 s.
4. MRT-Verfahren mit einem präklinischen 3T-Scanner
- Nach der Beschallung werden die Tiere in einem präklinischen kryogenfreien 3T-Scanner auf einen Tisch gebracht.
- Positionieren Sie die Ratten in Bauchlage. Halten Sie die Temperatur des Heizkissens im Scanner aufrecht und überwachen Sie die Atemfrequenz mit einem pneumatischen Kissensensor. Führen Sie das MRT-Protokoll durch, um verschiedene Arten der MRT-Bildgebung zu testen (Tabelle 1).
- Beziehen Sie neben der kontrastverstärkten MRT auch andere quantitative Bildgebungsverfahren wie diffusionsgewichtete Bildgebung (DWI), T2*-Kartierung, T1-Kartierung und dynamische kontrastverstärkte (DCE) MRT ein, um ihre potenzielle Praktikabilität für verschiedene bildgebende Untersuchungen zu demonstrieren. In Tabelle 1 finden Sie die in dieser Studie verwendeten MRT-Protokolle.
- Injizieren Sie GAD-basierte MRT-Kontrastmittel (Gadavist, 1 mmol/kg) nach der T1-gewichteten MRT-Gradienten-Echosequenz und nehmen Sie Post-GAD-Bilder auf.
HINWEIS: Bei einer 200 g Ratte injizierten wir 200 μl des MRT-Kontrastmittels und verabreichten anschließend eine 200 μl Kochsalzlösung, um den Schlauch zu spülen.
5. Makroskopische Untersuchung des Rattengehirns
HINWEIS: Nach der MRT-Untersuchung wurden 2 ml Evans-Blau-Lösung (2% verdünnt mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung) injiziert, und die Ratte wurde mindestens 30 Minuten ruhen gelassen, damit sich die Lösung im ganzen Körper verteilen und zirkulieren konnte. Anschließend wurden die Ratten mit einer Überdosis Isofluran (5%) euthanasiert, um das Gehirn makroskopisch zu untersuchen (nach institutionell anerkannten Protokollen). Um die Euthanasie zu bestätigen, war ein Zehenschlag erforderlich und das Tier wurde mindestens 1 Minute lang auf Atemstillstand beobachtet. Es wurde die Perfusion durchgeführt, gefolgt von einer Untersuchung des Rattengehirns. Das Perfusionsverfahren lässt sich wie folgt zusammenfassen:
- Führen Sie eine Thorakotomie mit einer chirurgischen Schere durch, um Organe in der Brust freizulegen und die Herzregion sichtbar zu machen.
- Schnitt (~5 mm) in den rechten Vorhof ein.
- Führen Sie zu Perfusionszwecken Kochsalzlösung in den linken Ventrikel ein.
- Öffne den Schädelknochen mit einer chirurgischen Schere, um das Gehirn freizulegen und zu präsentieren.
HINWEIS: Eine ausreichende Perfusion sollte zu einem gleichmäßig hellen Erscheinungsbild des Gehirns führen, während persistierende blaue Bereiche auf einen BHS-assoziierten Albuminaustritt hinweisen, wie durch Evans-Blau nachgewiesen .
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Ergebnisse
Diese Studie stellt ein präklinisches Protokoll zur Überwachung der Blut-Hirn-Schranke-Öffnung in einem Rattenmodell mithilfe eines kommerziellen FUS-Systems für Tierversuche vor. Das FUS-System wurde auf einer Arbeitsbank oder einem großen Transportwagen aufgebaut (Abbildung 1). Die Ratten wurden mit Isofluran, das über eine Nasenkappe in Sauerstoff gemischt wurde, anästhesiert, während sie im Halterahmen mit Transducerhalterung lagen. Ein Hydrophon mit einer Resonanzfrequenz von 500 kHz zu...
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Diskussion
Es wurde ein Protokoll und ein tierexperimentelles Verfahren unter Verwendung eines Rattenmodells der Jugularvenenkatheterisierung für BHS-Eröffnungsstudien entwickelt. Es gibt zwar zahlreiche präklinische Protokolle, aber dieses Protokoll umfasst ein kommerziell erhältliches FUS-System und ein Rattenmodell, wodurch die Verfahren zur Vorbereitung von Tieren minimiert und dadurch die experimentelle Reproduzierbarkeit gewährleistet wird.
In diesem Protokoll basierte die Auswahl der Mikroblase au...
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Offenlegungen
Die Autoren haben keine relevanten Interessenkonflikte anzugeben.
Danksagungen
Diese Studie wurde teilweise unterstützt durch das National Institute of Dental and Craniofacial Research (NIDCR) Grant K99DE032397, UCSF Department Seed Grant (Nr. 7504831), UCSF RAP Grant (PI: Kazim Narsinh, MD) und die Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, GA 3535/1-1).
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 1 mL Spritze | BD Plastipak | ||
| 20 mL, Natriumchlorid 0,9 % | Hospira, Inc | 00409-7101-67 | |
| 3 ml Spritze | BD Plastipak | ||
| 5 ml Spritze | BD Plastipak | ||
| Stumpfe Nadel, 21 G | SAI Infusionstechnologien | B21-50 | |
| Katheteranschluss, 21 G | SAI Infusion Technologien | CC-25-25 | |
| Katheter-Lock-Lösung | SAI-Infusionstechnologien | Sku # HGS-10 | (500 µ/mL) Glycerin |
| Evans Blue | Sigma aldrich | E2129-10g | |
| ExAblate Neuro | Insightec Inc., Israel | ||
| Gadavist | Bayer | 2068062 | |
| GE Isofluran-Verdampfer | GE Healthcare | ||
| IPS-12RS Spritzenpumpe | Inovenso | IPS-12 | |
| Isofluran USP | Vet one | 501017 | |
| Lumason Mikroblase | Bracco Diagnostics Inc | SKJ709700 | |
| Männliche Sprague-Dawley-Ratten (200– 250 g) | Charles River Laboratories | ||
| Nadel, 18 g | BD Precisionglide | ||
| Phosphatgepufferte Kochsalzlösung | Mediatech | 21-030-CVR | |
| Polyethylenschlauch | BD Intramedic | ||
| präklinischer 3T kryofreier Bruker Biospin Scanner | Bruker | Biospec3T | |
| RK-50 fokussierter Ultraschallwandler | FUS Instruments | Tx-50-1000-0 | |
| RK-50 Tischgerät fokussiertes Ultraschallgerät | FUS Instruments | ||
| Sonic Concepts | Sonic Concepts Inc., WA, USA | ||
| belüfteter Dosierstift | B Braun | 4550560 |
Referenzen
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