Methodenartikel

Isolierung und Kryokonservierung von hochlebensfähigen mononukleären Zellen des peripheren Blutes des Menschen aus Vollblut: Ein Leitfaden für Einsteiger

DOI:

10.3791/66794

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25. Oktober 2024

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1Division of Cardiology, Department of Medicine, University of California San Diego, 2Department of Medical Biochemistry, Amsterdam Immunity and Infection: Inflammatory diseases; Amsterdam Cardiovascular Sciences: Atherosclerosis and Ischemic Syndrome, Amsterdam UMC location University of Amsterdam, 3Department of Cellular and Molecular Medicine, University of California San Diego, 4Division of Clinical Immunology & Rheumatology, Department of Medicine, Heersink School of Medicine, University of Alabama at Birmingham, 5Comprehensive Arthritis, Musculoskeletal, Bone and Autoimmunity Center, Heersink School of Medicine, University of Alabama at Birmingham, 6Department of Medicine, University of California San Diego

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Dieses Protokoll stellt einen zugänglichen Leitfaden für die Sammlung, Lagerung und das Auftauen von mononukleären Zellen des peripheren Blutes dar, der für nachgelagerte Analysen und Arbeitsabläufe wie Durchflusszytometrie und RNA-Sequenzierung geeignet ist. Plasma- und Buffy-Coat-Sammlungen werden ebenfalls vorgeführt.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mononukleäre Zellen des peripheren Blutes (PBMCs) werden häufig in der biomedizinischen Forschung zum Immunsystem und seiner Reaktion auf Krankheiten und Krankheitserreger eingesetzt. Dieses detaillierte Protokoll beschreibt die Ausrüstung, das Zubehör und die Schritte für die Isolierung, Kryokonservierung und das Auftauen hochwertiger und hochlebensfähiger PBMCs aus Vollblutzellen, die für Downstream-Anwendungen wie Durchflusszytometrie und RNA-Sequenzierung geeignet sind. Protokolle für die parallele und gleichzeitige Verarbeitung von Plasma und Buffy Coat aus dem Vollblut mit PBMCs werden ebenfalls beschrieben. Dieses leicht verständliche Schritt-für-Schritt-Protokoll, bei dem die Dichtegradientenzentrifugation zur Isolierung von PBMCs verwendet wird, wird von einer Checkliste mit Verbrauchsmaterialien, Geräten und Vorbereitungsschritten begleitet. Dieses Protokoll ist für Personen geeignet, die bereits Erfahrung mit Labortechniken haben, und kann in klinischen oder Forschungslabors implementiert werden. Qualitativ hochwertige Zellviabilität und RNA-Sequenzierung resultierten aus PBMCs, die von Bedienern ohne vorherige Laborerfahrung mit diesem Protokoll entnommen wurden.

Einleitung

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Dieses Protokoll demonstriert eine zugängliche Methode und einen Arbeitsablauf für die Isolierung von mononukleären Zellen des peripheren Blutes (PBMCs) aus Vollblut. Dieses Protokoll richtet sich insbesondere an unerfahrene Forschungstechniker, Studenten und klinisches Laborpersonal mit dem Ziel, die Entnahme und Kryokonservierung von PBMCs zu erleichtern, ohne eine vorherige Ausbildung in Labortechniken zu erfordern.

Bei diesem Protokoll wird eine Zentrifugation verwendet, um die Bestandteile des Vollbluts nach Dichte zu trennen. Vollblut besteht aus vier Hauptkomponenten, die in der Reihenfolge abnehmender Dichte aufgeführt sind: rote Blutkörperchen/Erythrozyten (~45 % des Volumens), weiße Blutkörperchen (<1 % des Volumens), Blutplättchen (<1 % des Volumens) und Plasma (~55 % des Volumens)1,2,3,4,5,6. Weiße Blutkörperchen können aufgrund ihrer Zellkerneigenschaften in zwei Kategorien unterteilt werden: rund oder mehrkernig6. PBMCs sind definiert als weiße Blutkörperchen mit runden Kernen und bestehen aus den folgenden Zelltypen: Lymphozyten (T-Zellen, B-Zellen, NK-Zellen), dendritische Zellen und Monozyten6. Zu den mehrkernigen weißen Blutkörperchen gehören Granulozyten, die aus den folgenden Zelltypen bestehen: Neutrophile, Basophile und Eosinophile6. Mehrkernige weiße Blutkörperchen sind dichter als PBMCs6. Die Dichten der einzelnen Bestandteile des Vollblutes sind in Tabelle 1 aufgeführt.

Bei diesem Protokoll wird Vollblut in Dichtegradienten-Zentrifugationsröhrchen gesammelt. Diese Röhrchen enthalten ein vorgepacktes Dichtegradientenmedium mit einer Dichte von 1,077 g/ml. Nach der Zentrifugation werden dichtere Zellen, einschließlich mehrkerniger weißer Blutkörperchen und Erythrozyten, durch das Dichtegradientenmedium von PBMCs und Blutplättchen getrennt (Abbildung 1A)6,7. Die PBMC- und Thrombozytenfraktion wird dann gesammelt, gewaschen und zentrifugiert, um Blutplättchen zu entfernen. Die daraus resultierenden gereinigten PBMCs werden gesammelt und bei -80 °C oder in flüssigem Stickstoff gelagert. Kryokonservierte PBMCs können auftaut und direkt in nachgelagerten Analysen verwendet oder zusätzlich verarbeitet werden, um bestimmte Komponentenzelltypen zu isolieren.

Dieses Protokoll wurde für die qualitativ hochwertige RNA-Sequenzierung von hochlebensfähigen PBMCs optimiert. In diesem Artikel wurden PBMCs von Patienten in einer Ambulanz isoliert und kryokonserviert. Anschließend wurden Monozyten mittels FACS aus PBMCs isoliert und mittels RNA-Sequenzierung analysiert. Das Protokoll kann jedoch weitgehend an andere experimentelle Bedürfnisse angepasst werden, wie z.B. Zellkultur, Geneditierung, ex-vivo-Funktionsstudien, Einzelzellanalysen, Phänotypisierung durch Durchflusszytometrie oder Zytometrie nach Flugzeit, Isolierung von DNA/RNA oder Proteinen, Objektträger für die Immunhistochemie, u.a. 8,9,10,11,12,13,14,15, 16,17,18.

Zusätzlich zur PBMC-Entnahme aus Dichtegradientenzentrifugationsröhrchen wird in diesem Protokoll erläutert, wie Plasma und Buffy Coat durch Zentrifugation mit einem EDTA-Röhrchen gesammelt werden. Nach der Zentrifugation wird das Vollblut in Plasma, Erythrozyten und eine dünne Grenzschicht, die als Buffy Coat bezeichnet wird und Leukozyten enthält, getrennt (Abbildung 1B)6. Der Buffy Coat wird häufig für die DNA-Extraktion und nachfolgende genomische Analysen verwendet19,20. Die Plasmaschicht enthält die zellfreien Bestandteile des Vollblutes und kann für Biomarker-Assays verwendet werden21,22.

Protokoll

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Das Studienprotokoll wurde von der UCSD und dem KUMC Human Protections Program genehmigt und entspricht der Deklaration von Helsinki. Alle Personen gaben eine Einverständniserklärung zur Teilnahme und Blutentnahme.

1. Verarbeitung und Kryokonservierung von PBMCs

  1. Drucken Sie einen Tag vor der Blutentnahme die Checkliste der in Tabelle 2 aufgeführten Materialien und Reagenzien aus und bereiten Sie sie entsprechend vor und beschriften Sie sie.
    HINWEIS: Dieses Protokoll wurde für die Entnahme von 6 Dichtegradientenzentrifugationsröhrchen entwickelt. Jedes Röhrchen liefert etwa 12 Millionen PBMCs, von denen etwa 50 % bzw. 20 % lebende Lymphozyten bzw. Monozyten sind. Skalieren Sie entsprechend für experimentelle Anforderungen. Beachten Sie, dass die absolute Anzahl der Zellen je nach Patient oder Behandlungsbedingungen erheblich variieren kann.
  2. Sammeln Sie mit der Standard-Phlebotomietechnik Vollblut in 6 Dichtegradientenzentrifugationsröhrchen und 1 EDTA-Röhrchen, bis es gefüllt ist, ca. 6 ml Volumen.
    HINWEIS: Wenn Proben von mehreren Patienten oder Behandlungsbedingungen erforderlich sind, können die entnommenen Röhrchen bis zu 4 Stunden gelagert und dann gleichzeitig verarbeitet werden.
  3. Nach der Entnahme zentrifugieren Sie alle Röhrchen bei 1.800 x g für 20 min bei Raumtemperatur.
    HINWEIS: Im ergänzenden Video 1 finden Sie eine Demonstration der Bedienung einer Zentrifuge.
  4. Öffnen Sie nach der Zentrifugation vorsichtig das Dichtegradientenzentrifugationsröhrchen. Verwenden Sie eine Transferpipette, um die durchscheinende gelbe Schicht, die das Plasma enthält, zu entfernen und zu entsorgen. Stören Sie nicht die trübe Zellschicht direkt über dem Dichtegradientenmedium. Gehen Sie auf Nummer sicher und lassen Sie überschüssiges Plasma, anstatt PBMCs zu entsorgen. Wiederholen Sie dies für alle Röhrchen.
    HINWEIS: Nach der Zentrifugation des Röhrchens, das das Dichtegradientenmedium enthält, befinden sich Plasma und PBMCs über dem Dichtegradientenmedium; Erythrozyten und Granulozyten setzen sich am Boden ab. Eine Visualisierung finden Sie in Abbildung 1A .
  5. Pipettieren Sie mit einer neuen Transferpipette das verbleibende Volumen, das die Zellen und das Restplasma in jedem Röhrchen enthält, vorsichtig mehrere Male über dem Dichtegradientenmedium auf und ab.
  6. Pipettieren Sie nach der Resuspension den resuspendierten Inhalt des Röhrchens in ein beschriftetes konisches 50-ml-Röhrchen. Wiederholen Sie den Vorgang für alle Tuben.
  7. Gießen Sie Lösung 1 (RPMI Medium) in das 50-ml-Röhrchen, bis es die 50-ml-Linie erreicht.
  8. Wiederholen Sie die Schritte 1.4 bis 1.7 für jeden Patienten oder Behandlungszustand nach Bedarf.
    HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass verschiedene Proben nicht vermischt werden, und verwenden Sie eine neue Transferpipette, um eine Kontamination zu vermeiden.
  9. Zentrifugieren Sie das 50 mL Röhrchen bei 300 x g für 10 min bei Raumtemperatur.
    HINWEIS: Das in Abschnitt 2 beschriebene Plasma- und Buffy-Entnahmeprotokoll kann während dieser Zeit abgeschlossen werden.
  10. Entsorgen Sie so viel Überstand wie möglich. Tippen Sie nach Bedarf, um Tropfenreste zu entfernen.
    HINWEIS: Nach der Zentrifugation enthält das Pellet PBMCs, und der Überstand enthält Blutplättchen und Restplasma.
  11. Gießen Sie ein 15-ml-Röhrchen Lösung 2 (RPMI-Medium + 12,5 % Humanserumalbumin + 1 μM Flavopiridol) in das konische 50-ml-Röhrchen, das das PBMC-Pellet enthält. Drehen Sie das Rohr vorsichtig um, um das Zellpellet wieder zu resuspendieren.
  12. Aspirieren Sie 15 ml Lösung 3 (RPMI-Medium + 11,25 % Humanserumalbumin + 1 μM Flavopiridol + 10 % DMSO) mit einer Transferpipette. Geben Sie tropfenweise in das 50-ml-Röhrchen.
    HINWEIS: Lösung 3 enthält DMSO, das bei Raumtemperatur für Zellen giftig ist. Fügen Sie Lösung 3 erst hinzu, wenn sie sofort verarbeitet werden kann.
  13. Drehen Sie das Röhrchen vorsichtig 3 Mal um, um es zu mischen.
  14. Füllen Sie jedes vormarkierte und vorgekühlte Kryofläschchen mit 1 ml PBMC mit einer Multi-Dispense-Pipette.
    HINWEIS: Im ergänzenden Video 2 finden Sie eine Demonstration der Bedienung einer Multidispense-Pipette.
  15. Stellen Sie die Kryoröhrchen in einen vorgekühlten Gefrierbehälter. Stellen Sie den Behälter dann in einen Gefrierschrank bei -80 °C.
  16. Wiederholen Sie die Schritte 1.9 bis 1.13 für jeden Patienten oder Behandlungszustand nach Bedarf.
  17. Bewahren Sie die Kryofläschchen mindestens 12 Stunden lang im Gefrierbehälter auf und geben Sie sie dann bei -80 °C in eine beschriftete Aufbewahrungsbox.
    HINWEIS: Alternativ können Sie die gefrorenen Kryoröhrchen zur Langzeitlagerung in flüssigen Stickstoff (<-135 °C) umfüllen.

2. Verarbeitung von Plasma und Buffy Coat aus EDTA-Röhren

  1. Zentrifugieren Sie bei 1.800 x g für 10 min bei Raumtemperatur.
    HINWEIS: Nach der Zentrifugation besteht die oberste Schicht aus Plasma, die untere enthält Erythrozyten und die Grenzfläche ist der Buffy Coat. Eine Visualisierung finden Sie in Abbildung 1B .
  2. Mit einer neuen Transferpipette wird so viel Plasma wie möglich angesaugt, ohne die Buffy-Coat-Schicht zu stören. Geben Sie dann 0,5 ml-Aliquots in vormarkierte Kryoröhrchen ab. Aspirieren Sie die Buffy-Coat-Schicht und übertragen Sie sie in das entsprechend gekennzeichnete Kryofläschchen.
    HINWEIS: Einige Plasma- und Erythrozyten können die Buffy-Coat-Sammlung kontaminieren.
  3. Wiederholen Sie Schritt 2.2 für jeden Patienten oder Behandlungszustand nach Bedarf.
  4. Lagern Sie die Kryofläschchen nach der Entnahme in einem -80 °C heißen Gefrierschrank.
    HINWEIS: Alternativ zur Langzeitlagerung in flüssigem Stickstoff (<-135 °C) lagern.

3. Auftauen von PBMCs

  1. Drucken Sie einen Tag vor dem Auftauen eine Checkliste mit den in Tabelle 3 aufgeführten Materialien und Reagenzien aus und bereiten Sie sie entsprechend vor und beschriften Sie sie.
    HINWEIS: Dieses Protokoll wurde für das Auftauen von 1 1,5-ml-Röhrchen mit 1 ml PBMC entwickelt. Jedes Röhrchen ergibt etwa 2 Millionen PBMCs, von denen etwa 50 % bzw. 20 % lebende Lymphozyten bzw. Monozyten sind. Skalieren Sie entsprechend für experimentelle Anforderungen. Beachten Sie, dass die absolute Anzahl der Zellen je nach Patient oder Behandlungsbedingungen erheblich variieren kann.
  2. Gefrorene PBMCs mit Trockeneis aus dem Lager überführen und in einem 37 °C heißen Inkubator für 4 Minuten oder kurz vor dem letzten Auftauen des Eiskristalls auftauen.
    HINWEIS: Falls gewünscht, kann ein Aliquot für Zellzählungs- und Viabilitätsmessungen entnommen werden, wie in Abschnitt 4 beschrieben.
  3. Nach dem Auftauen 1 ml Lösung 4 (PBS + 2 mM EDTA) in jedes Kryofläschchen geben. Gießen Sie dann den Inhalt in ein vorbeschriftetes 50-ml-Röhrchen mit 10 ml Lösung 4 für jedes aufgetaute PBMC-Röhrchen. Tippen Sie, um Tropfenreste zu entfernen.
  4. Legen Sie das Zellsieb auf das leere 50-ml-Röhrchen und gießen Sie dann die Zellsuspension durch das Zellsieb.
    HINWEIS: Tippen Sie bei Bedarf leicht, um die Oberflächenspannung zu brechen.
  5. Jedes Röhrchen mit den passierten Zellen wird 7 min lang bei Raumtemperatur bei 400 x g zentrifugiert.
  6. Gießen Sie nach dem Zentrifugieren den DMSO-haltigen Überstand aus. Tippen Sie nach Bedarf, um Tropfenreste zu entfernen.
  7. Resuspendieren Sie das Zellpellet in dem gewünschten Medium, das für nachgelagerte experimentelle Anforderungen geeignet ist (z. B. Zellkulturmedien, Durchflusszytometrie, Antikörpercocktail usw.).

4. Zellzählung und Lebensfähigkeit

  1. Unmittelbar nach dem Auftauen von gefrorenen PBMCs in Schritt 3.2 pipettieren Sie 20 μl Zellen in ein 1,5-ml-Röhrchen. Fügen Sie ein gleiches Volumen von 0,4 % Trypanblau-Lösung hinzu und pipettieren Sie zum Mischen vorsichtig auf und ab.
  2. Befolgen Sie mit einem automatisierten Zellzähler das Protokoll des Herstellers, um Zellen zu zählen und die Lebensfähigkeit zu beurteilen. Stellen Sie sicher, dass der Verdünnungsfaktor von 2 berücksichtigt wird.
    HINWEIS: Wie an anderer Stelle beschrieben, kann ein Hämozytometer als alternative Methode zur Beurteilung der Zellzahl und -viabilität verwendet werden23.

Ergebnisse

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Nach der PBMC-Entnahme und Kryokonservierung wurde die Lebensfähigkeit von aufgetauten PBMCs, Monozyten und Lymphozyten aus 56 einzigartigen Proben mittels Durchflusszytometrie unter Verwendung von Reagenzien, die in Tabelle 4 aufgeführt sind, gemäß den Anweisungen des Herstellers (Abbildung 2A-F) bewertet. Es wurde eine mittlere ± SD-Viabilität von PBMCs, Monozyten und Lymphozyten von 94 ± 4,0 %, 98 ± 1,1 % bzw. 93 ± 5,6 % erreicht (Abbildung 2G). Die Viabilitätsmessung durch Trypanblau-Ausschluss ergab eine mittlere Viabilität von 88 ± 7,5 % und eine Zellzahl von 2,3 x 106 ± 1,9 x 106. Die durchflusszytometrische Analyse zeigte auch, dass lebende Monozyten 17 ± 5,9 % und Lymphozyten 53 ± 13,0 % der gesamten PBMCs ausmachten.

Anschließend wurden Monozyten aus aufgetauten PBMCs aus 59 einzigartigen Proben mittels Durchflusszytometrie sortiert und zur Bibliotheksvorbereitung und RNA-Sequenzierung eingereicht, wie an anderer Stellebeschrieben 24. Eine mittlere ± SD-Gesamtsequenzanzahl von 18,0 ± 16,3 Millionen wurde mit einem Lese-Alignment von 93 ± 6,3 % und einem GC-Gehalt von 49,6 ± 1,4 % erreicht (Abbildung 3A-B). Ein mittlerer Prozentsatz ± SD-Reads von 88 ± 3,6 % wurde mit einer Teilmenge von 56 einzigartigen Stichproben gefunden. Diese Parameter zeigen, dass hochgradig lebensfähige PBMCs, die für Downstream-Anwendungen, einschließlich hochwertiger RNA-Sequenzierung, geeignet sind, von Bedienern mit jedem Grad der Laborausbildung unter Verwendung dieses Protokolls erhalten werden können.

BestandteilDichteZitat
Plasma1,022 g/mL bis 1,026 g/mL1
Blutplättchen<1,061 g/ml bis >1,070 g/ml2
PBMCs<1,077 g/ml6
Neutrophile mit niedriger Dichte*<1,077 g/ml3
Granulozyten (Neutrophile*, Basophile und Eosinophile)>1,077 g/ml6
Erythrozyten1,11 g/ml4

Tabelle 1: Bestandteile des Vollbluts, aufgelistet in der Reihenfolge abnehmender Dichte.

Reagant/WerkstoffMenge (pro 6 CPT-Röhrchen und 1 EDTA-Röhrchen)TrinkgeldWarnhinweise
CPT-Röhren6Etikettieren Sie entsprechend der Patienten- oder Proben-ID.
EDTA-Röhre1Etikettieren Sie entsprechend der Patienten- oder Proben-ID.
Konisches 50-ml-Röhrchen2Zusätzlich zur Patienten- oder Proben-ID 1 Röhrchen für PBMCs und 1 Röhrchen für Abfall beschriften.
Kryo-Fläschchen39Etikettieren Sie 30 für PBMCs, 8 für EDTA-Plasma und 1 für Buffy Coat. Es dürfen nicht alle Kryoröhrchen verwendet werden.
Herr Frosty2Bis zur Hälfte mit Isopropanol auffüllen und über Nacht bei -20°C vorkühlen.Isopropanol ist ein brennbarer Reizstoff. Von Funken/Flammen fernhalten. Vermeiden Sie das Einatmen und handhaben Sie mit Handschuhen und Vorsicht.
Flavopiridol100 μl 1000X VorratZur Herstellung von 1000X Flavopiridol-Stamm suspendieren Sie 5 mg Flavopiridol in 1,14 ml DMSO für eine Konzentration von 10 mM. Aliquotieren Sie 200 μl in einzelne Behälter und frieren Sie sie ein. Zur Verwendung einzelne Aliquote auftauen und 1:10 in DNase/RNase-freiem destilliertem Wasser verdünnen und dann als 1000X-Lösung verwenden.Flavopiridol ist ein Reizstoff. Mit Handschuhen anfassen und pflegen.
Lösung 150 mLRPMI Mittel.
Um 50 mL Stammlösung herzustellen, verwenden Sie 50 mL RPMI Medium.
Lösung 2ca. 15 mLRPMI Medium + 12,5 % Humanserumalbumin + 1 μM Flavopiridol.
Um 50 ml Stammlösung herzustellen, verwenden Sie 25 ml RPMI-Medium + 25 ml Humanserumalbumin + 50 μl 1000X Flavopiridol.		Flavopiridol ist ein Reizstoff. Mit Handschuhen anfassen und pflegen.
Lösung 3ca. 15 mLRPMI Medium + 11,25 % Humanserumalbumin + 1 μM Flavopiridol + 10 % DMSO.
Um 50 mL Stammlösung herzustellen, verwenden Sie 22,5 mL RPMI-Medium + 22,5 mL HSA + 5 mL DMSO + 50 μl 1000X Flavopiridol.		Flavopiridol ist ein Reizstoff und DMSO ist giftig und wird leicht über die Haut aufgenommen. Mit Handschuhen anfassen und pflegen.

Tabelle 2: Checkliste der Reagenzien und Materialien, die für die Entnahme und Kryokonservierung von PBMCs vorbereitet und gekennzeichnet werden müssen.

Reagant/WerkstoffMenge (pro 1 ml aliquoter gefrorener PBMCs)TrinkgeldWarnhinweise
Lösung 410 mLPBS + 2 mM EDTA

Um 50 mL Stammlösung herzustellen, verwenden Sie 5 mL 10X PBS + 200 μL 0,5M EDTA + 44,8 mL DNase/RNase-freies destilliertes Wasser
Konisches 50-ml-Röhrchen3Zusätzlich zur Patienten- oder Proben-ID 1 Röhrchen für vorgespannte PBMCs, 1 für nachgespannte PBMCs und 1 für Abfall beschriften. Füllen Sie das Röhrchen, das mit vorgefärbten PBMCs gekennzeichnet ist, mit 9 mL Lösung 4 pro mL gefrorener PBMCs
1,5 mL Röhrchen1Für die Zellzählung; Etikett mit Patienten- oder Proben-ID
0,4% Trypanblau-Lösungca. 20 μlFür die Zellzählung; kann am Vortag vorzeitig in das 1,5 mL Röhrchen gegeben werden.Trypanblau ist ein Karzinogen. Mit Handschuhen anfassen und pflegen.

Tabelle 3: Checkliste der Reagenzien und Materialien, die für das Auftauen und Zählen von PBMCs vorbereitet und gekennzeichnet werden müssen.

Reagenz/MaterialMenge (pro Million Zellen)
Lebend-toter Fleck5 μL
Menschliches Vertrauen FcX5 μL
CD3 Antikörper5 μL
CD19 Antikörper5 μL
CD56 Antikörper5 μL
CD66b Antikörper5 μL
HLA-DR Antikörper5 μL
CD14 Antikörper5 μL
CD16 Antikörper2,5 μL
RNAsin100 Einheiten

Tabelle 4: Tabelle der Reagenzien für die Isolierung von Monozyten aus PBMCs mittels Durchflusszytometrie.

Trennung von Blutbestandteilen im Dichtegradientenzentrifugationsdiagramm; Plasma, PBMCs, Buffy-Coat-Schichten.
Abbildung 1: Vollblutbestandteile, wie sie durch Zentrifugation in Dichtegradientenzentrifugation oder EDTA-Röhrchen getrennt wurden. (A) Die Zentrifugation von Vollblut in Dichtegradienten-Zentrifugationsröhrchen führt zur Trennung von Plasma, Blutplättchen und PBMCs oberhalb des Dichtegradientenmediums mit mehrkernigen und Erythrozyten unterhalb des Dichtegradientenmediums. (B) Die Zentrifugation von Vollblut in EDTA-Röhrchen führt zur Trennung von Plasma in der obersten Schicht, Erythrozyten in der unteren Schicht und dem Buffy Coat in der Grenzfläche. Erstellt mit Biorender.com. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Streudiagramme der Durchflusszytometrie; PBMCs, Monozyten, Lymphozyten; Viabilitätsanalyse, Diagramm des Zelltyps.
Abbildung 2: Die Lebensfähigkeit von aufgetauten kryokonservierten PBMCs wurde durch Lebend-/Totflussfärbung und Durchflusszytometrie bewertet. (A) Ablagerungen, die mit einem Sternchen * gekennzeichnet sind, werden durch Vorwärts- und Seitenstreuung von PBMCs ausgeschlossen. (B) Repräsentative Lebend/Tot-Analyse ganzer PBMCs (C) Pan-Monozyten werden für die folgenden FITC-markierten Oberflächenantigene als HLA-DR-positiv und -negativ gegated: CD3, CD19, CD56 und CD66b. (D) Repräsentative Lebend/Tot-Analyse von Monozyten. (E) Lymphozyten, die von den folgenden FITC-markierten Oberflächenantigenen kontrolliert werden: CD3, CD19, CD56 und CD 66b. (F) Repräsentative Lebend/Tot-Analyse von Lymphozyten. (G) Prozentuale Lebensfähigkeit jedes Zelltyps, quantifiziert aus 56 Proben. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

FastQC-Datenanalyse-Diagramme; Millionen Sequenzen vs. alignable GC-Inhaltsverteilung.
Abbildung 3: RNA-Sequenzierungsqualität von Monozyten, die aus kryokonservierten PBMCs sortiert wurden. 56 einzigartige Proben wurden sequenziert und ein mittlerer ± SD 18,0 ± insgesamt 16,3 Millionen Sequenzen generiert. (A) Die Ausrichtung war hoch, wobei 92,5 % ± 6,3 % der Sequenzen mit dem Referenzgenom übereinstimmten. (B) Der GC-Gehalt dieser Sequenzen betrug 49,6 ± 1,4 %. Erstellt mit FastQC25. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Ergänzendes Video 1: Demonstration der Verwendung der Zentrifuge Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzendes Video 2: Demonstration der Bedienung einer Multidispenser-Pipette. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dieses Protokoll für die PBMC-Entnahme und Kryokonservierung wurde von Personen mit und ohne vorherige Laborausbildung erfolgreich umgesetzt. In unserer Anwendung führten die FACS- und RNA-Sequenzierung von hochlebensfähigen Monozyten, die aus gelagerten PBMCs gereinigt wurden, zu qualitativ hochwertigen Sequenzen.

Eine große Stärke dieses Protokolls ist seine Zugänglichkeit. Bei der im Protokoll vorgestellten Technik werden Röhrchen verwendet, die mit einem Feststoffdichtegradientenmedium vorgepackt sind. Dadurch kann Vollblut direkt in das Röhrchen entnommen und dann sofort zur Isolierung von PBMCs verarbeitet werden. Es wird eine relativ kleine Anzahl von vorgefertigten Lösungen und Spezialgeräten benötigt, um die Zusammenarbeit zwischen dem Forschungslabor, in dem Reagenzien hergestellt werden können, und dem klinischen Labor, in dem Proben entnommen und verarbeitet werden, zu erleichtern. Die schriftlichen und Videoprotokolle richten sich an Bediener auf jedem Schulungsniveau.

Obwohl bei diesem Protokoll frisches Vollblut zur Isolierung von PBMCs verwendet wird und daher eine relativ hohe erwartete Ausbeute und Reinheit von >90 % erreicht wird, ist es möglicherweise nicht für Anwendungen geeignet, die außergewöhnlich hohe Reinheiten von >98 % erfordern26,27. Darüber hinaus kann die Beschaffung von Dichtegradientenzentrifugationsröhrchen kostspielig sein, insbesondere wenn eine große Anzahl von Proben entnommen werden muss.

Alternative Verfahren zur PBMC-Entnahme umfassen die Verwendung eines Flüssigkeitsdichtegradientenmediums oder die immunomagnetische Depletion28,29. Kurz gesagt, bei ersterem wird ein vorgefertigtes Dichtegradientenmedium unter heparinisiertes Vollblut geschichtet, gefolgt von einer Zentrifugation. Letzteres verwendet magnetisch markierte Antikörper, um Nicht-PBMCs zu markieren, die dann in einer magnetischen Säule zurückgehalten werden, während unmarkierte PBMCs unbeeinflusst passieren.

Im Vergleich zum vorgestellten Protokoll ist die Verwendung eines flüssigen Dichtegradientenmediums sowohl kostengünstiger als auch aufgrund des Fehlens von Dichtegradienten-Zentrifugationsröhrchen viel weniger Material; Die PBMC-Isolierung kann in einem Standard-50-ml-Röhrchendurchgeführt werden 8. Diese Technik ist jedoch aufwändiger, hat eine längere Verarbeitungszeit und kann einem höheren Risiko von Benutzerfehlern unterliegen. Heparin muss präzise zugegeben werden, um eine Überverdünnung zu vermeiden, und das Dichtegradientenmedium muss sorgfältig in den richtigen Mengen geschichtet werden, um eine gute PBMC-Trennung zu gewährleisten26.

Im Vergleich zum vorgestellten Protokoll bietet die Verwendung der immunomagnetischen Depletion eine höhere Ausbeute und Reinheit, eine geringere Handhabung aufgrund fehlender Zentrifugation, eine schnellere Verarbeitungszeit und erfordert viel weniger Material 30,31,32. Der größte Nachteil ist jedoch, dass diese Methode die teuerste der drei beschriebenen Methoden ist, insbesondere in großem Maßstab.

Obwohl dieses Protokoll robust ist, können bestimmte kritische Schritte zusätzliche Aufmerksamkeit erfordern. Stellen Sie während des gesamten Protokolls sicher, dass die Proben nicht vermischt und in die entsprechend gekennzeichneten Röhrchen gegeben werden, insbesondere wenn Sie mit mehreren Patienten oder Erkrankungen gleichzeitig arbeiten. Für Schritt 1.4 ist sicherzustellen, dass keine PBMCs verworfen werden. Überschüssiges Plasma verringert nur die Konzentration von PBMCs, was für die Aufrechterhaltung der Lebensfähigkeit und Qualität der Probe weniger kritisch ist. Unabhängig davon deutet das Vorhandensein von Ausfällungen in gesammelten PBMCs darauf hin, dass Teile des Dichtegradientenmediums entfernt wurden. Pipettieren Sie in Schritt 1.5 vorsichtiger, um dieses Problem zu vermeiden. In den Schritten 1.10 und 3.6 ist darauf zu achten, dass das zentrifugierte Küvettenpellet nicht verworfen wird. Für die Schritte 1.12 und 3.3 ist ein zügiges Arbeiten von entscheidender Bedeutung, da Lösung 3 DMSO enthält, das für Zellen bei Raumtemperatur toxisch ist33. Es ist auch wichtig zu beachten, dass die Lagerung von PBMCs in flüssigem Stickstoff gegenüber der Lagerung bei -80 °C empfohlen wird. Eine Langzeitlagerung bei -80 °C wurde mit einer verminderten Zellviabilität und einer veränderten Genexpression in Verbindung gebracht34,35.

Dieses Protokoll kann je nach experimentellem Bedarf angepasst werden. Die Zugabe von Flavopiridol, einem Inhibitor der RNA-Polymerase und der mRNA-Synthese, in den Lösungen 2 und 3 soll jegliche Handhabung und stressinduzierte Artefakte bei der RNA-Sequenzierung36 verhindern. Auf Flavopiridol kann jedoch verzichtet werden, wenn funktionelle oder ex vivo-Studien mit PBMCs gewünscht werden.

Plasma, das aus EDTA-Röhrchen entnommen wird, wird mit EDTA, einem Chelatbildner, kontaminiert. Infolgedessen ist EDTA-Plasma für Assays mit Gerinnungs- oder Calciumionen ungeeignet37,38. Falls gewünscht, kann die Plasmaschicht in den Dichtegradienten-Mediumröhrchen nach der Zentrifugation stattdessen in Schritt 1.4 gesammelt werden. Diese Röhrchen enthalten Natriumheparin als Antikoagulans, das unter Zusatz von Heparinase39 entfernt werden kann. Insbesondere hemmt Heparin die reverse Transkriptase und die PCR-Amplifikation, wodurch das gesammelte Plasma für PCR-Experimente ohne Zusatz eines Heparin-Blockers ungeeignet ist40.

Der gesammelte Buffy Coat aus EDTA-Röhrchen wird nicht in einer Lösung gelagert, die DMSO oder Flavopiridol enthält. DMSO ist wichtig für die Verringerung der Eiskristallbildung und des Zelltods41. Flavopiridol ist wichtig für die Hemmung der RNA-Synthese36. Daher ist der Buffy Coat für ex vivo und transkriptomische Analysen ungeeignet. Falls gewünscht, können die Schritte 1.6 bis 1.15 unter Verwendung von gesammeltem Buffy-Coat durchgeführt werden, um die Zellviabilität zu maximieren und die RNA-Synthese zu hemmen.

Während dieses Protokoll für die RNA-Sequenzierung konzipiert wurde, umfassen weitere potenzielle Anwendungen von PBMCs, die mit diesem Protokoll gesammelt und kryokonserviert wurden, Zellkulturen, Geneditierung, Ex-vivo-Funktionsstudien, Einzelzellanalysen, Phänotypisierung durch Durchflusszytometrie oder Zytometrie nach Flugzeit, Isolierung von DNA/RNA oder Proteinen, Objektträger für die Immunhistochemie und vieles mehr.

Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren haben keine relevanten finanziellen oder nicht-finanziellen Interessen offenzulegen.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wir möchten uns bei den Patienten bedanken, die freiwillig ihr Einverständnis, ihre Zeit und ihre Spende von Blutproben zur Verfügung gestellt haben. Wir danken auch Dr. Patrick Moriarty, Julie-Ann Dutton und Mark McClellen vom Kansas University Medical Center für ihre Zusammenarbeit und die Implementierung dieses Protokolls an einem entfernten Standort. CY hat Forschungsunterstützung durch den NIH-Zuschuss 1K08HL150271 erhalten.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
1000 &Mikro; L SpitzenGilsonF174501Ungefähr 3 Spitzen pro Patient/Behandlungsbedingung für PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
benötigt 15 ml RöhrchenBiopioneeerCNT-15Zur Aufbewahrung von Lösungen 2/3
2 pro Patient/Behandlungsbedingung für PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
benötigt 2 mL KryoröhrchenGlobe Scientific3012Ungefähr 40 Kryoröhrchen pro Patient/Behandlungszustand für PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
20 & micro; L SpitzenGilsonF174201Zur Verwendung bei der Zellzählung; das benötigte Volumen hängt von der verwendeten Methode der Zellzählung ab. 1 Spitze wird pro 1 ml nicht gepoolter gefrorener PBMCs benötigt, die aufgetaut werden
sollen 50 ml konisches RöhrchenCEM Corporation50-187-76832 werden pro Patient / Behandlungsbedingung für PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection benötigt
3 werden pro 1 ml nicht gepoolte gefrorene PBMCs benötigt, die aufgetaut werden
sollen CD14-AntikörperBiolegend325621
CD16 AntikörperBiolegend360723
CD19 AntikörperBiolegend363007
CD3 AntikörperBiolegend300405
CD56 AntikörperBiolegend318303
CD66b AntikörperBiolegend305103
ZellsiebBiopioneeerDGN2583671 benötigter pro 1 ml nicht gepoolter gefrorener PBMCs, die aufgetaut werden
sollen CPT Mononukleäres ZellvorbereitungsröhrchenBD Biosciences3627536 benötigte Röhrchen pro Patient/Behandlungsbedingung für PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
Cryo Freezer BoxSouthern LabwareSB2CC-81Fasst 81 Röhrchen
1 pro Patient/Behandlungsbedingung für PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
Cryotube Rack Fisherbrand05-669-45Fasst bis zu 50 Kryoröhrchen
DMSOInvitrogen15575020Benötigt ca. 2,5 ml pro Patient/Behandlungsbedingung für PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
DNase/RNasefreies destilliertes WasserInvitrogen10977015. 2 mL pro Patient/Behandlungsbedingung für PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
Benötigt ca. 9 mL pro 1 ml gefrorener PBMCs, die aufgetaut
werden sollenEDTA-RöhrchenBD Biosciences3666431 Röhrchen pro Patient/Behandlungsbedingung für PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
benötigt FlavopiridolSigma-AldrichF3055-5MG
HLA-DR AntikörperBiolegend307609
Humanserum AlbuminGeminiBio800-120Ungefähr 25 ml pro Patient oder Behandlungsbedingung für PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection erforderlich
Human Trustain FcXBiolegend422301
IsopropanolSigma-AldrichW292912-1KG-KZur Verwendung in Mr. Frosty
EtikettendruckerPhomemoM110-WH
Lebendtot FleckBiolegend423105
Mr. FrostyThermo Scientific5100-0001Fasst bis zu 18 Röhrchen.
2 Mr. Frostys pro Patient/Behandlungsbedingung für PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
Multidispense PipetteBrandtech705110
Multidispense PipettenspitzenBrandtech705744Ungefähr 3 Spitzen pro Patient/Behandlungsbedingung für PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
P1000 PipetteGilsonF144059M
P20 PipetteGilsonF144056MZur Verwendung bei der Zellzählung; das benötigte Volumen hängt von der verwendeten Methode der Zellzählung ab.
DruckeretikettenPhomemoPM-M110-3020Benötigt werden ca. 45 Etiketten pro Patient/Behandlungsbedingung für PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
Benötigt ca. 5 Etiketten pro 1 ml nicht gepoolter gefrorener PBMCs, die aufgetaut werden
müssen RNasefreies EDTA (0,5 m)InvitrogenAM9260GUngefähr 40 & Mikro; L benötigt pro 1 ml gefrorener PBMCs, die aufgetaut werden
sollen RNase-freies PBS (10X)InvitrogenAM9625Ungefähr 1 mL pro 1 ml gefrorener PBMCs, die aufgetaut werden sollen
RNasinPromegaN2111
RPMICorning10-040-CVUngefähr 80 mL pro Patient oder Behandlungsbedingung für PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
TransferpipettenFisherbrand13-711-7MUngefähr 5 pro Patient/Behandlungsbedingung für PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
Tube HolderEndicott-Seymour14-781-15Hält bis zu 80 CPT/EDTA-Röhrchen
Ca

Referenzen

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Schlagwörter

PBMC IsolierungDichtegradientenzentrifugationZellkryokonservierungBuffy CoatEDTA PlasmaDurchflusszytometrieRNA SequenzierungZellviabilit tMonozyten Sorting

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