Isolierung und Kryokonservierung von hochlebensfähigen mononukleären Zellen des peripheren Blutes des Menschen aus Vollblut: Ein Leitfaden für Einsteiger
Summary
Dieses Protokoll stellt einen zugänglichen Leitfaden für die Sammlung, Lagerung und das Auftauen von mononukleären Zellen des peripheren Blutes dar, der für nachgelagerte Analysen und Arbeitsabläufe wie Durchflusszytometrie und RNA-Sequenzierung geeignet ist. Plasma- und Buffy-Coat-Sammlungen werden ebenfalls vorgeführt.
Abstract
Mononukleäre Zellen des peripheren Blutes (PBMCs) werden häufig in der biomedizinischen Forschung zum Immunsystem und seiner Reaktion auf Krankheiten und Krankheitserreger eingesetzt. Dieses detaillierte Protokoll beschreibt die Ausrüstung, das Zubehör und die Schritte für die Isolierung, Kryokonservierung und das Auftauen hochwertiger und hochlebensfähiger PBMCs aus Vollblutzellen, die für Downstream-Anwendungen wie Durchflusszytometrie und RNA-Sequenzierung geeignet sind. Protokolle für die parallele und gleichzeitige Verarbeitung von Plasma und Buffy Coat aus dem Vollblut mit PBMCs werden ebenfalls beschrieben. Dieses leicht verständliche Schritt-für-Schritt-Protokoll, bei dem die Dichtegradientenzentrifugation zur Isolierung von PBMCs verwendet wird, wird von einer Checkliste mit Verbrauchsmaterialien, Geräten und Vorbereitungsschritten begleitet. Dieses Protokoll ist für Personen geeignet, die bereits Erfahrung mit Labortechniken haben, und kann in klinischen oder Forschungslabors implementiert werden. Qualitativ hochwertige Zellviabilität und RNA-Sequenzierung resultierten aus PBMCs, die von Bedienern ohne vorherige Laborerfahrung mit diesem Protokoll entnommen wurden.
Introduction
Dieses Protokoll demonstriert eine zugängliche Methode und einen Arbeitsablauf für die Isolierung von mononukleären Zellen des peripheren Blutes (PBMCs) aus Vollblut. Dieses Protokoll richtet sich insbesondere an unerfahrene Forschungstechniker, Studenten und klinisches Laborpersonal mit dem Ziel, die Entnahme und Kryokonservierung von PBMCs zu erleichtern, ohne eine vorherige Ausbildung in Labortechniken zu erfordern.
Bei diesem Protokoll wird eine Zentrifugation verwendet, um die Bestandteile des Vollbluts nach Dichte zu trennen. Vollblut besteht aus vier Hauptkomponenten, die in der Reihenfolge abnehmender Dichte aufgeführt sind: rote Blutkörperchen/Erythrozyten (~45 % des Volumens), weiße Blutkörperchen (<1 % des Volumens), Blutplättchen (<1 % des Volumens) und Plasma (~55 % des Volumens)1,2,3,4,5,6. Weiße Blutkörperchen können aufgrund ihrer Zellkerneigenschaften in zwei Kategorien unterteilt werden: rund oder mehrkernig6. PBMCs sind definiert als weiße Blutkörperchen mit runden Kernen und bestehen aus den folgenden Zelltypen: Lymphozyten (T-Zellen, B-Zellen, NK-Zellen), dendritische Zellen und Monozyten6. Zu den mehrkernigen weißen Blutkörperchen gehören Granulozyten, die aus den folgenden Zelltypen bestehen: Neutrophile, Basophile und Eosinophile6. Mehrkernige weiße Blutkörperchen sind dichter als PBMCs6. Die Dichten der einzelnen Bestandteile des Vollblutes sind in Tabelle 1 aufgeführt.
Bei diesem Protokoll wird Vollblut in Dichtegradienten-Zentrifugationsröhrchen gesammelt. Diese Röhrchen enthalten ein vorgepacktes Dichtegradientenmedium mit einer Dichte von 1,077 g/ml. Nach der Zentrifugation werden dichtere Zellen, einschließlich mehrkerniger weißer Blutkörperchen und Erythrozyten, durch das Dichtegradientenmedium von PBMCs und Blutplättchen getrennt (Abbildung 1A)6,7. Die PBMC- und Thrombozytenfraktion wird dann gesammelt, gewaschen und zentrifugiert, um Blutplättchen zu entfernen. Die daraus resultierenden gereinigten PBMCs werden gesammelt und bei -80 °C oder in flüssigem Stickstoff gelagert. Kryokonservierte PBMCs können auftaut und direkt in nachgelagerten Analysen verwendet oder zusätzlich verarbeitet werden, um bestimmte Komponentenzelltypen zu isolieren.
Dieses Protokoll wurde für die qualitativ hochwertige RNA-Sequenzierung von hochlebensfähigen PBMCs optimiert. In diesem Artikel wurden PBMCs von Patienten in einer Ambulanz isoliert und kryokonserviert. Anschließend wurden Monozyten mittels FACS aus PBMCs isoliert und mittels RNA-Sequenzierung analysiert. Das Protokoll kann jedoch weitgehend an andere experimentelle Bedürfnisse angepasst werden, wie z.B. Zellkultur, Geneditierung, ex-vivo-Funktionsstudien, Einzelzellanalysen, Phänotypisierung durch Durchflusszytometrie oder Zytometrie nach Flugzeit, Isolierung von DNA/RNA oder Proteinen, Objektträger für die Immunhistochemie, u.a. 8,9,10,11,12,13,14,15, 16,17,18.
Zusätzlich zur PBMC-Entnahme aus Dichtegradientenzentrifugationsröhrchen wird in diesem Protokoll erläutert, wie Plasma und Buffy Coat durch Zentrifugation mit einem EDTA-Röhrchen gesammelt werden. Nach der Zentrifugation wird das Vollblut in Plasma, Erythrozyten und eine dünne Grenzschicht, die als Buffy Coat bezeichnet wird und Leukozyten enthält, getrennt (Abbildung 1B)6. Der Buffy Coat wird häufig für die DNA-Extraktion und nachfolgende genomische Analysen verwendet19,20. Die Plasmaschicht enthält die zellfreien Bestandteile des Vollblutes und kann für Biomarker-Assays verwendet werden21,22.
Protocol
Das Studienprotokoll wurde von der UCSD und dem KUMC Human Protections Program genehmigt und entspricht der Deklaration von Helsinki. Alle Personen gaben eine Einverständniserklärung zur Teilnahme und Blutentnahme.
1. Verarbeitung und Kryokonservierung von PBMCs
- Drucken Sie einen Tag vor der Blutentnahme die Checkliste der in Tabelle 2 aufgeführten Materialien und Reagenzien aus und bereiten Sie sie entsprechend vor und beschriften Sie sie.
HINWEIS: Dieses Protokoll wurde für die Entnahme von 6 Dichtegradientenzentrifugationsröhrchen entwickelt. Jedes Röhrchen liefert etwa 12 Millionen PBMCs, von denen etwa 50 % bzw. 20 % lebende Lymphozyten bzw. Monozyten sind. Skalieren Sie entsprechend für experimentelle Anforderungen. Beachten Sie, dass die absolute Anzahl der Zellen je nach Patient oder Behandlungsbedingungen erheblich variieren kann. - Sammeln Sie mit der Standard-Phlebotomietechnik Vollblut in 6 Dichtegradientenzentrifugationsröhrchen und 1 EDTA-Röhrchen, bis es gefüllt ist, ca. 6 ml Volumen.
HINWEIS: Wenn Proben von mehreren Patienten oder Behandlungsbedingungen erforderlich sind, können die entnommenen Röhrchen bis zu 4 Stunden gelagert und dann gleichzeitig verarbeitet werden. - Nach der Entnahme zentrifugieren Sie alle Röhrchen bei 1.800 x g für 20 min bei Raumtemperatur.
HINWEIS: Im ergänzenden Video 1 finden Sie eine Demonstration der Bedienung einer Zentrifuge. - Öffnen Sie nach der Zentrifugation vorsichtig das Dichtegradientenzentrifugationsröhrchen. Verwenden Sie eine Transferpipette, um die durchscheinende gelbe Schicht, die das Plasma enthält, zu entfernen und zu entsorgen. Stören Sie nicht die trübe Zellschicht direkt über dem Dichtegradientenmedium. Gehen Sie auf Nummer sicher und lassen Sie überschüssiges Plasma, anstatt PBMCs zu entsorgen. Wiederholen Sie dies für alle Röhrchen.
HINWEIS: Nach der Zentrifugation des Röhrchens, das das Dichtegradientenmedium enthält, befinden sich Plasma und PBMCs über dem Dichtegradientenmedium; Erythrozyten und Granulozyten setzen sich am Boden ab. Eine Visualisierung finden Sie in Abbildung 1A . - Pipettieren Sie mit einer neuen Transferpipette das verbleibende Volumen, das die Zellen und das Restplasma in jedem Röhrchen enthält, vorsichtig mehrere Male über dem Dichtegradientenmedium auf und ab.
- Pipettieren Sie nach der Resuspension den resuspendierten Inhalt des Röhrchens in ein beschriftetes konisches 50-ml-Röhrchen. Wiederholen Sie den Vorgang für alle Tuben.
- Gießen Sie Lösung 1 (RPMI Medium) in das 50-ml-Röhrchen, bis es die 50-ml-Linie erreicht.
- Wiederholen Sie die Schritte 1.4 bis 1.7 für jeden Patienten oder Behandlungszustand nach Bedarf.
HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass verschiedene Proben nicht vermischt werden, und verwenden Sie eine neue Transferpipette, um eine Kontamination zu vermeiden. - Zentrifugieren Sie das 50 mL Röhrchen bei 300 x g für 10 min bei Raumtemperatur.
HINWEIS: Das in Abschnitt 2 beschriebene Plasma- und Buffy-Entnahmeprotokoll kann während dieser Zeit abgeschlossen werden. - Entsorgen Sie so viel Überstand wie möglich. Tippen Sie nach Bedarf, um Tropfenreste zu entfernen.
HINWEIS: Nach der Zentrifugation enthält das Pellet PBMCs, und der Überstand enthält Blutplättchen und Restplasma. - Gießen Sie ein 15-ml-Röhrchen Lösung 2 (RPMI-Medium + 12,5 % Humanserumalbumin + 1 μM Flavopiridol) in das konische 50-ml-Röhrchen, das das PBMC-Pellet enthält. Drehen Sie das Rohr vorsichtig um, um das Zellpellet wieder zu resuspendieren.
- Aspirieren Sie 15 ml Lösung 3 (RPMI-Medium + 11,25 % Humanserumalbumin + 1 μM Flavopiridol + 10 % DMSO) mit einer Transferpipette. Geben Sie tropfenweise in das 50-ml-Röhrchen.
HINWEIS: Lösung 3 enthält DMSO, das bei Raumtemperatur für Zellen giftig ist. Fügen Sie Lösung 3 erst hinzu, wenn sie sofort verarbeitet werden kann. - Drehen Sie das Röhrchen vorsichtig 3 Mal um, um es zu mischen.
- Füllen Sie jedes vormarkierte und vorgekühlte Kryofläschchen mit 1 ml PBMC mit einer Multi-Dispense-Pipette.
HINWEIS: Im ergänzenden Video 2 finden Sie eine Demonstration der Bedienung einer Multidispense-Pipette. - Stellen Sie die Kryoröhrchen in einen vorgekühlten Gefrierbehälter. Stellen Sie den Behälter dann in einen Gefrierschrank bei -80 °C.
- Wiederholen Sie die Schritte 1.9 bis 1.13 für jeden Patienten oder Behandlungszustand nach Bedarf.
- Bewahren Sie die Kryofläschchen mindestens 12 Stunden lang im Gefrierbehälter auf und geben Sie sie dann bei -80 °C in eine beschriftete Aufbewahrungsbox.
HINWEIS: Alternativ können Sie die gefrorenen Kryoröhrchen zur Langzeitlagerung in flüssigen Stickstoff (<-135 °C) umfüllen.
2. Verarbeitung von Plasma und Buffy Coat aus EDTA-Röhren
- Zentrifugieren Sie bei 1.800 x g für 10 min bei Raumtemperatur.
HINWEIS: Nach der Zentrifugation besteht die oberste Schicht aus Plasma, die untere enthält Erythrozyten und die Grenzfläche ist der Buffy Coat. Eine Visualisierung finden Sie in Abbildung 1B . - Mit einer neuen Transferpipette wird so viel Plasma wie möglich angesaugt, ohne die Buffy-Coat-Schicht zu stören. Geben Sie dann 0,5 ml-Aliquots in vormarkierte Kryoröhrchen ab. Aspirieren Sie die Buffy-Coat-Schicht und übertragen Sie sie in das entsprechend gekennzeichnete Kryofläschchen.
HINWEIS: Einige Plasma- und Erythrozyten können die Buffy-Coat-Sammlung kontaminieren. - Wiederholen Sie Schritt 2.2 für jeden Patienten oder Behandlungszustand nach Bedarf.
- Lagern Sie die Kryofläschchen nach der Entnahme in einem -80 °C heißen Gefrierschrank.
HINWEIS: Alternativ zur Langzeitlagerung in flüssigem Stickstoff (<-135 °C) lagern.
3. Auftauen von PBMCs
- Drucken Sie einen Tag vor dem Auftauen eine Checkliste mit den in Tabelle 3 aufgeführten Materialien und Reagenzien aus und bereiten Sie sie entsprechend vor und beschriften Sie sie.
HINWEIS: Dieses Protokoll wurde für das Auftauen von 1 1,5-ml-Röhrchen mit 1 ml PBMC entwickelt. Jedes Röhrchen ergibt etwa 2 Millionen PBMCs, von denen etwa 50 % bzw. 20 % lebende Lymphozyten bzw. Monozyten sind. Skalieren Sie entsprechend für experimentelle Anforderungen. Beachten Sie, dass die absolute Anzahl der Zellen je nach Patient oder Behandlungsbedingungen erheblich variieren kann. - Gefrorene PBMCs mit Trockeneis aus dem Lager überführen und in einem 37 °C heißen Inkubator für 4 Minuten oder kurz vor dem letzten Auftauen des Eiskristalls auftauen.
HINWEIS: Falls gewünscht, kann ein Aliquot für Zellzählungs- und Viabilitätsmessungen entnommen werden, wie in Abschnitt 4 beschrieben. - Nach dem Auftauen 1 ml Lösung 4 (PBS + 2 mM EDTA) in jedes Kryofläschchen geben. Gießen Sie dann den Inhalt in ein vorbeschriftetes 50-ml-Röhrchen mit 10 ml Lösung 4 für jedes aufgetaute PBMC-Röhrchen. Tippen Sie, um Tropfenreste zu entfernen.
- Legen Sie das Zellsieb auf das leere 50-ml-Röhrchen und gießen Sie dann die Zellsuspension durch das Zellsieb.
HINWEIS: Tippen Sie bei Bedarf leicht, um die Oberflächenspannung zu brechen. - Jedes Röhrchen mit den passierten Zellen wird 7 min lang bei Raumtemperatur bei 400 x g zentrifugiert.
- Gießen Sie nach dem Zentrifugieren den DMSO-haltigen Überstand aus. Tippen Sie nach Bedarf, um Tropfenreste zu entfernen.
- Resuspendieren Sie das Zellpellet in dem gewünschten Medium, das für nachgelagerte experimentelle Anforderungen geeignet ist (z. B. Zellkulturmedien, Durchflusszytometrie, Antikörpercocktail usw.).
4. Zellzählung und Lebensfähigkeit
- Unmittelbar nach dem Auftauen von gefrorenen PBMCs in Schritt 3.2 pipettieren Sie 20 μl Zellen in ein 1,5-ml-Röhrchen. Fügen Sie ein gleiches Volumen von 0,4 % Trypanblau-Lösung hinzu und pipettieren Sie zum Mischen vorsichtig auf und ab.
- Befolgen Sie mit einem automatisierten Zellzähler das Protokoll des Herstellers, um Zellen zu zählen und die Lebensfähigkeit zu beurteilen. Stellen Sie sicher, dass der Verdünnungsfaktor von 2 berücksichtigt wird.
HINWEIS: Wie an anderer Stelle beschrieben, kann ein Hämozytometer als alternative Methode zur Beurteilung der Zellzahl und -viabilität verwendet werden23.
Representative Results
Discussion
Dieses Protokoll für die PBMC-Entnahme und Kryokonservierung wurde von Personen mit und ohne vorherige Laborausbildung erfolgreich umgesetzt. In unserer Anwendung führten die FACS- und RNA-Sequenzierung von hochlebensfähigen Monozyten, die aus gelagerten PBMCs gereinigt wurden, zu qualitativ hochwertigen Sequenzen.
Eine große Stärke dieses Protokolls ist seine Zugänglichkeit. Bei der im Protokoll vorgestellten Technik werden Röhrchen verwendet, die mit einem Feststoffdichtegradientenmedium vorgepackt sind. Dadurch kann Vollblut direkt in das Röhrchen entnommen und dann sofort zur Isolierung von PBMCs verarbeitet werden. Es wird eine relativ kleine Anzahl von vorgefertigten Lösungen und Spezialgeräten benötigt, um die Zusammenarbeit zwischen dem Forschungslabor, in dem Reagenzien hergestellt werden können, und dem klinischen Labor, in dem Proben entnommen und verarbeitet werden, zu erleichtern. Die schriftlichen und Videoprotokolle richten sich an Bediener auf jedem Schulungsniveau.
Obwohl bei diesem Protokoll frisches Vollblut zur Isolierung von PBMCs verwendet wird und daher eine relativ hohe erwartete Ausbeute und Reinheit von >90 % erreicht wird, ist es möglicherweise nicht für Anwendungen geeignet, die außergewöhnlich hohe Reinheiten von >98 % erfordern26,27. Darüber hinaus kann die Beschaffung von Dichtegradientenzentrifugationsröhrchen kostspielig sein, insbesondere wenn eine große Anzahl von Proben entnommen werden muss.
Alternative Verfahren zur PBMC-Entnahme umfassen die Verwendung eines Flüssigkeitsdichtegradientenmediums oder die immunomagnetische Depletion28,29. Kurz gesagt, bei ersterem wird ein vorgefertigtes Dichtegradientenmedium unter heparinisiertes Vollblut geschichtet, gefolgt von einer Zentrifugation. Letzteres verwendet magnetisch markierte Antikörper, um Nicht-PBMCs zu markieren, die dann in einer magnetischen Säule zurückgehalten werden, während unmarkierte PBMCs unbeeinflusst passieren.
Im Vergleich zum vorgestellten Protokoll ist die Verwendung eines flüssigen Dichtegradientenmediums sowohl kostengünstiger als auch aufgrund des Fehlens von Dichtegradienten-Zentrifugationsröhrchen viel weniger Material; Die PBMC-Isolierung kann in einem Standard-50-ml-Röhrchendurchgeführt werden 8. Diese Technik ist jedoch aufwändiger, hat eine längere Verarbeitungszeit und kann einem höheren Risiko von Benutzerfehlern unterliegen. Heparin muss präzise zugegeben werden, um eine Überverdünnung zu vermeiden, und das Dichtegradientenmedium muss sorgfältig in den richtigen Mengen geschichtet werden, um eine gute PBMC-Trennung zu gewährleisten26.
Im Vergleich zum vorgestellten Protokoll bietet die Verwendung der immunomagnetischen Depletion eine höhere Ausbeute und Reinheit, eine geringere Handhabung aufgrund fehlender Zentrifugation, eine schnellere Verarbeitungszeit und erfordert viel weniger Material 30,31,32. Der größte Nachteil ist jedoch, dass diese Methode die teuerste der drei beschriebenen Methoden ist, insbesondere in großem Maßstab.
Obwohl dieses Protokoll robust ist, können bestimmte kritische Schritte zusätzliche Aufmerksamkeit erfordern. Stellen Sie während des gesamten Protokolls sicher, dass die Proben nicht vermischt und in die entsprechend gekennzeichneten Röhrchen gegeben werden, insbesondere wenn Sie mit mehreren Patienten oder Erkrankungen gleichzeitig arbeiten. Für Schritt 1.4 ist sicherzustellen, dass keine PBMCs verworfen werden. Überschüssiges Plasma verringert nur die Konzentration von PBMCs, was für die Aufrechterhaltung der Lebensfähigkeit und Qualität der Probe weniger kritisch ist. Unabhängig davon deutet das Vorhandensein von Ausfällungen in gesammelten PBMCs darauf hin, dass Teile des Dichtegradientenmediums entfernt wurden. Pipettieren Sie in Schritt 1.5 vorsichtiger, um dieses Problem zu vermeiden. In den Schritten 1.10 und 3.6 ist darauf zu achten, dass das zentrifugierte Küvettenpellet nicht verworfen wird. Für die Schritte 1.12 und 3.3 ist ein zügiges Arbeiten von entscheidender Bedeutung, da Lösung 3 DMSO enthält, das für Zellen bei Raumtemperatur toxisch ist33. Es ist auch wichtig zu beachten, dass die Lagerung von PBMCs in flüssigem Stickstoff gegenüber der Lagerung bei -80 °C empfohlen wird. Eine Langzeitlagerung bei -80 °C wurde mit einer verminderten Zellviabilität und einer veränderten Genexpression in Verbindung gebracht34,35.
Dieses Protokoll kann je nach experimentellem Bedarf angepasst werden. Die Zugabe von Flavopiridol, einem Inhibitor der RNA-Polymerase und der mRNA-Synthese, in den Lösungen 2 und 3 soll jegliche Handhabung und stressinduzierte Artefakte bei der RNA-Sequenzierung36 verhindern. Auf Flavopiridol kann jedoch verzichtet werden, wenn funktionelle oder ex vivo-Studien mit PBMCs gewünscht werden.
Plasma, das aus EDTA-Röhrchen entnommen wird, wird mit EDTA, einem Chelatbildner, kontaminiert. Infolgedessen ist EDTA-Plasma für Assays mit Gerinnungs- oder Calciumionen ungeeignet37,38. Falls gewünscht, kann die Plasmaschicht in den Dichtegradienten-Mediumröhrchen nach der Zentrifugation stattdessen in Schritt 1.4 gesammelt werden. Diese Röhrchen enthalten Natriumheparin als Antikoagulans, das unter Zusatz von Heparinase39 entfernt werden kann. Insbesondere hemmt Heparin die reverse Transkriptase und die PCR-Amplifikation, wodurch das gesammelte Plasma für PCR-Experimente ohne Zusatz eines Heparin-Blockers ungeeignet ist40.
Der gesammelte Buffy Coat aus EDTA-Röhrchen wird nicht in einer Lösung gelagert, die DMSO oder Flavopiridol enthält. DMSO ist wichtig für die Verringerung der Eiskristallbildung und des Zelltods41. Flavopiridol ist wichtig für die Hemmung der RNA-Synthese36. Daher ist der Buffy Coat für ex vivo und transkriptomische Analysen ungeeignet. Falls gewünscht, können die Schritte 1.6 bis 1.15 unter Verwendung von gesammeltem Buffy-Coat durchgeführt werden, um die Zellviabilität zu maximieren und die RNA-Synthese zu hemmen.
Während dieses Protokoll für die RNA-Sequenzierung konzipiert wurde, umfassen weitere potenzielle Anwendungen von PBMCs, die mit diesem Protokoll gesammelt und kryokonserviert wurden, Zellkulturen, Geneditierung, Ex-vivo-Funktionsstudien, Einzelzellanalysen, Phänotypisierung durch Durchflusszytometrie oder Zytometrie nach Flugzeit, Isolierung von DNA/RNA oder Proteinen, Objektträger für die Immunhistochemie und vieles mehr.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Materials
| 1000 µL Tips | Gilson | F174501 | Approximately 3 tips needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection |
| 15 mL tube | Biopioneeer | CNT-15 | To hold Solutions 2/3<br/> 2 needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection |
| 2 mL Cryovials | Globe Scientific | 3012 | Approximately 40 cryovials needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection |
| 20 µL Tips | Gilson | F174201 | For use in cell counting; volume needed is dependent on method of cell counting used. 1 tip is needed per 1 mL of unpooled frozen PBMCs to be defrosted |
| 50 mL Conical Tube | CEM Corporation | 50-187-7683 | 2 needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection<br/> 3 needed per 1 mL of unpooled frozen PBMCs to be defrosted |
| CD14 Antibody | Biolegend | 325621 | |
| CD16 Antibody | Biolegend | 360723 | |
| CD19 Antibody | Biolegend | 363007 | |
| CD3 Antibody | Biolegend | 300405 | |
| CD56 Antibody | Biolegend | 318303 | |
| CD66b Antibody | Biolegend | 305103 | |
| Cell Strainer | Biopioneeer | DGN258367 | 1 needed per 1 mL of unpooled frozen PBMCs to be defrosted |
| CPT Mononuclear Cell Preparation Tube | BD Biosciences | 362753 | 6 tubes needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection |
| Cryo Freezer Box | Southern Labware | SB2CC-81 | Holds 81 tubes<br/> 1 needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection |
| Cryotube Rack | Fisherbrand | 05-669-45 | Holds up to 50 cryovials |
| DMSO | Invitrogen | 15575020 | Approximately 2.5 mL needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection |
| DNase/RNase-Free Distilled Water | Invitrogen | 10977015 | Approximately 2 mL needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection<br/> Approximately 9 mL needed per 1 mL of frozen PBMCs to be defrosted |
| EDTA Tubes | BD Biosciences | 366643 | 1 tube needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection |
| Flavopiridol | Sigma-Aldrich | F3055-5MG | |
| HLA-DR Antibody | Biolegend | 307609 | |
| Human Serum Albumin | GeminiBio | 800-120 | Approximately 25 mL needed per patient or treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection |
| Human Trustain FcX | Biolegend | 422301 | |
| Isopropanol | Sigma-Aldrich | W292912-1KG-K | For use in Mr. Frosty |
| Label Printer | Phomemo | M110-WH | |
| Live-Dead Stain | Biolegend | 423105 | |
| Mr. Frosty | Thermo Scientific | 5100-0001 | Holds up to 18 tubes.<br/> 2 Mr. Frostys needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection |
| Multidispense Pipette | Brandtech | 705110 | |
| Multidispense Pipette Tips | Brandtech | 705744 | Approximately 3 tips needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection |
| P1000 Pipette | Gilson | F144059M | |
| P20 Pipette | Gilson | F144056M | For use in cell counting; volume needed is dependent on method of cell counting used. |
| Printer Labels | Phomemo | PM-M110-3020 | Approximately 45 labels needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection<br/> Approximately 5 labels needed per 1 mL of unpooled frozen PBMCs to be defrosted |
| RNase-Free EDTA (0.5 M) | Invitrogen | AM9260G | Approximately 40 µL needed per 1 mL of frozen PBMCs to be defrosted |
| RNase-Free PBS (10X) | Invitrogen | AM9625 | Approximately 1 mL needed per 1 mL of frozen PBMCs to be defrosted |
| RNasin | Promega | N2111 | |
| RPMI | Corning | 10-040-CV | Approximately 80 mL needed per patient or treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection |
| Transfer Pipettes | Fisherbrand | 13-711-7M | Approximately 5 needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection |
| Tube Holder | Endicott-Seymour | 14-781-15 | Holds up to 80 CPT/EDTA Tubes |
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