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Methodenartikel

In vitro Modellierung der Fettablagerung bei metabolischer Dysfunktion-assoziierter steatotischer Lebererkrankung

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DOI:

10.3791/66810

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19. Juli 2024

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1Inner Mongolia Medical University, 2Xilin Gol League Mongolian Medical Hospital, 3National and local Joint Mongolian Medicine R & D Engineering Center, 4Inner Mongolia Minzu University, 5Affiliated Hospital of Inner Mongolia Minzu University, 6Traditional Chinese & Mongolian Medical Research Institute of Inner Mongolia

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

In diesem Artikel wird die Verwendung von Ölsäure-induzierten HepG2-Zellen als Modell für eine mit metabolischer Dysfunktion assoziierte steatotische Lebererkrankung beschrieben.

Zusammenfassung

Die Prävalenz der mit metabolischer Dysfunktion assoziierten steatotischen Lebererkrankung (MASLD) ist aufgrund von Veränderungen in den Wirtschafts- und Lebensstilmustern sprunghaft angestiegen, was zu erheblichen gesundheitlichen Herausforderungen führt. In früheren Berichten wurde die Etablierung von tierischen und zellulären Modellen für MASLD untersucht und die Unterschiede zwischen ihnen hervorgehoben. In dieser Studie wurde ein zelluläres Modell erstellt, indem die Fettakkumulation in MASLD induziert wurde. HepG2-Zellen wurden mit der ungesättigten Fettsäure Ölsäure in verschiedenen Konzentrationen (0,125 mM, 0,25 mM, 0,5 mM, 1 mM) stimuliert, um MASLD zu emulieren. Die Wirksamkeit des Modells wurde mit Hilfe von Zellzählkit-8-Assays, Ölrot-O-Färbung und Lipidgehaltsanalyse bewertet. Ziel dieser Studie war es, ein einfach zu bedienendes zelluläres Modell für MASLD-Zellen zu schaffen. Die Ergebnisse der Zellzählkit-8-Assays zeigten, dass das Überleben von HepG2-Zellen von der Konzentration der Ölsäure mit einem GI50 von 1,875 mM abhing. Die Zellviabilität in den 0,5 mM- und 1 mM-Gruppen war signifikant niedriger als in der Kontrollgruppe (P < 0,05). Darüber hinaus untersuchten die Ölrot-O-Färbung und die Lipidgehaltsanalyse die Fettablagerung bei unterschiedlichen Ölsäurekonzentrationen (0,125 mM, 0,25 mM, 0,5 mM, 1 mM) auf HepG2-Zellen. Der Lipidgehalt der 0,25 mM-, 0,5 mM- und 1 mM-Gruppe war signifikant höher als der der Kontrollgruppe (P < 0,05). Darüber hinaus waren die Triglyceridspiegel in den OA-Gruppen signifikant höher als in der Kontrollgruppe (P < 0,05).

Einleitung

Die mit metabolischer Dysfunktion assoziierte steatotische Lebererkrankung (MASLD) umfasst eine Reihe von Erkrankungen, darunter einfache Steatose, nichtalkoholische Steatohepatitis (NASH), Zirrhose und hepatozelluläres Karzinom 1,2,3,4,5,6, die alle auf andere Faktoren als den Alkoholkonsum zurückzuführen sind7. MASLD ist die häufigste Lebererkrankung, die durch metabolische Leberschädigung verursacht wird und fast ein Viertel der Weltbevölkerung betrifft 8,9,10,11,12. Während die genaue Pathogenese von MASLD noch nicht geklärt ist, versuchen verschiedene Theorien, ihre Entstehung zu erklären. Eine vorherrschende Auffassung deutet auf eine Abkehr von der klassischen "Two-Hit"-Theorie hin zu einem "Multiple-Hit"-Modellhin 1 hin. Im Mittelpunkt dieser Hypothesen steht die Rolle der Insulinresistenz, von der angenommen wird, dass sie für die Pathogenese von MASLD von zentraler Bedeutung ist13. Untersuchungen deuten darauf hin, dass die Insulinresistenz in den Hepatozyten zu einem erhöhten Spiegel an freien Fettsäuren führt, wodurch Triglyceride gebildet werden, die in der Leber gespeichert werden14,15.

Forscher haben sowohl In-vivo - als auch In-vitro-Modelle verwendet, um die Fettablagerung bei MASLD zu simulieren. Dennoch bleibt es eine Herausforderung, seinen Pathomechanismus vollständig zu replizieren. Trotz dieser Einschränkung waren diese Modelle maßgeblich an der Untersuchung potenzieller therapeutischer Ziele für MASLD beteiligt. Die Entwicklung eines stabilen MASLD-Modells ist jedoch von entscheidender Bedeutung. Tiermodelle sind zwar effektiv, aber zeitaufwändig und teuer, was das wachsende Interesse an in vitro Zellmodellen unterstreicht. Diese Modelle verwenden oft einzelne oder mehrere freie Fettsäuren wie Ölsäure (OA) und Palmitinsäure, um diätinduzierte MASLD nachzubilden. Unter diesen wird die humane Hepatoblastom-Zelllinie HepG2 häufig verwendet, um in vitro zelluläre Modelle von MASLD zu etablieren.

Die OA-Induktion regt HepG2-Zellen an, die Fettablagerung ähnlich wie MASLD zu replizieren, eine Methode mit einer gut etablierten Geschichte. Das Ziel dieser Studie war es, die Lebensfähigkeit, die Färbung von Oil Red O (ORO), den Lipidgehalt und den Triglyceridspiegel (TG) von HepG2-Zellen zu demonstrieren, die mit 0,25 mM OA behandelt wurden. Ziel dieses Experiments war es, weitere Beweise für die Entwicklung von MAFLD-Modellierungsstudien zu liefern.

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Protokoll

HINWEIS: In der Materialtabelle finden Sie Einzelheiten zu allen Materialien, Instrumenten und Reagenzien, die in diesem Protokoll verwendet werden.

1. Zellkultur

  1. Kultur-HepG2-Zellen in Kulturflaschen, die Dulbeccos modifiziertes Eagle-Medium (DMEM) enthalten (enthält 10 % fötales Rinderserum [FBS], 100 Einheiten/ml Penicillin und 100 μg/ml Streptomycin). Die Kulturkolben werden in einem 5 %CO 2 - Inkubator bei 37 °C gehalten.

2. Wirkung von Ölsäure auf die Lebensfähigkeit der Zellen, gemessen mit dem Zellzählkit-8

  1. Ein bestimmtes Volumen OA wird in Dimethylsulfoxid (DMSO) gelöst, um eine Konzentration von 200 mM zu erreichen. Lagern Sie die Lösung für die zukünftige Verwendung bei -20 °C.
  2. HepG2-Zellen in einer 96-Well-Platte mit einer Zelldichte von 6 × 103 Zellen pro Well säen. Geben Sie 100 μl DMEM in jede Vertiefung. Inkubieren und kultivieren Sie die Zellen bei 37 °C in einem 5% CO2 -Inkubator für 24 h. Teilen Sie die HepG2-Zellen in zwei Gruppen auf:
    1. Kontrollgruppe: Zellkulturmedium hinzufügen.
    2. OA-Gruppe: Fügen Sie dem Zellkulturmedium OA hinzu, um Endkonzentrationen von 0,125 mM, 0,25 mM, 0,5 mM und 1 mM zu erreichen.
  3. Nach 24 Stunden anfänglicher Inkubation wird der Überstand aus jeder Vertiefung verworfen und OA entsprechend der angegebenen Gruppierung hinzugefügt, wobei 100 μl pro Vertiefung hinzugefügt werden. Für die Kontrollgruppe geben Sie 100 μl Zellkulturmedium in jede Vertiefung. Inkubieren Sie die Zellen für weitere 24 Stunden.
    HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass jede Gruppe über sechs Replikationsvertiefungen verfügt. Um eine Verdunstung zu verhindern, geben Sie 100 μl phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) in den äußeren Ring der Vertiefungen in der 96-Well-Platte.
  4. Nach 24 Stunden Inkubation 10 μl Zellzählkit-8 (CCK-8) in jede Vertiefung geben, vorsichtig mischen und 2 Stunden im Dunkeln inkubieren. Nehmen Sie die 96-Well-Platte aus dem Inkubator, legen Sie sie in den Mikroplatten-Reader und messen Sie den Absorptionswert bei 450 nm (A450). Die GI50-Werte wurden entsprechend der OD gezählt.

3. Öl-Rot-O-Färbung zur Beobachtung der intrazellulären Lipidtröpfchenbildung

  1. HepG2-Zellen in 6-Well-Zellkulturplatten mit einer Dichte von 5 × 105 Zellen pro Well säen und die Platten in einem Inkubator mit konstanter Temperatur für 24 Stunden kultivieren. In Abbildung 1 finden Sie eine visuelle Darstellung der beschriebenen Schritte.
  2. Geben Sie nach 24 Stunden Zellkultur 2 ml OA-haltiges Zellkulturmedium in jede Vertiefung und erreichen Sie Endkonzentrationen von 0,125 mM, 0,25 mM, 0,5 mM und 1 mM. Nach weiteren 24 Stunden nehmen Sie das Zellkulturmedium aus jeder Vertiefung und waschen Sie es zweimal mit PBS. Geben Sie 1 ml ORO-Fixiermittel in jede Vertiefung und inkubieren Sie sie 30 Minuten lang.
  3. Bereiten Sie die ORO-Färbelösung vor, indem Sie Färbelösung A mit Färbelösung B im Verhältnis 3:2 mischen. Lassen Sie die Mischung 10 min bei Raumtemperatur stehen, dann filtrieren Sie sie einmal durch einen 0,45 μm Filter. Bewahren Sie die gefilterte Lösung bis zur Verwendung in einem lichtgeschützten Zentrifugenröhrchen auf.
  4. Entsorgen Sie das Fixiermittel und waschen Sie es zweimal mit destilliertem Wasser. Geben Sie 1 ml 60% Isopropanol in jede Vertiefung und inkubieren Sie 30 s lang. Verwerfen Sie 60 % der Isopropanollösung und geben Sie 1 ml frisch zubereitete ORO-Färbelösung in jede Vertiefung, bevor Sie sie 20 Minuten lang inkubieren. Entsorgen Sie die ORO-Färbelösung, geben Sie 1 ml 60%iges Isopropanol in jede Vertiefung und inkubieren Sie 30 s lang. 5x mit Wasser waschen, um überschüssige Farbe zu entfernen.
  5. Bedecken Sie die Zellen mit destilliertem Wasser und beobachten Sie sie unter einem Mikroskop. Sobald die Bilder aufgenommen sind, entsorgen Sie die Flüssigkeit in der Platte und lassen Sie sie trocknen. Geben Sie dann 2 ml Isopropanol in jede Vertiefung und schütteln Sie die Platte auf einem Orbitalschüttler 10 Minuten lang. Übertragen Sie die Flüssigkeit auf eine neue 96-Well-Platte mit 16 Wells in jeder Gruppe und fügen Sie 100 μl pro Well hinzu. Berechnen Sie den Lipidgehalt, indem Sie die optische Dichte (OD) jeder Vertiefung mit einem Mikroplatten-Reader bei 510 nm (A510) messen.

4. Auswirkungen unterschiedlicher Konzentrationen von Ölsäure auf das Gesamttriglycerid im HepG2-Zellüberstand

  1. Äquilibrieren Sie das Kit 20 Minuten lang bei Raumtemperatur und bereiten Sie die erforderlichen Platten für das Experiment vor.
  2. Den Zellüberstand auffangen und bei 1.570 × g 10 min zentrifugieren. Legen Sie Standard-Wells fest und testen Sie Proben-Wells. 50 μl Standardkonzentration ([S0 → S5], gefolgt von: 0, 0,5, 1, 2, 4, 8 mmol/l) in die Standardvertiefungen geben. Zusätzlich zu den Blind- und Standard-Wells geben Sie 10 μl verschiedener Proben in die Probenvertiefungen und fügen Sie anschließend 40 μl Probenverdünnungsmittel in jede Vertiefung hinzu. Geben Sie 100 μl Nachweis-Antikörper-Meerrettich-Peroxidase in jede Vertiefung, verschließen Sie sie mit einer Plattenmembran und inkubieren Sie sie 1 h lang bei 37 °C in einem Ofen mit konstanter Temperatur.
  3. Entsorgen Sie den Überstand, tupfen Sie ihn auf staubfreiem Papier trocken und waschen Sie jede Mulde mit 1x Waschlösung. 1 Min. bei Raumtemperatur ziehen lassen. Wiederholen Sie den Waschvorgang 5x.
  4. Geben Sie 50 μl Substrat A und 50 μl Substrat B in jede Vertiefung. Vorsichtig mischen und 15 min bei 37 °C inkubieren. Geben Sie 50 μl Terminationslösung in jede Vertiefung und messen Sie den OD-Wert jeder Vertiefung bei 450 nm (A450) innerhalb von 15 Minuten.
  5. Plotten Sie die Konzentration des Standards entlang der x-Achse und den entsprechenden Absorptionswert (OD) entlang der y-Achse, um eine lineare Regression durchzuführen, und leiten Sie die Kurvengleichung ab, um den Konzentrationswert jeder Probe zu berechnen.

5. Statistische Analyse

  1. Ermitteln Sie signifikante Unterschiede in quantitativen Daten.
  2. Berechnen Sie den Mittelwert ± Standardabweichung (SD) und stellen Sie die Daten grafisch dar. Betrachten Sie P < 0,05 als statistisch signifikant.

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Ergebnisse

Wirkung von Ölsäure auf die Lebensfähigkeit der Zellen
HepG2-Zellen wurden unterschiedlichen Konzentrationen von OA ausgesetzt (0 mM, 0,125 mM, 0,25 mM, 0,5 mM, 1 mM), was zu einer Abnahme der Zellüberlebensraten bei 0,125 mM, 0,25 mM, 0,5 mM und 1 mM im Vergleich zu 0 mM führte. Eine statistische Signifikanz wurde bei 0,5 mM (P < 0,05) und 1 mM (P < 0,05) im Vergleich zu 0 mM beobachtet. Die Ergebnisse des Einflusses von OA auf die Zellviabilität, wie sie mit dem CCK-8-Kit bew...

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Diskussion

MASLD ist ein klinisch-pathologisches Syndrom, das durch eine übermäßige intrazelluläre Fettablagerung in Hepatozyten gekennzeichnet ist, die auf Faktoren zurückzuführen ist, die über Alkohol und andere etablierte leberschädigende Wirkstoffe hinausgehen18. MASLD ist eng mit erworbenem metabolischem Stress und Leberschäden verbunden, insbesondere in Verbindung mit Insulinresistenz und genetischer Anfälligkeit. Um Medikamente effektiv auf MASLD zu untersuchen und zu screenen, ist es entscheidend, ei...

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Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Danksagungen

Die aktuelle Studie wurde im Rahmen der "Studie über die Schlüsselfragen der heilenden Wirkung von Koumiss auf regionale Krankheiten der mongolischen Medizin" im Jahr 2018 des Wissenschafts- und Technologieprogramms des Ministeriums für Wissenschaft und Technologie des Autonomen Gebiets Innere Mongolei gefördert.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
0,22 &Mikro; m FilterMillex
0,25% Trypsin-EDTA (1x) Trypsin-EDTAGibco25200-056
0,45 & Mikro; m FilterMillex
2 mL Krygenes FläschchenCORNING430659
25 cm2 ZellkulturflascheCORNING430639
6-Well-ZellkulturplatteCORNING3516
96-Well-ZellkulturplatteCORNING3599
BlutzinktivplatteShanghai Jing Jing Biochemisches Reagenz & Instrument Co.
Cell Counting Kit-8 AssaysBeijing Solarbio Science & Germany Technology Co., Ltd. CA1210-1000T
CO2 InkubatorNUAIRENU-5710E
  DMSO Dimethylsulfoxid Beijing Solarbio Wissenschaft & Technology Co., Ltd. D8371
Dulbecco's Modified Eagle MediumGibco8122691
EnzymmarkierungsgerätTecanSpark
Fetales Rinderserum, qualifizierteGibco10099141
HepG2-ZellliniePeking Nordchina Chuanglian Biotechnology Research Institute (BNCC)221031
Humane Triglyceride (TG) ELISA AnleitungNanjing Jiacheng Bioengineering Institute20170301
Inverses Mikroskop für ZellkulturenLeicaDMi1 
IsopropanolTianjin Zhiyuan Chemisches Reagenz Co.
Oil Red Stain Kit, für kultivierte ZellenBeijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd. G1262
Ölsäure Verifizierter Lieferant - Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.
Penicillin StreptomycinGibco15140122
SPSS 24.0Statistik-Software
022701132021030141A502071

Referenzen

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