Methoden zur Ermöglichung der räumlichen Transkriptomik von Knochengewebe

Summary

Hier beschreiben wir eine Methode, die die Entkalkung von frisch gewonnenem Knochengewebe und den Erhalt hochwertiger RNA ermöglicht. Es wird auch ein Verfahren zum Schneiden von FFPE-Proben (Formalin Fixed Paraffin Embedded) von nicht demineralisierten Knochen vorgestellt, um qualitativ hochwertige Ergebnisse zu erhalten, wenn frisches Gewebe nicht verfügbar ist oder nicht entnommen werden kann.

Abstract

Das Verständnis der Beziehung zwischen den Zellen und ihrer Position in jedem Gewebe ist entscheidend, um die biologischen Prozesse aufzudecken, die mit der normalen Entwicklung und der Krankheitspathologie verbunden sind. Die räumliche Transkriptomik ist eine leistungsfähige Methode, die es ermöglicht, das gesamte Transkriptom innerhalb von Gewebeproben zu analysieren und so Informationen über die zelluläre Genexpression und den histologischen Kontext, in dem sich die Zellen befinden, zu liefern. Während diese Methode in großem Umfang für viele Weichgewebe eingesetzt wurde, war ihre Anwendung für die Analyse von Hartgeweben wie Knochen eine Herausforderung. Die größte Herausforderung besteht darin, dass es nicht möglich ist, bei der Verarbeitung der Hartgewebeproben für die Sektion eine qualitativ hochwertige RNA und Gewebemorphologie zu erhalten. Daher wird hier ein Verfahren beschrieben, um frisch gewonnene Knochengewebeproben zu verarbeiten, um effektiv räumliche Transkriptomik-Daten zu generieren. Die Methode ermöglicht die Entkalkung der Proben, wodurch erfolgreiche Gewebeschnitte mit erhaltenen morphologischen Details möglich sind und gleichzeitig ein RNA-Abbau vermieden wird. Darüber hinaus werden detaillierte Richtlinien für Proben bereitgestellt, die zuvor in Paraffin eingebettet waren, ohne Demineralisierung, wie z. B. Proben, die aus Gewebebanken entnommen wurden. Unter Verwendung dieser Leitlinien werden qualitativ hochwertige räumliche Transkriptomik-Daten gezeigt, die aus Gewebebankproben von Primärtumor- und Lungenmetastasen von Knochenosteosarkomen generiert wurden.

Introduction

Knochen ist ein spezialisiertes Bindegewebe, das hauptsächlich aus Fasern des Kollagens Typ 1 und anorganischen Salzen¹ besteht. Dadurch ist der Knochen unglaublich stark und steif und gleichzeitig leicht und traumaresistent. Die große Festigkeit des Knochens beruht auf seinem mineralischen Gehalt. Tatsächlich erhöht sich die Steifigkeit bei jeder Erhöhung des prozentualen Anteils an Mineralien um das Fünffache². Folglich stehen Forscher vor erheblichen Problemen, wenn sie mittels histologischer Schnitte die Biologie einer Knochenprobe analysieren.

Eine nicht entkalkte Knochenhistologie ist machbar und manchmal erforderlich, je nach Art der Untersuchung (z. B. zur Untersuchung der Mikroarchitektur des Knochens); Es ist jedoch eine große Herausforderung, vor allem, wenn die Exemplare groß sind. In diesen Fällen erfordert die Gewebeaufbereitung für histologische Zwecke mehrere Modifikationen der Standardprotokolle und -techniken³. Im Allgemeinen wird das Knochengewebe direkt nach der Fixation entkalkt, um die üblichen histologischen Untersuchungen durchzuführen, ein Prozess, der je nach Größe des Gewebes und verwendetem Entkalkungsmittel einige Tage bis mehrere Wochen dauern kann⁴. Entkalkte Schnitte werden häufig für die Untersuchung des Knochenmarks, die Diagnose von Tumoren usw. verwendet. Es gibt drei Haupttypen von Entkalkungsmitteln: starke Säuren (z. B. Salpetersäure, Salzsäure), schwache Säuren (z. B. Ameisensäure) und Chelatbildner (z. B. Ethylendiamintetracetinsäure oder EDTA)⁵. Starke Säuren können den Knochen sehr schnell entkalken, aber sie können das Gewebe schädigen; schwache Säuren sind sehr verbreitet und eignen sich für diagnostische Verfahren; Chelatbildner sind bei weitem die am häufigsten verwendeten und für Forschungsanwendungen geeigneten, da in diesem Fall der Demineralisierungsprozess langsam und schonend ist und die Beibehaltung einer qualitativ hochwertigen Morphologie und die Erhaltung von Gen- und Proteininformationen ermöglicht, wie sie bei vielen Verfahren (z. B. In-situ-Hybridisierung , Immunfärbung) erforderlich sind. Wenn jedoch das gesamte Transkriptom erhalten werden muss, wie z. B. für Genexpressionsanalysen, kann selbst eine langsame und sanfte Demineralisierung nachteilig sein. Daher sind bessere Ansätze und Methoden erforderlich, wenn die morphologische Analyse der Gewebe mit Genexpressionsanalysen der Zellen gekoppelt werden muss.

Dank der jüngsten Verbesserungen in der Einzelzell-RNA-Sequenzierung (scRNA-seq) und der räumlichen Transkriptomik ist es nun möglich, die Genexpression einer Gewebeprobe auch dann zu untersuchen, wenn zur Lagerung der Gewebeproben eine Formalinfixierungsparaffineinbettung (FFPE) verwendet wurde ^6,7,8. Diese Möglichkeit hat den Zugang zu einer größeren Anzahl von Proben ermöglicht, wie sie beispielsweise in Gewebebanken weltweit gelagert werden. Wenn scRNA-seq eingesetzt werden soll, ist die RNA-Integrität die wichtigste Anforderung; Bei der räumlichen Transkriptomik von FFPE-Proben sind jedoch sowohl hochwertige Gewebeschnitte als auch hochwertige RNA notwendig, um die Genexpression im histologischen Kontext jedes Gewebeschnitts sichtbar zu machen. Während dies mit Weichteilen leicht zu erreichen war, gilt dies nicht für Hartgewebe wie Knochen. Tatsächlich wurde nach unserem besten Wissen noch nie eine Studie mit räumlicher Transkriptomik an FFPE-Knochenproben durchgeführt. Dies liegt daran, dass es an Protokollen mangelt, die FFPE-Knochengewebe effektiv verarbeiten und gleichzeitig ihren RNA-Gehalt erhalten können. Hier wird zunächst eine Methode zur Aufbereitung und Entkalkung frisch gewonnener Knochengewebeproben unter Vermeidung des RNA-Abbaus bereitgestellt. In Anbetracht der Notwendigkeit einer Transkriptomik-Analyse der FFPE-Proben, die in Gewebebanken weltweit gesammelt wurden, werden auch Richtlinien für den korrekten Umgang mit FFPE-Proben von nicht demineralisierten Knochen vorgestellt.

Protocol

Alle unten beschriebenen Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren an der University of Pittsburgh School of Dental Medicine zugelassen.

1. Verfahren zur Herstellung von FFPE-Blöcken aus Knochengewebeproben, die demineralisiert werden müssen

1. Aufbereitung von Reagenzien und Materialien
   1. Bereiten Sie EDTA 20% pH 8,0 vor. Für 1 l lösen Sie 200 g EDTA in 800 mL Reinstwasser, stellen Sie den pH-Wert mit Natriumhydroxid 10 N auf 8,0 ein und bringen Sie schließlich das Volumen mit Reinstwasser auf 1 l. Bei Raumtemperatur lagern.
      HINWEIS: Verwenden Sie immer frisch zubereitetes EDTA 20% pH 8,0. Natriumhydroxid (NaOH) 10 N wird durch Auflösen von 400 g NaOH in 1 l Reinstwasser hergestellt.
   2. Bereiten Sie Paraformaldehyd (PFA) 4% in einem Abzug mit 1x PBS ohne Calcium und Magnesium vor.
      HINWEIS: Kennzeichnen Sie einen Bereich in einem Abzug für die Arbeit mit konzentrierten Paraformaldehyd-Lösungen oder Paraformaldehyd-Feststoffen und kennzeichnen Sie ihn entsprechend. Um eine Exposition zu vermeiden, halten Sie die Behälter so weit wie möglich geschlossen. Verwendung in den kleinsten praktischen Mengen, die für das durchzuführende Experiment erforderlich sind. Wenn das Wiegen von Paraformaldehyd-Pulver und die Waage nicht in einem Abzug verwendet werden kann, nehmen Sie zuerst einen Behälter, geben Sie dann PFA-Pulver in die Haube und decken Sie sie ab, bevor Sie zur Waage zurückkehren, um das Pulver zu wiegen. Verwenden Sie immer frisch zubereitetes 4% PFA.
   3. Verwenden Sie für jede Probe ein geeignetes Gefäß.
      HINWEIS: Verwenden Sie beispielsweise für 1 mg Knochengewebe einen Behälter, der es ermöglicht, dass mindestens 1 ml einer Lösung mit dem Knochen in Kontakt kommt.
   4. Sterilisieren Sie alle chirurgischen Geräte, die für die Dissektion benötigt werden.
   5. Reinigen Sie alle Bereiche mit einer dekontaminierenden Lösung, um RNasen zu entfernen.
   6. Sammeln Sie die restlichen experimentellen Materialien, einschließlich Eisbehälter und 70%iges Ethanolspray, und erhalten Sie Zugang zu einem Orbitalschüttler.
2. Isolierung von Knochengewebeproben von Mäusen
   1. Euthanasieren Sie die Maus durch CO₂ -Exposition, führen Sie dann eine Gebärmutterhalsluxation durch und legen Sie sie auf den Rücken. Besprühen Sie die Maushaut mit 70% Ethanol.
   2. Mit einer sterilen Präparierschere die Haut öffnen und den Beinmuskel freilegen. Schneiden Sie den Muskel entlang des Beins ab, um eine klare Sicht auf die Position des Knochens zu erhalten, und disartikulieren Sie den Knochen vorsichtig, um ihn ohne Beschädigung zu entfernen.
      HINWEIS: Es ist nicht notwendig, alle am Knochen befestigten Muskeln vollständig zu entfernen. Versuchen Sie, so schnell wie möglich zu sein, um den RNA-Abbau zu begrenzen.
   3. Geben Sie die Knochenprobe sofort in ein Röhrchen mit 4 % PFA und stellen Sie das Röhrchen auf Eis.
   4. Wiederholen Sie den Vorgang, um wie gewünscht weitere Knochenproben zu entnehmen.
   5. Proben mit 4 % PFA werden mindestens 24 Stunden lang bei 140 U/min bei 4 °C auf einen Orbitalschüttler gerührt, um eine ordnungsgemäße Fixierung zu ermöglichen.
3. Entkalkung von Knochengewebeproben
   1. Entnehmen Sie das Knochengewebe nach der Fixierung aus dem Orbitalschüttler.
   2. Waschen Sie das Knochengewebe 2 Mal mit 1x PBS für 3 min auf einem Orbitalschüttler bei 140 U/min, um eventuelle PFA-Reste zu entfernen.
   3. Entfernen Sie mit einer sterilen Präparierschere alle verbleibenden Muskeln, die noch am Knochen befestigt sind.
   4. Waschen Sie das Knochengewebe noch einmal mit 1x PBS für 3 min.
   5. Legen Sie das Knochengewebe in einen neuen Behälter mit 20% EDTA pH 8,0. Stellen Sie dann den Behälter 30 Minuten lang bei Raumtemperatur (RT) bei 140 U/min bei 140 U/min auf einen Orbitalschüttler.
   6. Entsorgen Sie die Lösung, geben Sie frische 20 % EDTA pH 8,0 in den Behälter und stellen Sie sie 30 Minuten lang bei RT bei 140 U/min auf einen Orbitalschüttler.
   7. Wiederholen Sie Schritt 1.3.6 10 Mal.
   8. Entsorgen Sie die Lösung, geben Sie frische 20 % EDTA pH 8,0 in den Behälter und stellen Sie sie über Nacht bei 4 °C in einem Kühlraum auf einen Orbitalschüttler bei 140 U/min.
4. Dehydrierung von Knochengewebeproben
   1. Entnehmen Sie die Knochengewebeprobe aus dem Behälter.
   2. Untersuchen Sie das Gewebe und überprüfen Sie die Wirksamkeit der Entkalkung, indem Sie den Knochen vorsichtig drehen und verdrehen. Alternativ können Sie eine Röntgenaufnahme des Knochens mit einem Röntgengerät durchführen.
      HINWEIS: Wenn sich die Probe leicht biegt, wurde ein guter Entkalkungsgrad erreicht. Ist dies nicht der Fall, sollten die Entkalkungsparameter (Zeit, Rührgeschwindigkeit, verwendetes Volumen von 20 % EDTA pH 8,0 usw.) erhöht werden.
   3. Waschen Sie das Knochengewebe 2 Mal mit 1x PBS für 3 min, um Rückstände von EDTA zu entfernen.
   4. Legen Sie das Knochengewebe in einen neuen Behälter und leiten Sie die Dehydrierung mit 70% Ethanol ein. 15 min bei 140 U/min inkubieren.
   5. Die 70%ige Ethanollösung verwerfen, die Probe in eine 90%ige Ethanollösung geben und 15 Minuten bei 140 U/min inkubieren.
   6. Entsorgen Sie die 90%ige Ethanollösung, geben Sie die Probe in 100%iges Ethanol und inkubieren Sie sie 15 Minuten lang bei 140 U/min.
   7. Entsorgen Sie das 100%ige Ethanol, geben Sie die Probe in neues 100%iges Ethanol und inkubieren Sie es 15 Minuten lang bei 140 U/min.
   8. Entsorgen Sie das 100%ige Ethanol, geben Sie die Probe in neues 100%iges Ethanol und inkubieren Sie es 15 Minuten lang bei 140 U/min.
   9. Entsorgen Sie das 100%ige Ethanol, legen Sie die Probe in neues 100%iges Ethanol und inkubieren Sie es 30 Minuten lang bei 140 U/min.
   10. Entsorgen Sie das 100%ige Ethanol, geben Sie die Probe in neues 100%iges Ethanol und inkubieren Sie es 45 Minuten lang bei 140 U/min.
       HINWEIS: Die Dehydrierung kann auch mit einem automatischen Prozessor durchgeführt werden. Richten Sie in diesem Fall das Programm mit den gleichen Bedingungen ein, die für die manuelle Auslagerung gemeldet wurden. Die gemeldeten Bedingungen gelten für Proben, die nicht dicker als 4 mm sind (d. h. Knochengewebeproben von Mäusen). Bei Proben, die dicker als 4 mm sind, muss der Dehydratisierungszeitpunkt experimentell bestimmt werden.
5. Clearing von Knochengewebeproben
   1. Geben Sie die Knochengewebeprobe in ein neues Gefäß und leiten Sie den Reinigungsprozess mit Xylol ein. 20 min bei 140 U/min inkubieren.
   2. Entsorgen Sie das gebrauchte Xylol, fügen Sie neues Xylol hinzu und inkubieren Sie weitere 20 Minuten bei 140 U/min.
   3. Entsorgen Sie das gebrauchte Xylol, fügen Sie neues Xylol hinzu und inkubieren Sie es 45 Minuten lang bei 140 U/min.
      HINWEIS: Der Ausgleich kann auch mit einem automatischen Prozessor durchgeführt werden. Richten Sie in diesem Fall das Programm mit den gleichen Bedingungen ein, die für den manuellen Ausgleich gemeldet wurden. Die gemeldeten Bedingungen gelten für Proben, die nicht dicker als 4 mm sind (d. h. Knochengewebeproben von Mäusen). Bei Proben, die dicker als 4 mm sind, muss der Zeitpunkt experimentell bestimmt werden.
6. Infiltration und Einbettung von Knochengewebeproben
   1. Entnehmen Sie die Knochengewebeprobe nach dem Clearing aus dem Orbitalschüttler/automatischen Prozessor.
   2. Geben Sie die Knochengewebeprobe in eine Einbettkassette und initiieren Sie die Infiltration mit Wachs (siehe Materialtabelle). 30 min bei 60 °C inkubieren.
   3. Entsorgen Sie das gebrauchte Wachs, fügen Sie neues Wachs hinzu und inkubieren Sie es 30 Minuten lang bei 60 °C.
   4. Entsorgen Sie das gebrauchte Wachs, fügen Sie neues Wachs hinzu und inkubieren Sie es 45 Minuten lang bei 60 °C.
   5. Legen Sie die Knochengewebeprobe vorsichtig in eine Form mit der gewünschten Ausrichtung.
   6. Lassen Sie den Probenblock auf einer kalten Oberfläche erstarren.
   7. Lagern Sie das erhaltene FFPE bei 4 °C, bis Sie mit dem Schneiden beginnen können.
      HINWEIS: FFPE-Blöcke können viele Jahre gelagert werden, bevor die Teilung durchgeführt wird.

2. Richtlinien für die Sektion von nicht demineralisierten FFPE-Proben

HINWEIS: Die folgenden Richtlinien enthalten wertvolle Tipps und Anweisungen, die nützlich sind, um die Qualität der Gewebeschnitte erheblich zu verbessern und gleichzeitig einen RNA-Abbau zu vermeiden, insbesondere bei kleinen nicht entkalkten Knochenproben. Diese Richtlinien können auch auf entkalkte Knochenproben angewendet werden, sofern verfügbar. Bei größeren Knochengewebeproben sollte eine Demineralisierung durchgeführt werden, um Schnitte von besserer Qualität zu erhalten. In solchen Fällen sollte die oben beschriebene Methode angewandt werden, und die Parameter (Zeitplan, Lösungsmengen usw.) sollten entsprechend angepasst werden. Die folgenden Richtlinien eignen sich entweder, wenn FFPE-Knochengewebe bereits verarbeitet wurde (z. B. FFPE-Block, der von Gewebebanken oder anderen Labors entnommen wurde) oder wenn die entnommenen Schnitte zur Durchführung von Analysen verwendet werden, die qualitativ hochwertige RNA, hochwertige Gewebeschnitte oder beides erfordern.

1. Vorbereitung der Ausrüstung
   1. Besprühen Sie alle Arbeitsflächen und Instrumente mit dekontaminierenden Lösungen, um RNasen zu entfernen.
   2. Bereiten Sie ein Wasserbad mit doppelt destilliertem Wasser vor und stellen Sie die Temperatur auf 42 °C ein.
   3. Nehmen Sie eine Mikrotomklinge, besprühen Sie sie mit 70%igem Ethanol, um Ölrückstände zu entfernen, und besprühen Sie sie dann mit dekontaminierenden Lösungen, um RNasen zu entfernen.
   4. Befestigen Sie die Klinge auf dem Mikrotom. Stellen Sie sicher, dass der Abstandswinkel auf 10° eingestellt ist.
      HINWEIS: Verwenden Sie zum Trennen immer neue Klingen.
   5. Bereiten Sie zwei Eimer Eis vor.
   6. Besorgen Sie sich eine Pinzette, eine Bürste und eine Sonde, besprühen Sie sie mit dekontaminierenden Lösungen, um RNasen zu entfernen, und legen Sie sie in einen der beiden Eiskübel.
   7. Bereiten Sie ein Eisbad vor, indem Sie doppelt destilliertes Wasser in den anderen Eiskübel geben.
      HINWEIS: Der FFPE-Block sollte nicht im zugegebenen Wasser schwimmen; Daher muss die Menge an Wasser, die dem Eiskübel zugesetzt wird, gerade so groß sein, dass die Probe nass wird, ohne zu schwimmen.
2. Schnittdarstellung
   1. Nehmen Sie den FFPE-Block bei 4 °C aus dem Lager und legen Sie ihn auf das Mikrotom. Stellen Sie den Befehl auf Trimmen oder auf 14 μm Scrolldicke und beginnen Sie mit dem Trimmen der Probe, bis das Gewebe freigelegt ist.
      HINWEIS: Wenn der FFPE-Block bereits gekürzt wurde und das Gewebe bereits freigelegt ist, überspringen Sie Schritt 2.2.1. Vergewissern Sie sich, dass der Block keine Löcher und Risse aufweist. Wenn ja, fahren Sie direkt mit Schritt 2.2.2 fort. Wenn nicht, schneiden Sie einige Abschnitte, um die Oberfläche abzuflachen und Löcher und Risse zu vermeiden, und fahren Sie dann mit Schritt 2.2.2 fort.
   2. Legen Sie den FFPE-Block auf das Eisbad, um die Probe zu hydratisieren. Der Zeitpunkt der Hydratation muss experimentell bestimmt werden.
      1. Beginnen Sie mit 2 Minuten und erhöhen Sie die Zeit, wenn die Flüssigkeitszufuhr nicht ausreicht. Überschreiten Sie nicht 10 Minuten. Durch die Hydratation wird das Gewebe erweitert und die Bildung von "Jalousien" und Linien reduziert. Längere Hydratationszeiten können zu Rissen im Paraffinblock und möglicherweise zu einer Gewebeablösung führen.
      2. Wenn 10 Minuten nicht ausreichen, um die Probe zu hydratisieren, führen Sie Hydratationszyklen durch, die nicht länger als 10 Minuten dauern, und versuchen Sie erneut, die Probe zu schneiden.
      3. Wenn die Oberfläche des Blocks aufgrund von Rissen oder Schnitten nicht glatt und sauber ist, sollten Sie die Probe erneut einbetten. Die RNA-Qualität wird durch den Re-Embedding-Prozess nicht beeinflusst.
   3. Legen Sie die Probe in die Probenklemme des Mikrotoms, richten Sie sie an der Klinge aus und beginnen Sie mit dem Schneiden. Stellen Sie die Scrolldicke auf 5 μm ein.
   4. Sammeln Sie den Schnitt und legen Sie ihn mit einer kalten Pinzette und Bürsten bei 42 °C in das Wasserbad.
      HINWEIS: Wenn eine RNA-Isolierung von Gewebeschnitten durchgeführt wird, sammeln Sie die Schnitte in einem Zentrifugenröhrchen und befolgen Sie die Herstellungsspezifikationen für die RNA-Präparation (siehe Materialtabelle).
   5. Inkubieren Sie den Abschnitt im Wasserbad, um das Gewebe zu dehnen und verbleibende Falten und Falten zu beseitigen.
      HINWEIS: Die Zeit des Schwimmens im Wasserbad für jeden Abschnitt muss experimentell bestimmt werden. Erwägen Sie, die Knochenabschnitte eine zusätzliche Minute lang zu lassen, wenn Probleme mit der Gewebeablösung auftreten. Lassen Sie den Abschnitt nicht zu lange schweben, da lange Schwimmzeiten das Gewebe schädigen können.
   6. Legen Sie den Schnitt auf einen Objektträger und inkubieren Sie ihn 3 Stunden lang bei 42 °C.
   7. Legen Sie den Objektträger über Nacht in einen Exsikkator oder einen Ofen bei RT, um ihn richtig zu trocknen.
   8. Bewahren Sie den Objektträger mit dem daran befestigten Teil bei RT in einer Objektträgerbox auf.
      HINWEIS: Dias können bei RT viele Jahre lang aufbewahrt werden. Wenn eine räumliche Transkriptomik anstelle eines Glasobjektträgers durchgeführt wird, platzieren Sie den Abschnitt auf dem vom Hersteller bereitgestellten räumlichen Genexpressionsträger und befolgen Sie die angegebenen Empfehlungen (siehe Materialtabelle).

Results

Die hier vorgestellte Methode beschreibt, wie frisch isolierte Knochen verarbeitet werden können, um demineralisierte FFPE-Proben zu erhalten, die unter Beibehaltung der RNA-Integrität leicht mit einem Mikrotom geschnitten werden können (Abbildung 1). Die Methode wurde erfolgreich an murinen Femuren eingesetzt, kann aber auch für andere Knochengewebeproben ähnlicher Abmessungen angewendet werden, oder sie kann für größere Knochenproben (z. B. menschliche Proben) angepasst werden, indem alle Parameter (Timing, Lösungsvolumen usw.) erhöht werden.

Abbildung 1: Schematische Darstellung des Protokolls. Schematische Darstellung des Verfahrens zur Gewinnung von FFPE-Blöcken aus entkalktem Knochengewebe mit erhaltener RNA-Integrität (Punkte 1 und 2). Schematische Darstellung der Richtlinien zum Abschnitt FFPE-Blöcke (Punkt 3). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Um den korrekten Zeitpunkt der Entkalkung zu validieren, wurde ein Zeitverlauf durchgeführt, in dem nicht entkalkte Femure, Femure, die für 3 h entkalkt wurden (wobei EDTA alle 30 min insgesamt 6 Mal gewechselt wurde) und Femure, die für 24 h entkalkt wurden (wobei EDTA alle 30 min für insgesamt 10 Mal gewechselt und dann über Nacht in EDTA belassen wurde) verglichen wurden (Abbildung 2). Die erhaltenen FFPE-Blöcke wurden dann gemäß den oben genannten Richtlinien geschnitten und die histologische Qualität und RNA-Integrität der erhaltenen Schnitte überprüft. Zu diesem Zweck wurden die strukturelle Integrität und die Morphologie der Gewebeschnitte mittels Hämatoxylin- und Eosin-Färbung (H&E) mit anschließender mikroskopischer Untersuchung (Abbildung 2A,C,E) bewertet, während die RNA-Qualität durch die Bewertung des Verteilungswerts von RNA-Fragmenten mit einer Größe von mehr als 200 Nukleotiden (200 nt) (bekannt als DV200-Score)⁴ (Abbildung 2B, D,F). H&E-Bilder zeigten, dass nicht entkalkte und 3 h entkalkte Femurabschnitte mehrere Frakturen, Löcher und Beschädigungen aufwiesen (Abbildung 2A,C,), während Abschnitte von Femuren, die 24 h lang entkalkt wurden, eine gute histologische Qualität aufwiesen (Abbildung 2E). Alle vorgelegten Proben weisen DV200-Werte von mehr als 50 % auf, was als Mindestwert für die Durchführung von scRNA-seq- oder räumlichen Transkriptomanalysen angesehen^{wird 4}. Längere Inkubationszeiten mit täglichem EDTA-Wechsel bei 4 °C und milder Bewegung in kleineren Behältern wurden ebenfalls getestet und werden nicht empfohlen, da unter diesen Bedingungen die RNA-Integrität der Proben dramatisch abnimmt (Abbildung 2H). Daher wurde die Inkubationszeit auf 24 Stunden verkürzt, während die Häufigkeit, die Bewegung und das Volumen der Entkalkung erhöht wurden, um die Entkalkung zu fördern.

Abbildung 2. Schnitte und RNA-Integritätsqualitätskontrolle (QC) von 8 Wochen alten Femuren der Maus nach der Entkalkung. Femure von 8-Wochen-Mäusen wurden frisch präpariert, fixiert und mit 20 % EDTA pH 8,0 entkalkt. zu unterschiedlichen Zeitpunkten, eingebettet in Paraffin unter Verwendung der beschriebenen Methode und nach den berichteten Richtlinien geschnitten. Die histologische Qualitätskontrolle der erhaltenen Schnitte wurde dann mittels H&E-Färbung durchgeführt, während die RNA-Integrität durch Bewertung des RNA-Fragmentverteilungswerts mit einer Größe von mehr als 200 Nukleotiden (200 nt) (DV200) beurteilt wurde. (A) H&E-Färbung mit 8 Wochen alten Femurschnitten von Mäusen ohne Entkalkung. Das rechte Bild zeigt eine höhere Vergrößerung des geschachtelten Bereichs. (B) RNA-QC von 8 Wochen alten Femurschnitten der Maus ohne Entkalkung. (C) H&E-Färbung mit 8 Wochen alten Femurschnitten von Mäusen nach 3 h Entkalkung. Das rechte Bild zeigt eine höhere Vergrößerung des geschachtelten Bereichs. (D) RNA-QC von 8 Wochen alten Femurschnitten aus Mäusen nach 3 h Entkalkung. (E) H&E-Färbung mit 8 Wochen alten Femurschnitten von Mäusen nach 24 h Entkalkung. Das rechte Bild zeigt eine höhere Vergrößerung des geschachtelten Bereichs. (F) RNA-QC von 8 Wochen alten Femurschnitten aus Mäusen nach 24 Stunden Entkalkung. (G) H&E-Färbung mit 8 Wochen alten Femurschnitten von Mäusen nach 72 h Entkalkung. Das rechte Bild zeigt eine höhere Vergrößerung des geschachtelten Bereichs. (H) RNA-QC von 8 Wochen alten Femurschnitten der Maus nach 72 h Entkalkung. Abkürzungen: H&E = Hämatoxylin und Eosin; DV200 (%) = % des Fragmentverteilungswertes > 200 nt; NT = Nukleotide. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Um die Wirksamkeit der berichteten Leitlinien für den Umgang mit nicht demineralisierten FFPE-Proben zu testen, wurden FFPE-Blöcke von nicht demineralisierten Metastasen des primären Osteosarkoms und des Lungenosteosarkoms gesammelt, die aus unserem muskuloskelettalen onkologischen Tumorregister und unserer Gewebebank (MOTOR) entnommen wurden, und eine räumliche Transkriptomanalyse durchgeführt (Abbildung 3). Bevor mit der räumlichen Transkriptomanalyse fortgefahren wurde, wurden FFPE-Blöcke wieder in Paraffin eingebettet, um eine glatte Ausgangsoberfläche zu erhalten. Anschließend wurden die RNA- und histologische Qualität der Schnitte ausgewertet (Daten nicht gezeigt). Die Hydratationsschritte waren entscheidend, da primäre Osteosarkom-Proben nicht ohne ausreichende Hydratation geschnitten werden konnten. Im Gegensatz dazu waren bei Lungenmetastasen keine Hydratationsschritte erforderlich. Nach der Sektion wurde das Gewebe auf einen räumlichen Transkriptionsträger gelegt (Abbildung 3A), mit H&E gefärbt (Abbildung 3D), und die räumliche Transkriptomanalyse wurde gemäß den Herstellerangaben durchgeführt (siehe Materialtabelle). Die erhaltenen cDNA-Bibliotheken wurden sequenziert und die verarbeiteten Daten wurden mit Space Ranger zur Qualitätskontrolle⁵ visualisiert (Abbildung 3B). Die Ergebnisse von Space Ranger zeigten sehr hohe Werte (fast 100%) für gültige Barcodes, gültige eindeutige molekulare Identifikatoren (UMIs), Q30-Basen und den Median der nachgewiesenen Gene pro Spot (zwischen 1700 und 5000), was die Robustheit und Solidität der erhaltenen Daten demonstriert (Abbildung 3B). Mittels unverzerrter graphenbasierter Clusteranalyse wurden 12 Hauptcluster identifiziert, darunter Cluster von osteogenen, Immun-, Epithel- und Endothelzellen sowie Adipozyten (Abbildung 3E). Bemerkenswert ist, dass sich die Grenzen der Cluster mit den Rändern der vom Pathologen identifizierten histologischen Regionen überschnitten (Abbildung 3D). Weitere Abschnitte derselben Proben wurden ebenfalls mit Goldners Trichrom gefärbt, um die mineralisierten Bereiche sichtbar zu machen (Abbildung 3C).

Abbildung 3. Räumliche transkriptomische Analyse von zwei Paaren von nicht entkalkten primären Osteosarkomen (OS) und Lungenmetastasen. FFPE-Blöcke von zwei übereinstimmenden Paaren von nicht demineralisiertem humanem primärem Osteosarkom und Lungenmetastasen wurden aus unserer MOTOR-Gewebebank gesammelt. Die Proben wurden unter Verwendung der berichteten Richtlinien geschnitten und auf einen Visium Spatial Gene Expression Slide für FFPE-Proben gelegt, um eine räumliche transkriptomische Analyse durchzuführen. (A) Visium Spatial Gene Expression Slide für FFPE-Proben mit den beigefügten Abschnitten. (B) Space Ranger-Ausgabe mit gemeinsamen Parametern, die zur Bewertung der Qualität der erhaltenen Daten für alle Proben verwendet werden. (C) Goldners Trichrom-Färbung mit Lokalisation von mineralisiertem Knochengewebe und Osteoid. (D) H&E-Färbung mit der Anmerkung des Pathologen. (E) Clusteranalyse, die die Lokalisierung der gewebebewohnenden Zellpopulationen zeigt. Abkürzungen: FFPE = formalin-fixed und paraffin-embedded; MOCs = maligne osteogene Zellen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Discussion

Hier wird eine detaillierte Methode zur Präparation von FFPE-Blöcken entkalkter Knochen und zur Erhaltung der RNA-Integrität für die Sequenzierung (d. h. Next-Generation-Sequencing (NGS)) oder für andere RNA-bezogene Techniken (z. B. In-situ-Hybridisierung , quantitative reverse Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion (qRT-PCR) usw.) bereitgestellt.

Bei der Methode wird EDTA verwendet, um Knochengewebeproben zu entkalken. Die EDTA-Inkubation ermöglicht eine langsame, aber feine Demineralisierung der Proben, wodurch die histologischen Merkmale des Gewebes bestmöglich erhalten bleiben. In der Regel wird die Knochenentkalkung mit 10 % EDTA pH 7,0 für mindestens 2 Wochen durchgeführt, indem die Lösung jeden zweiten Tag aufgefrischt^{wird 4}. Lange Entkalkungszeiten tragen jedoch erheblich zum RNA-Abbau bei ^6,7,8. Um dieses Problem zu lösen, wurde die EDTA-Konzentration auf 20 % erhöht, der pH-Wert auf 8,0 angehoben und die Häufigkeit des Lösungswechsels auf alle 30 Minuten erhöht. Diese Bedingungen, in Kombination mit der großen Menge an Lösung, der das Gewebe ausgesetzt ist, der starken Bewegung und dem hohen Verhältnis von Behälter zu Gewebevolumen, maximieren die Entkalkung und verkürzen die Behandlungszeiten, was eine sanfte, aber schnelle Demineralisierung ermöglicht. Zu beachten ist, dass es bei der Verwendung von Knochengewebeproben für die Transkriptomsequenzierung möglicherweise nicht erforderlich ist, diese vollständig zu entkalken. In diesem Fall ist das optimale Verhältnis zwischen ausreichender Demineralisierung und guter RNA-Konservierung zu finden. Ein weiterer wichtiger Punkt ist, dass unabhängig davon, wie Proben behandelt werden, wenn sie fixiert wurden, ihre RNA fragmentiert wird. Die hier beschriebene Methode ermöglicht die Retention von RNA-Fragmenten mit einer Größe von mehr als 200 Nukleotiden (%DV200) (Abbildung 2F), was auf eine hohe RNA-Qualität hinweist ^9,11.

Diese Methode weist gewisse Einschränkungen auf. Da Mäuse die einzige Quelle für Knochengewebeproben waren, wurde die Methode nur an murinen Knochen validiert, die relativ klein sind. Darüber hinaus ist nicht bekannt, ob diese Methode bei Mäusen angewendet werden kann, die älter oder jünger als 8 Wochen sind, da sie nur an 8 Wochen alten Mäusen getestet wurde. Wir haben uns für 8 Wochen alte Mäuse entschieden, weil sie skelettreif sind. Da das Altern den Mineralgehalt der Knochen verändert, müssen möglicherweise Änderungen an diesem Ansatz vorgenommen werden.

Darüber hinaus wird berichtet, dass Richtlinien dazu beitragen sollen, die Qualität der Gewebeschnitte zu verbessern, wenn FFPE-Proben von kleinen nicht entkalkten Knochenproben verwendet werden, wie z. B. wenn sie direkt aus Gewebebanken entnommen werden. In diesen Situationen kann nichts getan werden, wenn die RNA abgebaut wird, aber die Schnittqualität kann verbessert werden. Bei Proben mit gutem RNA-Gehalt, wie hier gezeigt, ist hingegen eine räumliche Transkriptomanalyse möglich, wenn die bereitgestellten Richtlinien befolgt werden. Zu beachten ist, dass in primären Osteosarkomproben die Knochenstruktur durch das Vorhandensein der Tumormasse verändert werden kann, wodurch die eigentlichen Proben schwächer und spröde werden, was die Schnittbildung erleichtern kann. Daher wurde die Trichrom-Färbung von Goldner verwendet, um zu beurteilen, ob dies der Fall ist, da mineralisierte und nicht mineralisierte Gebiete mit dieser Färbetechnik identifiziert werden können (Abbildung 3C).

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die beschriebene Methode eine leicht anwendbare Methode zur Entkalkung von Knochengewebeproben und zur Gewinnung von FFPE-Schnitten darstellt, die effektiv für NGS oder andere Techniken verwendet werden können, die eine RNA-Integrität erfordern. Darüber hinaus werden Richtlinien für die Sektion von Proben bereitgestellt, die vor der Paraffineinbettung möglicherweise nicht demineralisiert wurden, wie z. B. Proben aus Gewebebanken. Angesichts der rasanten Entwicklung der räumlichen Transkriptomik-Analysen können die vorgeschlagene Methode und die Leitlinien für die Knochenforschung im Allgemeinen und auch für die Knochenkrebsforschung sehr hilfreich sein.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Erweiterter Orbitalschüttler	VWR	76683-470	Verwenden Sie diese Option, um das Gewebe während der Inkubation unter Bewegung zu halten, wie in den Methodenanweisungen beschrieben.
Camel Hair Brushes	Ted Pella	11859	Zur Bearbeitung von FFPE-Abschnitten, wie in den Richtlinien beschrieben.
Dual Index Kit TS Set A 96 rxns	10X Genomics	PN-1000251	Zur Durchführung von räumlicher Transkriptomik.
Ethanol 200 Proof	Decon Labs Inc	2701	Zur Dehydrierung des Gewebes verwenden, wie in den Methodenanweisungen angegeben.
Ethylendiamintetraessigsäure, Dinatriumsalzdihydrat (EDTA)	Thermo Fisher Scientific	S312-500	Zur Herstellung von EDTA 20% pH 8,0 verwenden;
Fisherbrand Curved Medium Point Allzweckzange	Fisher Scientific	16-100-110	Zur Handhabung von FFPE-Abschnitten, wie in den Richtlinien beschrieben.
Fisherbrand Feinpräzisionssonde	Fisher Scientific	12-000-153	Zur Handhabung von FFPE-Profilen verwenden, wie in den Richtlinien beschrieben.
Fisherbrand  Superfrost Plus Objektträger	Fisher Scientific	12-550-15	Zum Anbringen von geschnittenen Schriftrollen verwenden, wie in den Richtlinien beschrieben.
Hochprofil-Diamant-Mikrotomklingen	CL Sturkey	D554DD	Verwenden Sie diese Option zum Trennen von FFPE-Blöcken, wie in den Richtlinien beschrieben.
Novaseq 150PE	Novogene	N/A	Sequenzierer.
Paraformaldehyd (PFA) 32% wässrige Lösung	EM Grade Elektronenmikroskopie Sciences	15714-S	eine Endkonzentration von 4% mit 1x PBS verdünnen  zur Gewebefixierung.
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)	Thermo Fisher Scientific	10010-049	Gebrauchsfertig. Zum Verdünnen von PFA und zum Waschen verwenden, wie in den Methodenanweisungen beschrieben.
Premiere Tissue Schwimmbad	Fisher Scientific	A84600061	Zur Entfernung von Falten aus FFPE-Profilen verwenden, wie in den Richtlinien beschrieben.
RNase AWAY Oberflächendekontaminationsmittel	Thermo Fisher Scientific	7002	Zur Reinigung aller Oberflächen verwenden, wie in den Verfahrensanweisungen beschrieben.
RNeasy DSP FFPE Kit	Qiagen	73604	Zur Isolierung von RNA aus FFPE-Schnitten nach deren Generierung, wie in den Richtlinien beschrieben.
Halbautomatisches Rotationsmikrotom	Leica Biosystems	RM2245	Verwenden Sie es zum Schneiden von FFPE-Blöcken, wie in den Richtlinien beschrieben.
Natriumhydroxid	Millipore Sigma	S8045-500	Bereiten Sie eine 10-N-Lösung vor, indem Sie 400 g langsam in 1 Liter Milli-Q-Wasser auflösen.
Space Ranger	10X Genomics	2.0.1	Verwenden Sie diese Option, um die Ausgabe von Sequenzierungsdaten zu verarbeiten.
Surgipath Paraplast	Leica Biosystems	39601006	Zur Durchführung von Gewebeinfliltrationen und -einbettungen wie in den Methodenanweisungen beschrieben.
Visium Accessory Kit	10X Genomics	PN-1000194	Zur Durchführung von räumlichen Transkriptom-Experimenten.
Visium Human Transcriptome Probe Kit Klein	10X Genomics	PN-1000363	Zur Durchführung von räumlichen Transkriptom-Experimenten.
Visium Spatial Gene Expression Slide Kit 4 rxns	10X Genomics	PN-1000188	Wird verwendet, um die Schnitte zu platzieren, wenn räumliche Transkriptomik-Experimente durchgeführt werden.
Xylol	Leica Biosystems	3803665	Zur Gewebereinigung verwenden, wie in den Verfahrensanweisungen beschrieben.