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Ernte, Einbettung und Kultivierung von dorsalen Wurzelganglien in Geräten mit mehreren Kompartimenten zur Untersuchung peripherer neuronaler Merkmale

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DOI:

10.3791/66854

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28. Juni 2024

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1Department of Biological Systems Engineering, University of Nebraska-Lincoln

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Protokoll bietet eine Technik zur Entnahme und Kultivierung von explantierten Spinalganglien (DRG) von adulten Sprague Dawley-Ratten in einem Multikompartiment-Gerät (MC).

Zusammenfassung

Das häufigste periphere neuronale Merkmal des Schmerzes ist eine erniedrigte Stimulationsschwelle oder Überempfindlichkeit der terminalen Nerven aus den Spinalganglien (DRG). Eine vermutete Ursache für diese Überempfindlichkeit ist die Interaktion zwischen Immunzellen im peripheren Gewebe und Neuronen. In-vitro-Modelle haben grundlegende Erkenntnisse geliefert, um zu verstehen, wie diese Mechanismen zur Überempfindlichkeit von Nozizeptoren führen. In-vitro-Modelle stehen jedoch vor der Herausforderung, die Wirksamkeit auf den Menschen zu übertragen. Um dieser Herausforderung zu begegnen, wurde ein physiologisch und anatomisch relevantes in vitro-Modell für die Kultur von intakten Spinalganglien (DRGs) in drei isolierten Kompartimenten in einer 48-Well-Platte entwickelt. Primäre DRGs werden von erwachsenen Sprague-Dawley-Ratten nach humaner Euthanasie geerntet. Überschüssige Nervenwurzeln werden beschnitten und das DRG wird in geeignete Größen für die Kultur geschnitten. DRGs werden dann in natürlichen Hydrogelen gezüchtet, was ein robustes Wachstum in allen Kompartimenten ermöglicht. Dieses Multikompartimentsystem bietet anatomisch relevante Isolierung der DRG-Zellkörper aus Neuriten, physiologisch relevante Zelltypen und mechanische Eigenschaften, um die Wechselwirkungen zwischen Nerven- und Immunzellen zu untersuchen. Somit bietet diese Kulturplattform ein wertvolles Werkzeug für die Untersuchung von Behandlungsisolationsstrategien, was letztendlich zu einem verbesserten Screening-Ansatz zur Vorhersage von Schmerzen führt.

Einleitung

Chronische Schmerzen sind weltweit die Hauptursache für Behinderung und Arbeitsverlust1. Chronische Schmerzen betreffen weltweit etwa 20 % der Erwachsenen und stellen eine erhebliche gesellschaftliche und wirtschaftliche Belastung dar2, wobei die Gesamtkosten in den Vereinigten Staaten jedes Jahr auf 560 bis 635 Milliarden US-Dollar geschätztwerden 3.

Das wichtigste periphere Merkmal bei chronischen Schmerzpatienten ist eine abgesenkte Stimulationsschwelle der Nerven, die dazu führt, dass das Nervensystem besser auf Reize reagiert 4,5. Die erniedrigte Stimulationsschwelle kann zu einer schmerzhaften Reaktion auf einen zuvor nicht schmerzhaften Reiz (Allodynie) oder zu einer verstärkten Reaktion auf einen schmerzhaften Reiz (Hyperalgesie) führen6. Die derzeitigen Behandlungen chronischer Schmerzen sind nur begrenzt wirksam, und Behandlungen, die in Tiermodellen erfolgreich sind, scheitern in Studien am Menschen oft aufgrund mechanistischer Unterschiede in der Schmerzmanifestation7. In-vitro-Modelle, die periphere Sensibilisierungsmechanismen genauer nachahmen können, haben das Potenzial, die Translation neuer Therapeutika zu erhöhen 8,9. Darüber hinaus könnten die Forscher durch die Modellierung wichtiger Aspekte sensibilisierter Nerven in einem Kultursystem ein tieferes Verständnis der Mechanismen entwickeln, die zu niedrigeren Schwellenwerten führen, und neue therapeutische Ziele identifizieren, die diese umkehren10.

Die idealen In-vitro-Plattformen oder mikrophysiologischen Systeme würden die physikalische Trennung von distalen Neuriten und dem Zellkörper der dorsalen Wurzelganglien (DRG), eine dreidimensionale (3D) zelluläre Umgebung und das Vorhandensein nativer Stützzellen umfassen, um die In-vivo-Bedingungen genau nachzuahmen. Eine kürzlich erschienene Arbeit von Caparaso et al.11 zeigt jedoch, dass aktuellen DRG-Kulturplattformen eine oder mehrere dieser Schlüsselfunktionen fehlen, so dass sie für die Replikation von In-vivo-Bedingungen unzureichend sind. Auch wenn diese Plattformen einfach einzurichten sind, ahmen sie nicht die biologische Grundlage der peripheren Sensibilisierung nach und lassen sich daher möglicherweise nicht in vivo wirksam. Um diese Einschränkung zu beheben, wurde ein physiologisch relevantes in vitro Modell für die Kultivierung von Spinalganglien (DRG) innerhalb einer Hydrogelmatrix mit drei isolierten Kompartimenten entwickelt, um eine temporale fluidische Isolierung von Neuriten und DRG-Zellkörpern zu ermöglichen11. Dieses Modell bietet sowohl physiologische als auch anatomische Relevanz, was das Potenzial hat, die periphere Sensibilisierung von Neuronen in vitro zu untersuchen.

Das wachsende Interesse an der Verwendung von DRG-Explantaten in einer 3D-Kultur ist auf ihre Fähigkeit zurückzuführen, ein robustes Neuritenwachstum zu ermöglichen, was als indirekter Indikator für die Lebensfähigkeit von DRG dient12. Während primäre neonatale oder embryonale DRG-Explantate überwiegend in aktuellen In-vitro-Kulturplattformen verwendet werden13,14, bietet die Verwendung von Explantaten von adulten Nagetieren ein besseres Modell der reifen neuronalen Physiologie, das die menschliche DRG-Physiologie im Vergleich zu Explantaten von neonatalen oder embryonalen Nagetieren genau nachahmt15. Explantat-DRGs beziehen sich auf die Erhaltung des zellulären und molekularen Gewebes von nativem DRG-Gewebe, hauptsächlich durch die Erhaltung nativer nicht-neuronaler Stützzellen. In diesem Protokoll wird die Methodik zur Ernte und Kultivierung von DRG-Explantaten von adulten Sprague Dawley-Ratten in einem Gerät mit mehreren Kompartimenten (MC) beschrieben (Abbildung 1).

Die Wirksamkeit wurde bei der Kultivierung von DRGs aus der Hals-, Brust- und Lendenwirbelsäule ohne beobachtbare Unterschiede im Neuritenwachstum gezeigt. Für diese Anwendung bestand das Ziel darin, Neuritenwachstum in die äußeren Kompartimente des Geräts zu erzeugen; Daher wurde in diesem Artikel nicht nach DRG-Stufen unterschieden. Wenn jedoch für ein bestimmtes Experiment benötigt wird, kann das DRG-Niveau an die Bedürfnisse der Experimentatoren angepasst werden. Es gibt derzeit andere kompartimentierte Kulturmodelle für die 3D-Kultur von DRGs16, jedoch enthalten diese Geräte keine konservierten nativen nicht-neuronalen Unterstützungszellen, was die Translation einschränken kann. Die Erhaltung der nativen Struktur von geernteten DRGs ist wichtig, da sie den Erhalt nicht-neuronaler Stützzellen gewährleistet, deren Interaktionen mit DRG-Neuronen für die Aufrechterhaltung der funktionellen Eigenschaften dieser Neuronen unerlässlich sind. In mehreren Studien wurden dissoziierte DRGs mit nicht-nativen neuronalen Zellen wie Schwann-Zellen kokultiviert, um die Myelinisierung von Neuronen zu fördern 17,18,19.

Protokoll

Die DRG-Ernte wurde in Übereinstimmung mit dem Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) an der University of Nebraska-Lincoln durchgeführt. Für die Studie wurden weibliche Sprague Dawley-Ratten im Alter von 12 Wochen (~250 g) verwendet. Die Einzelheiten zu den Tieren, Reagenzien und Geräten, die in der Studie verwendet wurden, sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Herstellung und Montage von Geräten mit mehreren Kammern

  1. Computergestütztes Design und 3D-Druck des Mehrkammergeräts
    HINWEIS: Das MC-Gerät besteht aus drei Kompartimenten für die Isolierung von DRG-Zellkörpern und Neuriten (Abbildung 2A). Das MC-Gerät ist nicht im Handel erhältlich. Die STL-Datei wird jedoch hierin bereitgestellt (Ergänzende Codierungsdatei 1), um den 3D-Druck zu ermöglichen. Das Drucken des MC dauert einen (1) Tag.
  2. Laden Sie die STL-Datei des MC mit kompatibler Software auf einen Resin 3D-Drucker hoch.
    HINWEIS: Das ideale Material für den Druck ist ein Hochtemperaturharz. Ein wesentlicher Vorteil der Verwendung von Hochtemperaturharz besteht darin, dass es biokompatibel ist und autoklaviert und wiederverwendet werden kann. Für den Druck des Geräts könnte auch ein Digital Light Processing (DLP) 3D-Drucker oder andere 3D-Drucker verwendet werden.
  3. Übertragen Sie die gedruckten Geräte für 30 Minuten in eine Waschlösung in Isopropanol (>96%), um Harzreste von der Oberfläche des gedruckten MC-Geräts zu entfernen.
  4. Die Geräte werden bei 80 °C für 120 min mit einem handelsüblichen Härter nachgehärtet (siehe Materialtabelle). Das Härtungsmittel verbessert die mechanischen Eigenschaften des gedruckten MC-Geräts, indem es Temperatur und UV-Strahlung ausgesetzt wird.
  5. Die MC-Geräte im Backofen bei 160 °C 180 min thermisch aushärten.
  6. Sterilisieren Sie die Geräte mit einem Autoklaven für 45 Minuten im Schwerkraftzyklus.

2. Hydrogel-Vorbereitung

  1. Synthese von methacrylierter Hyaluronsäure (MAHA, 85%-115% Methacrylation) und Charakterisierung unter Verwendung eines von Seidlits et al.20 beschriebenen Protokolls.
    HINWEIS: Um das Wachstum von DRGs zu unterstützen, werden häufig Dreifach-Hydrogele verwendet, die aus methacrylierter Hyaluronsäure, Kollagen Typ I und Laminin bestehen. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass DRGs häufig in MAHA wachsen, die zwischen 1,25 und 2,5 mg/ml und Kollagen zwischen 2,0 und 4,5 mg/ml liegen. Für Laminin wurde festgestellt, dass 0,75 mg/ml ausreichend sind, um ein robustes Wachstum der DRGs zu gewährleisten. Hier werden Verfahren zur Herstellung eines Dreifachgels mit 1,25 mg/ml MAHA, 4,5 mg/ml Kollagen und 0,75 mg/ml Laminin detailliert beschrieben. Die Hydrogelvorbereitung sollte in einem Laminar-Flow-Schrank erfolgen, um einen aseptischen Arbeitsbereich zu schaffen.

3. Vorbereitung der Photoinitiatorlösung

HINWEIS: Um den MAHA unter UV-Licht zu vernetzen, ist ein Photoinitiator erforderlich. Es wird häufig in Prozentsätzen von 0,3 % bis 0,6 % verwendet.

  1. Bereiten Sie die Photoinitiatorlösung 3 Tage vor der DRG-Ernte vor.
  2. Heizen Sie das Beschallungswasserbad auf 37 °C vor, bevor Sie die Photoinitiatorlösung vorbereiten.
  3. Bereiten Sie mit der sterilen Technik in einer Durchflusshaube eine Natriumbicarbonatlösung von 23,125 mg/ml (NaHCO3) her, indem Sie NaHCO3 in 5x Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)-HEPES-Lösung auflösen.
  4. Mischen Sie in einem Glasfläschchen 0,6 % Gew./Vol.-Photoinitiator in einer sterilen phosphatgepufferten Kochsalzlösung (PBS) mit 20 Vol.-% und einer 5X DMEM/HEPES-Lösung mit 80 Vol.-%.
  5. Um sich vor Licht zu schützen, wickeln Sie das Glasfläschchen in Alufolie ein. Stellen Sie jedoch sicher, dass die Aluminiumfolie entfernt wird, bevor Sie das Fläschchen in das auf 37 °C erhitzte Beschallungswasserbad mit Beschallung zwischen 30 und 40 Minuten überführen.
    HINWEIS: Die Photoinitiatorlösung muss vor Licht geschützt werden, da sie in Radikale zerfallen und den Polymerisationsprozess in Gang setzen kann, wenn sie Lichtausgesetzt wird 21.
  6. Sterilfiltrieren Sie die Lösung mit einem 0,22 μm Spritzenvorsatzfilter in ein neues steriles Glasfläschchen.

4. Auflösung von methacrylierter Hyaluronsäure

  1. Lösen Sie die methacrylierte Hyaluronsäure (hergestellt in Schritt 2) am selben Tag auf, an dem die Photoinitiatorlösung hergestellt wird (Schritt 3).
  2. Legen Sie das gefrorene lyophilisierte MAHA für 15 Minuten in einen Exsikkator, um es auf Raumtemperatur zu bringen.
  3. Wiegen Sie in einer Laminar-Flow-Haube und mit der sterilen Wägetechnik das lyophilisierte MAHA in einem Glasfläschchen.
  4. Geben Sie das erforderliche Volumen der gefilterten Photoinitiatorlösung zu MAHA, um die gewünschte MAHA-Konzentration zu erreichen. Die übliche Endgelkonzentration beträgt 1,25 mg/ml MAHA und 4,5 mg/ml Kollagen.
  5. Verschließen Sie die Kappe mit Laborsiegelfolie, wickeln Sie das Glasfläschchen mit Aluminiumfolie ein und legen Sie es bei Raumtemperatur auf eine Orbitalschüttelplatte, bis es sich vollständig aufgelöst hat (normalerweise 3 Tage). Gelegentlich die Lösung vortexen, um große MAHA-Klumpen auseinander zu brechen und eine gleichmäßige Auflösung von MAHA zu gewährleisten.

5. Montage des Geräts

  1. Legen Sie das MC-Gerät einen Tag vor der DRG-Ernte in eine 48-Well-Platte.
  2. Tragen Sie mit einer 3-ml-Spritze eine dünne Linie Silikongel in die Rille unter dem MC-Gerät (Abbildung 2B) auf. Dies hilft dabei, das Gerät sicher an der Well-Platte zu befestigen.
  3. Platzieren Sie das MC-Gerät mit Hilfe der Pinzette #3 vorsichtig in der Vertiefung einer 48-Well-Platte, wie in Abbildung 2C gezeigt.
    HINWEIS: Die Größe des Geräts kann an die beabsichtigte Anwendung angepasst werden, und auf Wunsch kann eine Platte einer anderen Größe verwendet werden. Die Geräte können wiederverwendet werden. Zur Wiederverwendung muss das Hydrogel vorsichtig aus allen Tunneln ausgewaschen werden, und die Laderille unter dem Gerät muss mit 70 % Ethanol unter leichtem Rühren verwendet werden. Nachdem dies abgeschlossen ist, können die Geräte erneut autoklaviert werden, um sie vor der Verwendung zu sterilisieren.

6. Vorbereitung der Tiere

  1. Autoklavieren Sie alle notwendigen Sezierwerkzeuge vor Beginn der Ernte.
  2. Besorgen Sie sich eine erwachsene männliche oder weibliche Sprague-Dawley-Ratte im Alter von 12-20 Wochen. Das Geschlecht der Ratte hat keinen Einfluss auf das DRG-Wachstum.
  3. Euthanasieren Sie die Ratte gemäß dem genehmigten IACUC-Protokoll mit einer CO2 -Überdosierung als primärer Euthanasiemethode und einer bilateralen Pneumothoraxpunktion als sekundärer Euthanasiemethode gemäß den Richtlinien der American Veterinary Medical Association22.
  4. Legen Sie die Ratte mit der Bauchseite nach unten auf eine sterile Unterlage auf einem Präpariertisch. Sprühen Sie das Fell mit 70% Ethanol ein.

7. Entnahme der Spinalwurzelganglien (DRG)

  1. Bereiten Sie Trimmmedien vor, die 86 % neurobasales A-Medium, 10 % fötales Rinderserum (FBS), 1 % Penicillin-Streptomycin (PS), 1 % Glutamin und 2 % B27 plus 50x enthalten, und geben Sie es in eine 24-Well-Platte. Dieses Medium und die Well-Platte werden für die vorübergehende Lagerung von geernteten DRGs verwendet, bevor sie in das Hydrogel eingebettet werden.
  2. Tragen Sie einen Laborkittel, eine OP-Maske, eine Haube, eine Schutzbrille und Handschuhe.
  3. Schneiden Sie mit einer großen stumpfen Schere durch die Haut an der Basis der Halswirbelsäule und dann die Länge der Wirbelsäule hinunter.
  4. Um das Blut weiter aus dem Wirbelkanal abzuleiten, schneiden Sie unter den Schulterblättern hindurch und durch den Muskel, um die wichtigsten Blutgefäße zu durchtrennen.
  5. Verwende eine große, scharfe Schere, um den Muskel von der Wirbelsäule wegzuschneiden. Räumen Sie so viel Muskelmasse wie möglich frei, um die Wirbelsäule sichtbar zu machen.
  6. Entfernen Sie die dorsalen und lateralen Segmente der Wirbel. Verwenden Sie einen geraden Rongeur und eine scharfe Schere, um die Dorn- und Querfortsätze der Wirbel zu entfernen, beginnend am zervikalen Ende und in Richtung des lumbalen Endes.
  7. Entferne das Rückenmark. Schneide mit einer kleinen Schere mit scharfer Nase vorsichtig durch die Nervenwurzeln, die mit den DRGs auf beiden Seiten des Rückenmarks verbunden sind. Schneiden Sie das zervikale Ende des Rückenmarks ab und heben Sie es vorsichtig allmählich aus dem Spinalkanal heraus, wobei Sie alle verbleibenden Nervenwurzeln durchschneiden, die mit den DRGs verbunden sind.
    HINWEIS: Feinmotorik ist unerlässlich, um sicherzustellen, dass der DRG-Aufbau dabei nicht durchtrennt wird.
  8. Um DRGs freizulegen, verwenden Sie den gebogenen Rongeur, um mehr seitliche Teile der Wirbel zu entfernen. Ziehe von der Mittellinie abwechselnd die Seiten nach außen. Achten Sie darauf, den DRG-Körper nicht zu durchschneiden, da dies die Zellkörper und Axone schädigen kann.
  9. Entfernen Sie mit der Pinzette #3 und der Federschere mit gerader Kante die DRGs zwischen den einzelnen Ebenen der Wirbel. Fassen Sie die Spinalnervenwurzeln aus dem DRG, ziehen Sie sie vorsichtig aus der Tasche und schneiden Sie das andere Ende des Spinalnervs durch. Achten Sie darauf, den DRG-Aufbau nicht direkt zu greifen.
  10. Die DRGs werden in Vertiefungen einer 24-Well-Platte (mit Trimmmedien, Schritt 7.1) auf Eis gelegt.
  11. Nachdem Sie alle DRGs gesammelt haben, räumen Sie den Arbeitsbereich auf, legen Sie den Kadaver in einen Autoklavbeutel und lagern/entsorgen Sie ihn ordnungsgemäß gemäß dem IACUC-Protokoll.

8. DRG Trimmen und Schneiden

  1. Füllen Sie eine 60 mm Petrischale auf einer sauberen Bank mit Trimmmedien (Schritt 7.1). Stellen Sie das Präparierfernrohr und den Glasperlensterilisator auf und platzieren Sie einen autoklavierten Werkzeugkasten mit Trimmwerkzeugen (#3 Pinzette und Federschere mit gerader Kante) neben dem Zielfernrohr.
  2. Entfernen Sie unter dem Präparierbereich überschüssiges Gewebe um das DRG herum und schneiden Sie die Nervenwurzeln in der Nähe des DRG-Körpers ab (typischerweise etwas dunkler als die umgebenden Nerven).
  3. Füllen Sie eine zweite 60-mm-Petrischale mit frischem Medium. Schneiden Sie unter dem Präparierfernrohr die beschnittenen DRGs auf ca. 0,5 mm (oder zwischen 0,5 mm und 0,8 mm) ab. Während des Schneidens wird ein Lineal unter die Petrischale gelegt, um die korrekte geschätzte Größe der geschnittenen DRGs zu erhalten.
  4. Übertragen Sie die geschnittenen DRGs in eine frische 24-Well-Platte, wobei das Medium auf Eis liegt.
    HINWEIS: Das Trimmen, Schneiden und Einbetten von DRG sollte in einem Laminar-Flow-Schrank erfolgen, um einen aseptischen Arbeitsbereich zu schaffen. In Ermangelung eines Laminar-Flow-Schranks müssen aseptische Techniken eingehalten werden, wobei ein Minimum an geeigneter persönlicher Schutzausrüstung (PSA) empfohlen wird (Laborkittel, Masken, Schutzbrille und Handschuhe) und alle Werkzeuge während des gesamten Prozesses sterilisiert werden, um eine mögliche Kontamination zu vermeiden.

9. Kollagen-Neutralisation

  1. Neutralisieren Sie das Kollagen am selben Tag wie die DRG-Ernte nach dem Trimmen und Schneiden der DRGs.
  2. Bei der Arbeit auf Eis pipettieren Sie ~8,16 % Reinstwasser, ~1,84 % 1 M Natriumhydroxid (NaOH), ~10 % 10x PBS und ~80 % Kollagen des Gesamtvolumens der Lösung in ein Glasfläschchen.
  3. Langsam mit einer sterilen Pipettenspitze mit geringer Retention mischen, um Kollagen (normalerweise zuletzt hinzugefügt) in die Mischung zu pipettieren. Achten Sie darauf, dass die Pipettenspitze während des Mischens in der Lösung bleibt, um Blasenbildung zu vermeiden. Überprüfen Sie den pH-Wert des neutralisierten Kollagens mit pH-Streifen, um sicherzustellen, dass er ~7 beträgt.
    HINWEIS: Neutralisiertes Kollagen kann 2-3 Stunden auf Eis aufbewahrt werden, ohne zu gelieren; Daher sollte die Herstellung des Hydrogels zügig durchgeführt werden, sobald das Kollagen neutralisiert ist.

10. Herstellung von Hydrogelen

  1. Bei der Arbeit auf Eis pipettieren Sie Laminin (bis zu einer Endkonzentration von 0,75 mg/ml) und 1x PBS in ein Glasfläschchen.
  2. Piptieren Sie mit sterilen Pipettenspitzen mit niedriger Retention neutralisiertes Kollagen und MAHA-Lösung in die Mischung, um die gewünschte Konzentration zu erreichen.
  3. Langsam mischen und den pH-Wert des resultierenden Hydrogels überprüfen (sollte ~7 betragen).

11. DRG-Einbettung

  1. Führen Sie eine Einbettung in mehrere Fächer durch.
    1. Pipettieren Sie 65,1 μl bzw. 52,8 μl des vorgemischten Hydrogels in die Soma- bzw. Neuritenkompartimente.
      HINWEIS: Dies setzt die Verwendung von MC-Geräten in einer 48-Well-Platte voraus. Diese Volumes können je nach Größe des verwendeten MC-Geräts geändert werden.
    2. Betten Sie die geschnittenen DRGs vorsichtig in das Soma-Fach ein (Abbildung 2A) und stellen Sie sicher, dass sie den Boden der Well-Platte nicht zerkratzen. Platzieren Sie das DRG in der Mitte, damit die Neuriten durch die Tunnel in die angrenzenden Kompartimente hineinwachsen können.
    3. Thermisches Vernetzen des Hydrogels im Inkubator bei 37 °C für 30 min. Schalten Sie währenddessen die UV-Lampe ein, um sich aufzuwärmen.
    4. Nach der thermischen Vernetzung wird das Hydrogel 90 s lang UV-vernetzt.
    5. Fügen Sie dem Hydrogel und dem DRG DRG-Wachstumsmedien hinzu und führen Sie nach einer Stunde einen vollständigen Medienwechsel durch, um nicht umgesetzte oder verbleibende Spuren von Photoinitiatoren, die im Medium verbleiben, zu entfernen.
    6. Führen Sie alle 3 Tage einen halben Medienwechsel durch und überwachen Sie das Wachstum der DRGs durch Betrachten unter dem Mikroskop.
    7. Nach ~4 Wochen, wenn die DRG-Neuriten zu wachsen beginnen (Abbildung 3A), nehmen Sie Bilder mit dem Fluoreszenzplatten-Imager auf und quantifizieren Sie die Länge der Neuriten mit FIJI (ImageJ).

12. DRG-Einbettung steuern

  1. Pipettieren Sie 250 μl Hydrogel in einer 48-Well-Platte (ohne MC).
  2. Legen Sie das geschnittene DRG vorsichtig in die Mitte des Wells und auf halbem Weg nach unten in das Hydrogel und achten Sie darauf, dass es den Boden der Well-Platte nicht zerkratzt.
  3. Thermisches Vernetzen des Hydrogels im Inkubator bei 37 °C für 30 min.
  4. UV-Vernetzung des Hydrogels für 90 s.
  5. Geben Sie DRG-Wachstumsmedien zu Hydrogel und DRG und führen Sie nach einer Stunde einen vollständigen Medienwechsel durch.
  6. Führen Sie alle 3 Tage einen halben Medienwechsel durch und überwachen Sie das Wachstum des DRG, indem Sie es unter dem Mikroskop betrachten.
  7. Nach ~4 Wochen, wenn die DRG-Neuriten zu wachsen beginnen (Abbildung 3B), nehmen Sie Bilder mit dem Fluoreszenzplatten-Imager auf.
    HINWEIS: Jedes Hellfeldmikroskop eignet sich für die Bildgebung. Ein automatisiertes plattenbasiertes Mikroskop beschleunigt diesen Prozess. Die kontrollierte Einbettung in einfache Gele ohne das Gerät wird durchgeführt, um das Wachstum von DRG-Neuriten in Multikompartimenten zu vergleichen. Sobald Benutzer bestätigt haben, dass DRGs in MC- und Kontrollgelen ähnlich wachsen, müssen sie die Kontrollgele möglicherweise nicht jedes Mal wiederholen.

13. DRG-Bildgebung

  1. Nehmen Sie Hellfeldbilder mit 4-facher Vergrößerung mit einem fluoreszierenden Platten-Imager bei verschiedenen Brennweiten auf, um das gesamte DRG- und MC-Gerät zu visualisieren.
  2. Passen Sie die Helligkeit und den Kontrast des Bildes an, um die Neuriten besser sehen zu können.
  3. Speichern Sie das Bild als .tiff Datei.

14. DRG-Neuriten-Quantifizierung

  1. Laden Sie FIJI (ImageJ) herunter und installieren Sie es.
  2. Öffnen Sie ImageJ. Öffnen Sie die Bilddatei, und stellen Sie sicher, dass die Datei monochrom ist.
  3. Verstärken Sie den Kontrast, so dass kleinste Neuriten sichtbar sind. Öffnen Sie dazu die Option Helligkeit und Kontrast mit der Tastenkombination Strg+Umschalt+C.
  4. Passen Sie die Schieberegler des Controllers nach Bedarf an, um die Neuriten zu visualisieren, und klicken Sie auf Anwenden , um die gewünschte Helligkeit und den gewünschten Kontrast zu erhalten.
  5. Öffnen Sie den Neuriten-Tracer, indem Sie das Menü Plugins öffnen, Segmentierung auswählen und auf Einfacher Neurite Tracer klicken.
  6. Starten Sie eine neue Spur, indem Sie mit einem Ende des Neuriten direkt gegen den DRG-Körper klicken.
  7. Klicken Sie auf einen anderen Punkt entlang des Neuriten, um eine Spur hinzuzufügen, bis der Neurit von Ende zu Ende verfolgt wird. Klicken Sie auf Pfad beenden , nachdem Sie den Neuriten verfolgt haben.
  8. Konvertieren Sie die gezeichnete Länge in reale Einheiten und speichern Sie die Ergebnisse, indem Sie sie kopieren und in Excel einfügen.
  9. Verwenden Sie das Geradlinigkeitswerkzeug in FIJI, um eine Linie mit der gleichen Länge wie die Maßstabsleiste zu zeichnen (ohne das Ende der Linie loszulassen) und sehen Sie sich den Längenwert an, der unter der Symbolleiste sichtbar ist. Der Längenwert wird für die Konvertierung verwendet.
  10. Messen Sie die Länge von sechs langen Neuriten, die sich von beiden Seiten des DRG erstrecken (Abbildung 3C,D) und berechnen Sie die durchschnittliche Länge dieser Neuriten, um eine repräsentative durchschnittliche Länge des DRG zu erhalten, wie in Abbildung 4 gezeigt.
    HINWEIS: Die Immunfärbung wurde an DRG-Explantaten in einfachen Gelen getestet, um das Vorhandensein von nicht-neuronalen Stützzellen zu zeigen7. DRGs werden bei Raumtemperatur in 4 % Paraformaldehyd (PFA) fixiert, dreimal mit 1x PBS für 15 min gewaschen und bis zur Immunfärbung in 1x PBS bei 4 °C gelagert.
  11. Entfernen Sie bei Explantaten in MC-Geräten das MC-Gerät und befolgen Sie den oben beschriebenen Vorgang7.

Ergebnisse

Das vorliegende Protokoll beschreibt eine Technik zur Gewinnung und Kultivierung von DRG von adulten Sprague Dawley-Ratten in einer Vorrichtung mit mehreren Kompartimenten (MC). Wie in Abbildung 1 gezeigt, wurde DRG, das von erwachsenen Ratten entnommen wurde, gekürzt und in ~0,5 mm geschnitten. Die getrimmten und geschnittenen DRGs wurden dann in ein Hydrogel in der Soma-Region des MC-Geräts eingebettet (Abbildung 2) und vor der Neuritenquantifizierung 27 Tage lang kultiviert. DRG wurde in einfachem Gel kultiviert, um als Kontrolle zu dienen. Die Konzentration der Hydrogelformulierung, die für dieses Experiment verwendet wurde, betrug 4,5/1,25 mg/ml Kollagen: MAHA. An den Tagen 27 und 21 für Multikompartiment- bzw. Plain-Gele kam es zu einem robusten Wachstum der Neuriten (Abbildung 3). Die durchschnittliche Länge der Neuriten in MC (894,22 μm ± 308,75 μm) war vergleichbar mit der Neuritenlänge in einfachen Kontrollgelen (864,26 μm ± 362,84 μm) (Abbildung 4). Dies zeigt die Fähigkeit des MC-Geräts, die DRG-Kultur und das Neuritenwachstum zu unterstützen. Die Neuritlängen wurden mit der ImageJ-Software quantifiziert.

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Abbildung 1: Schematische Darstellung des experimentellen Verfahrens. (A) Entnahme von Spinalganglien (DRG) von adulten Sprague-Dawley-Ratten. (B) Trimmen und Schneiden von geerntetem DRG. (C) Hydrogel-Formulierung, DRG-Einbettung und Kultur in Hydrogel innerhalb des MC, eingebaut in eine 48-Well-Platte. (D) Wachstum der DRG-Neuriten nach 21-30 Tagen Kultur. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 2: Gedrucktes Multi-Kompartiment mit drei isolierten Kammern, das in einer 48-Well-Platte verwendet werden kann. (A) Ein repräsentatives Bild, das die Draufsicht des gedruckten MC-Geräts zeigt, zeigt die DRG- und Neuriten-Kompartimente (rote Linien) und den DRG-Einbettungsbereich (grün). (B) Seitenansicht von MC. (C) Ein Bild von MC, das in eine 48-Well-Platte eingepasst ist. Maßstabsleiste = 10 mm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 3: Neuritenwachstum in Geräten mit mehreren Kompartimenten (MC) und Kontroll-Plain-Gelen. (A) Ein repräsentatives Bild, das das nachgezeichnete Neuritenwachstum in einem Gerät mit mehreren Kompartimenten (MC) im Hellfeld zeigt. (Unten) Neuriten, die durch die Tunnel von MC gewachsen sind, sind mit Pfeilen gekennzeichnet. (B) Bild des Neuritenwachstums in einfachen Kontrollgelen (ohne MC). (C) Ein repräsentatives Bild, das die Neuritenverfolgung von zwölf langen Neuriten in einfachen Kontrollgelen (violette Linien) zeigt. Sechs lange Neuriten auf beiden Seiten des DRG wurden quantifiziert, um die durchschnittliche Neuritenlänge zu erhalten. Die Bilder wurden mit einem Fluoreszenzplatten-Imager bei 4-facher Vergrößerung aufgenommen, und die Neuriten wurden mit FIJI (ImageJ) quantifiziert. Maßstabsbalken = 1000 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 4: Neuritenlänge in Multikompartimenten (MC) im Vergleich zu Plain Gel (PG). Streudiagramm mit einzelnen Neuritenlängen mit Mittelwerten und Standardabweichungen, die durch Fehlerbalken dargestellt werden. Die durchschnittliche Neuritenlänge in MC betrug 1204,40 μm ± 690,43 μm (mittlere ± SD) im Vergleich zu 864,26 μm ± 362,84 μm (mittlere ± SD) im einfachen Gel, was darauf hindeutet, dass MC das Neuritenwachstum unterstützt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Ergänzende Codierungsdatei 1: STL-Datei eines Geräts mit mehreren Kammern (MC), das mit computergestützter Designsoftware erstellt wurde. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Diskussion

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Ernte adulter Sprague Dawley DRGs und zur Kultivierung in natürlichen 3D-Hydrogelen. Im Gegensatz zu dieser Methode wird bei anderen Ansätzen zur Entnahme von DRGs von Mäusen und Ratten die Wirbelsäule isoliert. Die exzidierte Wirbelsäule wird halbiert und das Rückenmark wird entfernt, um die DRGs 23,24,25 freizulegen. Eine Schädigung des Rückenmarks schränkt die Blutversorgung ein, was sich auf DRGs und innere Neuronen auswirkt26. Dadurch wird die Aktivität der DRGs reduziert, wodurch die chirurgischen Ansätze besser geeignet sind. Darüber hinaus wurde eine Methode zum 3D-Druck eines robusten MC-Geräts skizziert, das eine physiologisch relevante Kultur von DRGs ermöglicht.

Dieses Protokoll skizziert eine Methode zur Kultivierung von DRG in vitro, wobei der Schwerpunkt auf der Untersuchung der peripheren Sensibilisierung von Neuronen in einem anatomisch und physiologisch relevanten Modell liegt. Mit dieser Kulturmethode kann eine physikalische Trennung von distalen Neuriten und dem DRG-Zellkörper in einer 3D-Umgebung hergestellt werden. Das MC-Gerät ahmt die in vivo-Umgebung nach, da DRG-Explantate mit Zellen erhalten bleiben und mit nativen Gliazellen co-kultiviert werden können. Das DRG-Explantat enthält nicht-native neuronale Zellen, die mit anderen Zellen co-kultiviert werden könnten, um physiologische Bedingungen nachzuahmen. Diese physiologische Relevanz fördert Studien darüber, wie nicht-neuronale Zellen die Neuritenaktivität regulieren, und hilft beim Verständnis grundlegender Mechanismen, die an der Nozizeption beteiligt sind. Die Einbeziehung dieser nicht-neuronalen Interaktionen sollte im Vergleich zu vereinfachten Kulturmodellen mit dissoziierten DRGs genauere Vorhersagen der Zellsignalisierungsergebnisse ermöglichen. Das Vorhandensein von zwei Neuritenkompartimenten maximiert die physiologische Relevanz, da einzelne DRGs in vivo verschiedene Gewebe innervieren. Diese Konstruktion ermöglicht die Behandlung eines Neuritenkompartiments, während das andere als Kontrolle dient. Kontroll- und Behandlungskompartimente, die mit einem einzigen Soma verbunden sind, könnten verwendet werden, um kompartimentübergreifende Effekte zu untersuchen, indem in vivo Bedingungen nachgeahmt werden, bei denen Neuriten von einem einzigen Soma ausgehen und unterschiedliche Reize erfahren, während sie verschiedene Gewebe innervieren, was einen Einblick in die Wechselwirkung zwischen Neuriten gibt. Wenn es zu einer Wechselwirkung zwischen Neuriten in benachbarten Kompartimenten kommt, können unbehandelte DRGs als echte Kontrolle dienen.

Dieses Gerät könnte zur Isolierung der Behandlung oder zur Untersuchung der Interaktion zwischen Neuronen und DRG im Zusammenhang mit Schmerzen verwendet werden. Da distale Neuriten selektiv getrennt vom DRG-Soma und den proximalen Neuriten behandelt werden können, könnte dieses System für periphere Behandlungen wie gezielte Gelenktherapeutika verwendet werden, bei denen das terminale Ende der peripheren sensorischen Neuronen direkt behandelt wird.

Ein wesentlicher Vorteil des MC-Bausteins sind die Hochdurchsatz-Experimente über mehrere Vertiefungen derselben Platte, da der MC-Baustein so konzipiert ist, dass er in eine 48-Well-Platte passt. Ein weiterer Vorteil der In-vitro-Plattform ist die Fähigkeit, die Steifigkeit des Hydrogels innerhalb des MC zu verändern, indem die Kollagen- und MAHA-Konzentrationen so abgestimmt werden, dass sie die Eigenschaften verschiedener Gewebemikroumgebungen nachahmen. Eine mögliche Einschränkung dieses Protokolls besteht darin, dass die fluidische Isolierung zwischen den Neurorite- und DRG-Soma-Kompartimenten nicht ideal für Kulturen nach 72 h ohne Medienwechsel ist. Eine frühere Studie bestätigte, dass die fluidische Isolierung in den Kompartimenten bis zu 72 h ohne Medienwechsel aufrechterhalten wird11. Frühere Studien haben gezeigt, dass eine Erhöhung der Hyaluronsäurekonzentration die Kollagenvernetzungsdichte signifikant erhöht und somit die Diffusivität von Makromolekülen in der Hydrogelmatrix einschränkt27. Um die fluidische Isolierung für Kulturen nach 72 h zu verbessern, kann daher die MAHA-Konzentration erhöht werden, wie in einer Studie von Caparaso et al.7 gezeigt wurde, in der eine Erhöhung der MAHA-Isolierung zu einer verbesserten fluidischen Isolierung führte. Die Kontrolleinbettung erfolgt, um ein vergleichbares Wachstum der DRG-Neuriten in MC und einfachem Gel zu gewährleisten. Damit soll sichergestellt werden, dass MC keinen Einfluss auf das Wachstum der DRG hat. Es wird nicht empfohlen, die Kontrolleinbettung bei jedem Experiment zu wiederholen, sobald das DRG-Wachstum in MC validiert ist.

Die Autoren räumen ein, dass menschliche DRGs im Vergleich zu Ratten-DRGs größer sind, mehr Zellen enthalten und unterschiedliche Anteile an Neuronen-Subtypen aufweisen28. Die Verwendung von Nagetier-DRGs ist eine Einschränkung dieser Studie in Bezug auf die Translation in die Klinik; Dieses System könnte jedoch als Screening-Plattform wertvoll sein, um Verbindungen zu identifizieren, die die neuronale Erregbarkeit beeinflussen. Obwohl es Unterschiede in der Zusammensetzung zwischen DRGs von Nagetieren und Menschen gibt, gibt es auch eine hohe Überlappung innerhalb des Proteoms zwischen DRGs von Ratten und Menschen29. Diese Überlappung im Proteom - und das Vorhandensein der gleichen neuronalen Subtypen - deutet darauf hin, dass das Ratten-DRG zum Screening von Therapeutika auf hohem Niveau verwendet werden kann, und es können weitere Tests durchgeführt werden, um zu untersuchen, ob sich Veränderungen im Ratten-DRG mechanistisch auf das menschliche DRG übertragen lassen.

Diese Plattform ermöglicht eine gezielte pharmakologische Stimulation und die Untersuchung von Neuronen oder Zellkörpern mit zeitlicher Kontrolle. Veränderungen der neuronalen Erregbarkeit und Signalübertragung können leicht durch Manipulation von Neuriten oder dem DRG gemessen werden. Die Fähigkeit, die neuronale Erregbarkeit mittels Calcium-Imaging in einfachen Kontrollhydrogelen mit explantierten DRGs zu beurteilen, wurde nachgewiesen7. Ähnliche Methoden können im MC-Gerät eingesetzt werden, um die neuronale Erregbarkeit zu beurteilen.

Diese Methode kann verwendet werden, um verschiedene Schmerzzustände zu untersuchen, bei denen die Stimulation peripherer primärer sensorischer Neuronen ein treibender Faktor ist, wie z. B. bandscheibenassoziierte Rückenschmerzen. Das Screening von Nozizeptoren-Überempfindlichkeit kann ein vielversprechendes Instrument sein, um neuartige Medikamente zur Verringerung der Übererregbarkeit zu entdecken. Die Verringerung der Übererregbarkeit hat das Potenzial, klinisch zu einer Schmerzlinderung zu führen. Diese Plattform kann Hochdurchsatzmedikamente screenen, um die wirksamsten Kandidaten für die In-vivo-Validierung mit Hilfe von schmerzähnlichen Verhaltensassays zu identifizieren.

Offenlegungen

Die Autoren dieser Studie erklären, dass sie keinen Interessenkonflikt haben.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde durch einen NSF Grant (2152065) und einen NSF CAREER Award (1846857) unterstützt. Die Autoren danken allen aktuellen und ehemaligen Mitgliedern des Wachs Lab für ihren Beitrag zu diesem Protokoll. Die Diagramme in Abbildung 1 wurden in Biorender erstellt.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
#5 PinzettenFine Science Tools11252-00Zum Trimmen und Schneiden DRG
10x DMEMMilliporeSigmaD2429
1x PBS (autoklaviert)Hergestellt im Labor7,3 - 7,5 pH
24 Well PlattenVWR82050-892Zur vorübergehenden Lagerung von geernteten und geschnittenen DRGs
3 mL Spritze steril, EinmalgebrauchBD309657
48 Well PlattenGreiner Bio-One677180
60 mm PetrischaleFisher ScientificFB0875713AZum Halten von Medien zum Trimmen und Schneiden
AlufolieFisherbrand01-213-104
B27 Plus 50xThermoFisher17504044Für DRG Medien
Kollagen Typ IIbidi50205
Gebogen Tasse Friedman Pearson RongeurFine Science Tools16221-14Zum Sezieren
Dumont #3 PinzetteFine Science Tools11293-00Zum Sezieren
Fötales Rinderserum (FBS)ThermoFisher16000044Für DRG-Medien
Form CureForm LabsHärter
Form WashForm LabsZum Abwaschen von überschüssigen
GlasperlensterilisatorFisher ScientificNC9531961
Glasfläschchen (8 mL)DWK Life Sciences (Wheaton)224724
GlutaMaxThermoFisher35050-061Für DRG-Medien
HEPES (1M)Millipore SigmaH0887
Hochtemperatur-V2-HarzFormLabsFLHTAM02
Hyaluronsäure NatriumsalzMilliporeSigma53747Zur Herstellung von MAHA
IrgacureMilliporeSigma410896
Laminin R& D Systems344600501
Große Schere mit stumpfer NaseMilitexEG5-26Zum Sezieren
Große Pinzetten (gezackte Spitzen)Militex9538797Zum Präparieren
Große Schere mit scharfer NaseFine Science Tools14010-15Zum Präparieren
Retention PipettenspitzenFisher Scientific02-707-017Zum Pipettieren von Kollagen und MAHA
Methacrylierte Hyaluronsäure (MAHA)Hergestellt im LaborN/A85 - 115 % Methacrylation
Nervenwachstumsfaktor (NGF)R& D Systems556-NG-100Für DRG-Medien
Neurobasal A MedienThermoFisher10888022Für DRG-Medien
ParafilmBemisPM996
ParafilmBemisPM996
Penicillin/Streptomycin (PS)EMD Millipore516106Für DRG-Medien
pH-TeststreifenVWR InternationalBDH35309.606
Pipettenspitzen (1000 & Mikro; L)USA Scientific1111-2021
Preform 3.23.1 SoftwareFormslabZum Hochladen der STL-Datei
RatteCharles River Harz
3D-DruckerForm LabsForm3L 3D-Druck MC-Gerät
Kleine Schere mit scharfer NaseFine Science Tools14094-11Zum Sezieren
NatriumbicarbonatMilliporeSigmaS6014
Rongeur mit geradem TopfFine Science Tools16004-16Zum Sezieren
Federschere mit gerader KanteFine Science Tools15024-10Zum Sezieren
Chirurgische Schulterblattklinge (Nr. 10)Fisher Scientific22-079-690
Spritzenfilter, PES (0,22 & Mikro; m)Celltreat229747
Winzige FederschereWorld Precision Instruments14003Zum Trimmen und Schneiden DRG
UV-LampeAnalytik Jena USZur Photovernetzung von Hydrogel (15 - 18 mW/cm2)
Harzen von MC Low

Referenzen

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Ernte, Einbettung und Kultivierung von dorsalen Wurzelganglien in Geräten mit mehreren Kompartimenten zur Untersuchung peripherer neuronaler Merkmale
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