Herstellung von vernetzten Natriumalginat-Mikrosphären mit unterschiedlichen Metallionen unter Verwendung der mikrofluidischen Elektrospray-Technologie

Zusammenfassung

Das Protokoll beschreibt die Herstellung von Natriumalginat-Mikrosphären, die mit verschiedenen Metallionen vernetzt sind, unter Verwendung eines mikrofluidischen Geräts für das Wirkstoffträgerdesign. Untersucht wurden auch die antimikrobiellen Eigenschaften und die langsame Wirkstofffreisetzung dieser Mikrosphären.

Zusammenfassung

Mikrosphären sind mikrometergroße Partikel, die Medikamente durch physikalische Verkapselung oder Adsorption auf die Oberfläche und innerhalb von Polymeren laden und allmählich freisetzen können. Im Bereich der Biomedizin wurden Hydrogel-Mikrosphären aufgrund ihrer Fähigkeit, die Häufigkeit der Arzneimittelverabreichung zu reduzieren, Nebenwirkungen zu minimieren und die Compliance der Patienten zu verbessern, umfassend auf ihre Anwendung als Arzneimittelträger untersucht. Natriumalginat (ALG) ist ein natürlich vorkommendes lineares Polysaccharid mit drei glykosidischen Rückgratbindungen. In jeder der Einheiten des Polymers sind zwei Hilfshydroxylgruppen vorhanden, die die Eigenschaften einer Alkoholhydroxyleinheit aufweisen. Die synthetischen ALG-Einheiten können chemische Vernetzungsreaktionen mit Metallionen durchlaufen, wodurch eine vernetzte Netzwerkstruktur aus Polymerstapeln gebildet wird, die schließlich ein Hydrogel bildet. Hydrogel-Mikrosphären können mit einem einfachen Verfahren hergestellt werden, bei dem die ionischen Vernetzungseigenschaften von ALG genutzt werden. In dieser Studie haben wir ALG-basierte Hydrogel-Mikrosphären (ALGMS) unter Verwendung einer mikrofluidischen Elektroabscheidungsstrategie hergestellt. Die vorbereiteten Hydrogel-Mikrosphären waren gleichmäßig dimensioniert und gut dispergiert, was auf eine genaue Kontrolle des mikrofluidischen Elektrospray-Flusses zurückzuführen ist. ALGMS, die mit verschiedenen Metallionen vernetzt sind, wurden unter Verwendung einer mikrofluidischen Elektrospray-Technik hergestellt, die Mikrofluidik und hohes elektrisches Feld kombiniert, und ihre antimikrobiellen Eigenschaften, ihre langsame Wirkstofffreisetzungsfähigkeit und ihre Biokompatibilität untersucht. Diese Technologie ist vielversprechend für den Einsatz in der fortschrittlichen Arzneimittelentwicklung und -produktion.

Einleitung

Drug-Delivery-Systeme sind ein Forschungsschwerpunkt auf dem Gebiet des Bio-Tissue Engineering, der darauf abzielt, die Effizienz und Wirksamkeit der Arzneimittelverabreichung zu verbessern und Nebenwirkungen und Nebenwirkungen^{zu reduzieren 1}. Unter diesen Systemen sind Hydrogel-Mikrosphären, die sich durch gute Biokompatibilität, einstellbare mechanische Eigenschaften und funktionelle Plastizität auszeichnen, eines der am häufigsten verwendeten Vehikel für das Laden und Verabreichen von Medikamenten². Sie können sowohl für die langsame als auch für die kontrollierte Freisetzung von Arzneimitteln verwendet werden, bieten eine gute Schutzwirkung für Arzneimittel, vermeiden oder minimieren unspezifische Wirkungen von Arzneimitteln in anderen Geweben und zielen auf die Verabreichung von Arzneimitteln an bestimmte Gewebestrukturen^{ab 3}. Daher sind Hydrogel-Mikrosphären zu einem neuen und effizienten System zur Verabreichung von Medikamenten geworden, wobei die Forschung auf diesem Gebiet nach und nach entsteht⁴.

Hydrogel-Mikrosphären werden in der Regel aus biologisch abbaubaren Materialien synthetisiert, darunter Polysaccharide, Proteine und natürliche Polymere⁵. Unter ihnen ist ALG ein biokompatibles, biologisch abbaubares Polysaccharid, das aus marinen Braunalgen gewonnen^{wird 6}. Seine Molekülkette enthält freie Hydroxyl- und Carboxylgruppen, die mit den meisten zweiwertigen oder mehrwertigen Kationen vernetzen können, um eine wasserunlösliche Hydrogelstruktur mit einem dreidimensionalen Netzwerk^{zu bilden 5}. Die durch ALG gebildeten Hydrogel-Mikrosphären können in neutralen und alkalischen Lösungen in negativ geladene Polyelektrolyte umgewandelt werden. Diese Abstoßung zwischen negativen Ladungen führt dazu, dass die Mikrosphären aufquellen und der verkapselte Wirkstoff oder das Medikament freigesetzt werden kann. Diese Eigenschaften haben dazu geführt, dass ALG-Mikrosphären als vielversprechende Wirkstoffträger angesehen werden, die häufig für das Laden von Wirkstoffen und die kontrollierte Freisetzung eingesetzt werden⁷.

Für die Herstellung von Hydrogel-Mikrosphären existieren verschiedene Methoden. Zu den traditionellen ALGMS-Präparationsmethoden gehören in der Regel die Sol-Gel-Methode oder die Emulsion-Sol-Methode. Diese Verfahren umfassen Schritte wie Fällung, Mitfällung und Gelierungsreaktionen, um die Zielmikrosphären⁸ zu erhalten. In den letzten Jahren hat sich das mikrofluidische Elektrospray-Verfahren mit der kontinuierlichen Entwicklung der Mikrofluidik-Technologie allmählich zu einer effizienten und präzisen Methode zur Herstellung von Mikrosphären^{entwickelt 9}. Bei diesem Verfahren wird die mikrofluidische Technologie verwendet, um eine Polymerlösung durch eine mikrofeine Düse elektrozu sprühen, um mikrometergroße Tröpfchen und Mikrokugeln während des anschließenden Aushärtungs- oder Vernetzungsprozesses¹⁰ zu bilden. Im Vergleich zur herkömmlichen Methode bietet das mikrofluidische Elektrospray eine präzise Kontrolle der Partikelgröße und -morphologie der Mikrosphären durch Anpassung von Parametern wie Lösungsdurchflussrate, Spannung und feiner Düsengröße¹¹. Es ermöglicht auch die kontinuierliche Hochgeschwindigkeitsvorbereitung von Mikrosphären, verbessert die Präparationseffizienz und hält milde Reaktionsbedingungen aufrecht. Darüber hinaus können ALGMS so vorbereitet werden, dass sie verschiedene Funktionen besitzen, wie z. B. Medikamente mit kontrollierter Freisetzung und beladene Katalysatoren, was eine einfache Anwendung in verschiedenen Bereichen ermöglicht.

Im Folgenden stellen wir ein Protokoll für die Herstellung von ALG-Mikrosphären mit dem mikrofluidischen Elektrosprayverfahren vor. Bei diesem Verfahren wird eine ALG-Lösung durch ein mikrofluidisches Gerät geleitet und mit Elektrospray besprüht. Die resultierenden Tröpfchen wurden in der Lösung gesammelt, die verschiedene Metallionen (Ca²⁺, Cu²⁺, Zn²⁺ und Fe³⁺) enthielt, um die Vernetzungsreaktion zu initiieren. Diese Reaktion verbessert die Stabilität und Haftung der Mikrosphären und stattet sie mit unterschiedlichen Funktionalitäten aus. Diese Methode ist einfach durchzuführen, und die synthetisierten Mikrosphären weisen eine gute Größengleichmäßigkeit in ihrer Morphologie auf. Darüber hinaus untersuchten wir ihre antimikrobiellen Eigenschaften, ihre langsame Wirkstofffreisetzungsfähigkeit und ihre Biokompatibilität. Dieses Protokoll wird für die weitere Entwicklung und Produktion von Arzneimitteln nützlich sein.

Protokoll

Das in den Experimenten verwendete Blut wurde von weiblichen BALB/c-Mäusen mit Lichtschutzfaktor mit einem Gewicht von 20-25 g und einem Alter von etwa 7 Wochen gewonnen. Die Ethikkommission für Tierversuche des Zhejiang Shuren College genehmigte alle Tierpflege- und Versuchsverfahren.

1. Vorbereitung der Lösung

1. ALG wiegen und in Reinstwasser auflösen, indem man in einem Wasserbad bei 50 °C umrührt, um eine 2%ige ALG-Lösung zu erhalten.
2. Die Massenfraktion wird separat mit 5%igen Lösungen (oder molare Massenkonzentration beträgt 0,3 M) von CaCl₂, FeCl₃, ZnSO₄ und CuSO₄ in Reinstwasser hergestellt. Gießen Sie jede Lösung separat in eine Auffangschale.

2. Mikrofluidisches Elektrospray-Gerät

1. Nehmen Sie ein Glaskapillarrohr und legen Sie es über eine Lötlampenflamme, um es zu erweichen, und dehnen Sie es dann auf verschiedene Durchmesser (50 μm-500 μm). Schneiden Sie die feinen Teile mit einem Glasschneider ab und polieren Sie die Spitzenöffnung vorsichtig mit hochwertigem Siliziumkarbid-Schleifpapier. Verbinden Sie nach der Reinigung das dicke Ende des Kapillarschlauchs mit einem langen Schlauch und das andere Ende des Schlauchs mit einer Abgabenadel und einer 5-ml-Spritze (Ergänzende Abbildung 1).
   HINWEIS: Scharfe Kanten von Glasrohrschnitten lassen sich nur schwer in den Schlauch einführen. Daher sollte der Bruch an der Flammenkante abgerundet sein.
2. Befestigen Sie die Spritze an der mikrofluidischen Spritzenpumpe und den Kapillarschlauch an einem Ende an der Halterung. Verbinden Sie den roten Hochspannungs-Endclip des Hochspannungsnetzteils mit der Abgabenadel der Spritze und legen Sie den silbernen Clip in die Auffangflüssigkeit. Diese Konfiguration schafft eine einfache mikrofluidische Elektrospray-Vorrichtung (Abbildung 1A).
   HINWEIS: Platzieren Sie das Kapillarrohr senkrecht zum Tisch.

3. Vorbereitung der ALG-Mikrosphären

1. Stellen Sie die getrennten Auffangschalen mit unterschiedlichen Metallionen direkt unter das Kapillarröhrchen. Schalten Sie die mikrofluidische Spritzenpumpe ein und wählen Sie Schneller Vorlauf , um den Schlauch mit dem ALG zu entlüften, und stellen Sie dann die entsprechende Durchflussrate (2 ml/h) ein.
2. Schalten Sie den Hochspannungsschalter ein und drehen Sie den Drehknopf, um die entsprechende Spannung (5-7 kV) einzustellen.
3. Geben Sie 20 ml Lösung in jede der 90-mm-Petrischale, um ALG-Mikrosphären zu sammeln, die mit verschiedenen Metallionen vernetzt sind (Abbildung 1B).
4. ALG bildet unter Einwirkung des elektrischen Feldes und der Schwerkraft innerhalb weniger Sekunden Mikrosphären in verschiedenen ionensammelnden Lösungen. Aspirieren Sie die Mikrosphären mit einer sterilisierten Pipette und übertragen Sie sie in einzelne 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen, um Zn²⁺-, Ca2⁺-, Cu²⁺- und Fe³⁺ -ALG-Hydrogel-Mikrosphären zu erhalten (Abbildung 1C). Markieren Sie die Zn-ALGMS-, Ca-ALGMS-, Cu-ALGMS- und Fe-ALGMS-Rohre.
   HINWEIS: Mikrokugeln mit unterschiedlichen Durchmessern können durch Anpassen von Parametern wie Spannung, Spitzendurchmesser, Durchflussrate und Lösungskonzentration erhalten werden.
5. Nehmen Sie eine kleine Menge der vorbereiteten Mikrokügelchen, verteilen Sie sie so gleichmäßig wie möglich in PBS und legen Sie sie zur Visualisierung unter ein Mikroskop.
6. Wählen Sie 10 zufällig ausgewählte Beobachtungsfelder in derselben Charge von Mikrosphären aus, importieren Sie die zu messenden Bilder in die ImageJ-Software, konvertieren Sie die Bilder in den entsprechenden Graustufenmodus und verwenden Sie die Schwellenwertsegmentierungstechnologie, um den Bereich der Zielpartikel genau zu definieren und die Funktion zur Analyse der Partikel zu starten, damit ImageJ die Zielpartikel identifizieren und messen kann. Erhalten Sie Daten über die Mikrosphären und importieren Sie die Daten dann in die Origin-Software zur Analyse und Partikelgrößenkartierung.

4. Test der antimikrobiellen Wirksamkeit

1. Bereiten Sie 5 ml-Suspensionen von Staphylococcus aureus (S. aureus) und Escherichia coli (E. coli) mit einer anfänglichen bakteriellen Trübung von 0,2 mcF unter Verwendung eines flüssigen Luria-Bertani (LB)-Mediums vor.
2. Geben Sie 10 ml jeder Bakterienlösung in 4 einzelne sterile 15-ml-Zentrifugenröhrchen. Geben Sie dann 0,5 mL Zn-ALGMS, Ca-ALGMS, Cu-ALGMS und Fe-ALGMS ALG in jedes Röhrchen und legen Sie sie 12 h lang bei 37 °C und 200 U/min in einen Schüttler mit konstanter Temperatur. Geben Sie die gleiche Menge Kochsalzlösung in die Kontrollgruppe.
3. Verdünnen Sie jede Bakterienlösung auf 10 bis⁵ Mal mit sterilem Wasser. Verwenden Sie eine sterile Glaskugel, um 200 μl Bakterienlösung auf einem festen LB-Medium zu verteilen.
4. Verteilen Sie die Lösung schnell und gleichmäßig auf der Beschichtungsplatte, vermeiden Sie dabei ein Hin und Her in der gleichen Fläche. Legen Sie dann die Platten für 12 h bei 37 °C in einen Inkubator. Beobachte die Kolonien verschiedener Gruppen.
   HINWEIS: Alle aseptischen Eingriffe sollten in der Nähe einer Alkohollampe durchgeführt werden. Sterilisieren Sie mikrobielle Kulturgefäße, Impfutensilien und Nährmedien.

5. Testen der Wirkstofffreisetzung

1. Um die Wirkstofffreisetzungsfähigkeit verschiedener Mikrosphären zu bewerten, verwenden Sie Rinderserumalbumin (BSA) als beladenes Modellmedikament. Geben Sie 500 μl jeder Mikrosphäre (Ca-ALGMS, Cu-ALGMS, Zn-ALGMS und Fe-ALGMS) für 24 h in 1 mg/ml BSA-Suspension.
2. Für den Wirkstofffreisetzungsassay wird jede gesättigte Probe in 5,0 M phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS; pH 7,4) gegeben, gefolgt von einem 15-minütigen Rühren bei 37 °C und kontinuierlichem Schütteln bei 80 U/min.
3. Verwenden Sie 100 μl der Lösung und ersetzen Sie das Medium nach 1, 3, 6, 12, 24, 36 und 48 Uhr durch ein frisches.
4. Quantifizieren Sie die überstehenden Proteinkonzentrationen zu bestimmten Zeiten mit einem BCA-Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers. Messen Sie das freigesetzte Arzneimittel quantitativ mit Hilfe eines Enzymmarkers, um die entsprechende Absorption zu erhalten, und rechnen Sie den gemessenen Wert gemäß der Standardkurve in die tatsächliche Arzneimittelkonzentration um. Berechnen Sie die Freisetzungsrate des Arzneimittels mit der folgenden Formel:
   Prozentsatz der Wirkstofffreisetzung = (Konzentration des zu einem bestimmten Zeitpunkt freigesetzten Arzneimittels / anfängliche Arzneimittelkonzentration) x 100 %
5. Entfernen Sie in regelmäßigen Abständen das gleiche Volumen PBS aus jeder Vertiefung und ersetzen Sie es durch ein gleiches Volumen frisches Medium.

6. Hämolyse-Test

1. Die vorbereiteten Ca-ALGMS, Cu-ALGMS, Zn-ALGMS und Fe-ALGMS werden in PBS eingelegt und 24 Stunden lang bei 37 °C inkubiert, um die Inkubationslösung zu formulieren.
2. Gewinnung von Vollblut von gesunden BALB/c-Mäusen durch okuläre Phlebotomie, gesammelt in antikoagulierten Röhrchen, die Natriumcitrat enthalten. Vortex und zentrifugieren bei 1509 x g für 15 min, um rote Blutkörperchen zu erhalten.
3. Spülen Sie die roten Blutkörperchen 2x-3x mit PBS und bereiten Sie eine 10%ige Lösung für rote Blutkörperchen mit PBS vor.
4. Herstellung verschiedener ALGMS: Nehmen Sie 500 μl jeder Mikrosphäre für die Versuchsgruppe, 1 ml Reinstwasser (ddH₂O) für die Positivkontrollgruppe und 1 ml PBS-Lösung für die Negativkontrollgruppe und mischen Sie jeweils mit 20 μL Blutzelllösung.
5. Inkubieren Sie die Proben bei 37 °C für 4 h, zentrifugieren Sie sie bei 1509 x g, 15 min. Halten Sie den Überstand beiseite und fotografieren Sie die roten Blutkörperchen in jeder Gruppe nach der Hämolyse.
6. Nehmen Sie die Hämolyserate der positiven Kontrollgruppe mit 100 % und der negativen Kontrollgruppe mit 0 % an. Messen Sie die Absorptionswerte der Überstände in jeder Gruppe und berechnen Sie die Hämolyserate nach folgender Formel:
   Hämolyse (%) = (Absorptionswerte der Überstände jeder Gruppe-
   Absorptionswerte von destilliertem Wasser allein) / (Absorptionswerte der positiven Kontrollgruppe - Absorptionswerte von destilliertem Wasser allein) x 100

7. Test der Zytobiokompatibilität

1. Waschen Sie die verschiedenen ALGMS 2x mit PBS und legen Sie sie für 15 min in eine 5 mL Petrischale und entsorgen Sie den Überstand.
2. Separat werden verschiedene ALGMS mit 0,2 ml in einem vollständigen Kulturmedium (DMEM) mit 10 % FBS zugegeben, 24 Stunden lang bei 37 °C inkubiert und die Lösung filtriert, um das Sickerwasser zu erhalten.
3. Kultivieren Sie NIH3T3-Zellen mit einer Zelldichte von etwa 70 % in 24-Well-Platten, behandeln Sie die NIH3T3-Zellen mit Mikrosphären-Laugungslösung und kultivieren Sie weitere 24 Stunden lang mit vollständigem Medium.
4. Entfernen Sie das Zellkulturmedium und waschen Sie die Zellen mit PBS.
5. Beurteilen Sie die Lebensfähigkeit der Zellen mit dem Calcein-AM/PI-Assay. Nehmen Sie 2,5 μl Calcein-AM-Lösung (4 mM) und 12,5 μl PI-Lösung (2 mM) und fügen Sie sie zu 5 mL 1x PBS hinzu und mischen Sie gut, um eine Arbeitslösung mit 2 μM Calcein-AM und 5 μM PI zu erhalten.
6. Die Arbeitslösung auf zuvor ausgesäte Zellkulturplatten mit 500 μl pro Vertiefung geben, 15 Minuten lang bei 37 °C unter Lichtschutz inkubieren und unter einem inversen Fluoreszenzmikroskop beobachten und fotografieren. Richten Sie drei Replikate für jede Gruppe ein.
7. Berechnen Sie die Zellviabilität nach der folgenden Formel:
   Lebensfähigkeit der Zellen (%) = Anzahl lebensfähiger Zellen / (Anzahl lebensfähiger Zellen + Anzahl toter Zellen)

Ergebnisse

Charakterisierung von ALGMS, die mit verschiedenen Metallionen vernetzt sind
Die optische Morphologie von Ca-ALGMS, Cu-ALGMS, Zn-ALGMS und Fe-ALGMS ist in Abbildung 2 dargestellt und weist eine gute Sphärizität, eine glatte Oberfläche, eine gleichmäßige Partikelgrößenverteilung (Ergänzende Abbildung 2) und eine ausgezeichnete Monodispersität auf. Darüber hinaus führten wir eine mikroskopische Charakterisierung mit Hilfe der Rasterelektronenmikroskopie (REM) und der energiedispersiven Spektroskopie (EDS) durch. Wie in Abbildung 3 gezeigt, waren die Mikrosphären im Allgemeinen kugelförmig mit gut definierter Rundheit. Die Oberfläche von Zn-ALGMS war ungleichmäßig verteilt und erschien rauer mit vielen Falten. Wir führten eine energiedispersive Spektroskopie durch, um die Inhaltsverteilung der Metallionen zu bestimmen, die an der Vernetzungsreaktion im Gel beteiligt sind. Insbesondere kann die Mikrosphärengröße durch Ändern von Parametern wie dem Sammelabstand, der Gelkonzentration und der elektrischen Feldspannung¹² angepasst werden. In dem skizzierten Protokoll können durch Anpassen der Parameter des mikrofluidischen Geräts und der Flüssigkeitskonzentration Partikel unterschiedlicher Größe entsprechend den spezifischen Anforderungen leicht erhalten werden.

Bewertung der antimikrobiellen Eigenschaften
Wir haben die antimikrobielle Kapazität verschiedener Mikrosphären mit der Plattenmethode bewertet, wie in Abbildung 4 gezeigt. Verschiedene Mikrosphären zeigten eine antibakterielle Aktivität gegen E. coli und S. aureus, wobei Cu-ALGMS und Zn-ALGMS die stärksten antibakteriellen Eigenschaften zeigten. Diese erhöhte Wirksamkeit ist auf die antimikrobielle Aktivität der Metalle, namentlich Kupfer (Cu) und Zink (Zn)¹³, zurückzuführen. Sukhodub et al. zeigten, dass Fe³⁺, Zn²⁺, Ca²⁺ und Cu²⁺ synergistische antibakterielle Wirkungen mit Chitosan zeigten, während die Proben ohne Chitosan keine solche Aktivität zeigten, was die synergistische antibakterielle Wirkung der gebildeten Komplexe bestätigt¹⁴. Die erzielten Ergebnisse stimmen mit dieser Studie überein, wobei Cu-ALGMS und Zn-ALGMS anderen Hydrogel-Mikrosphären bei der Behandlung von bakteriellen Infektionskrankheiten überlegen sind.

Bewertung der Wirkstofffreisetzungseigenschaften
Die Evaluierung der Wirkstofffreisetzung aus verschiedenen metallbasierten Alginat-Hydrogel-Mikrosphären unter Verwendung von BSA als Modellwirkstoff ergab Unterschiede in ihren Freisetzungsprofilen. (Ergänzende Abbildung 3). Ionen zeigten eine bessere langsame Wirkstofffreisetzungsfähigkeit als die anderer Materialien. Die Wirkstofffreisetzungsrate von Fe²⁺ war relativ schneller als die der anderen drei Ionen, während die Wirkstofffreisetzungsrate von Ca2⁺ und Zn²⁺ relativ langsamer war. Diese Ergebnisse unterstreichen die Unterschiede in der Wirkung verschiedener Ionen auf die Wirkstofffreisetzung. Wir vermuten, dass Fe²⁺ möglicherweise mit dem Wirkstoff interagiert oder auf eine Weise bindet, die die Freisetzung erleichtert, während Ca²⁺ und Zn²⁺ stärker an den Wirkstoff binden, oder dass es andere Faktoren gibt, die die Freisetzungsrate begrenzen. Diese anhaltende Wirkstofffreisetzung aus den Hydrogel-Mikrosphären kann mit der Vernetzungsstärke zwischen dem Metall und dem Alginatpolysaccharid zusammenhängen. Darüber hinaus trug der Unterschied in der Adsorptionskapazität verschiedener Metalle im Vergleich zu BSA wahrscheinlich zu den beobachteten Unterschieden in der Retardierungsfähigkeit von Arzneimitteln bei.

Bewertung der Biokompatibilität
Eine gute Biokompatibilität ist eine Voraussetzung für Drug Delivery Carrier in der klinischen Anwendung. Daher haben wir die Hämokompatibilität von Mikrosphären mit Hilfe eines in vitro Hämolysetests untersucht. Wir verwendeten reines Wasser als Positivkontrolle und PBS-Lösung als Negativkontrolle. Die experimentellen Ergebnisse sind in der ergänzenden Abbildung 4 dargestellt und zeigen, dass die roten Blutkörperchen in der Suspension bei Kontakt mit verschiedenen Mikrosphären intakt blieben, was auf eine minimale Hämolyse durch die Mikrosphären hinweist. Die Ergebnisse der Zytobiokompatibilität zeigten, dass die Mikrosphären die zelluläre Aktivität nicht beeinflussten (Ergänzende Abbildung 5). Diese Ergebnisse deuteten darauf hin, dass die Mikrosphären eine gute Verträglichkeit mit den Blutzellen aufweisen.

Abbildung 1: Vorbereitung von Alginat-Hydrogel-Mikrosphären. (A) Installation der mikrofluidischen Elektrospray-Technologie. (B) Das Echtzeitbild des mikrofluidischen Elektrospray-Prozesses. (C) Die hergestellten Ca2⁺-, Cu2⁺-,^Z-n2+- und Fe3⁺ -Alginat-Hydrogel-Mikrosphären. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Mikroskopische Aufnahme von Alginat-Hydrogel-Mikrosphären. Mikroskopische Aufnahme von (A) Ca-ALGMS, (B) Cu-ALGMS, (C) Zn-ALGMS und (D) Fe-ALGMS in PBS (pH 7,4). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Rasterelektronenmikroskopie und energiedispersive Spektroskopie. Die Bilder zeigen die Charakterisierung von (A) Ca-ALGMS, (B) Cu-ALGMS, (C) Zn-ALGMS und (D) Fe-ALGMS mit i und ii für Rastermikroskopiedaten und iii-v für Spektroskopiedaten. Die Bilder iii-v zeigen ein EDS-Mapping, bei dem das EDS eine Fläche auf der Probenoberfläche auswählt, um Informationen über die Elementverteilung über den gesamten Bereich zu erhalten. Der Map-Sweep-Modus wird in Anwendungen für die Zusammensetzungsanalyse, die Phasenzonenanalyse und die Partikelgrößenverteilung von Materialien verwendet, bei denen jedes Element durch eine andere Farbe dargestellt wird, wie gezeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4. Antimikrobielle Eigenschaften von Mikrosphären. (A) Die antimikrobiellen Eigenschaften der Gruppen wurden mit der Bakterienabstrichmethode getestet. (B, C) Quantifizierung der Ergebnisse der bakteriellen Abstrichzahl für jede Gruppe. Die Kontrollproben zeigen Kolonien, die ohne Zugabe auf LB-Medium gezüchtet wurden. Die relativen Kolonien für die anderen Bakterien wurden berechnet, indem die Klonzahl der Kontrollgruppe als 100 % angenommen und als Ausgangsbasis verwendet wurde. Der Fehlerbalken: Standardabweichung, n = 3. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Ergänzende Abbildung 1: Ein Glasschlauch ist über einen langen Gummischlauch mit der Spritze verbunden. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 2: Partikelgröße. (A) Zn-ALGMS, (B) Ca-ALGMS, (C) Cu-ALGMS, (D) Fe-ALGMS. Für alle Proben wurde eine molare Konzentration von 5 % verwendet. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 3: Freisetzung von Medikamenten. Die Wirkstofffreisetzungskurve von Ca-ALGMS, Cu-ALGMS, Zn-ALGMS und Fe-ALGMS in PBS (pH 7,4). Der Fehlerbalken: Standardabweichung, n = 3 Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 4: Hämolyse-Assay von Ca-ALGMS, Cu-ALGMS, Zn-ALGMS und Fe-ALGMS. PC (Positivkontrolle): ddH₂O; NC (Negative Steuerung): PBS. Der Fehlerbalken: Standardabweichung, n = 3. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 5: Zytotoxizität von Mikrosphären, die mit verschiedenen Ionen vernetzt sind. Die Biokompatibilitätsbewertung von Zn-ALGMS, Ca-ALGMS, Cu-ALGMS und Fe-ALGMS wurde durchgeführt. Für die Durchführung des Tests wurde Calcein-AM/PI verwendet, und für die Ergebnisse wurden hier 5 Sichtfelder nach dem Zufallsprinzip ausgewählt. ImageJ wurde verwendet, um das Verhältnis von roten Blutkörperchen zu toten Zellen zu analysieren, um eine relative Zellviabilität zu erhalten. 1.PC, Positivkontrolle, 2.NC, Negativkontrolle, 3. Zn-ALGMS, 4. Ca-ALGMS, 5. Cu-ALGMS, 6. Fe-ALGMS, Der Fehlerbalken: Standardabweichung, n = 3. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Diskussion

In diesem Protokoll stellen wir eine Methode zur Herstellung von ALGMS vor, die auf der mikrofluidischen Elektrospray-Technologie basiert. Das Verfahren ist einfach zu bedienen und liefert eine große Anzahl von Mikrokugeln mit gleichmäßiger Rundheit und kontrollierbarem Durchmesser. Dieser Ansatz bietet Forschern Komfort und kann die Erforschung und Anwendung von Hydrogel-Mikrosphären fördern. Darüber hinaus wurde durch die Vernetzung mit verschiedenen Metallionen die Stabilität und Bioaktivität des ALGMS verbessert. In den antimikrobiellen Experimenten zeigten Cu-ALGMS und Zn-ALGMS signifikante bakterielle Hemmwirkungen.

Hydrogel-Mikrosphären sind flexible Mikrostrukturen mit ausgezeichneter Plastizität, die eine effektive Wirkstoffabgabe durch spezifische Materialauswahl und Strukturdesign ermöglichen. Alginat, ein natürliches Polysaccharid, das unter milden Bedingungen geliert, ist biokompatibel, biologisch abbaubar und ungiftig. Natriumalginat-Mikrosphären im Mikrometermaßstab werden häufig in der Biochemie und Biomedizin eingesetzt, einschließlich der pharmazeutischen Forschung, der Arzneimittelverabreichung und des Tissue Engineering. Ein wesentlicher Vorteil von Natriumalginat-Mikrosphären bei der Verabreichung von Arzneimitteln ist ihre Fähigkeit zur nachhaltigen Wirkstofffreisetzung, die die Aufrechterhaltung hoher Konzentrationen des pharmazeutischen Wirkstoffs über einen längeren Zeitraum gewährleistet¹⁴. Unsere Experimente zur nachhaltigen Wirkstofffreisetzung haben gezeigt, dass ALGMS mit unterschiedlicher ionischer Vernetzung die Wirkstofffreisetzung aufrechterhalten können und für Anwendungen zur Wirkstoffverabreichung verwendet werden können.

Zu den gängigen Herstellungsmethoden für Hydrogel-Mikrosphären gehören die Chargenemulgierung, die mechanische Zerkleinerung, die Lithographie, die mikrofluidische Emulsion und das Elektrospray ^8,15. Die Vorteile der Chargenemulgierung und der mechanischen Zerkleinerungsmethoden liegen in der Einfachheit des Herstellungsverfahrens und der hohen Leistungseffizienz. Allerdings ist es schwierig, die Form einzelner Hydrogel-Mikrokügelchen mit diesen Methoden zu kontrollieren. Bei der Photolithographie wird Licht auf eine Maskenplatte oder Form fokussiert, um die Vernetzung auszuhärten und Hydrogel-Mikrosphären zu bilden. Die Produktionseffizienz dieser Methode wird jedoch leicht durch die Maskenplatte, die Lichtquelle und die Form beeinträchtigt. Darüber hinaus kann das mikrofluidische Emulsionsverfahren den Formprozess von Hydrogel-Mikrosphären besser steuern und Hydrogel-Mikrosphären mit bestimmten Formen herstellen. Die Produktionseffizienz ist jedoch gering¹⁶. Im Vergleich zu diesen Verfahren können mit dem mikrofluidischen Elektrospray-Verfahren Hydrogel-Mikrosphären mit einheitlicher Größe, regelmäßiger Form und einstellbarer Partikelgröße^{hergestellt werden 17}. Der wichtigste Schritt in diesem Protokoll ist die Vorbereitung der Mikrosphären. Die Größe und Form der Mikrokugeln kann in Abhängigkeit von der Ebenheit des Glasrohrs, dem Spannungswert und der Durchflussrate¹⁸ variieren. Es gibt auch einige Einschränkungen bei der Verwendung der mikrofluidischen Elektrospray-Technologie zur Herstellung von Mikrosphären, wie z. B. die Verstopfungsneigung von Mikrokanälen und die begrenzte Ausbeute, die begrenzte Kompatibilität der Materialien und die Schwierigkeit des Prozess-Scale-ups sowie die Schwierigkeit der Prozesssteuerung und -überwachung. Dies schränkt ihre breite Anwendung in gewissem Maße ein¹⁹.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die mikrofluidische Elektrospray-Technologie eine ausgereifte Methode zur Herstellung von Mikrosphären ist, die den Vorteil einer einstufigen Synthese bietet. Durch die Optimierung der Größenparameter des Strömungskanals und die Steuerung der Materialkonzentration und des Durchflusses können Mikrosphären in verschiedenen Morphologien und Größen leicht gewonnen werden. Bemerkenswert ist, dass das Verfahren nur mit der wässrigen Phase und ohne zusätzliche Tenside auskommt, was es umweltfreundlich und einfach zu bedienen macht, wodurch aufwendige Waschprozesse vermieden werden. Diese Methode bietet eine Strategie zur Herstellung von Mikrosphären aus Hydrogelmaterialien, ähnlich dem Alginat-Gelierungsprozess.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
120 Mesh Bildschirm	Solarbio, China	YA0946
Alkoholbrenner	Solarbio, China	YA2320
BALB/c Mäuse	Wukong Biotechnologie, China
Bicinchoninsäure Assay Reagenz	Meilunbio, China	MA0082
Rinderserum Albumin	Lablead, China	9048-46-8
CaCl2& nbsp; Pulver	Aladdin, China	10043-52-4
Calcein-AM / PI	Biosharp, China	BL130A
Zentrifugenröhrchen	Corning, Amerika	430290
CuSO4 & nbsp; Pulver	Jnxinyuehuagong, China	7758-99-8
DMEM	Gibicol, China	C11995500BT
FeCl3 & nbsp; Pulver	Aladdin, China	7705-08-0
Fötales Rinderserum	HAKATA, China	HN-FBS Glasröhren
	Sartorius, Deutschland	CC0028
Lichtmikroskopie	EvidentScientific, Japan	BX53 (LED)
Mikrofluidische Spritzenpumpe	Längerpumpe, England	LSP01-3A
NIH3T3	HyGyte, China	TCM-C752
Petrischale	Thermofisher, America	150464
Phosphatpuffer Kochsalzlösung	Thermofisher, America	3002
Rasterelektronenmikroskop	Thermofisher, America	Axia ChemiSEM
Natriumalginatpulver	Bjbalb, China	Y13095
ZnSO4 Pulver	Jnxinyuehuagong, China	7733-02-0