Generierung und Analyse von High-Parameter-Histologiebildern mit Histoflow-Zytometrie

Zusammenfassung

Hier wird ein Verfahren beschrieben, mit dem fünf oder mehr Fluoreszenzparameter mittels Immunfluoreszenzmikroskopie abgebildet werden können. Es wird eine Analysepipeline für die Extraktion einzelner Zellen aus diesen Bildern und die Durchführung von Einzelzellanalysen durch durchflusszytometrie-ähnliche Gating-Strategien skizziert, mit der Zelluntergruppen in Gewebeschnitten identifiziert werden können.

Zusammenfassung

Die Verwendung der Histologie zur Untersuchung der Immunzelldiversität in Gewebeschnitten, wie sie aus dem Zentralnervensystem (ZNS) stammen, ist durch die Anzahl der Fluoreszenzparameter, die gleichzeitig abgebildet werden können, entscheidend begrenzt. Die meisten Untergruppen von Immunzellen wurden mittels Durchflusszytometrie unter Verwendung komplexer Kombinationen von Proteinmarkern definiert, die oft vier oder mehr Parameter zur endgültigen Identifizierung erfordern, was über die Möglichkeiten der meisten herkömmlichen Mikroskope hinausgeht. Da die Durchflusszytometrie Gewebe dissoziiert und räumliche Informationen verliert, besteht ein Bedarf an Techniken, die räumliche Informationen speichern und gleichzeitig die Rollen komplexer Zelltypen hinterfragen können. Diese Probleme werden hier angegangen, indem eine Methode zur Erweiterung der Anzahl der Fluoreszenzparameter entwickelt wird, die abgebildet werden können, indem die Signale von spektral überlappenden Fluorophoren gesammelt und die Signale jedes einzelnen Fluorophors durch spektrale Entmischung getrennt werden. Diese Bilder werden dann mit einer Analysepipeline verarbeitet, um histologische Bilder mit hohen Parametern aufzunehmen und einzelne Zellen aus diesen Bildern zu extrahieren, so dass die einzigartigen Fluoreszenzeigenschaften jeder Zelle auf Einzelzellebene analysiert werden können. Mit Hilfe von Durchflusszytometrie-ähnlichen Gating-Strategien können Zellen dann in Untergruppen profiliert und auf die Histologieschnitte zurückgeführt werden, um nicht nur ihre Häufigkeit zu quantifizieren, sondern auch festzustellen, wie sie mit der Gewebeumgebung interagieren. Insgesamt wird die Einfachheit und das Potenzial der Verwendung der Histoflow-Zytometrie zur Untersuchung komplexer Immunpopulationen in histologischen Abschnitten demonstriert.

Einleitung

Entzündungen, die von Zellen des Immunsystems und Gliazellen ausgelöst werden, können zu chronischen Erkrankungen des ZNS beitragen, bei denen jede Population die Aktivität der anderen fördern kann ^1,2,3. Zu verstehen, wie das Immunsystem mit diesen Elementen des ZNS interagiert, um eine ZNS-Entzündung zu fördern, ist derzeit ein wichtiges Thema von Interesse und wurde durch hochparametrische Techniken wie die Einzelzell-RNA-Sequenzierung erheblich erleichtert. Durch Einzelzell-RNA-Sequenzierung haben wir entdeckt, dass bei mehreren ZNS-Erkrankungen eine umfangreiche Kommunikation zwischen Gliazellen und dem Immunsystem stattfindet ^4,5,6. Zu verstehen, wie sich diese Wechselwirkungen auf diese Erkrankungen auswirken, wird entscheidend sein, um die Biologie dieser Krankheiten aufzuklären.

Ein Problem bei Einzelzellsequenzierungsanalysen besteht darin, dass bei diesen Techniken das Gewebe aufgebrochen werden muss, um einzelne Zellen oder Zellkerne zu erhalten, was zu einem vollständigen Verlust der räumlichen Information führt. Zu wissen, wo sich eine Zelle in einem Gewebe befindet, ist entscheidend, um die Rolle der Zelle bei der Entstehung von Entzündungen zu verstehen. Zum Beispiel können sich Immunzellen wie B-Zellen während einer Neuroinflammation im ZNS konzentrieren; sie dringen jedoch selten in das ZNS-Parenchym ein und konzentrieren sich stattdessen in den ZNS-Schranken⁷. Angesichts ihrer Lokalisation ist es unwahrscheinlich, dass diese Zellen zur ZNS-Entzündung beitragen, indem sie physisch mit Gliazellen im ZNS-Parenchym interagieren, was darauf hindeutet, dass Wechselwirkungen, die sie mit Gliazellen haben könnten, durch sezernierte Faktoren erfolgen würden. Darüber hinaus weist die bei ZNS-Erkrankungen auftretende Pathologie häufig eine Struktur ^8,9 auf, so dass die Lokalisation einer Zelle im Gewebe entscheidend bestimmen könnte, ob sie aktiv zu der Störung beiträgt oder ein Zuschauer ist. Daher ist die Verwendung der räumlichen Orientierung zur Bewertung der Rolle einer Zelle in der Pathologie unerlässlich.

Die Untersuchung von Zellen im Gewebe wurde in der Regel mit Hilfe der Immunhistochemie oder der Immunfluoreszenzmikroskopie durchgeführt. Ein Problem bei diesen Techniken besteht darin, dass sie in der Regel nur bis zu vier Parameter gleichzeitig abbilden können. Dies ist eine große Einschränkung dieser Techniken, da wir aus der Durchflusszytometrie und Einzelzell-RNA-Sequenzierungsanalysen wissen, dass viele Zellpopulationen zwei oder mehr Parameter für ihre Identifizierung benötigen; Außerdem erhöht sich die Anzahl der erforderlichen Parameter in der Regel, wenn nach bestimmten Teilmengen einer Zelle vom Typ¹⁰ gesucht wird. Daher ist es unpraktisch, Standard-Bildgebungsverfahren zu verwenden, um zu untersuchen, wie Untergruppen von Zellen innerhalb eines Gewebes interagieren können.

Dieses Problem wurde teilweise durch neuere Methoden mit hohen Parametern überwunden, die räumliche Informationen speichern können, wie z. B. die räumliche RNA-Sequenzierung¹¹ und die bildgebende Massenzytometrie¹². Diese Techniken sind zwar wertvoll, haben aber mehrere Probleme, wie z. B. dass sie nicht überall verfügbar sind, dreidimensionale Daten in zwei Dimensionen reduzieren und viel Fachwissen für die Ausführung erfordern. Eine andere Technik, die als sequentielle Färbung bekannt ist, bei der Gewebe mit einem Satz Antikörper gefärbt werden, gefolgt von einer Inaktivierung des vorherigen Antikörpersatzes, bevor sie mit einem anderen Satz von Antikörpern gefärbt werden, kann eine Histologie mit hohen Parametern erreichen, ohne dass spezielle Geräte oder Fachwissen erforderlich sind 13,14,15. Die sequentielle Färbung kann jedoch äußerst arbeitsintensiv sein und erfordert eine große Menge an Mikroskopiezeit, was für Labore, die kein persönliches Mikroskop besitzen, unpraktisch sein kann. Daher besteht ein Bedarf an Techniken, die die Anzahl der Fluoreszenzparameter erweitern können, die gleichzeitig auf Mikroskopen abgebildet werden können, die weit verbreitet und zeitnah abgebildet werden können.

Sobald die Daten mit hohen Parametern erfasst wurden, stellt sich ein weiteres Problem: Es ist unwahrscheinlich, dass herkömmliche Bildanalysemethoden die Daten erfolgreich analysieren können. Techniken wie manuelles Zählen oder Schwellenwerte sind nur dann praktikabel, wenn die Analyse aus einem einzigen Parameter besteht oder wenn mehrere Marker die gleiche Lokalisation haben, bei der nur überlappende Signale gezählt werden. Diese Einschränkung macht die herkömmliche Analyse für die Arbeit mit Datasets mit hohen Parametern ungeeignet. Eine erfolgreiche Analyse dieser Datensätze wurde durch die Segmentierung einzelner Zellen aus histologischen Bildern und die anschließende Durchführung durchflusszytometrischer Gating-ähnlicher Gating-Strategien zur Identifizierung von Zelltypen erreicht^16,17. Ein weiteres Problem, das diese Analysen betrifft, besteht jedoch darin, dass sie nur für Datensätze funktionieren, bei denen alle interessierenden Zellen physisch voneinander getrennt sind, da diese Techniken keine Methoden verwenden, die Zellen, die in physischem Kontakt stehen, genau trennen können. Daher ist eine neuere Methode erforderlich, die Einzelzellanalysen in histologischen Schnitten auch dann durchführen kann, wenn die Zellen in physischem Kontakt stehen.

In diesem Artikel wird ein einfaches Protokoll namens Histoflow-Zytometrie beschrieben, das zuvor eingeführt wurde¹⁸ und das die Anzahl der Fluoreszenzparameter erweitert, die gleichzeitig mit weit verbreiteten Mikroskopen abgebildet werden können. Bei diesem Protokoll werden Gewebe mit spektral überlappenden Farbstoffen gefärbt und dann mit spektraler Kompensation Durchscheinen aus überlappenden Kanälen entfernt, um klare Einzelfärbungen zu erhalten. Um die Analyse von hochparametrischen Histologiebildern zu erleichtern, wird eine detaillierte Analysepipeline beschrieben, die einzelne Zellen aus Gewebeschnitten extrahiert, um Zellen mit Hilfe von Durchflusszytometrie-ähnlichen Gating-Strategien in unterschiedliche Populationen zu sortieren. Dieses Protokoll funktioniert in Geweben, in denen Zellen diffus vorhanden sind, und in Geweben, in denen Zellen eng miteinander verdichtet sind, was diese Technik vielseitig für die Untersuchung von Geweben wie dem ZNS sowohl in der Homöostase als auch in der Neuroinflammation macht. Die Histoflow-Zytometrie ist daher eine nützliche Technik zur Untersuchung von Wechselwirkungen zwischen komplexen Zelltypen, die mehrere Zellmarker benötigen, um Zellen zu definieren und gleichzeitig räumliche Informationen zu erhalten.

Protokoll

Dieses Protokoll gilt nicht für das Schneiden von Geweben für die Histologie; Bitte lesen Sie Jain et ^al.18 oder¹⁹ für Beschreibungen, wie Gewebe für die Histologie geschnitten werden. Dieses Protokoll kann mit allen geschnittenen Geweben auf Objektträgern verwendet werden. In diesem Artikel werden leistenale Lymphknoten verwendet, die von einem immunisierten Tier isoliert wurden, wie zuvor beschrieben¹⁸. Das Verfahren und der Zeitplan für dieses Protokoll sind in Abbildung 1 zusammengefasst. Die Einzelheiten zu den Reagenzien und der Ausrüstung, die in dieser Studie verwendet wurden, sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Färben von Gewebeschnitten

ANMERKUNG: Zusätzlich zum Färben von Geweben mit allen Antikörpermarkierungen, an denen der Forscher interessiert ist, sollte der Forscher auch Einzelfarbkontrollen (eine für jeden Fluoreszenzparameter, der verwendet werden soll) auf benachbarten oder anderweitig identischen Gewebeobjektträgern vorbereiten, wobei jede einzelne Farbkontrolle mit den Reagenzien gefärbt wird, die erforderlich sind, um das Signal eines Fluoreszenzparameters zu erzeugen.

1. Perm und Blockierungspuffer sowie Perm und Färbepuffer vorbereiten (Zusammensetzung siehe Tabelle 1 ).
2. Tauen Sie Gewebeschnitte auf Objektträgern bei Raumtemperatur auf und wischen Sie das Kondenswasser mit einem Tuch ab. Verwenden Sie einen hydrophoben Marker, um den Rand des Gewebes zu umreißen, das gefärbt werden muss, und lassen Sie die Markierungen trocknen.
3. Rehydrieren Sie das Gewebe, indem Sie die Gewebeabschnitte 1 Minute lang in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) einweichen. Schütteln Sie das PBS ab und verwenden Sie ein Tuch, um überschüssiges PBS zu entfernen, ohne das Taschentuch direkt zu berühren.
4. Fixieren Sie das Gewebe, indem Sie genügend 4% Paraformaldehyd (PFA) hinzufügen, um das Gewebe vollständig zu bedecken. 20 min bei Raumtemperatur inkubieren.
   ACHTUNG: PFA kann giftig sein und sollte in einem Abzug gehandhabt werden.
   HINWEIS: Dieser Schritt ist nur für frisches gefrorenes Gewebe erforderlich. Wenn das Gewebe bereits fixiert ist, ignorieren Sie diesen Schritt. Die PFA-Fixierung wird hier beschrieben, aber das Gewebe kann je nach den Anforderungen des Experiments mit anderen Methoden fixiert werden.
5. Waschen Sie die Taschentücher 1 Minute lang in einem PBS-Bad unter leichtem Schaukeln und nehmen Sie dann den Objektträger aus der Badewanne. Tauschen Sie das PBS aus und wiederholen Sie die Wäsche noch 3 Mal.
6. Schütteln Sie überschüssiges PBS ab und verwenden Sie ein Tuch, um überschüssiges PBS zu entfernen, ohne das Taschentuch direkt zu berühren.
7. Bestimmen Sie, welche Sekundärantikörper in Schritt 1.12 des Protokolls verwendet werden müssen und von welcher Tierart die Sekundärantikörper gewonnen werden. Reichern Sie den Perm und den Blockierungspuffer an, indem Sie dem Perm Serum von diesen Tieren zusetzen und den Blockierungspuffer auf eine Endkonzentration von 5 % für jede Spezies bringen.
   HINWEIS: Die Verwendung von Sekundärantikörpern hilft, die Signalintensität zu verstärken. Daher wird empfohlen, dass Primärantikörper, die schwache Signale erzeugen, mit Sekundärantikörpern gepaart werden sollten, um ihre Signale zu verstärken. Wenn alle Antikörperziele, die gefärbt werden, hell genug sind, um keine Sekundärantikörper zu benötigen, können die Schritte 1.7-1.12 und Schritt 1.15 übersprungen werden.
8. Blockieren Sie die unspezifische Bindung von Antikörpern, indem Sie genügend angereichertes Perm und Blockierungspuffer hinzufügen, um jedes Gewebe zu bedecken. Inkubieren Sie die Objektträger für 1-8 h bei Raumtemperatur in einer befeuchteten, lichtgeschützten Kammer.
9. Geben Sie unkonjugierte Primärantikörper in experimentell bestimmten Verdünnungen zu Perm und Färbepuffer (die Spezies oder Immunglobulin-Isotypen der Primärantikörper sollten alle unterschiedlich und unterscheidbar sein durch die Sekundärantikörper, die der Forscher in Schritt 1.12 verwenden möchte).
10. Schütten Sie die Dauerwelle und den Blockierungspuffer ab und verwenden Sie ein Tuch, um überschüssigen Puffer zu entfernen, ohne das Gewebe direkt zu berühren. Geben Sie genügend Dauerwelle und Färbepuffer mit primären Antikörpern in das Gewebe, um es zu bedecken, und inkubieren Sie den Objektträger bei 4 °C für 12-48 h.
    HINWEIS: Der Forscher muss den optimalen Zeitpunkt für die Antikörperinkubation bestimmen.
11. Bereiten Sie den Blockierungspuffer und den Färbepuffer vor (Tabelle 1).
12. Dem in Schritt 1.11 hergestellten Färbepuffer werden Sekundärantikörper in experimentell bestimmten Verdünnungen zugesetzt. Die verwendeten Sekundärantikörper sollten auf dieselben Spezies oder Antikörperisotypen abzielen, die in Schritt 1.9 verwendet wurden.
13. Bereiten Sie den Abschreckpuffer vor (wie in Tabelle 1).
    HINWEIS: Dieser Schritt hilft, die Autofluoreszenz aus dem Gewebe zu reduzieren. Wenn dies nicht erforderlich ist, können die Schritte 1.13 und 1.14 übersprungen werden.
14. Waschen Sie die Tücher wie in den Schritten 1.5-1.6 beschrieben. Fügen Sie dann genügend Quenchpuffer hinzu, um das Gewebe auf den Objektträgern zu bedecken, und inkubieren Sie die Objektträger 1-2 Minuten lang bei Raumtemperatur.
15. Waschen Sie das Taschentuch wie in den Schritten 1.5-1.6 beschrieben. Anschließend werden die in dem in Schritt 1.12 hergestellten Färbepuffer verdünnten Sekundärantikörper so zu den Geweben gegeben, dass das Gewebe vollständig mit dem Färbepuffer bedeckt ist. Objektträger bei 4 °C für 2-8 h inkubieren.
16. Bereiten Sie die Blockierungslösung vor, indem Sie 50 μl normales Serum von der in Schritt 1.18 verwendeten Antikörperspezies (5 % jeder Spezies) zu dem in Schritt 1.11 hergestellten Blockierungspuffer hinzufügen.
17. Waschen Sie die Tücher wie in den Schritten 1.5-1.6 beschrieben. Geben Sie dann die Blockierungslösung mit normalem Serum, das in Schritt 1.16 hergestellt wurde, in das Gewebe, so dass es vollständig mit Färbepuffer bedeckt ist. Inkubieren Sie die Objektträger bei Raumtemperatur für 1-8 h.
18. Die Färbelösung wird durch Zugabe von Fluorophor-konjugierten Primärantikörpern in experimentell bestimmten Verdünnungen zu dem in Schritt 1.11 hergestellten Färbepuffer hergestellt. Geben Sie außerdem einen Kernfleck, wie z. B. Kerngelb, in einer experimentell bestimmten Verdünnung in die Färbelösung.
    HINWEIS: Die Schritte 1.18-1.19 sind nur erforderlich, wenn der Forscher zusätzliche Antikörpermarkierungen verwenden muss, die keine Sekundärantikörper für die Signalverstärkung benötigen. Wenn keine primären konjugierten Antikörper verwendet werden, können Kernfärbungen in Schritt 1.12 hinzugefügt werden.
19. Schütteln Sie den Blockierungspuffer ab und verwenden Sie ein Tuch, um überschüssigen Puffer zu entfernen, ohne das Taschentuch direkt zu berühren. Geben Sie so viel in Schritt 1.18 hergestellte Färbelösung in das Gewebe, dass es bedeckt ist, und inkubieren Sie es bei 4 °C für 12-48 h.
20. Waschen Sie die Tücher wie in den Schritten 1.5-1.6 beschrieben. Geben Sie 5 Tropfen Eindeckmittel auf jeden Objektträger, ohne Blasen einzuführen, und kippen Sie vorsichtig und langsam ein Glasdeckglas über das Gewebe, um das Gewebe vollständig mit Eindeckmittel zu bedecken und alle Luftblasen auszuschließen. Lagern Sie die Objektträger bei 4 °C im Dunkeln, bis sie für die Aufnahme bereit sind.

2. Bildgebung der Gewebeschnitte

HINWEIS: In diesem Stadium werden die Gewebeschnitte mit allen Antikörpern gefärbt, die für alle Erkrankungen, die abgebildet werden sollen, von Interesse sind, und einfarbige Kontrollen werden mit einem Fluoreszenzparameter auf jedem Schnitt gefärbt. Die Bildgebung sollte auf einem Mikroskop erfolgen, das über mehrere Detektoren verfügt, die so eingestellt werden können, dass sie bestimmte Lichtbereiche erkennen, und idealerweise sollte es Zugang zu so vielen Laserlinien wie möglich zur Anregung haben.

1. Setzen Sie einen der vollständig gefärbten Objektträger in das Mikroskop ein und richten Sie das Mikroskop so ein, dass der Schnitt mit dem Objektiv abgebildet wird, das für die Datenerfassung verwendet werden soll.
2. Basierend auf den Fluorophoren, mit denen das Gewebe gefärbt wird, identifizieren Sie die Anregungslaserlinien, die zur Stimulation dieser Fluorophore erforderlich sind, und identifizieren Sie die Emissionsbereiche für jeden Fluorophor, der die größte Signalmenge enthält.
   HINWEIS: Online-Tools zur Anzeige von Fluoreszenzspektren (z. B. siehe Materialtabelle) können nützlich sein, um die optimalen Anregungswellenlängen von Fluorophoren und die optimalen Bereiche für die Fluorophordetektion zu identifizieren. Fluorophore, die für die Histoflow-Zytometrie verwendet werden, sollten so gewählt werden, dass sich jedes Fluorophor in der optimalen Laserlinie, durch die das Fluorophor stimuliert wird, oder durch den optimalen Bereich der Emissionswellenlängen unterscheidet. Fluorophore mit engeren Anregungs-/Emissionswellenlängen sind schwieriger zu trennen. Die für diese Studie verwendeten Fluorophore sind im Abschnitt "Ergebnisse" aufgeführt.
3. Öffnen Sie Software 1 (siehe Materialtabelle) in einem konfokalen Mikroskop und wählen Sie oben den Konfigurationsreiter aus. Wählen Sie dann auf der linken Seite den Hardware-Button aus und ändern Sie die Bittiefe auf 16 Bit.
   HINWEIS: Es wird empfohlen, für die Datenerfassung höhere Bittiefen, wie z. B. 16-Bit-Daten, zu verwenden, da dies die Genauigkeit der spektralen Kompensation verbessert. Darüber hinaus verbessern höhere Pixeldichten, höhere Zahlen für Liniendurchschnitte und mehr Schritte im Z-Stapel die Qualität der spektralen Trennung.
4. Wählen Sie oben auf dem Bildschirm die Registerkarte "Erfassen " aus, und geben Sie die Formateinstellung ein, um die Pixeldichte des Bildes einzubeziehen (in der Regel führen höhere Auflösungen zu besseren Ergebnissen).
5. Falls verfügbar, wählen Sie die bidirektionale X-Erfassung , um die Bildgebungszeit zu verkürzen, vorausgesetzt, diese Funktion wurde ausreichend kalibriert.
6. Wählen Sie einen Lochblendenwert für das konfokale Mikroskop (typischerweise zwischen 400 und 600 nm), bei dem kleinere Werte in der Regel qualitativ hochwertigere histoflow-zytometrische Ergebnisse liefern, obwohl kleinere Lochblendenwerte die Aufnahme von Bildern erschweren und möglicherweise zusätzliche Bildgebungszeit oder höhere Anregungsintensitäten erfordern, um Bilder zu erzeugen.
7. Wählen Sie oben im linken Menü das Bedienfeld "Sequenziellen Scan anzeigen " aus, um die Option für den sequenziellen Scan zu öffnen. Verwenden Sie das '+' -Zeichen, um zusätzliche Sequenzen einzurichten, wobei jede Sequenz eine Anregungswellenlänge enthält, die in Schritt 2.2 festgelegt wurde.
8. Schalten Sie alle benötigten Laser ein, indem Sie auf die ON-Tasten klicken, die den gewünschten Lasern in der Mitte des Bildschirms zugeordnet sind, um sie in den ON-Zustand zu versetzen. Gehen Sie in jede spezifische Sequenz und erhöhen Sie die Laserleistung in der Mitte des Bildschirms auf den gewünschten Wert, wobei für jede Sequenz eine Anregungswellenlänge verwendet wird.
9. Schalten Sie in jeder Sequenz so viele Detektoren wie nötig im unteren Teil des Bildschirms ein , um alle Fluorophore abzubilden, die auf dieser Laserlinie abgebildet werden. Passen Sie die Bereiche der Detektoren an, indem Sie auf ihre Bereiche doppelklicken und den oberen und unteren Bereich der zu erfassenden Wellenlängen eingeben.
   HINWEIS: Es wird empfohlen, nach Möglichkeit hochempfindliche Detektoren zu verwenden, und idealerweise sollten alle Kanäle auf denselben Detektortypen gesammelt werden, obwohl dies nicht erforderlich ist.
10. Drücken Sie die Live-Taste und fokussieren Sie sich auf das Sample. Verwenden Sie die Schaltfläche "Auto Scale " links neben dem Bild in der Software, um zu bewerten, ob die Kanäle ausreichend mit dem Signal gesättigt sind. Der Benutzer sollte die Verstärkungswerte und Laserintensitäten in jeder Sequenz anpassen, bis die automatische Skalierung den Maximalwert (65535 für 16-Bit-Daten) nicht erreicht, aber für alle Kanäle sehr nahe an der Sättigung liegt.
    HINWEIS: Da sich verschiedene Fluorophore in ihrer Helligkeit und verschiedene Antikörperziele in ihrer Häufigkeit unterscheiden können, muss die Empfindlichkeit der Detektoren so angepasst werden, dass sie für helle Signale eine geringe Empfindlichkeit und für schwache Signale eine hohe Empfindlichkeit aufweist, wenn beide Fluorophore durch denselben Laser stimuliert werden (die Laserintensität kann sich in diesem Szenario nicht ändern, da beide Fluorophore betroffen wären). Um optimale Ergebnisse zu erzielen, sollte das Fluoreszenzsignal von jedem Kanal im Experiment so ausgeglichen werden, dass jeder Kanal ungefähr die gleichen Signalmengen hat, was das spektrale Durchscheinen in andere Kanäle reduziert und zu stärkeren Signalen führt. Da sich verschiedene Proben in der Häufigkeit der zu färbenden Marker von Interesse unterscheiden können, wird empfohlen, die Mikroskopeinstellungen unter mehreren Versuchsbedingungen zu testen, um sicherzustellen, dass unter keiner der Versuchsbedingungen ein Bleichen stattfindet.
11. Sobald die Mikroskopeinstellungen abgeschlossen sind, beladen Sie das Mikroskop mit den einfarbigen Kontrollobjektträgern und finden Sie eine repräsentative Färbung für jeden Fluorophor. Richten Sie einen Z-Stack ein, indem Sie unterhalb des Samples fokussieren und die Starttaste im Z-Stack-Menü drücken, dann oberhalb des Samples fokussieren und die Endtaste drücken.
12. Wählen Sie die Anzahl der Schritte und den Abstand zwischen den Schritten (und verwenden Sie die gleiche Anzahl von Schritten und Parametern wie Pixeldichte und Bittiefe, die zum Abbilden der vollständig gefärbten Dias verwendet werden), und drücken Sie dann die Starttaste.
    HINWEIS: Im Idealfall sollten diese Bilder die hellsten Signale von echter Färbung enthalten, die auf dem Objektträger zu finden sind.
13. Nachdem die Einzelfarbregler abgebildet wurden, verwenden Sie dieselben Mikroskopeinstellungen, um alle vollständig gefärbten Proben abzubilden.

3. Fluoreszenz-Kompensation

1. Öffnen Sie .lif-Dateien in Software 1 und klicken Sie auf die Registerkarte Prozess.
2. Wählen Sie das Modul Farbstofftrennung und dann die Option Automatische Farbstofftrennung . Wählen Sie die manuelle Methode für die Farbtrennung aus, und wählen Sie keine Neuskalierung.
3. Öffnen Sie eines der einfarbigen Kontrollbilder. Überprüfen Sie die einfarbigen Steuerelemente manuell auf spektrales Durchscheinen von einem Kanal zum nächsten, indem Sie Graustufenfenster für jeden Kanal beobachten, um Hinweise auf ein Signal in ungeeigneten Kanälen zu finden. Verwenden Sie bei Bedarf die Schaltfläche "Automatisch skalieren ", um schwaches Durchscheinen zu erkennen.
4. Beginnen Sie mit dem Entfernen des Durchscheins, indem Sie Zahlen (in der Regel 0-1, wobei 0 für keinen Durchbluten und 1 für 100 % Durchbluten steht) manuell in die Matrix auf dem Bildschirm eingeben und dann auf Anwenden drücken, um zu testen, ob das Durchscheinen ausreichend entfernt wurde. Dies sollte so lange wiederholt werden, bis die Signale in allen anderen Kanälen mit Ausnahme des interessierenden Kanals auf Hintergrundpegel reduziert wurden.
   HINWEIS: Eine Überkompensation führt zu ungenauen Ergebnissen, daher muss die Fluoreszenz auf den Hintergrundwert reduziert werden, darf aber nicht darunter liegen. Überkompensierte Daten erscheinen als ein Kanal mit einem Signal und andere Kanäle mit Schwarzen Löchern, wo das Signal von Interesse ist (Abbildung 2).
5. Sobald eines der einfarbigen Steuerelemente abgeschlossen ist, notieren Sie die Werte in der Matrix, setzen Sie die Matrix zurück und wechseln Sie zum nächsten einfarbigen Steuerelement. Wiederholen Sie diesen Vorgang für jedes einzelne Farbsteuerelement.
   HINWEIS: Der erste Farbstoff befindet sich in der Zeile von Farbstoff 1, und die Menge an Fluoreszenz, die von Farbstoff 1 entfernt werden muss, befindet sich in den angrenzenden Spalten.
6. Assemblieren Sie alle von jedem Steuerelement erfassten Werte in einer Matrix und wenden Sie diese Matrix auf eine vollständig gefärbte Probe an. Wenn die Separation korrekt aussieht, wenden Sie die Einstellungen auf alle Bilder im Test an, andernfalls bewerten Sie die Steuerelemente für einzelne Farben neu.
   HINWEIS: Eine effektive Kompensation sollte den größten Teil des Durchscheinens über Kanäle hinweg beseitigen, wie in Abbildung 3 zusammengefasst und dargestellt.
7. Speichern Sie alle kompensierten Dateien in einer separaten .lif-Datei.

4. Identifizierung von Zellkernen und Zellen mit Ilastik

1. Öffnen Sie die kompensierten .lif-Dateien in FIJI²⁰. Aktivieren Sie die Anzeige von Stapeln in einem Hyperstack und wählen Sie ein Bild aus.
2. (Fakultativ) Verwenden Sie ein Auswahlwerkzeug wie das Rechteckwerkzeug, um die Teile des Bildes einzuschließen, die analysiert werden sollen, und Bereiche auszuschließen, die nicht analysiert werden. Schneiden Sie das Bild mit der Bild- > Zuschneidefunktion zu.
   HINWEIS: Das Reduzieren der Bildgröße ist in den nachfolgenden Schritten nützlich, um den RAM-Verbrauch (Random Access Memory) zu reduzieren und die Verarbeitungsgeschwindigkeit zu erhöhen.
3. Speichern Sie das Bild als .tif Datei. Speichern Sie das Bild auch als hdf5-Datei, indem Sie das ilastik-Plugin für FIJI verwenden, indem Sie auf Plugins > ilastik > Export hdf5 klicken. Speichern Sie die Datei als "Name der Wahl".h5 mit 0 Komprimierung.
4. Öffnen Sie Ilastik²¹ und erstellen Sie ein Pixelklassifizierungsprojekt. Verwenden Sie die Funktion Neue hinzufügen > Separate Bilder hinzufügen , um mindestens 3 repräsentative Bilder hinzuzufügen, indem Sie neue Eingabedaten hinzufügen.
5. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf eines der Bilder, wählen Sie Eigenschaften bearbeiten und ändern Sie den Anzeigemodus in Graustufen.
6. Wählen Sie auf der linken Seite des Bildschirms die Registerkarte für die Funktionsauswahl aus. Klicken Sie auf Merkmale auswählen und wählen Sie alle Merkmale bis zum höchsten Sigma-Wert aus, den das Programm Ihnen erlaubt, und drücken Sie dann OK.
7. Wählen Sie nun die Registerkarte "Training" aus. Verwenden Sie das Pinselwerkzeug (während die erste Beschriftung ausgewählt ist), um einzelne Zellen von Interesse hervorzuheben (Abbildung 4), sodass das Innere (Zytoplasma und Zellkern) und die Zellmembran in die Hervorhebung einbezogen werden.
8. Wiederholen Sie dies für alle Trainingsstichproben, bei denen alle interessierenden Zelltypen ausgewählt sind und aus jeder Probe mehrere Zellen mit unterschiedlichen Intensitäten, Morphologien und Lokalisationen im Gewebe ausgewählt werden sollten.
   HINWEIS: Abhängig von den Markern, die für einen einzelnen Satz von Färbungen ausgewählt werden, kann es intrazelluläre Färbungen oder Zellmembranfärbungen für die interessierenden Zellen geben oder nicht. Unabhängig davon, welche Marker verwendet werden, stellen Sie sicher, dass das Highlight die äußerste Färbung auf den interessierenden Zellen und das Zellinnere umfasst, unabhängig davon, ob eine intrazelluläre Färbung verwendet wird.
9. Verwenden Sie als Nächstes die zweite Beschriftung, um alles hervorzuheben, was nicht die interessierenden Zellen sind (Abbildung 4). Dies kann Leerräume, unmarkierte Zellkerne oder Gewebe umfassen, das keine interessanten Marker aufweist. Stellen Sie sicher, dass der Raum unmittelbar neben den interessierenden Zellen einbezogen wird, um das Erlernen der genauen Zellgrenzen zu fördern.
10. Verwenden Sie die Live-Update-Funktion , um die Qualität des Trainings für Bilder von Interesse zu bewerten. Wenn das Training unzureichend ist, setzen Sie das Training in den Schritten 4.7 bis 4.9 fort. Andernfalls klicken Sie bei Zufriedenheit auf die Registerkarte Prediction Export .
11. Legen Sie die Quelle auf Wahrscheinlichkeiten fest. Klicken Sie auf die Schaltfläche Einstellungen für den Export von Bildern auswählen und stellen Sie dann den Parameter c auf export 0-1 ein (unter der Annahme, dass Beschriftung 1 die gewünschten Parameter hervorhebt).
12. Konvertieren Sie den Datentyp in eine 16-Bit-Ganzzahl und exportieren Sie ihn als hdf5-Datei in das gewünschte Verzeichnis mit dem Namen von Interesse (wir empfehlen die Verwendung von {nickname} mask.h5), und drücken Sie dann OK.
13. Klicken Sie auf die Registerkarte Stapelverarbeitung . Klicken Sie auf die Schaltfläche Rohdatendateien auswählen, wählen Sie alle .h5-Dateien von Interesse aus, die verarbeitet werden müssen, und drücken Sie dann Öffnen. Klicken Sie auf Alle Dateien verarbeiten.
14. Wiederholen Sie die Schritte 4.4 bis 4.13, nur dass Sie anstelle der Identifizierung von Zellen nun die Zellkerne identifizieren und alles andere ausschließen (Abbildung 4). Exportieren Sie dies als separate Vorhersage zur Identifizierung von Zellkernen.
15. Öffnen Sie Ilastik und erstellen Sie ein neues Datenkonvertierungsprojekt. Fügen Sie eine repräsentative hdf5-Datei auf der Registerkarte Eingabedaten hinzu, indem Sie die Funktion Neues hinzufügen > Separates Bild hinzufügen verwenden.
16. Klicken Sie auf die Registerkarte Datenexport und wählen Sie die Schaltfläche Exportbildeinstellungen auswählen, wobei die Quelle auf Eingabe eingestellt ist. Ändern Sie das Format in mehrseitiges TIFF, wählen Sie mit der Auswahlfunktion einen Speicherort aus und legen Sie den Namen der Datei auf {Spitzname} fest. Drücken Sie OK.
17. Klicken Sie auf die Registerkarte Stapelverarbeitung und wählen Sie alle Ihre hdf5-Dateien mit der Schaltfläche Eingabedatendateien auswählen aus und klicken Sie auf die Schaltfläche Alle Dateien verarbeiten .
18. Öffnen Sie Software 2 (siehe Materialtabelle) und fügen Sie alle in den Schritten 4.3 und 4.17 erzeugten tif/tiff-Dateien über die Schaltfläche Dateien hinzufügen hinzu. Wählen Sie einen Speicherort für die Dateiausgabe aus und klicken Sie auf die Schaltfläche Alle starten , um alle Dateien in IMS-Dateien zu konvertieren. Die Dateien sind nun bereit für die Analyse in Software 3 (siehe Materialtabelle).

5. Analyse in Software 3

1. Öffnen Sie eines der Bilder, das alle fluoreszierenden Flecken enthält. Wählen Sie Bearbeiten-> Kanäle hinzufügen und fügen Sie die IMS-Dateien hinzu, die den Masken entsprechen, die über Zellkerne und Zellkörper erstellt wurden. Wiederholen Sie diesen Vorgang für alle Proben.
2. Wählen Sie die Schaltfläche Neue Zellen hinzufügen aus. Wählen Sie die Option Zellkern und Zelle erkennen und fahren Sie fort.
3. Wählen Sie die Maske über den Kernen als Quellkanal für die Erkennung von Kernen aus, und wählen Sie die erweiterte Option zum Aufteilen von Kernen nach Kernpunkten. Wählen Sie einen Wert für den Kerndurchmesser) und fahren Sie fort.
   HINWEIS: Der optimale Wert für den Kerndurchmesser muss getestet werden, indem die Simulation ausgeführt und manuell ausgewertet wird, ob das Programm nicht genügend Kerne spaltet (mehrere Kerne werden gruppiert) oder ob es eine Überteilung gibt (ein Kern wird in mehr als einen aufgeteilt).
4. Wählen Sie einen Wert für die Qualitätsbewertung aus, und fahren Sie fort. In der Regel ist es am besten, alle Zellkerne einzubeziehen, da das Weglassen von Kernen dazu führen kann, dass mehrere Zellen zu einer verschmolzen werden.
5. Wählen Sie einen Schwellenwert für die Erstellung von Kernoberflächen und fahren Sie dann fort. Stellen Sie sicher, dass alle Kerne, auch solche, die dunkler sind, noch in den Schwellenwert einbezogen werden. Stellen Sie den Schwellenwert nicht zu niedrig an, da dies die Größe der Kerne überschätzen oder möglicherweise Trümmer als Kernfärbung enthalten kann.
6. Wählen Sie einen Wert für die Mindestanzahl von Voxeln pro Kern und fahren Sie fort. In der Regel ist es am besten, alles aufzubewahren, es sei denn, Ablagerungen oder Nicht-Kerne können mit diesem Parameter ausgeschlossen werden.
7. Wählen Sie die Option Zellgrenze und Zytoplasma aus, wählen Sie die Maske über den Zellen aus, die als Quellkanal für die Erkennung von Zellkörpern dienen soll, und fahren Sie dann fort.
8. Wählen Sie einen Zellenschwellenwert aus, der alle interessierenden Zellen genau erfasst, aber nicht so niedrig ist, dass er den Hintergrund oder eine unspezifische Erkennung von Zellen einschließt. Wählen Sie die Option aus, um berührende Zellen so zu teilen, dass es einen Zellkern pro Zelle gibt, der durch den Abstand zu den Kernen getrennt ist. Wählen Sie auch, Zellen auf Zellkernen zu erweitern und dann fortzufahren.
9. Wählen Sie einen Wert für die Mindestanzahl von Voxeln pro Zelle aus, und fahren Sie fort. In der Regel ist es am besten, alles zu behalten, es sei denn, Schmutz oder Nicht-Zellen können mit diesem Parameter ausgeschlossen werden.
10. Bewerten Sie, ob die erstellten Oberflächen über den Zellen korrekt sind, indem Sie prüfen, ob mehrere Zellen miteinander verschmolzen wurden oder ob Zellen fehlen. Wenn die Flächen unzureichend sind, gehen Sie zurück zu Schritt 5.2 und probieren Sie neue Parameter aus, bis die optimalen Einstellungen ermittelt sind.
11. Sobald die besten Einstellungen festgelegt sind, klicken Sie im linken Menü auf das Objekt der erstellten Zellen , klicken Sie auf die Registerkarte Erstellung und klicken Sie auf die Schaltfläche Parameter für Batch speichern , um die verwendeten Einstellungen zu speichern.
12. Öffnen Sie mehrere Fenster von Software 3 und öffnen Sie in jedem Fenster separate Bilder. Drücken Sie in jedem Fenster die neue Schaltfläche Zellen , wählen Sie die gespeicherten Einstellungen im Menü "Favoritenerstellungsparameter " aus und weisen Sie jedes Fenster an, bis zum Abschluss ausgeführt zu werden. Wiederholen Sie dies so oft wie nötig, bis alle Proben analysiert sind.
    HINWEIS: Wenn Sie mehrere Instanzen von Software 3 ausführen, wird diese Analyse schneller durchgeführt, aber die Anzahl der Fenster, die parallel ausgeführt werden können, hängt von der Verarbeitungsgeschwindigkeit der Central Processing Unit (CPU) und der Menge an RAM ab, auf der der Computer ausgeführt wird, auf dem die Analyse ausgeführt wird.
13. Sobald alle Stichproben abgeschlossen sind, klicken Sie auf das erstellte Zellenobjekt im linken Menü in jedem Bild und klicken Sie auf die Registerkarte Statistiken. Klicken Sie auf die Schaltfläche Liste der sichtbaren Statistikwerte konfigurieren , deaktivieren Sie alle Statistiken mit Ausnahme des Werts für den Mittelwert der Zellenintensität und drücken Sie dann OK.
14. Klicken Sie für jedes Bild, das analysiert werden muss, auf der Registerkarte "Statistiken" auf die Schaltfläche "Alle Statistiken in Datei exportieren " und speichern Sie die Dateien an einem Speicherort.

6. Histoflowzytometrische Analyse und Kartierung von Populationen auf Gewebeschnitten

1. Öffnen Sie Anaconda und JupyterLab innerhalb von Anaconda. Öffnen Sie als Nächstes das Skript, das in der ergänzenden Codierungsdatei 1 bereitgestellt wird. Führen Sie den Code über das Menü Ausführen aus, und wählen Sie Alle Zellen ausführen aus, oder führen Sie die Zellen einzeln in der Reihenfolge aus, indem Sie Ausgewählte Zellen ausführen auswählen.
2. Wenn Sie aufgefordert werden, die Quelldatei einzugeben, geben Sie das Dateiverzeichnis für die exportierten Fluoreszenzwerte ein, die in Schritt 5.14 generiert wurden. Das Dateiverzeichnis erhalten Sie, indem Sie sich die Eigenschaften einer der exportierten .csv Dateien ansehen und den Dateipfad in die Eingabeaufforderung kopieren.
3. Als nächstes fragt das Programm nach einem Ausgabeort für die verarbeiteten Dateien. Geben Sie das Dateiverzeichnis für einen beliebigen Speicherort ein, der zum Speichern der verarbeiteten Dateien geeignet ist. Das Programm erkennt automatisch die Anzahl der im Ordner enthaltenen Fluoreszenzkanäle.
4. Führen Sie den nächsten Abschnitt des Codes aus, um die Daten mit den Namen der einzelnen Kanäle zu versehen. Dieser Code kann nach Bedarf geändert werden, um den Parameter "numberOfChannels" so zu ändern, dass er der Anzahl der in Schritt 6.3 erkannten Kanäle entspricht. Zusätzlich können die Namen der Kanäle für beliebig viele Kanäle geändert werden, indem die Zeile 'ChX':'Marker' so oft wie nötig wiederholt wird und die Namen der Marker geändert werden.
5. Beim Ausführen der nächsten Codezeile wird am angegebenen Speicherort eine .csv Datei erstellt, die mit Anmerkungen versehen ist und alle Fluoreszenzparameter im Dataset enthält. Wiederholen Sie die Schritte 6.1 bis 6.5 für jeden Satz von Software 3-Exporten, um .csv Dateien für alle Daten zu erstellen.
6. Konvertieren Sie die .csv Dateien in .fcs-Dateien, indem Sie Software 4 öffnen (siehe Materialverzeichnis) und die .csv Dateien in das Programmfenster ziehen. Software 4 beginnt automatisch mit der Konvertierung der Dateien in .fcs-Dateien.
7. Doppelklicken Sie auf eines der Beispiele in Software 4, um ein Fenster zu diesem Beispiel zu öffnen. Verwenden Sie die Gating-Tools in Software 4, um eine Gating-Strategie zu erstellen. Es wird empfohlen, mit dem Gating auf einem Marker zu beginnen, der die Abstammungslinie definiert, der alle interessierenden Zellen enthält, dann mit Gates fortzufahren, die zuerst seltenere Teilmengen entfernen, und dann mit den häufigeren Zelltypen zu enden.
8. Sobald eine Gating-Strategie eingerichtet ist, testen Sie die Genauigkeit des Gatings, indem Sie mit der rechten Maustaste auf diese Population im Menü klicken und Exportieren auswählen. Exportieren Sie alle Parameter als .csv Datei mit Headern.
9. Öffnen Sie JupyterLab in Anaconda. Öffnen Sie als Nächstes das Skript in der ergänzenden Codierungsdatei 2, und führen Sie den Code aus. Wenn Sie aufgefordert werden, den Speicherort der Software 4-Datei einzugeben, geben Sie das Dateiverzeichnis für die exportierte .csv Datei ein, die im vorherigen Schritt generiert wurde. Das Dateiverzeichnis erhalten Sie, indem Sie sich die Eigenschaften der exportierten .csv Datei ansehen und den Dateipfad in die Eingabeaufforderung kopieren.
10. Wenn Sie aufgefordert werden, den Ausgabespeicherort hinzuzufügen, wählen Sie ein beliebiges Dateiverzeichnis aus, und stellen Sie sicher, dass das Dateiverzeichnis den Dateinamen am Ende enthält ("Dateiverzeichnis"\filename.txt). Führen Sie den Rest des Codes aus.
11. Kopieren Sie den Text in der .txt Datei, und öffnen Sie die entsprechende IMS-Datei in Software 3 für das gleiche Beispiel, auf dem die exportierten Daten basieren. Klicken Sie in der Datei auf das Objekt Zelle , wechseln Sie zur Registerkarte Statistiken, fügen Sie den Text in die Suchleiste ein und starten Sie die Suche. Alle Zellen, die Sie interessieren, werden hervorgehoben.
12. Überprüfen Sie manuell, ob alle interessierenden Zellen mit der Gating-Strategie erfasst wurden. Wenn die Anzahl der Zellen unter- oder überschätzt wird (Beispiele in Abbildung 5), gehen Sie zurück zu Schritt 6.7, passen Sie das Gate an und bewerten Sie erneut, ob die Zellen mit dem neuen Gate genau erfasst werden. Wiederholen Sie dies mit allen Gates in der Gating-Strategie und bewerten Sie das Gating an mehreren Samples.
13. Wenn alle Gatter validiert sind, exportieren Sie die Daten aus Software 4 mit der Tabelleneditor-Funktion und analysieren Sie die Daten mit der bevorzugten Analysemethode.
    HINWEIS: Zellpopulationen können auf die Gewebeschnitte in Software 3 zurückgeführt werden, indem die Gated Population wie in den Schritten 6.8 bis 6.11 identifiziert und dann eine Oberfläche basierend auf den ausgewählten Zellen erstellt wird. Dies kann für jede Gated Population erfolgen, wie in Abbildung 6 und Abbildung 7 dargestellt.

Ergebnisse

Abbildung 1: Arbeitsablauf der Histoflow-Zytometrie. Die Gewebeschnitte werden mit spektral überlappenden Farbstoffen gefärbt (Schritt 1). Die Bilder werden über einzelne Anregungslaser gesammelt, die mit abstimmbaren Bandpassfiltern gepaart sind, um das spektrale Durchscheinen zwischen den Fluorophoren zu minimieren (Schritt 2). Das spektrale Durchscheinen zwischen den Kanälen wird auf der Grundlage einer Kompensationsmatrix korrigiert, die mit Hilfe von einfarbig gefärbten Gewebekontrollen erzeugt wird (Schritt 3). Zellkerne und Zellen auf Bildern werden dann mit Ilastik identifiziert (Schritt 4) und in Software 3 (Schritt 5) in einzelne Zellen aufgeteilt. Zusätzliche Parameter werden berücksichtigt, bevor alle Daten aus Software 3 in Software 4 exportiert werden, um eine Durchflusszytometrie-Analyse durchzuführen. Die Zellidentitäten werden dann aus Software 4 exportiert und auf die Zell-IDs im ursprünglichen Gewebe zurückgeführt, um die räumliche Lokalisierung von Zellen in Gewebeschnitten aufzuklären (Schritt 6). Geldzeichen stehen für kommerzielle Software, die gekauft werden muss, und Computerzeichen stehen für freie Software. Die ungefähre Zeit für jeden Schritt ist neben der Sanduhr angegeben. Kommerzielle Software ist in der Materialtabelle aufgeführt. Diese Abbildung ist eine Adaption von Jain et ^al.18. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

In Abbildung 3 wurden Lymphknotengewebe mit einem Anti-Maus-CD138-Antikörper von Ratten gefärbt, gepaart mit einem Esel Anti-Ratte Dylight 405 Sekundärantikörper, Nuclear Yellow, einem Ratte Anti-Maus CD4-Antikörper, konjugiert an Alexa Fluor 488, einem Ratte Anti-Maus IgD-Antikörper, konjugiert an PerCP-eF710, einem Kaninchen Anti-Maus Iba1 Antikörper gepaart mit einem Esel Anti-Kaninchen Alexa Fluor 546 Sekundärantikörper, ein Ratten-Anti-Maus-CD3ε-Antikörper, der an PE-eF610 konjugiert ist, ein Ratten-Anti-Maus-B220-Antikörper, der mit Alexa Fluor 647 konjugiert ist, und ein Ratten-Anti-Maus-CD45-Antikörper, der an APC-R700 konjugiert ist. Zur Stimulation der Farbstoffe Dylight 405 und Nuclear Yellow wurde ein violetter 405-nm-Laser verwendet, und ihre Emissionen wurden im Bereich von 408-438 nm bzw. 460-530 nm detektiert. Zur Stimulation der Farbstoffe Alexa Fluor 488 und PerCP-eF710 wurde ein grüner 488-nm-Laser verwendet, und ihre Emissionen wurden im Bereich von 495-545 nm bzw. 682-750 nm detektiert. Zur Stimulation der Farbstoffe Alexa Fluor 546 und PE-eF610 wurde ein gelb-grüner 552-nm-Laser verwendet, und ihre Emissionen wurden im Bereich von 557-600 nm bzw. 615-652 nm detektiert. Ein roter 640-nm-Laser wurde verwendet, um die Farbstoffe Alexa Fluor 647 und APC-R700 zu stimulieren, und ihre Emissionen wurden im Bereich von 647-682 nm bzw. 700-750 nm detektiert.

Abbildung 2: Beispiele für schlechte und qualitativ hochwertige Vergütung. Die Kügelchen wurden mit einem Antikörper gefärbt, der an PE-eFluor 610 konjugiert war, und in den Kanälen abgebildet, die den Kanälen PE-eFluor 610 (PE-eF610) und Alexa Fluor 546 (A546) entsprechen. Auf dasselbe Bild im A546-Kanal wurden unterschiedliche Kompensationsgrade angewendet (10 % Reduktion für Unterkompensation, 28 % Reduktion für korrekte Kompensation und 60 % Reduktion für Überkompensation), um das Durchscheinen aus dem PE-eF610-Fluorophor zu entfernen, was zu unterschiedlichen Trennungsgraden führte. Um die Kompensationsgrade besser zu visualisieren, wird eine aufgehellte Version der Durchscheinbilder bereitgestellt. Der gelbe Pfeil zeigt auf denselben Bereich in jedem Bild, der einem Bereich entspricht, in dem der PE-eF610-Kanal eine echte Färbung aufweist. Maßstabsbalken: 4 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Fluoreszenzkompensation anhand von gefärbten Gewebeschnitten. (A-C) Lymphknotengewebeschnitte wurden mit einzelnen Abs gefärbt, die an die aufgeführten Fluorophore konjugiert waren. Unkompensierte, einfach gefärbte Proben wurden dann über alle Kanäle (A, oben) abgebildet und die Kompensation auf die Einzelfarbkontrollen (A, unten) angewendet. (B) Das Durchscheinen zwischen den Kanälen in (A) wurde quantifiziert (mittlere Fluoreszenzintensität des aktuellen Bildes dividiert durch die mittlere Fluoreszenzintensität des Kanals des aktuellen Fluorophors) und in Heatmaps dargestellt. Weiße Quadrate stellen Werte dar, die den Durchscheinen von 100 % überschreiten. (C) Die spektrale Überlappung wird unter den unkompensierten und zellbasierten Kompensationsbedingungen durch den Vergleich der spektralen Trennung von Iba1-A546 und CD3-PEeF610 in vollständig gefärbten Proben bewertet. Maßstabsleisten: 30 μm. Diese Abbildung ist eine Adaption von Jain et ^al.18. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Durch die Befolgung dieses Protokolls (zusammengefasst in Abbildung 1) sollten spektral überlappende Fluoreszenzfarbstoffe effektiv getrennt werden, wie in Abbildung 3A,B gezeigt. Eine vollständige Trennung der Farbstoffe ist zwar nicht möglich, aber die Trennung sollte ausreichen, um verschiedene Zelltypen eindeutig zu unterscheiden (Abbildung 3C). Wenn in einem anderen Kanal noch Schatten von spektral überlappenden Zellen vorhanden sind, kann dies darauf hindeuten, dass immer noch Durchscheinen stattfindet und die Bilder möglicherweise neu verarbeitet werden müssen (Abbildung 2). Darüber hinaus ist eine Überkompensation offensichtlich, wenn der kompensierte Bereich unter die Fluoreszenzwerte fällt, die mit der Hintergrundfärbung verbunden sind, und als schwarze Bereiche erscheint, in denen das Durchscheinen einmal war (Abbildung 2). Eine Überkompensation kann zum Verlust des realen Signals in dem Kanal führen, auf den die Kompensation angewendet wurde, und muss vermieden werden. Nichtsdestotrotz, wenn dieses Protokoll korrekt befolgt wurde, sollte es keine Probleme mit der Kompensation geben, und daher sollte der Forscher überlegen, ob ein scheinbares Durchscheinen künstlich oder Teil der Biologie ist.

Abbildung 4: Beispiel für eine Ilastik-basierte Zellkern- und Zelldetektion. Die nukleare gelbe Färbung (oben links) wurde verwendet, um Kerne (oben rechts in gelb) und was kein Kern ist (in blau) zu identifizieren. Die repräsentative CD45-Färbung (unten links) wird verwendet, um Zellen (unten rechts in gelb) und was keine Zelle ist (in blau) zu identifizieren. Diese Abbildung ist eine Adaption von Jain et ^al.18. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Sobald die Farbstoffe genau getrennt sind, ist die Aufspaltung des Gewebes in einzelne Zellen für die Durchführung von Einzelzellanalysen unerlässlich. Das hier beschriebene Protokoll verwendet benutzerdefiniertes maschinelles Lernen (Abbildung 4), um Zellen zu trennen, selbst wenn sie eng aneinander gepresst sind, wie in den in Abbildung 6 gezeigten Lymphknoten gezeigt.

Abbildung 5: Bewertung, ob ein Tor richtig eingestellt wurde. Dargestellt ist eine repräsentative CD138-Färbung (eingefärbt in Cyan) in einem Lymphknoten, und es wurden drei separate Gates (das Punktdiagramm links) erstellt, um CD138⁺ -Zellen im Gewebe zu identifizieren. Eine zu konservative Schätzung von CD138⁺ -Zellen ist als blaues Tor dargestellt und auf das Gewebe in blau abgebildet. Eine ausgewogene Schätzung der CD138⁺ -Zellen ist als grünes Tor dargestellt und auf das Gewebe in grün abgebildet. Eine übermäßig permissive Schätzung von CD138⁺ -Zellen ist als rotes Tor dargestellt und auf das Gewebe in Rot abgebildet. Der gelbe Kreis kennzeichnet einen Bereich, in dem CD138⁺ -Zellen nicht durch das übermäßig konservative Gate identifiziert werden, und der magentafarbene Kreis kennzeichnet einen Bereich ohne CD138+-Zellen, von dem behauptet wird, dass er CD138^+- Zellen durch das übermäßig permissive Gate enthält. Maßstabsbalken: 30 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Bei der Bestimmung der genauen Positionen der Gates in der Durchflusszytometrie-Analyse (siehe Abbildung 5) sollte darauf geachtet werden, dass diese Gates die Häufigkeit der Zellen nicht über- oder unterschätzen. Dies sollte bestimmt werden, indem die Zellen wieder auf das Gewebe abgebildet werden, wie in Abbildung 5, um zu sehen, ob die Zellen, die Ihre interessierenden Marker exprimieren, in der Analyse erfasst werden. Wenn zu viele Zellen ausgewählt werden (z. B. werden Zellen, die CD138 nicht exprimieren, als CD138⁺ ausgewählt), sollten die Gates verschoben werden, um weniger permissiv zu sein, und wenn zu wenige Zellen ausgewählt werden, sollten die Gates freizügiger gemacht werden. Gates sollten hinsichtlich der Selektivität so optimiert werden, dass zuerst die Upstream-Gates optimiert werden und dann jedes nachfolgende Gate in der Kette als nächstes optimiert wird. Letztendlich sollte eine effektive Optimierung einer Gating-Strategie in der Lage sein, interessante Zelluntermengen aufzulösen (Abbildung 6 und Abbildung 7).

Abbildung 6: Durchflusszytometrische Identifizierung von Zellen in Gewebeschnitten. (A) Fluoreszenzwerte, die von einzelnen Zellen aus Software 3 in Lymphknotenschnitten exportiert wurden, wurden in Software 4 analysiert, um die angegebenen Zellpopulationen basierend auf der gezeigten Gating-Strategie zu identifizieren. (B) Die in Software 4 identifizierten Populationen wurden auf denselben Gewebeschnitt zurückgeführt, und für jede Population wurden Oberflächen generiert. Der CD45-Fleck ist nicht zu sehen. Maßstab: 30 μm. Diese Abbildung ist eine Adaption von Jain et ^al.18. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 7: Aufschlüsselung einzelner Färbungen und Populationen in Mauslymphknoten. Einzelne Färbungen für Immunzellmarker sind in den oberen Feldern dargestellt, und die zugehörige Gated Population, die in Abbildung 6A identifiziert wurde, ist unter jeder einzelnen Färbung dargestellt. Maßstabsleiste: 30 μm, siehe Bild oben links. Diese Abbildung ist eine Adaption von Jain et ^al.18. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Diese Technik wurde bereits¹⁸ Mal verwendet, um Immunzellinfiltrate in das Rückenmark während der Neuroinflammation zu charakterisieren und zu bestätigen, dass äquivalente Anteile infiltrierender Immunzellen mittels Histoflowzytometrie und Durchflusszytometrie gefunden werden. Die Technik wurde auch validiert und zeigt, dass sie in Milz und Gehirn von Mäusen funktioniert und Unterschiede zwischen Behandlungsbedingungen identifizieren kann, die in identischen Durchflusszytometrie-Experimenten (unveröffentlicht) reproduziert wurden. Diese Technik wurde auch verwendet, um das Rückenmark von Mäusen zu analysieren, die stereotaktische Injektionen der ZNS-Modelle erhielten.

Abbildung 8: Trennung von 8 Farbstoffen in einem menschlichen Mandelschnitt. Humane Mandelschnitte wurden mit CD20 gefärbt, um B-Zellen zu identifizieren, und mit IgM, IgA und IgG, um Plasmazellen zu identifizieren. Blimp1- und CD38-Färbungen wurden eingebaut, um die Identität von Plasmazellen weiter zu validieren, und Ki67, um proliferierende Zellen zu identifizieren. Der nukleare gelbe Fleck ist in der kombinierten Abbildung nicht zu sehen. Maßstab: 22 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Diese Technik kann auch zur Analyse von menschlichen Gewebeschnitten angewendet werden. Als Beispiel für die Färbung in menschlichem Gewebe wurden menschliche Mandelschnitte mit einer Auswahl von 8 Markern gefärbt: einem Ziegen-Anti-Human-IgM-Antikörper, der an Dylight 405 konjugiert ist, Nuclear Yellow, einem Ziegen-Anti-Human-IgA-Antikörper, der an Alexa Fluor 488 konjugiert ist, einem Anti-Human-CD20-Antikörper von Mäusen, gepaart mit einem Anti-Maus-F(ab')2-Fragment, das an PerCP-eFluor 710 konjugiert ist, ein Ziegen-Anti-Mensch-IgG, konjugiert an Cy3, ein Kaninchen-Anti-Mensch-Ki67-Antikörper, gepaart mit einem Ziegen-Anti-Kaninchen-Antikörper, konjugiert an PE-Alexa Fluor 610, ein Ratten-Anti-Mensch-Blimp1-Antikörper, gepaart mit einem Esel-Anti-Ratten-Antikörper, der an Alexa Fluor 647 konjugiert ist, und ein Anti-Mensch-CD38-Antikörper von Mäusen, konjugiert an APC-R700. Nach der Kompensation ist die Trennung dieser Marker im Mandelschnitt zu sehen (Abbildung 8). Dies zeigt die Nützlichkeit dieser Technik in verschiedenen Geweben und Arten.

Name der Lösung	Zusammensetzung		Zubereitung
Blockieren des Puffers	10 % Pferdeserum, 1 % BSA und 0,1 % kalte Fischfleckengelatine in PBS		Fügen Sie 5 ml Pferdeserum, 0,5 g BSA, 50 μl kalte Fischfleckengelatine zu 45 ml PBS hinzu. Aliquotieren Sie diese Lösung in 15-ml-Röhrchen und lagern Sie sie bis zur Verwendung bei -20 °C.
Dauer- und Blockierungspuffer	10 % Pferdeserum, 1 % BSA, 0,1 % kalte Fischfleckengelatine, 0,1 % Triton X-100, 0,05 % Tween-20 in PBS		Fügen Sie 5 ml Pferdeserum, 0,5 g BSA, 50 μl kalte Fischfleckengelatine, 50 μl Triton X-100 und 25 μl Tween-20 bis 45 ml PBS hinzu. Aliquotieren Sie diese Lösung in 15-ml-Röhrchen und lagern Sie sie bis zur Verwendung bei -20 °C.
Dauerwellen- und Färbepuffer	1 % BSA, 0,1 % kalte Fischfleckengelatine, 0,5 % Triton X-100 in PBS		Fügen Sie 0,5 g BSA, 50 μl kalte Fischfleckengelatine und 250 μl Triton X-100 bis 50 ml PBS hinzu. Aliquotieren Sie diese Lösung in 15-ml-Röhrchen und lagern Sie sie bis zur Verwendung bei -20 °C.
Puffer abschrecken	5 % Trueblack, 66,5 % Ethanol, 28,5 % Wasser		Trueblack-Lösung bei 70 °C 5 Min. vorheizen. Fügen Sie dann 50 μl Trueblack zu 950 μl 70%igem Ethanol hinzu, um den Trueblack-Puffer herzustellen. Machen Sie es jedes Mal frisch. Sie benötigen ~500 μl pro Objektträger, obwohl die spezifischen Mengen von der Art Ihres Gewebes abhängen.
Puffer zum Färbemittel	1 % BSA und 0,1 % kalte Fischfleckengelatine in PBS		Fügen Sie 0,5 g BSA und 50 μl kalte Fischfleckengelatine zu 50 ml PBS hinzu. Aliquotieren Sie diese Lösung in 15-ml-Röhrchen und lagern Sie sie bis zur Verwendung bei -20 °C.

Tabelle 1: Eine Liste der Lösungen und ihrer Zusammensetzungen, die für die Färbung von Gewebeschnitten benötigt werden.

Ergänzende Codierungsdatei 1: Ein Python-Skript, das die Fluoreszenzwerte von jedem Kanal sammelt und eine Zusammenfassungsdatei erstellt. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Codierungsdatei 2: Ein Python-Skript, das eine Liste aller ID-Nummern von Gated Cells in einer Textdatei erstellt. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Diskussion

Hier wird der Einsatz der Histoflow-Zytometrie beschrieben, eine Technik, die bereits zuvor validiert wurde¹⁸. Es wird gezeigt, dass bei der Färbung von Gewebeschnitten mit spektral überlappenden Farbstoffen dieses Durchscheinen über Kanäle mittels spektraler Kompensation entfernt werden kann, was dazu führt, dass eine größere Anzahl von Fluoreszenzparametern eindeutig aufgelöst wird, als dies normalerweise mit herkömmlichen Methoden möglich wäre. Da Histologiebilder mit hohen Parametern mit herkömmlichen Methoden nur schwer zu analysieren sind, wird eine Analysepipeline bereitgestellt, um einzelne Zellen aus diesen Bildern zu segmentieren. Durch den Export der Fluoreszenzsignaturen dieser einzelnen Zellen kann gezeigt werden, dass Einzelzellanalysen, wie sie in der Durchflusszytometrie durchgeführt werden, in ähnlicher Weise auf histologische Bilder angewendet werden können. Während die Durchflusszytometrie keine räumliche Analyse umfasst, wird gezeigt, dass die Histoflowzytometrie Populationen, die durch Gating-Strategien identifiziert wurden, auf Gewebeschnitte abbilden kann, um ihre räumliche Lokalisation zu bewerten. Insgesamt wird gezeigt, dass die Histoflow-Zytometrie die Stärken der Durchflusszytometrie und der Histologie vereint.

Die Histoflow-Zytometrie hat zwar den Vorteil, dass räumliche Informationen erhalten bleiben, aber sie hat auch viele der gleichen Einschränkungen wie die konventionelle Histologie. Während die Durchflusszytometrie hervorragend für die Quantifizierung von Zellen in einem gesamten Gewebe geeignet ist, wird die Histologie in der Regel durch die Analyse einer kleinen Stichprobe von Gewebeschnitten durchgeführt, die als repräsentativ für das Gewebe entnommen werden. Damit die Histologie die Anzahl der Zellen in einem Gewebe genau quantifizieren kann, müsste man jedes Gewebestück, das aus dem Gewebe entnommen wird, abbilden und die Anzahl der Zellen in jedem quantifizieren, was unpraktisch wäre. Ein weiteres Problem ist, dass einige Zellen beim Schneiden des Gewebes in zwei Hälften geteilt werden und es keine Möglichkeit gibt, diese Zellen zu rekonstruieren. Eine Einschränkung des hier aufgeführten Protokolls besteht darin, dass es keine Methoden zum Ausschluss von Zellen an den Rändern des Gewebes enthält. Trotz dieser Einschränkungen besteht ein Vorteil der Histoflow-Zytometrie gegenüber der Durchflusszytometrie darin, dass es nicht notwendig ist, Gewebe in Einzelzellsuspensionen zu dissoziieren, was zu Verzerrungen in den isolierten oder unzureichend erfassten Populationen führen kann²². Während die Histoflow-Zytometrie also mehrere Vorteile gegenüber der herkömmlichen Durchflusszytometrie hat, wird es weiterhin eine Herausforderung sein, Messungen über das gesamte Gewebe zu erhalten.

Hier wird gezeigt, dass acht spektral überlappende Fluoreszenzparameter getrennt werden können; Anderen ist es jedoch gelungen, 13 Fluoreszenzfarbstoffe¹⁷ zu trennen. Die Anzahl der Farbstoffe, die getrennt werden können, hängt von den Eigenschaften des Mikroskops ab, in dem die Daten gesammelt werden. Fluoreszenzfarbstoffe unterscheiden sich hinsichtlich ihrer optimalen Anregungswellenlängen und in ihren gebräuchlichsten Emissionswellenlängen. Mikroskope, die sich diese Eigenschaften zunutze machen, indem sie einen breiten Bereich von Anregungswellenlängen verwenden, um die optimalen Anregungswellenlängen von Fluorophoren genauer anzupassen, und indem sie die Emissionsdetektoren so abstimmen, dass sie genau auf die am häufigsten emittierten Wellenlängen abgestimmt sind, maximieren die Trennung von Fluoreszenzfarbstoffen. Die Minimierung der spektralen Überlappung ist für die Erzeugung qualitativ hochwertiger Daten unerlässlich, da die Kompensation des Durchblutens über Kanäle hinweg möglicherweise den dynamischen Detektionsbereich der miteinander interagierenden Fluorophore beeinflussen kann, und daher ist die Trennung auf der Grundlage von Emission und Anregung ein kritischer erster Schritt bei der Trennung von Fluorophoren. Abhängig von den Eigenschaften Ihres Mikroskops und der Anzahl der Fluoreszenzparameter, die abgebildet werden müssen, kann es erforderlich sein, mehrere Fluorophore, die die gleichen Anregungswellenlängen, aber in ihren Emissionswellenlängen unterscheiden, auf denselben Laserlinien zu platzieren. Dies wird typischerweise durch die Verwendung von basischen Fluoreszenzfarbstoffen in Kombination mit konjugierten Fluoreszenzfarbstoffen erreicht, wobei die konjugierten Farbstoffe bei längeren Wellenlängen emittieren und somit anhand ihrer Emissionswellenlängen unterschieden werden können. Insgesamt müssen Farbstoffe entweder durch ihre Anregungs- oder Emissionsfrequenzen unterschieden werden, um eine effektive Trennung zu gewährleisten.

Das Erreichen einer perfekten Kompensation wird durch mehrere Faktoren erschwert, einschließlich des räumlichen Aspekts der Kompensation. Erstens, ob ein Fluorophor ein Photon emittiert, beruht zum Teil auf dem Zufall²³, bei dem die gesammelten Photonen in jedem Bild auf Orte mit dichter Färbung verzerrt sind. In weniger dicht gefärbten Bereichen kann es jedoch vorkommen, dass ein Photon emittiert wird, das in einem der überlappenden Kanäle, aber nicht im Hauptkanal vorkommt. Da die Kompensation pro Voxel angewendet wird, wird die spektrale Überlappung während der Kompensation aufgrund fehlender räumlicher Kolokalisierung nicht entfernt. Dies ist in Abbildung 2 zu sehen, wo die Kompensation dazu führt, dass die Stellen der dichten Färbung reduziert werden (die Ränder der Kügelchen), nicht aber die Mitte der Kügelchen, wo es nur minimale Flecken und eine geringe Überlappung mit den Kanälen mit Durchscheinen gibt. Diese Färbung in der Mitte der Kügelchen ist wahrscheinlich auf ein anderes Problem zurückzuführen, das die Kompensation beeinflussen kann, nämlich dass Photonen, die außerhalb der Fokusebene erzeugt werden, in Voxeln in der Fokusebene auftreten können, die wahrscheinlich nicht sowohl im Hauptkanal als auch in dem Kanal reproduziert werden, der kompensiert werden muss²⁴. Infolgedessen wird dieses "Rauschen" durch die Kompensation nicht wirksam beseitigt, ohne dass es zu einer Überkompensation kommt. Diese Probleme können teilweise behoben werden, indem ein Linienmittelwert verwendet wird, die Fluoreszenzwerte eines einzelnen Voxels mehrmals gemessen werden und der Durchschnitt verwendet wird, um die Auswirkungen zufälliger Ereignisse zu begrenzen. Bei Verwendung eines konfokalen Mikroskops kann die Lochblende auch verkleinert werden, um auszuschließen, dass unscharfe Photonen in die Bilder eingearbeitet werden^{können 25,26}. Die Verwendung dieser Korrekturen geht auf Kosten zusätzlicher Bildaufnahmezeiten, die sehr umfangreich werden können.

Diese Technik wurde zwar unter Verwendung von Bildern entwickelt, die von einem konfokalen Mikroskop aufgenommen wurden, funktioniert aber auch mit anderen Arten von Mikroskopen. Andere, die ähnliche Methoden anwenden, haben diese Methoden mit großem Erfolg auf Bilder von Zwei-Photonen-Mikroskopen¹⁷ angewendet. Während diese Technik auf Bilder von Weitfeldmikroskopen angewendet werden könnte, gibt es mehrere Vorteile, die mit konfokalen Mikroskopen verbunden sind, die die Auflösung der Frage, ob ein Photon aus der Brennebene stammt, verbessern. Da eine genaue Auflösung der Position von Photonen (d.h. optischer Schnitt) die Qualität der Kompensation verbessert, ist zu erwarten, dass die Qualität der Kompensation relativ schlecht sein wird. Dies könnte möglicherweise durch die Verwendung von Dekonvolution zur Entfernung unscharfer Photonen behoben werden, um die Auflösung der Weitfeldbilder zu verbessern²⁷. Ein wichtiger Vorbehalt, der darüber entscheidet, ob die Dekonvolution mit diesem Protokoll kompatibel ist, ist die Frage, ob die Fluoreszenzwerte in jedem Kanal über alle analysierten Bilder hinweg proportional zueinander bleiben. Wenn die Fluoreszenzwerte nach der Dekonvolution beliebig werden, dann ist es unwahrscheinlich, dass die gleiche Kompensationsmatrix, die auf einem Bild erzeugt wurde, erfolgreich auf andere Bilder angewendet wird. Insgesamt ist der wichtigste Faktor, der darüber entscheidet, ob ein Mikroskop diesen Arbeitsablauf nutzen kann, ob es über Detektoren verfügt, deren Erfassungsbereich flexibel eingestellt werden kann. Wenn dies verfügbar ist, können mehrere Fluorophore, die durch dieselbe Anregung stimuliert werden, durch die Detektion ihrer Emissionsspektren innerhalb verschiedener Detektionsfenster aufgelöst werden.

Die Anzahl der Fluoreszenzparameter kann noch weiter erhöht werden, wenn sie mit Techniken zur seriellen mehrfachen Färbung desselben Gewebes kombiniert werden¹³, wie z. B. IBEX^14,15. Durch die serielle Färbung kann eine praktisch unbegrenzte Anzahl von Parametern gemessen werden; Dies kann jedoch sehr zeitaufwendig sein. Die Verwendung einer Kombination aus den hier besprochenen Kompensationsmethoden und der seriellen Färbung kann die für die Aufnahme dieser Bilder erforderliche Zeit erheblich reduzieren, da für jede Färbungsrunde mehr Kanäle gleichzeitig abgebildet werden können. Die hier beschriebene Analysepipeline kann für beliebig viele Marker skaliert werden und ist mit seriell gefärbten Gewebeschnitten kompatibel.

Ein kritischer Schritt in dieser Analysepipeline ist die Segmentierung einzelner Zellen aus Histologiebildern. Die Suche nach effektiven Strategien zur genauen Segmentierung von Zellen aus histologischen Bildern ist ein häufiges Problem²⁸, und neuere Methoden werden kontinuierlich weiterentwickelt. Während mit dieser Methode einzelne Zellen effektiv von dicht gepackten Zellen getrennt werden können, sind die genauen Grenzen der Zellen oft unvollkommen. Es wird daher empfohlen, dass Benutzer die Analyse auf die Zellpopulationen beschränken, an denen sie interessiert sind, denn je weniger Zellen getrennt werden müssen, desto genauer sind die Zellgrenzen. Benutzer können auch eine bessere Trennung von Zellen erreichen, indem sie mehrere Populationen in ilastik definieren, was es dem Programm ermöglicht, verschiedene Zellpopulationen zu segmentieren. Ein Problem bei diesem Ansatz ist jedoch, dass Zellen, die auf diese Weise definiert sind, in Software 3 nicht zu demselben "Zell"-Objekt kombiniert werden können und möglicherweise zu einer Doppelzählung von Zellen führen könnten. Wenn jedoch genauere Zellgrenzen für ein Experiment entscheidend sind, kann dieser Ansatz verwendet werden. Es wird empfohlen, dass Benutzer mit neueren Segmentierungsalgorithmen experimentieren, während sie entwickelt werden, und sie in diese Pipeline integrieren, um noch bessere Ergebnisse zu erzielen.

Bei der Entwicklung eines neuen Histoflow-Zytometrie-Panels können mehrere Probleme auftreten. Erstens ist es entscheidend, dass verschiedene Fluoreszenzmarker ungefähr gleiche Mengen an Fluoreszenz erzeugen. Wenn ein Fluorophor viel heller ist als ein anderes, kann dies problematisch sein, wenn dieses Fluorophor in ein anderes Fluorophor übergeht, da das Durchscheinen die tatsächliche Färbung in diesem Kanal überholen kann. Dies ist in Abbildung 3 zu sehen, wo Alexa Fluor 546 stark in PE-eFluor 610 blutet. Während die Kompensation dieses Durchscheinen immer noch beseitigen kann, gibt es oft immer noch eine anhaltende Fluoreszenz, da unscharfes Licht nicht entfernt wird, was die Kompensation unvollständig machen kann. Darüber hinaus verfügen die meisten Detektoren, die in Mikroskopen verwendet werden, nicht über umfangreiche Dynamikbereiche wie bei Durchflusszytometern. Infolgedessen wird mit zunehmendem Durchbluten in einem Kanal ein größerer Teil des Dynamikbereichs in diesem Detektor mit Signalen von anderen Fluorophoren und weniger von dem interessierenden Fluorophor gesättigt. Wenn die Kompensation von einem solchen Kanal mit umfangreichem Durchscheinen entfernt wird, kann das wahre Signal aufgelöst werden. Die Differenz zwischen den Zellen, die für diesen Marker positiv sind, und denen, die für ihn negativ sind, wird jedoch kleiner und kann dazu führen, dass Zwischenzustände nicht aufgelöst werden können oder möglicherweise sogar positive von negativen aufgelöst werden können. Daher sollten Überlappungen zwischen den Kanälen vermieden werden. Zweitens kann sich die Helligkeit von Markern zwischen verschiedenen Geweben ändern. Ein Panel von Markern, das beispielsweise auf Lymphknoten wirkt, funktioniert möglicherweise nicht mehr, wenn es auf die Milz oder das Zentralnervensystem angewendet wird, da ein Marker zu hell oder dunkel werden kann, was dazu führt, dass dieser Kanal zu stark in andere Kanäle blutet oder vom Durchbluten aus anderen Kanälen überwältigt wird. In einem solchen Fall kann es notwendig sein, die Fluorophore auf Marker umzuschalten oder die Verwendung von primären konjugierten Antikörpern auf die Verwendung von Sekundärantikörpern umzustellen. Schließlich kann es nützlich sein, Unterschiede in der Lokalisierung von Markern zu nutzen, wenn es zu einer übermäßigen Überlappung zwischen den Kanälen kommt. Wenn sich zwei Kanäle stark überlappen, aber einer ein Kernmarker und der andere ein Zelloberflächenmarker ist, dann beeinflusst sich die spektrale Überlappung nur minimal, da die Kompensation nicht dieselben Voxel beeinflusst. Wenn möglich, sollten die Panels so gestaltet werden, dass sichergestellt wird, dass sich überlappende Kanäle in ihrer Lokalisierung unterscheiden oder dass die Marker auf separaten Zellen exprimiert werden.

Insgesamt wird gezeigt, dass die Histoflow-Zytometrie eine vielseitige Technik ist, um histologische Bilder auf Einzelzellebene zu analysieren. Während ältere Techniken auf die Analyse von Zellen beschränkt werden können, die nicht in direktem Zell-Zell-Kontakt stehen, kann diese Analysepipeline Zellen in Kontakt trennen, wodurch sie für die Untersuchung von Zellen in Geweben in der Homöostase oder bei Entzündungen geeignet ist, wenn sich Immunzellen an Schadensstellen ansammeln.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
100% Ethanol	Sigma	676829-1L
4% PFA	Elektronenmikroskopie Sciences	157-4
Anaconda	N/A	N/A
Rinderserum Albumin	Sigma	A4503-50G
Kalte Fischfleckengelatine	Sigma	G7765
Sammeln von Mehrkanaldaten aus dem Imaris.ipynb-Skript	N/A	N/A	https://github.com/elliottcalgary/Histoflow-Cytometry-Analysis-Konvertieren
der FlowJo-Ausgabe in eine txt-Datei für die Zellauswahl im Imaris.ipynb-Skript	N/A	N/A
https://github.com/elliottcalgary/Histoflow-Cytometry-Analysis-Donkey Anti-Ratte Alexa Fluor 647	JacksonImmunoResearch	712-605-153	1:300 Konzentration
Donkey Anti-Ratte DyLight 405	Jackson ImmunoResearch	712-475-153	1:200 Konzentration
Donkey Serum	JacksonImmunoResearch	017-000-001
F(ab')2-Ziege Anti-Maus IgG PerCP-eFluor 710	Thermofisher	46-4010-82	1:25 Konzentration
FIJI	N/A	N/A	https://imagej.net/software/fiji/
FlowJo	FlowJo LLC		Software 4
Fluoreszenzspektrenansatz			https://www.thermofisher.com/order/fluorescence-spectraviewer/#!/
Fluoromount-G	Southern Biotech	0100-01
Frisch gefrorene menschliche Mandelschnitte	amsbio	HF-707
Glasdeckglas	VWR	48393 106
Ziege anti-human IgA Alexa Fluor 488	JacksonImmunoResearch	109-546-011	1:400 Konzentration
Ziege anti-human IgG Cy3	JacksonImmunoResearch	709-166-098	1:400 Konzentration
Ziege anti-human IgM Dylight 405	JacksonImmunoResearch	109-476-129	1:300 Konzentration
Ziege Anti-Kaninchen A546	Thermo Fisher Scientific	A-11035	1:250 Konzentration
Ziege Anti-Kaninchen IgG PE-Alexa Fluor 610	Thermofisher	A-20981	1:250 Konzentration
Pferdeserum	Sigma	H1138
Ilastik	N/A	N/A
Ilastik FIJI plugin	N/A	N/A
Imaris File Converter	Oxford Instruments		Software 2
Imaris mit Zellmodul	Oxford Instruments		Software 3
kimwipe	Kimtech	34155
LasX Life Science Software	Leica		Software 1
Maus anti-human CD20	VWR	CA95024-322	1:40 Konzentration
Maus anti-human CD38 APC-R700	BD Biosciences	564980	1:20 Konzentration
Normales Ziegenserum	JacksonImmunoResearch	005-000-001
Normales Mausserum	JacksonImmunoResearch	015-000-001
Normales Kaninchenserum	JacksonImmunoResearch	011-000-001
Normales Rattenserum	JacksonImmunoResearch	012-000-120
Nuclear Yellow	Abcam	ab138903	DMSO in einer Konzentration von 2 mg/ml auflösen und bei 4° C lagern; C im Dunkeln
PAP Pen	Cedarlane	MU22
PBS	Gibco	10010-023
Kaninchen Anti-Mensch Ki67	Abcam	ab15580	Konzentration 1:500
Kaninchen Anti-Maus Iba1	Wako	019-19741	1:500 Konzentration
Ratte Anti-Mensch Blimp1	Thermofisher	14-5963-82	1:40 Konzentration
Ratte Anti-Maus B220 Alexa Fluor 647	BioLegend	103226	1:250 Konzentration
Ratte Anti-Maus CD138	Biolegend	142502	1:200 Konzentration
Ratte Anti-Maus CD3 PE-eFluor 610	Thermo Fisher Scientific	61-0032-82	1:40 Konzentration
Ratte Anti-Maus CD4 Alexa Fluor 488	BioLegend	100529	1:200 Konzentration
Ratte Anti-Maus CD45 allophycocyanin-R700	BD Biosciences	565478	1:50 Konzentration
Ratte Anti-Maus IgD PerCP-eFluor 710	Thermo Fisher Scientific	46-5993-82	1:50 Konzentration
SP8 Konfokales Mikroskop	Leica
Triton X-100	Sigma	X100-500ml
Trueblack	Biotium	23007
Tween-20	Sigma	P7949-500ml
Ultracomp Ebeads	Thermofisher	01-2222-42