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Methodenartikel

Profilierung des luminalen pH-Werts in dreidimensionalen gastrointestinalen Organoiden mit Hilfe von Mikroelektroden

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DOI:

10.3791/66900

⸱

5. Juli 2024

 ,  , 
1Department of Microbiology & Cell Biology, Montana State University, 2Department of Physics, Boston University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Das vorliegende Protokoll beschreibt pH-Messungen in aus menschlichem Gewebe gewonnenen Magenorganoiden unter Verwendung von Mikroelektroden zur raumzeitlichen Charakterisierung der intraluminalen Physiologie.

Zusammenfassung

Die Optimierung und detaillierte Charakterisierung von gastrointestinalen Organoidmodellen erfordert fortschrittliche Methoden zur Analyse ihrer luminalen Umgebungen. In dieser Arbeit wird eine hochgradig reproduzierbare Methode zur präzisen Messung des pH-Werts in der Lumina von menschlichen 3D-Magenorganoiden mittels mikromanipulatorgesteuerter Mikroelektroden vorgestellt. Die pH-Mikroelektroden sind im Handel erhältlich und bestehen aus abgeschrägten Glasspitzen mit einem Durchmesser von 25 μm. Für Messungen wird die pH-Mikroelektrode in das Lumen eines Organoids (>200 μm) vorgeschoben, das in Matrigel suspendiert ist, während eine Referenzelektrode in der Kulturplatte im umgebenden Medium eingetaucht ist.

Durch die Verwendung solcher Mikroelektroden zur Profilierung von Organoiden, die aus dem menschlichen Magenkörper stammen, zeigen wir, dass der luminale pH-Wert in jeder Kulturvertiefung bei ~7,7 ± 0,037 relativ konstant ist und dass kontinuierliche Messungen von mindestens 15 Minuten durchgeführt werden können. Bei einigen größeren Organoiden zeigten die Messungen einen pH-Gradienten zwischen der Epitheloberfläche und dem Lumen, was darauf hindeutet, dass pH-Messungen in Organoiden mit hoher räumlicher Auflösung durchgeführt werden können. In einer früheren Studie wurden Mikroelektroden erfolgreich zur Messung der luminalen Sauerstoffkonzentration in Organoiden eingesetzt, was die Vielseitigkeit dieser Methode für Organoidanalysen demonstriert. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass dieses Protokoll ein wichtiges Werkzeug für die funktionelle Charakterisierung des komplexen luminalen Raums innerhalb von 3D-Organoiden darstellt.

Einleitung

Organoide - multizelluläre Miniaturstrukturen, die aus Stammzellen gewonnen werden - haben unsere Fähigkeit, die menschliche Physiologie zu untersuchen, revolutioniert und beginnen, Tiermodelle zu ersetzen, selbst in regulatorischen Umgebungen1. Seit der Erstbeschreibung von Darmorganoiden durch Sato et al. im Jahr 2009 ist die Organoid-Technologie immens populär geworden2. Eine große Anzahl von Studien hat die zelluläre Zusammensetzung und Funktion von Organoidmodellen sehr detailliert charakterisiert 3,4,5,6. Der luminale Raum dieser multizellulären 3D-Strukturen ist jedoch weitgehend undefiniert 7,8. Das Lumen ist der zentrale Hohlraum von Organoiden, die aus Schleimhautgeweben gewonnen werden und von den apikalen Anteilen polarisierter Epithelzellen umgeben sind. Da zelluläre Sekretion und Absorption überwiegend an der apikalen Epitheloberfläche stattfinden, wird die luminale Mikroumgebung von Organoiden durch diese wichtigen physiologischen Prozesse gesteuert. Die derzeit verwendeten Organoidmodelle zeigen Variationen in den Signalmustern der Zellen, der Gesamtstammzelle, den Gradienten der Metabolitenkonzentration und den Umweltbedingungen9. Das Verständnis der organoiden luminalen Physiologie ist daher für die genaue Modellierung der Organfunktion und -pathologie notwendig. Leider behindert die relative Unzugänglichkeit des Lumens die funktionelle Analyse der luminalen Physiologie in 3D-Organoidenerheblich 10.

Die Fähigkeit, pH-Profile zu untersuchen, ist besonders wichtig im Magen, der dafür berüchtigt ist, den steilsten Protonengradienten im Körper zu haben, der von etwa 1-3 im Lumen bis nahezu neutral am Epithelreicht 11,12,13. Es gibt nach wie vor eine erhebliche Lücke in unserem Verständnis der mikroskaligen Aufrechterhaltung des pH-Gradienten des Magens und der Bedeutung von Organoidmodellen bei der Rekapitulation dieses dynamischen Milieus über die Magenschleimschicht. Traditionelle Ansätze zur Analyse des pH-Werts von Organoiden beinhalten die Verwendung von pH-empfindlichen Farbstoffen, bei denen es sich um fluoreszierende oder kolorimetrische Indikatoren handeln kann. McCracken et al. verwendeten eine luminale Injektion von SNARF-5F - einem ratiometrischen pH-Indikator - in Organoide, um einen Abfall des luminalen pH-Werts als Reaktion auf die Histaminbehandlung zu analysieren. Solche Farbstoffe können in die Nährmedien eingearbeitet werden, was eine nicht-invasive Überwachung des pH-Werts in Echtzeit ermöglicht. pH-empfindliche Farbstoffe erfordern nicht nur komplexe Kalibrierschritte, die zu einer schlechten Zuverlässigkeit und Genauigkeit bei Messungen beitragen, sondern solche Farbstoffe neigen auch dazu, innerhalb spezifischer Nachweisbereiche zu arbeiten, die möglicherweise nicht repräsentativ für den gesamten pH-Bereich innerhalb der interessierenden Mikroumgebung sind14,15. Es könnte jedoch als sinnvoll angesehen werden, Indikatorfarbstoffe für Bestätigungsversuche zu verwenden. Optische Nanosensoren, die fluoreszierende optodenbasierte pH-Sensoransätze verwenden, wurden ebenfalls entwickelt. Solche Sensortechniken erfordern jedoch mikroskopische Bildgebung und sind auch anfällig für Photobleichung, Phototoxizität sowie Bildgebungsverzerrungen16,17. Darüber hinaus haben Brooks et al. 3D-gedruckte Multiwell-Platten mit Mikroelektroden entwickelt, auf denen Organoide plattiert werden können18. Dieser Ansatz erlaubt jedoch keine Messungen direkt im Inneren des Organoid-Lumens.

Elektrodenbasierte pH-Messungen können im Vergleich zu anderen Methoden eine verbesserte Genauigkeit erreichen und eine Echtzeit-pH-Überwachung ermöglichen. Darüber hinaus ermöglichen pH-Elektroden, die an Mikromanipulatoren montiert sind, eine überlegene räumliche Auflösung von pH-Messungen, da die genaue Position der Elektrodenspitze fein gesteuert werden kann. Dies ermöglicht eine höchstmögliche Flexibilität und Reproduzierbarkeit bei der Analyse von Organoidmodellen. Bei den hier verwendeten Elektroden handelt es sich um miniaturisierte pH-Mikroelektroden, die auf der Grundlage der Diffusion von Protonen durch selektives pH-Glas arbeiten, das einen dünnen Platindraht umgibt. Die Mikroelektrode wird mit einer externen Ag-AgCl-Referenzelektrode verbunden und anschließend mit einem hochohmigen Millivolt-Messgerät verbunden. Das elektrische Potential zwischen den beiden Elektrodenspitzen, wenn es in dieselbe Lösung getaucht wird, spiegelt den pH-Wert der Lösung19 wider. Solche Microprofiling-Systeme wurden bei der metabolischen Analyse von Biofilmen20,21, planktonischen Algen22, menschlichen Sputumproben23 und sogar in mesenchymalen Stammzell-Sphäroiden24 eingesetzt. Sowohl unser Labor als auch Murphy et al. haben zuvor mikromanipulatorgesteuerte O2 -Mikroelektroden verwendet, um die Sauerstoffkonzentrationen in den luminalen Räumen von Organoiden zu bewerten. Murphy et al. kombinierten diese Methode mit mathematischer Modellierung, um einen Sauerstoffgradienten innerhalb ihrer Sphäroide aufzudecken. Unsere Gruppe war in der Lage, einen reduzierten luminalen Sauerstoffgehalt in gewebeabgeleiteten Magenorganoiden im Vergleich zur umgebenden extrazellulären Matrixzu finden 25.

Hier stellen wir eine detaillierte Methode für die manuelle Mikroelektrodenprofilierung des luminalen pH-Werts in Organoiden des sphärischen Gastrointestinaltrakts vor, die ein verbessertes physiologisches Verständnis ihrer komplexen luminalen Mikroumgebung ermöglicht. Wir gehen davon aus, dass diese Technik der Erforschung der Physiologie von Organoiden durch hochauflösende Echtzeitmessungen des pH-Werts auf der Mikroskala eine neue Dimension hinzufügen wird. Darüber hinaus könnte das folgende Protokoll leicht für die Analyse von O2, N2O, H2, NO, H2S, Redox und Temperatur in verschiedenen Arten von Organoidmodellen angepasst werden. Physiologisches Profiling dient als wertvolles Instrument zur Optimierung der Bedingungen von Organoidkulturen, um In-vivo-Umgebungen besser nachzuahmen und dadurch die Relevanz und den Nutzen von Organoidmodellen in der biomedizinischen Forschung zu erhöhen.

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Protokoll

Dieses Protokoll erfordert 3D-Organoide mit einem Durchmesser von mindestens 200 μm, die ein ausgeprägtes Lumen haben und in eine künstliche extrazelluläre Matrix (ECM, z. B. Matrigel) eingebettet sind. Humanes Magengewebe für die Organoid-Gewinnung wurde mit Genehmigung des Institutional Review Board der Montana State University und mit Einverständniserklärung von Patienten gewonnen, die sich bei Bozeman Health einer oberen Endoskopie unterziehen (Protokoll # 2023-48-FCR, zu D.B.) oder als befreite Proben des ganzen Magens oder des Schlauchmagens aus dem National Disease Research Interchange (Protokoll #DB062615-EX). Informationen über die für diese Studie verwendeten Organoidlinien und Durchgangsnummern sind in Tabelle 1 enthalten, und die Medienzusammensetzung ist in Tabelle 2 aufgeführt. Siehe zuvor veröffentlichte Protokolle für die Erzeugung und Aufrechterhaltung von gastrointestinalen Organoidlinien 6,26,27.

1. Vorbereitung von humanen Magenorganoiden für die Erstellung von pH-Profilen

  1. Initiieren und pflegen Sie Magen-Organoid-Kulturen unter Verwendung von Standardprotokollen. Organoide werden auf 24-Well-Platten in 500 μl Expansionsmedium pro Well aufbewahrt (Tabelle 2). In der Passage wurden alle 5-7 Tage Organoidlinien etabliert und in eine 35-mm-Glasbodenschale überführt, um die Experimente zur pH-Profilierung vorzubereiten.
    HINWEIS: Organoidkulturen für unsere Versuche werden aus Magendrüsenpräparaten gewonnen, die wie oben beschrieben aus adultem Gewebe gewonnen werden. Wir verwenden eine Kollagenase-Gewebeverdauungsmethode, um diese Drüsen zu isolieren, bevor sie in der EZM suspendiert werden, wie zuvor beschrieben 25,28,29.
  2. Wählen Sie aus aktiv wachsenden Organoidkulturen in den Passagen 1-15 Vertiefungen aus, die mindestens 100 Organoide (ca. 2 Millionen Zellen) mit Durchmessern zwischen 200 und 700 μm für den Transfer und die Expansion auf 3,5 mm Petrischalen enthalten.
  3. Lassen Sie bei der Vorbereitung der Organoide für die Beschichtung (Schritte 1.4-1.8) die Aliquot(en) der extrazellulären Matrix (ECM) mindestens 45 Minuten lang auf Eis auftauen. Halten Sie die ECM während des gesamten Protokolls auf Eis, um eine Gelierung zu verhindern. Die Zellkulturplatten können vorgewärmt werden, indem Sie sie in einen 37 °Cheißen Inkubator mit 5 % CO 2 stellen.
  4. Entfernen Sie das Medium aus den Vertiefungen und ernten Sie die Magenorganoidkulturen, indem Sie eiskaltes PBS auf jedes ECM-Tröpfchen pipettieren und das Gel mit der Spitze einer P1000-Pipette zerkratzen. Pipettieren Sie das PBS mit den EZM-Fragmenten, die Organoide enthalten, in ein konisches 15-ml-Röhrchen.
  5. Das Röhrchen wird bei 200 × g bei 4 °C 5 min lang zentrifugiert. Die EZM-Fragmente, die die Organoide enthalten, sind als Schicht am Boden des Röhrchens sichtbar. Den Überstand vorsichtig aspirieren und 350 μl 0,25 % Trypsin-EDTA in jedes Röhrchen pipettieren und vorsichtig durch Auf- und Abpipettieren mischen. Inkubieren Sie die Röhrchen in einem 37 °C warmen Wasserbad für 2-5 min.
  6. Nach der Inkubation mit Trypsin-EDTA werden 600 μl eiskaltes DMEM mit Penicillin/Streptomycin in jedes Röhrchen gegeben und mindestens 40x kräftig auf und ab pipettiert. Bei 200 × g bei 4 °C 5 min zentrifugieren. Aspirieren Sie den Überstand. Um Kulturen für pH-Messungen einzurichten, resuspendieren Sie das Zellpellet in eiskaltem, flüssigem ECM bei einem Verhältnis von 1:4 V/V von Organoid-Pellet zu ECM für die Beschichtung.
  7. Für jede Probe werden 40 μl flüssige ECM, die Organoide/Organoidfragmente enthält, in einer dünnen horizontalen Linie entlang des Durchmessers einer Glasbodenschale von 35 mm in einer Platte aufgefüllt.
    HINWEIS: Das Auftragen des Gels in einer Linie anstelle eines runden Tröpfchens auf die Platte ermöglicht einen leichteren Zugang zu einzelnen Organoiden, indem die Kultur ausgedünnt wird.
  8. Lassen Sie das Gel 15-30 Minuten lang polymerisieren; Geben Sie dann vorsichtig 2 ml organoides Expansionsmedium in die Platte, indem Sie entlang des Randes der Vertiefung pipettieren, um eine Störung des Gels zu vermeiden.
  9. Tauschen Sie die Medien jeden zweiten Tag aus. Warten Sie 4-8 Tage, bis mindestens 10 Organoide auf einen Mindestdurchmesser von 400 μm herangewachsen sind.
  10. Um mit einem pH-Profiling-Experiment fortzufahren, stellen Sie sicher, dass jede Kultur mindestens 10 Organoide enthält, die die folgenden Kriterien erfüllen: >200 μm Durchmesser, gesundes Aussehen (wenig bis kein dunkles Material in Organoiden sichtbar, die mit einem Hellfeldmikroskop beobachtet wurden) und nicht von anderen Organoiden überfüllt.

2. Auspacken und Kalibrieren von Mikroelektroden

HINWEIS: Um Messungen im Mikromaßstab zu ermöglichen, wird zusätzlich zur pH-Sensor-Mikroelektrode eine separate Referenzelektrode verwendet, anstatt ein integriertes (und damit sperrigeres) Design zu verwenden. Sowohl die pH-Mikroelektrode als auch die Referenzelektrode müssen nass gelagert werden. Lassen Sie die Luft nicht länger als 10 Minuten am Stück auskommen. Bestimmen Sie die geeignete Spitzengröße für die Anwendung. Hier haben wir eine potentiometrische pH-Mikroelektrode mit einem abgeschrägten Spitzendurchmesser von 25 μm verwendet.

  1. Während sich die Mikroelektrode noch in ihrem Schutzrohr befindet, überprüfen Sie die Spitze visuell auf Beschädigungen.
  2. Verbinden Sie die Referenzelektrode über den Stecker mit dem pH-Elektrodenkabel. Verbinden Sie dann die Mikroelektrode mit dem Verstärker und den Verstärker über ein USB-Kabel mit einem geerdeten PC mit der Software (Abbildung 1A).
  3. Füllen Sie zwei konische 50 mL Röhrchen 2/3 mit 70% Ethanol und deionisiertem H2O (diH2O). Legen Sie die Mikroelektrode und die Referenzelektrode in das diH2O Rohr und achten Sie darauf, dass beide Spitzen mindestens 1 cm in die Flüssigkeit eingetaucht erscheinen.
    HINWEIS: Für diesen und ähnliche Schritte können auch hohe Becher verwendet werden.
  4. Lassen Sie die Elektroden ~10 Minuten lang äquilibrieren.
    HINWEIS: Der Vorgang kann in diesem Schritt auch unterbrochen und später fortgesetzt werden, da die Elektroden in diH2O gelagert werden können.
  5. Während sich die Elektroden äquilibrieren, öffnen Sie die Software (rotes Symbol) auf dem PC-Arbeitsplatz. Stellen Sie sicher, dass auf der Registerkarte Einstellungen das Kontrollkästchen neben der Mikroelektrode aktiviert ist, um anzuzeigen, dass sie ordnungsgemäß angeschlossen und von der Software erkannt wird. Klicken Sie oben links im Fenster auf Experiment starten und geben Sie den gewünschten Dateinamen und das gewünschte Ziel ein. Klicken Sie im Fenster Sensorkalibrierung und Experimentiereinstellungen auf Alle Punkte löschen , um die Software für eine neue Kalibrierung vorzubereiten.
  6. Füllen Sie zwei konische 50-ml-Röhrchen 2/3 mit pH 4,01 und pH 9,21 Kalibrierpuffern. Tupfen Sie den Schutzschlauch und die Referenzelektrode vorsichtig mit einem feinen Labortuch trocken.
  7. Ausgehend von den Elektroden im pH 4,01 Puffer geben Sie als bekannten pH-Wert 4,01 ein. Sobald sich der mV-Messwert stabilisiert hat, wählen Sie Punkt hinzufügen. Vergewissern Sie sich, dass das Signal bei ~380 mV stabil ist. Nachdem der Punkt hinzugefügt wurde, setzen Sie beide Elektroden zum Spülen wieder in diH2O ein und tupfen Sie dann wieder trocken.
  8. Wiederholen Sie den vorherigen Schritt mit dem 9.21-Puffer und klicken Sie auf Punkt hinzufügen , wenn das Signal stabil ist (~83 mV). Überprüfen, ob die Mikroelektroden linear zwischen pH 4,01 und 9,21 reagieren; Daher ist nur eine Zwei-Punkt-Kalibrierkurve notwendig. Stellen Sie sicher, dass die resultierende Linie zwischen diesen Punkten eine negative Steigung von 50-70 mV/pH-Einheit aufweist. Klicken Sie auf Speichern und Kalibrierung verwenden.
    HINWEIS: Sie können nun mit der Aufzeichnung von Messungenbeginnen 30.

3. Erstellung von pH-Profilen menschlicher Magenorganoide

HINWEIS: Das folgende Protokoll wird für Rechtshänder beschrieben. VORSICHT: Deaktivieren Sie alle Energiesparoptionen auf Ihrem PC, da laufende Messungen unterbrochen werden, wenn der PC in den Energiesparmodus wechselt.

  1. Montieren Sie ein Ringstativ mit einer Klemme an der linken Seite eines Stereomikroskops, um die Referenzelektrode zu halten. Positionieren Sie einen Mikromanipulator, der an einem schweren Laborständer befestigt ist, auf der rechten Seite des Mikroskops (Abbildung 1A).
  2. Entfernen Sie die Mikroelektrode vorsichtig aus dem Schutzgehäuse, indem Sie sie flach auf die Bank legen und das Gehäuse mit einer schnellen, schnellen Bewegung abziehen.
    ACHTUNG: Die Mikroelektroden sind unglaublich zerbrechlich und es sollte darauf geachtet werden, dass die Spitze nicht mit steifem, festem Material in Berührung kommt. Die besten Ergebnisse erzielen Sie, wenn Sie Messungen auf einem stabilen Tischgerät durchführen, das frei von Geräten ist, die zu Vibrationen der Bank oder unerwünschten Bewegungen der Elektroden führen könnten.
  3. Montieren Sie die Mikroelektrode auf einem Mikromanipulator und ordnen Sie das Stereoskop und den Mikromanipulator so an, dass die Mikroelektrode in Richtung der Kulturschale vorgeschoben werden kann, ohne das Objektiv oder andere Teile des Mikroskops zu treffen.
  4. Positionieren Sie die Kulturschale mit den Organoiden so, dass das erste Organoid, das profiliert werden soll, angemessen sichtbar ist (Abbildung 1B).
  5. Befestigen Sie die Referenzelektrode leicht an der Klemme am Ringstativ links vom Stereoskop. Positionieren Sie die Referenzelektrode so, dass sie in dem Medium aufliegt, das die ECM umgibt. Achten Sie darauf, dass die Organoide nicht gestört werden, wenn der Tisch zwischen den Messungen bewegt wird.
  6. Schauen Sie direkt auf die Kulturplatte (nicht in das Mikroskop) und schieben Sie die Spitze der Mikroelektrode vor, bis sie ausreichend in das Medium eingetaucht ist. Klicken Sie in der Software auf der Registerkarte Datenlogger auf die Schaltfläche Start (einzelnes Dreieck nach rechts), um die Aufzeichnung zu starten. Stellen Sie sicher, dass das Kontrollkästchen Kalibriert auf der rechten Seite des Bildschirms aktiviert ist.
    HINWEIS: Lassen Sie ~10 s für jeden Messwert stabilisieren, bevor Sie zum nächsten Bereich wechseln.
  7. Stellen Sie vor dem Eintritt in die ECM sicher, dass die Elektrodenspitze unter dem Mikroskop sichtbar ist und dass sie so positioniert ist, dass sie linear auf das erste Organoid von Interesse zusteuert. Schieben Sie die Elektrode langsam in das Gel ein, ohne mit Organoiden in Berührung zu kommen. Notieren Sie mindestens drei pH-Messwerte und berechnen Sie den Durchschnitt.
  8. Positionieren Sie die Mikroelektrode so, dass sie bereit ist, sich entlang der Achse senkrecht zur Oberfläche in Richtung des ersten Organoids von Interesse zu bewegen. Lassen Sie die Elektrode eine kleine Vertiefung auf der Epitheloberfläche machen, ohne einzudringen (Abbildung 1C).
    HINWEIS: Dieser Schritt gibt auch Aufschluss darüber, ob das Organoid an Ort und Stelle bleibt oder ob es sich in der EZM freier bewegen kann.
  9. Schieben Sie die Mikroelektrode mit einer schnellen Bewegung in das Organoid vor. Wenn sich das Organoid um die Mikroelektrode herum bewegt oder sich entfernt, versuchen Sie es in einem etwas anderen Winkel oder setzen Sie es gegen ein anderes Organoid oder den Kunststoffrand an, der den Deckglasboden der Schale umgibt. Messen Sie den luminalen pH-Wert (drei einzelne Male) von 10 verschiedenen Organoiden für jede Versuchsbedingung. Wenn Sie mit der Aufzeichnung der Messungen fertig sind, klicken Sie auf die quadratische Schaltfläche Stopp.
    ACHTUNG: Schätzen Sie den Durchmesser des Organoids, um zu entscheiden, wie weit die Elektrode in das Organoidlumen vorgeschoben werden soll, und achten Sie darauf, es nicht zu durchstoßen. Um die Genauigkeit zu erhöhen, messen Sie den Durchmesser mit der Kamerasoftware Ihres Mikroskops, falls verfügbar. HINWEIS: Wenn die Spitze der Mikroelektrode nach einer oder mehreren Messungen merklich mit Schmutz bedeckt ist, waschen Sie die Mikroelektrode in Zelldissoziationslösung, PBS, EtOH und dann diH2O, bevor Sie fortfahren.

4. Motorisierte Profilierung (optional)

ANMERKUNG: Diese Option erfordert einen Mikromanipulator, der auf einem mechanischen Motortisch montiert ist, der schließlich von einer Computersoftware über eine Motorsteuerung31 gesteuert wird.

  1. Öffnen Sie die Profilerstellungssoftware (braunes Symbol), und starten Sie ein neues Experiment auf der Registerkarte Profilerstellung .
  2. Die Einstellungen für die z-Achse erkennen den Motor automatisch, wenn ein Motorgerät ordnungsgemäß angeschlossen ist.
    HINWEIS: Die Bewegung in x- und y-Richtung wird mit diesem Setup immer noch manuell gesteuert.
  3. Suchen Sie die Registerkarte Profilinteraktion30. Bevor Sie auf Start drücken, stellen Sie sicher, dass es möglich ist, schnell zum Blick auf das Mikroskopokular überzugehen, um den Eintritt des Organoids in der gewünschten Entfernung zu gewährleisten. Gehen Sie zu Profileinstellungen und gehen Sie wie folgt vor:
    1. Geben Sie an, dass der Startabstand 0 μm beträgt.
      ACHTUNG: Wenn die Epithelhülle für ein bestimmtes Organoid besonders hart ist, kann das Organoid weggedrückt oder verformt werden, anstatt es zu durchdringen. Wenn dies der Fall ist, schieben Sie die Elektrode weiter vor, aber notieren Sie sich die Stelle, an der der Eintritt erfolgt, da die Software dies nicht automatisch aufzeichnen kann.
    2. Wenn Sie die Größe des Organoids beurteilen, das profiliert wird, geben Sie einen Endabstand an, der nicht mehr als 3/4 des geschätzten Durchmessers eines Organoids beträgt.
      HINWEIS: Dieser spezielle Schritt soll eine Beschädigung der Elektrodenspitze verhindern.
    3. Geben Sie die gewünschte Schrittweite von 100 μm an, wie in Abbildung 2E dargestellt. Stellen Sie sicher, dass die minimale Schrittgröße mit der Größe der Elektrodenspitze übereinstimmt (z. B. 25 μm für eine 25 μm pH-25-Elektrodenspitze).
    4. Geben Sie eine sichere Position an, in die der Motor die Elektrodenspitze zwischen den Profilen zurückbringt.
      HINWEIS: Dies sollte eine angenehme Höhe über der Probe (außerhalb des Organoids) sein, in der der Sensor mit dem manuellen Mikromanipulator sicher seitwärts in x- und y-Richtung bewegt werden kann. Belassen Sie den Sensorwinkel auf der Standardeinstellung.
    5. Damit sich die Elektrode ausgleichen kann, geben Sie unter Warten vor Messung(en) mindestens 3 s an.
    6. Legen Sie die Messperiode(n) auf mindestens 1 s fest. Die Messungen über diesen Zeitraum werden gemittelt.
      HINWEIS: Bei Messungen in einer Umgebung mit hohem elektrischem Rauschen kann es hilfreich sein, einen längeren Zeitraum anzugeben.
    7. Stellen Sie die Verzögerung zwischen(n) auf mindestens 1 s ein.
    8. Legen Sie die bevorzugte Anzahl von Replikationen fest, die in jeder Tiefe gemessen werden sollen.
    9. Beginnen Sie mit der Aufzeichnung der Messungen, indem Sie auf die Schaltfläche Start klicken.

5. Reinigung der Elektroden

  1. Setzen Sie die zu reinigende Elektrode wieder in ihr Schutzrohr ein.
  2. Spülen Sie die Elektroden nach den Messungen mit diH2O.
  3. Spülen Sie die Elektroden einige Minuten lang mit 70% Ethanol.
  4. Spülen Sie die Elektroden mit pH 4,01 Puffer.
  5. Spülen Sie die Elektroden noch einmal mit diH2O, bevor Sie mit den Messungen fortfahren.

6. Lagerung von Elektroden

HINWEIS: Beide Elektroden sind bei Raumtemperatur an einem Ort mit geringer Aktivität zu lagern, sicher vor versehentlicher Beschädigung.

  1. Schieben Sie die pH-Mikroelektrode nach Gebrauch vorsichtig horizontal zurück in ihr Schutzrohr (schieben Sie sie zur horizontalen Unterstützung entlang des Labortisches).
  2. Halten Sie die Mikroelektrode aufrecht (Spitze nach oben) und füllen Sie das Schutzröhrchen vorsichtig mit sterilem Wasser. Stecken Sie den Schutzschlauch mit dem Stopfen, mit dem die Elektrode geliefert wurde. Stellen Sie sicher, dass alle Löcher im Schutzrohr mit Isolierband abgedichtet sind. In einer bruchsicheren Box bis zum nächsten Gebrauch aufbewahren.
    HINWEIS: Es wird empfohlen, die Originalverpackung zu verwenden, in der die Elektroden geliefert wurden, da sie Schutzeinsätze enthält, die die Elektroden bei der Lagerung an Ort und Stelle halten.
  3. Lagern Sie die Referenzelektrode in einem Becherglas oder Messzylinder, der mit einer 3M KCl-Lösung gefüllt ist. Decken Sie das Becherglas/den Messzylinder mit Parafilm ab, um ein Verdampfen der Lösung zu verhindern.
    HINWEIS: Wenn Sie einen Messzylinder verwenden, wird empfohlen, ihn mit Klebeband am Labortisch zu befestigen, um versehentliche Bewegungen zu verhindern.

7. Methylrot-Injektion (fakultativ)

HINWEIS: Methylrot ist ein kolorimetrischer Indikatorfarbstoff, der zur Validierung der Mikroelektrodenmessungen verwendet werden kann.

  1. Füllen Sie eine 2-μl-Glaskapillare mit sterilem Mineralöl auf, laden Sie es auf einen mikromanipulatorgesteuerten nL-Autoinjektor und füllen Sie es anschließend mit einer Lösung, die 0,02 % Methylrot und 150 mM HCl enthält.
    HINWEIS: Die Lösung sollte aufgrund des Säuregehalts des HCl in der Kapillare rot/rosa erscheinen.
  2. Organoide mit einem Durchmesser von mindestens 300 μm werden mit 9,2 μl der Lösung25 injiziert.
  3. Nehmen Sie Bilder oder Videos mit einer Kamera auf, die an das Stereomikroskop angepasst ist (Abbildung 2G).

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Ergebnisse

Die Sekretion von Säure ist eine entscheidende Funktion des menschlichen Magens. Inwieweit die Säuresekretion in Organoiden modelliert werden kann, ist jedoch noch umstritten 6,32,33,34. Aus diesem Grund haben wir das oben beschriebene Protokoll entwickelt, um die Säureproduktion in Magenorganoiden genau zu messen. Insbesondere verwendeten wir nicht stimulierte Organoide aus adulten Stammzellen...

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Diskussion

Der eingeschränkte Zugang zum luminalen Raum von Organoiden hat unser Verständnis der physiologischen Dynamik dieser Mikroumgebung stark eingeschränkt. Ein zuverlässiges Werkzeug für funktionelle Analysen der luminalen Physiologie wird unsere Fähigkeit erweitern, Organoide als In-vitro-Modelle für die Physiologie, Pharmakologie und Krankheitsforschung zu nutzen. Organoide sind hochgradig abstimmbare, physiologisch relevante Modelle mit dem zusätzlichen Potenzial, die genetische Variabilität innerhalb der menschl...

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Offenlegungen

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Danksagungen

Die Autoren danken Dr. Ellen Lauchnor, Dr. Phil Stewart und Bengisu Kilic für ihre bisherige Arbeit und Unterstützung bei den O2 -Mikrosensoren; Andy Sebrell für die Ausbildung in Organoidkultur und Mikromanipulation; Lexi Burcham für die Unterstützung bei der Organoidkultur, der Medienvorbereitung, der Datenaufzeichnung und der Organisation; und Dr. Susy Kohout für allgemeine Ratschläge in Elektrophysiologie. Wir danken Dr. Heidi Smith für ihre Unterstützung bei der Bildgebung und danken der Center for Biofilm Engineering Bioimaging Facility an der Montana State University, die durch Mittel des National Science Foundation MRI Program (2018562), des M.J. Murdock Charitable Trust (202016116), des US-Verteidigungsministeriums (77369LSRIP & W911NF1910288) und der Montana Nanotechnology Facility (ein NNCI-Mitglied, unterstützt durch den NSF Grant ECCS-2025391) unterstützt wird.

Besonderer Dank gilt dem gesamten Unisense-Team, das diese Arbeit möglich gemacht hat, insbesondere Dr. Andrew Cerskus, Dr. Laura Woods, Dr. Lars Larsen, Dr. Tage Dalsgaard, Dr. Line Daugaard, Dr. Karen Maegaard und Mette Gammelgaard. Die Finanzierung unserer Studie erfolgte durch die National Institutes of Health Grants R01 GM13140801 (D.B., R.B.) und UL1 TR002319 (K.N.L.) sowie einen Research Expansion Award des Montana State University Office for Research and Economic Development (D.B.). Abbildung 1A wurde mit BioRender erstellt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
3 m KClUnisense
5 mL Wobble-nicht serologische Pipet, einzeln verpackt, Papier/Kunststoff, Beutel, sterilCellTreat229091B
10 mL Wobble-nicht serologische Pipet, einzeln verpackt, Papier/Kunststoff, Beutel, sterilCellTreat229092B
15 mL Zentrifugenröhrchen - Schaumstoffgestell, sterilCellTreat 229412
24-Well-Gewebekulturplatte, sterilCellTreat229124
25 mL Wobble-not serologische Pipet, einzeln verpackt, Papier/Kunststoff, Beutel, sterilCellTreat229093B
35 mm Schale | Nr. 1.5 Deckglas | 20 mm Glasdurchmesser | UnbeschichtetesMatTekP35G-1.5-20-C
50 mL Zentrifugenröhrchen - Schaumstoffgestell, sterilCellTreat229422
70% EthanolBP82031GALBP82031GAL
70 μ; m Cell Sieb, einzeln verpackt, sterilCellTreat229483 
1.000 & Mikro; L Pipettenspitzen mit verlängerter Länge und geringer Retention, sterilCellTreat229037
Amphotericin B (Fungizone) LösungHyClone Laboratories, IncSV30078.01
BiosicherheitswerkbankNuaire NU-425-600Klasse II Typ A/B3
RinderserumalbuminFisher BioreagentsBP1605-100
ZellwiederherstellungslösungCorning354253Zelldissoziationslösung
DMEM/F-12 (Advanced DMEM)Gibco12-491-015
Dulbeccos Modifikation von Eagles Medium (DMEM)Fisher Scientific15017CV
Fötales RinderserumHyClone Laboratories, IncSH30088
G418 SulfatCorning30-234-CR
Gentamycin SulfatIBIScientific IB02030
HEPES, Freie SäureCytivaSH30237.01
HP Pavillion 2-in-1 14" Laptop Intel Core i3HPM03840-001
SalzsäureFisher ScientificA144C-212
InkubatorFisher Scientific11676604
iPhone 12 KameraApple
L-GlutaminCytivaSH3003401
Large Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wischer, 1-lagigFisher Scientific34133
M 205 FA StereomikroskopLeica
Matrigel Membran Matrix 354234CorningCB-40234
MC-1 UniMotor ControllerUnisense
Methylrot
MM33 MikromanipulatorMarzhauser Wetzlar61-42-113-0000Rechtshänder
MS-15 Motorisiertischer TischUnisense
Nanoject-IIDrummond3-000-204Nanoliter-Autoinjektor
Penicillin/Streptomycin (10.000 U/ml)Gibco15-140-148
pH-MikroelektrodenUnisense50-109158, 25-203452, 25-205272, 25-111626, 25-109160Die SensorTrace-Software ist nicht mit Apple-Computern kompatibel
ReferenzelektrodeUnisenseREF-RM-001652Die SensorTrace-Software ist nicht kompatibel mit Apple Computer
SB 431542Tocris Bioscience16-141-0
Smartphone Kamera AdapterGosky
Spezifikationen Laborstativ LSUnisenseLS-009238
Trypsin-EDTA 0,025%, phenolrotGibco25-200-056
UniAmpUnisense11632
United Biosystems Inc  MINI-ZELLENABSTREIFER 200/PKFisherMCS-200
Y-27632 DihydrochloridTocris Bioscience12-541-0
µ Sensor-KalibrierkitUnisense/ Mettler Toledo51-305-070, 51-302-069pH 4,01 und 9,21, 20 mL Packungen

Referenzen

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