Methodenartikel

Eine vereinfachte Methode zur Isolierung und Kultivierung von retinalen Pigmentepithelzellen aus erwachsenen Mäusen

DOI:

10.3791/66921

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24. Mai 2024

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1Department of Pathology, Case Western Reserve University, 2Division of Infectious Diseases and HIV Medicine, Department of Medicine, Case Western Reserve University, 3Cole Eye Institute, Ophthalmic Research, Cleveland Clinic

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Das retinale Pigmentepithel (RPE) fungiert als entscheidende Barriere zwischen Aderhaut und Netzhaut und fördert die Gesundheit und Funktion von retinalen Zelltypen, wie z. B. Photorezeptoren. Darin beschreiben wir ein einfaches und effektives Protokoll zur Isolierung und Kultivierung adulter muriner RPE.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Retinale Pigmentepithelzellen (RPE) sind entscheidend für die ordnungsgemäße Funktion der Netzhaut. Die RPE-Dysfunktion ist an der Pathogenese wichtiger Netzhauterkrankungen beteiligt, wie z. B. der altersbedingten Makuladegeneration, der Retinitis pigmentosa und der diabetischen Retinopathie. Wir stellen einen optimierten Ansatz für die Isolierung von RPE aus adulten Augen von Mäusen vor. Im Gegensatz zu bisher berichteten Methoden ermöglicht dieser Ansatz die Isolierung und Kultivierung von hochreinem RPE aus adulten Mäusen. Diese einfache und schnelle Methode erfordert keine umfangreichen technischen Fähigkeiten und ist mit grundlegenden wissenschaftlichen Werkzeugen und Reagenzien erreichbar. Primäre RPE werden aus C57BL/6-Hintergrundmäusen im Alter von 3 bis 14 Wochen durch Enukleation des Auges und anschließende Entfernung des vorderen Segments isoliert. Enzymatische Trypsinisierung und Zentrifugation werden verwendet, um das RPE aus der Augenmuschel zu dissoziieren und zu isolieren. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass dieser Ansatz ein schnelles und effektives Protokoll für die Verwendung von RPE bei der Untersuchung der Netzhautfunktion und -erkrankung bietet.

Einleitung

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Das retinale Pigmentepithel (RPE) ist eine spezialisierte Zellmonoschicht, die die Bruch-Membran auskleidet und sich zwischen den Photorezeptoren und der Aderhautbefindet 1. RPE-Zellen spielen eine entscheidende Rolle für die ordnungsgemäße Funktion der Netzhaut. RPE-Zellen transportieren Glukose und Vitamin A zu den Photorezeptoren, fördern das Sehvermögen durch Re-Isomerisierung von all-trans-Retinal in 11-cis-Retinal und erhalten die äußeren Segmente des Photorezeptors durch Phagozytose der abgestoßenen äußeren Segmente, entfernen Wasser aus dem subretinalen Raum, bilden die äußere Blut-Netzhaut-Schranke durch das Vorhandensein von Tight Junctions und sezernieren neurotrope Wachstumsfaktoren (wie Pigment Epithelium Derived Factor, und Basic Fibroblast Growth Factor), die Photorezeptoren unterstützen2. Die Dysfunktion von RPE-Zellen ist an der Pathogenese verschiedener Retinopathien beteiligt, einschließlich der altersbedingten Makuladegeneration, der Retinitis pigmentosa und der diabetischen Retinopathie 3,4,5. In-vitro-Studien mit RPE-Zellen sind entscheidend, um die Pathogenese dieser Krankheiten besser zu verstehen. Primäre RPE-Zellen werden für diese Studien bevorzugt, da RPE-Zelllinien zwar leicht verfügbar sind, aber wichtige Eigenschaften von primären RPE-Zellen fehlen.

Während verschiedene Spezies als Quellen für primäre RPE-Zellen verwendet wurden, haben Mäuse den Vorteil, dass sie genetische Modifikationen verwenden, um die Pathogenese von Retinopathien zu verstehen. Zuvor beschriebene Protokolle zur Isolierung von RPE-Zellen aus Nagetieren erfordern entweder die Verwendung von neugeborenen Tieren, sind langwierig, erfordern technisches Geschick oder sind nicht für die Kulturgeeignet 6,7,8,9,10,11,12. Wir beschreiben eine einfache und schnelle Methode zur Isolierung von RPE-Zellen aus adulten Mäusen, die hochreine Kulturen dieser Zellen liefern.

Protokoll

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Die Verwendung von Versuchspersonen in dieser Studie wurde vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der Case Western Reserve University genehmigt.

1. Vorbereitung der Reagenzien

  1. Bereiten Sie das Waschpuffermedium vor, indem Sie Hank's balanced salt solution (HBSS), kein Kalzium, kein Magnesium, kein Phenolrot, mit 10 mM HEPES-Pufferlösung ergänzen. Halten Sie die Lösung bis zur Verwendung bei 4 °C.
  2. Bereiten Sie das RPE-Medium vor, indem Sie Dulbecco's Modified Eagle's Medium mit 4,5 g/l Glukose, 1,25x GlutaMAX Supplement (Stammkonzentration 100x oder 200 mM; Endkonzentration von 2,5 mM L-Glutamin), mit 10% fötalem Rinderserum, 1% Penicillin/Streptomycin und 1x MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) ergänzen. Vor Gebrauch das Medium im Wasserbad auf 37 °C vorwärmen.

2. Extraktion von Mausaugen

  1. Euthanasieren Sie die Maus, vorzugsweise im Alter von 3 bis 14 Wochen, mit einer von der IACUC zugelassenen Methode der Euthanasie (Gebärmutterhalsdislokation unter Narkose unter Narkose unter Verwendung eines Ketamin/Xylazin-Cocktails in einer Menge von 0,1 ml pro 20 g Maus [87,5 mg/kg Ketamin und 12,5 mg/kg Xylazin] war die in dieser Studie verwendete Methode).
    HINWEIS: Augen, die von jüngeren Mäusen entnommen wurden, ermöglichen eine erhöhte Ausbeute an retinalen Pigmentepithelzellen im Laufe der Zeit und erweitern die Kapazität für aufeinanderfolgende Passagen.
  2. Legen Sie die Maus flach auf die Seite, wobei das Auge nach oben gerichtet ist.
  3. Platzieren Sie den Zeigefinger und den Daumen über bzw. unter dem Auge. Üben Sie sanft Druck auf die Knochenstruktur aus, die das Auge umgibt, um einen Vorsprung des Augapfels zu induzieren.
  4. Führen Sie die Spitze einer leicht geöffneten Schere unter das Auge ein und drehen Sie das Handgelenk vorsichtig um 90° vom Auge weg, bis sich das Auge von der Augenhöhle löst.
    HINWEIS: Schließen Sie die Schere nicht, um das Auge oder den Sehnerv zu schneiden, da dies das Präparieren der Augenmuschel erschwert.
  5. Legen Sie das Auge sofort in 70%iges Ethanol und rollen Sie es nicht länger als 5 s, bevor Sie es in ein auf Eis aufbewahrtes Waschpuffermedium geben.
  6. Übertragen Sie unter einem Präpariermikroskop jeweils ein Auge in eine Petrischale, die mit Waschpuffer und Streifen getränkter Gaze gefüllt ist.
  7. Stabilisieren Sie das Auge, indem Sie den Sehnerv mit einer Pinzette festhalten. Machen Sie vorsichtig einen Schnitt auf Höhe der Ora serrata mit einem 3,00 mm 45° chirurgischen Messer oder einer 0,009" Rasierklinge.
  8. Führen Sie die Schere mit einer Vannas-Schere vorsichtig in den Schnitt ein und schneiden Sie um den Umfang der Ora serrata herum, bis das vordere Augensegment und der Glaskörper entfernt und entsorgt werden können.
  9. Ziehen Sie die Netzhaut vorsichtig mit einer angebundenen Pinzette von der Augenmuschel ab und achten Sie darauf, die RPE-Schicht nicht zu stören.
    HINWEIS: Um die Netzhaut leichter entfernen zu können, füllen Sie eine Transferpipette mit Waschpuffermedium und tragen Sie es vorsichtig auf die Ränder der Augenmuschel auf, um die Netzhaut sanft anzuheben.
  10. Entfernen Sie abschließend den Sehnerv und das überschüssige Bindegewebe mit einer Schere aus der Augenmuschel. Achte darauf, dass du die Augenmuschel nicht durchstichst.

3. Isolierung des primären RPE

  1. Übertragen Sie die Augenmuschel in ein 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen, das 1 ml 0,25 % Trypsin + 0,02 % EDTA enthält.
    HINWEIS: Zu einem Aliquot von Trypsin-EDTA können zwei Augenmuscheln hinzugefügt werden, um die Ausbeute an kultivierbarem RPE zu erhöhen.
  2. Die Mikrozentrifugenröhrchen in ein auf 37 °C eingestelltes Wasserbad geben und 10 Minuten lang inkubieren. Nehmen Sie alle 2 Minuten die Schläuche aus dem Wasserbad und klopfen Sie den Boden des Rohrs 40 Mal fest auf die Arbeitsplatte.
  3. Nach 10 Minuten die Augenmuschel vorsichtig mechanisch mit einer P1000 oder einer serologischen 2-ml-Pipette aufbrechen, indem Sie nicht mehr als 3 Mal auf und ab pipettieren.
    HINWEIS: Die Fragmentierung der RPE-Bleche ist unerlässlich, da große Bleche nicht richtig haften.
  4. Neutralisieren Sie das Trypsin sofort, indem Sie die abgelösten RPE-Blätter, aber nicht die Augenmuschel, auf 0,5 ml fötales Rinderserum (FBS) in einem konischen 15-ml-Röhrchen schichten.
  5. Verdünnen Sie ferner das Trypsin, indem Sie 3 ml RPE-Medium tropfenweise auf die Schichten der FBS- und RPE-Folien schichten.
  6. Zentrifugieren Sie das RPE bei 340 x g für 3 min.
  7. Verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in einer geeigneten Menge RPE-Medium für eine 24-Well-Platte (1,9 cm2/Well) oder eine 48-Well-Platte (0,75 cm2/Well).
    HINWEIS: RPE kann auf Well-Platten plattiert werden, die mit extrazellulären Matrixproteinen, insbesondere Laminin, Kollagen IV oder Fibronektin, beschichtet sind, um die Adhärenz zu erhöhen11. RPE kann auch in 1 ml RPE-Medium resuspendiert und auf einen Trenngradienten mit 40 % Dichte geschichtet werden, um reine RPE-Zellen weiter zu isolieren. Darüber hinaus kann das Drehen der Platte bei 340 x g für 3-5 Minuten die Zelladhäsion erhöhen13.
  8. Inkubieren bei 37 °C bei 5 % CO2.

4. RPE kultivieren

  1. Unterbrechen Sie das isolierte RPE mindestens 3 Tage lang nicht. Entfernen Sie nach 72 h vorsichtig das alte Medium und ersetzen Sie es durch frische, vorgewärmte Medien.
  2. Wechseln Sie das Medium alle 48 h nach den ersten 3 Tagen.
  3. Sobald die Zellen die Konfluenz erreicht haben, passieren Sie die Zellen mit 0,25 % Trypsin + 0,02 % EDTA und reduzieren Sie das FBS im RPE-Medium auf 2 %.
    HINWEIS: Es wurde bereits berichtet, dass primäre RPE nach 5-7 Passagen mit der Dedifferenzierung beginnen und beginnen, ihre hexagonale Form und Pigmentierung zu verlieren14.

Ergebnisse

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Das beschriebene Protokoll wurde bei C57BL/6-Hintergrundmäusen verwendet. Das Geschlecht scheint die Fähigkeit, RPE zu kultivieren, nicht zu verändern. Mäuse unter 6 Wochen liefern im Vergleich zu älteren Mäusen nur begrenzte RPE-Blätter, und es sind möglicherweise mehr Augen erforderlich, um eine optimale Konfluenz zu erreichen. Nach der Isolierung brauchen RPE-Zellen etwa 3 Tage, um sich zu stabilisieren und an der Zellkulturplatte zu befestigen. Etwa 24 Stunden nach der Isolierung haben runde, pigmentierte Zellen, die kernförmig erscheinen, begonnen, sich abzusetzen, aber nicht vollständig an der Platte zu haften (Abbildung 1A). In den nächsten 48-72 Stunden beginnen sich die Zellen anzuheften und auszubreiten, während sie ihre dunkle Pigmentierung und ihren transparenten Kern beibehalten (Abbildung 1B,C). Nach 5 Tagen haben die RPE eine erhöhte Konfluenz und begonnen, Zell-zu-Zell-Kontakte zu bilden, die an eine polarisierte Monoschicht mit hexagonaler Form erinnern (Abbildung 1D).

Isolierte RPE wurden nach 6 Tagen in Kultur auf Reinheit und Integrität der Tight-Junctions untersucht. RPE wurden zunächst auf das Vorhandensein von Retinoid-Isomerohydrolase oder retinalem Pigmentepithel 65 kDA-Protein (RPE65), einem für RPE spezifischen Marker, untersucht (Abbildung 2, grün). Damit RPE eine einzige Schicht aus pigmentierten und hexagonalen Zellen bilden kann, müssen die Zell-zu-Zell-Verbindungen intakt bleiben. Das Tight Junction Protein-1 oder die Zonula occludens-1 (ZO-1) sind Gerüstproteine, die für die Aufrechterhaltung und Integrität der Tight Junctions zwischen den einzelnen RPE-Zellen unerlässlich sind14. Konfluente isolierte RPE-Kulturen behielten ihre interzellulären Verbindungsproteine bei, was durch die Färbung von ZO-1 an der Peripherie der Zelle demonstriert wird (Abbildung 2, rot). Sobald diese Zellen die Konfluenz in großen Schichten erreicht haben, behalten sie bis zu 2 Wochen lang Zell-zu-Zell-Kontakte bei, ohne zu überwachsen. Frühere Studien haben gezeigt, dass ZO-1 in Kultur bis zu 9 Tage lang stark exprimiert wird15. Zu den weiteren Markern, die in Kulturen von primärem RPE verwendet werden, gehören Kollagen IV, CRALBP und OTX211.

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Abbildung 1. Morphologie des primären RPE der Maus, kultiviert auf einer Standard-Polystyrol-24-Well-Platte. (A) Primäres RPE, isoliert aus beiden Augen einer C57BL/6-Maus und kultiviert in einer Einzelvertiefung einer unbeschichteten 24-Well-Platte aus Gewebekulturpolystyrol direkt nach der Isolierung. (B,C) Nach 48 h und 72 h beginnen primäre RPE an der Platte zu haften und bilden pigmentierte, zweikernige Zellen. (D) Nach 5 Tagen zeigt die Hellfeldmikroskopie, dass die hyperpigmentierten, sechseckigen Zellen die Konfluenz erhöhen und beginnen, Zell-zu-Zell-Kontakte zu bilden. Maßstab: 100 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 2. Der RPE-spezifische Marker RPE-65 und der interzelluläre Junction-Marker ZO-1 sind in isolierten primären murinen RPE konserviert. Primäres RPE von drei C57BL/6-Mäusen wurde 6 Tage lang kultiviert, bevor es mit 4 % Paraformaldehyd fixiert wurde. Die Zellen wurden 5 Minuten lang mit 0,1 % Triton-X in PBS permeabilisiert, mit 5 % normalem Ziegenserum blockiert und mit Antikörpern gegen RPE-65 (grün) oder ZO-1 (rot) inkubiert. Maßstab: 50 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 3. Vereinfachte schematische Darstellung des Protokolls zur Isolierung des retinalen Pigmentepithels. Nachdem Sie den Augapfel von der Maus entfernt haben, sterilisieren Sie das Auge, indem Sie es kurz in 70%iges Ethanol tauchen, bevor Sie es in den Waschpuffer geben. Im Waschpuffer entlang der Ora serrata einschneiden und den vorderen Augenabschnitt entfernen. Entfernen Sie die Netzhaut und legen Sie die Augenmuschel in eine Tube mit Trypsin/EDTA. Klopfen Sie das Röhrchen alle 2 Minuten für insgesamt 10 Minuten vorsichtig auf den Zähler, übertragen Sie den Überstand in ein konisches 15-ml-Röhrchen und zentrifugieren Sie das RPE-Pellet. Suspendieren Sie die Zellen und die Platte auf eine 24- oder 48-Well-Platte. Grafiken, die mit BioRender erstellt wurden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Diskussion

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In diesem Artikel haben wir ein vereinfachtes Protokoll für die Isolierung und Kultivierung von retinalem Pigmentepithel von Mäusen skizziert. RPE-Zellen, die aus den Augen adulter Mäuse isoliert wurden, exprimierten einen RPE-spezifischen Marker, RPE65, und einen interzellulären Verbindungsmarker, ZO-1. Zusätzlich entwickelten sich die kultivierten Zellen in Kultur zu pigmentierten, hexagonalen Blättern.

Mehrere Methoden zur Isolierung von RPE bei Nagetieren wurden bereits veröffentlicht 6,7,8,9,10,11,12. Viele Protokolle schälen die RPE-Schichten von der Bruch-Membran ab, was technisches Geschick erfordert und das Risiko einer RPE-Schädigung oder des Zelltods erhöht 6,7,9,11,12,16. Daher nutzt dieses Protokoll die enzymatische Ablösung der RPE-Schicht anstelle der mechanischen Dissoziation, um das Überleben zu fördern und die Integrität der RPE-Blätter in Kultur zu erhalten. Diese Methode liefert Maus-RPE in einer Kultur, die die RPE-Morphologie mit hochpigmentierten und hexagonalen Zellen beibehält, die die Expression von Tight-Junction-Proteinen konservieren. Darüber hinaus fehlt diesem Protokoll die Verwendung komplexer Reagenzien oder Materialien, die in anderen Protokollen verwendet werden, wie z. B. permeable Membraninserts, zusätzliche extrazelluläre Matrix-Beschichtungsproteine oder spezielle Gewebedissoziationsreagenzien. Stattdessen verwendet dieses Protokoll einen einfachen enzymatischen Verdau mit 0,25 % Trypsin-EDTA in Kombination mit Gewebebewegung, um die RPE-Schicht von der Bruch-Membran zu dissoziieren. Dieses Protokoll wurde erfolgreich an Mäusen im Alter von 3 bis 14 Wochen durchgeführt; Es könnten jedoch mehr Augen erforderlich sein, um erfolgreich eine konfluente Kultur bei jungen Mäusen zu gewinnen.

Bei der Ausführung dieses Protokolls können mehrere Herausforderungen auftreten. Technisches Geschick ist erforderlich, um die Ora serrata präzise zu umschneiden und die Netzhaut vorsichtig zu entfernen, ohne die RPE-Schicht zu stören. Die Netzhaut kann gestört werden, wenn der Umfang der Sklera durchtrennt wird, was die Lebensfähigkeit des RPE beeinträchtigen kann. Die Verfeinerung dieser Technik kann nur durch wiederholtes, kontinuierliches Üben erreicht werden. Darüber hinaus können RPE-Platten nach der Entnahme an der Netzhautschicht haften. Um einen übermäßigen Verlust von RPE zu vermeiden, stimulieren Sie die Netzhautablösung, indem Sie eine mit Waschpuffermedium gefüllte Spritze oder Transferpipette verwenden, um die Ränder der Netzhaut vorsichtig von der Augenmuschel abzuheben. Die Hyaluronidase-Inkubation kann auch die Ablösung erleichtern16. Für den Fall, dass sich RPE nicht richtig von der Bruch-Membran und der Aderhaut lösen, verlängern Sie die Inkubationszeit mit Trypsin im Wasserbad. Frieren Sie zusätzlich Aliquote von frischem Trypsin bei -20 °C ein und tauen Sie sie direkt vor Gebrauch auf, um eine optimale enzymatische Aktivität zu erhalten. Ein Versagen des RPE, sich nach der Isolierung an die Well-Platte zu binden, kann auftreten, wenn Zellen mit zu geringer Dichte ausgesät werden oder wenn das RPE während des Isolationsprozesses beschädigt wurde. Darüber hinaus erfordert unser Protokoll keine Beschichtung von Proteinen der extrazellulären Matrix (ECM) für die Kultur. Es wurde jedoch gezeigt, dass EZM-Proteine wie Fibronektin, Kollagen IV, Laminin oder Kollagen I die Zelladhäsion erhöhen und sollten in Betracht gezogen werden, wenn die Adhärenz schlecht ist11.

Um die Ausbeute an RPE-kultivierten Monolayern zu erhöhen, legen Sie mindestens 2-3 Augen von Mäusen mit gleichem genetischen Hintergrund zusammen. Zellen können mit der Zeit ihre hexagonale Form und ihr Pigment verlieren, wenn sie nicht in einer ausreichend hohen Dichte ausgesät werden. Bei Mäusen, die älter als 8 Wochen sind, sollten 2 Augen pro 24-Well-Platte für eine optimale Konfluenz ausreichen. Wenn Mäuse unter 8 Wochen alt sind, führen 3-4 Augen zu einer besseren Adhärenz und Konfluenz. Im Laufe der Zeit können Zellen anfällig für einen epithelial-mesenchymalen Übergang (EMT) mit Verlust der Pigmentierung und Annahme einer länglichen Form sein. Die Zugabe von Rho-Kinase- und TGFβR-1/ALK5-Inhibitoren, wie Y27632 bzw. Repsox, kann die EMT der kultivierten RPE-Zellen verhindern12. Während das Isolationsprotokoll kurz ist und nur 1 Stunde für die Isolierung von 2-4 Augen erforderlich ist, kann es bei der Primärkultur bis zu 7-10 Tage dauern, bis die vollständige Konfluenz erreicht ist. Darüber hinaus ist die passagierende RPE begrenzt, mit einem erhöhten Risiko für EMT bei jeder nachfolgenden Passage.

Retinale Pigmentepithelzellen sind wichtige Zellen für die Aufrechterhaltung der Homöostase im Auge. RPE wirken als Fresszellen, um die Aufrechterhaltung von Photorezeptoren zu unterstützen, Nervenschichten vor Lichtschäden zu schützen und als enge Epithelbarriere zu wirken, um den Transport zu regulieren17. Krankheiten, die sich direkt auf RPE auswirken, wie z. B. altersbedingte Makuladegeneration, Retinitis pigmentosa und diabetische Retinopathie, können Entzündungen verschlimmern, die Apoptose erhöhen und zelluläre Verbindungen stören, was zu einer erhöhten Wahrscheinlichkeit von Netzhautdegeneration und Erblindung führt17. Die Kultivierung von primärem RPE erleichtert die Untersuchung der Pathogenese von Augenerkrankungen, die RPE betreffen. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass unser Protokoll die Dauer der Isolierung verkürzt und die notwendigen Techniken und Reagenzien vereinfacht, während eine hochreine Zellkultur erhalten bleibt.

Offenlegungen

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Es gibt keine relevanten finanziellen oder nichtfinanziellen Angaben.

Danksagungen

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Die in dieser Veröffentlichung berichtete Forschung wurde von NIH Grants R01EY018341 and R01EY019250 (C.S.S.), NIH Grant F31EY035156 (A.H.) und P30 EY011373 unterstützt. Die Förderorganisation spielte keine Rolle bei der Konzeption oder Durchführung dieser Forschung.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
0.009 RD Single-Edge BladesPersonna941202
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)Corning10-013-CVmit 4,5 g/L Glucose, L-Glutamin, Natriumpyruvat
Fötales RinderserumCorning35010CV
GlutaMAX, 100xGibco35050061
Hank's Balanced Salt SolutionGibco14175095kein Calcium, kein Magnesium, kein Phenolrot
HEPES-Pufferlösung (1M)Gibco15630106
MEM nicht-essentielle Aminosäuren, 100xGibco11140050
Micro-Unitome MesserBVI Biber377546
Penicillin-Streptomycin Lösung, 100xCorning30-002-CI
Polystyrol MikrotiterplattenFalcon08-772-124-Well- oder 48-Well-Reguläres
fötales RinderserumCorning35-010-CV
Trypsin-EDTA (0,25%)Gibco25200056mit phenolroter
Vannas-SchereFine Science Tools10091-12

Referenzen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Strauss, O. The retinal pigment epithelium in visual function. Physiol Rev. 85 (3), 845-881 (2005).
  2. Lakkaraju, A., et al. The cell biology of the retinal pigment epithelium. Prog Retin Eye Res. 100846, (2020).
  3. Lambros, M. L., Plafker, S. M. Oxidative stress and the Nrf2 anti-oxidant transcription factor in age-related macular degeneration. Adv Exp Med Biol. 854, 67-72 (2016).
  4. Ferrari, S., et al. Retinitis pigmentosa: genes and disease mechanisms. Curr Genomics. 12 (4), 238-249 (2011).
  5. Xia, T., Rizzolo, L. J. Effects of diabetic retinopathy on the barrier functions of the retinal pigment epithelium. Vision Res. 139, 72-81 (2017).
  6. Edwards, R. B. Culture of rat retinal pigment epithelium. In Vitro. 13 (5), 301-304 (1977).
  7. Mayerson, P. L., Hall, M. O., Clark, V., Abrams, T. An improved method for isolation and culture of rat retinal pigment epithelial cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 26 (11), 1599-1609 (1985).
  8. Chang, C. W., Roque, R. S., Defoe, D. M., Caldwell, R. B. An improved method for isolation and culture of pigment epithelial cells from rat retina. Curr Eye Res. 10 (11), 1081-1086 (1991).
  9. Wang, N., Koutz, C. A., Anderson, R. E. A method for the isolation of retinal pigment epithelial cells from adult rats. Invest Ophthalmol Vis Sci. 34 (1), 101-107 (1993).
  10. Sakagami, K., et al. A rapid method for isolation of retinal pigment epithelial cells from rat eyeballs. Ophthalmic Res. 27 (5), 262-267 (1995).
  11. Heller, J. P., Kwok, J. C., Vecino, E., Martin, K. R., Fawcett, J. W. A method for the isolation and culture of adult rat retinal pigment epithelial (RPE) cells to study retinal diseases. Front Cell Neurosci. 9, 449(2015).
  12. Shen, J., He, J., Wang, F. Isolation and culture of primary mouse retinal pigment epithelial (RPE) cells with Rho-Kinase and TGFbetaR-1/ALK5 inhibitor. Med Sci Monit. 23, 6132-6136 (2017).
  13. Hood, E. M. S., Curcio, C., Lipinski, D. Isolation, culture, and cryosectioning of primary porcine retinal pigment epithelium on transwell cell culture inserts. STAR Protoc. 3 (4), 101758(2022).
  14. Naylor, A., Hopkins, A., Hudson, N., Campbell, M. Tight Junctions of the outer blood retina barrier. Int J Mol Sci. 21 (1), 211(2019).
  15. Ban, B., Rizzolo, L. J. A culture model of development reveals multiple properties of RPE tight junctions. Mol Vis. 3, 18(1997).
  16. Fernandez-Godino, R., Garland, D. L., Pierce, E. A. Isolation, culture and characterization of primary mouse RPE cells. Nat Protoc. 11 (7), 1206-1218 (2016).
  17. Yang, S., Zhou, J., Dengwen, L. Functions and diseases of the retinal pigment epithelium. Front Pharmacol. 12, 727870(2021).

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Retinales PigmentepithelRPE Isolierungadultes Maus RPERPE KulturNetzhauterkrankungenTrypsinierungsmethodeZelldissoziationprim re RPE ZellenIntegrit t der Tight JunctionsEnukleationstechnik

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