Methodenartikel

Herstellung einer Einzelzellsuspension von Thymus-Epithelzellen der Maus und Färbung intrazellulärer Moleküle für die durchflusszytometrische Analyse

DOI:

10.3791/66945

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26. Juli 2024

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1Thymus Biology Section, Experimental Immunology Branch, Center for Cancer Research, National Cancer Institute, National Institutes of Health, 2Flow Cytometry Facility, Experimental Immunology Branch, Center for Cancer Research, National Cancer Institute, National Institutes of Health

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Wir beschreiben Protokolle für die Herstellung einer Einzelzellsuspension von Thymusepithelzellen der Maus und die Färbung intrazellulärer Moleküle für die durchflusszytometrische Analyse.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Thymus-Epithelzellen (TECs) spielen eine wesentliche Rolle bei der Förderung der Entwicklung und Repertoireauswahl von T-Zellen. Kortikale TECs (cTECs) im thymusischen Kortex induzieren eine frühe T-Zell-Entwicklung und eine positive Selektion kortikaler Thymozyten. Im Gegensatz dazu ziehen medulläre TECs (mTECs) in der Thymusmedulla positiv selektierte Thymozyten aus der Hirnrinde an und etablieren die Selbsttoleranz in den T-Zellen. Eine Vielzahl von Molekülen, darunter DLL4 und beta5t, die in cTECs exprimiert werden, sowie Aire und CCL21, die in mTECs exprimiert werden, tragen zur Funktion des Thymus bei und unterstützen die Entwicklung und Selektion von T-Zellen. Die durchflusszytometrische Analyse funktionell relevanter Moleküle in cTECs und mTECs ist nützlich, um unser Verständnis der Biologie von TECs zu verbessern, auch wenn die derzeitigen Methoden zur Herstellung von Einzelzellsuspensionen von TECs nur einen kleinen Teil der TECs (ca. 1% für cTECs und ca. 10% für mTECs) aus dem Thymus junger erwachsener Mäuse gewinnen können. Da viele dieser funktionell relevanten Moleküle in TECs in den Zellen lokalisiert sind, beschreiben wir unsere Protokolle für die Herstellung der Einzelzellsuspension von Maus-TECs und die Färbung intrazellulärer Moleküle für die durchflusszytometrische Analyse.

Einleitung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Der Thymus ist ein epitheliales mesenchymales Organ, das die Entwicklung und Repertoireauswahl von T-Lymphozyten fördert. In den kortikalen und medullären Mikroumgebungen innerhalb des Thymus spielen Thymusepithelzellen (TECs) eine entscheidende Rolle bei der Steuerung der Entwicklung und Selektion von T-Zellen. Es ist allgemein anerkannt, dass kortikale TECs (cTECs) im thymusischen Kortex in erster Linie zur Induktion der frühen T-Zell-Zellentwicklung und zur positiven Selektion neu gebildeter T-Zell-Antigen-Rezeptor (TCR)-exprimierender Thymozyten beitragen. Im Gegensatz dazu sind medulläre TECs (mTECs) im Thymusmark essentiell für die Anziehung positiv selektierter Thymozyten aus dem Kortex und die Etablierung einer zentralen Selbsttoleranz durch die Eliminierung selbstreaktiver T-Zellen und durch die Erzeugung regulatorischer T-Zellen1,2. Diese Funktionen von TECs bei der Unterstützung der Entwicklung und Selektion von T-Zellen werden durch eine Vielzahl von Molekülen vermittelt, die in cTECs und mTECs exprimiert werden.

Dazu gehören der Delta-ähnliche Ligand 4 (DLL4), wichtig für die Spezifikation der T-Zell-Linie von lymphoiden Vorläufern)3,4, beta5t (auch bekannt als Psmb11, wichtig für die positive Selektion von CD8 T-Zellen)5,6 und Prss16 (auch bekannt als Thymus-spezifische Serinprotease oder TSSP, wichtig für die positive Selektion von CD4 T-Zellen)7,8 exprimiert in cTECs und Autoimmunregulator (Aire, wichtig für die promiskuitive Expression von Selbstgenen)9,10, Zinkfinger 2 der Fez-Familie (Fezf2, wichtig für die promiskuitive Expression von Aire-unabhängigen Selbstgenen und die Bildung von Thymusbüschelzellen)11,12,13,14und C-C-Motiv-Chemokin-Ligand 21 (CCL21, wichtig für die medulläre Migration und Akkumulation positiv ausgewählter Thymozyten)14,15,16, exprimiert in mTECs. Die Durchflusszytometrie bietet ein Mittel zum quantitativen Nachweis dieser funktionell signifikanten Moleküle in TECs und erleichtert die Beurteilung sowohl der Entwicklung als auch der Funktion von cTECs und mTECs. Da viele der Moleküle in TECs primär innerhalb der Zellen exprimiert werden, wie z.B. im Zytoplasma (z.B. Proteasomkomponente beta5t) und im Zellkern (z.B. Transkriptionsregulator Aire), ist es vorteilhaft, intrazelluläre Moleküle in cTECs und mTECs mittels Durchflusszytometrie quantitativ zu analysieren.

TECs sind im Thymus selten. Eine weibliche Maus im Alter von 5 Wochen hat etwa 1 × 106 cTECs und etwa 2,5 × 106 mTECs, während die Thymusrinde etwa 3 × 108 CD4+CD8+ Thymozyten und die Thymusmedulla etwa 5 × 107 CD4+CD8- und CD4-CD8+ Thymozyten enthält17. Daher handelt es sich bei jungen erwachsenen Mäusen bei der überwiegenden Mehrheit (>99%) der Zellen im Thymus um hämatopoetische Zellen, einschließlich Thymozyten, und nicht um TECs. Darüber hinaus sind TECs eng mit benachbarten Zellen (z. B. Thymozyten) und architektonischen extrazellulären Komponenten (z. B. Kollagen) innerhalb des Thymus verbunden, so dass die Freisetzung von TECs in die Zellsuspension eine Proteaseverdauung des Thymus erfordert. Herkömmliche Methoden zum enzymatischen Aufschluss liefern nur einen kleinen Bruchteil der TECs; ca. 1 % (1 × 104) bzw. 10 % (2 × 105) für cTECs bzw. mTECs von 5 Wochen alten Maus thymus17,18,19. Die geringe Effizienz der TEC-Freisetzung aus dem Thymus ist wahrscheinlich auf die Anfälligkeit von TECs gegenüber proteolytischen Enzymen und mechanischem Stress sowie auf die enge Assoziation von TECs mit benachbarten Zellen zurückzuführen, insbesondere zwischen cTECs und CD4+CD8+-Thymozyten20. In dieser Hinsicht sind die Ergebnisse der Einzelzellanalyse von Maus-TECs, einschließlich der durchflusszytometrischen Analyse und der Einzelzell-RNA-Sequenzierungsanalyse, basierend auf den derzeitigen enzymatischen verdauungsvermittelten Zellpräparationsmethoden, nur für einen kleinen Teil der TECs repräsentativ und daher bei weitem nicht vollständig. Trotz dieser Einschränkungen bei der enzymatischen Gewinnung von TECs ist die durchflusszytometrische Analyse von Maus-TECs in Einzelzellsuspension immer noch nützlich für die quantitative Analyse funktionell relevanter Moleküle in cTECs und mTECs. In Zellsuspension wurden TECs als Zellen definiert, die positiv für das epitheliale Oberflächenmolekül EpCAM (CD326) und negativ für das hämatopoetische Oberflächenmolekül CD45 sind. In EpCAM+CD45-TECs wurden die Zelloberflächenexpressionsniveaus von Ly51-Molekülen (auch bekannt als BP-1 und CD249) und der Bindungskapazität von Ulex Europaeus Agglutinin I (UEA1) (hauptsächlich Bindung an Glykoproteine und Glykolipide, die α-verknüpfte Fukose enthalten) verwendet, um cTECs (Ly51hoch, UEA1niedrig) und mTECs (Ly51,niedrig, UEA1hoch) zu markieren). Hier beschreiben wir unsere experimentellen Protokolle für die konventionelle Herstellung von Einzelzellsuspensionen von Maus-TECs und die Färbung intrazellulärer Moleküle für die durchflusszytometrische Analyse, wobei der Schwerpunkt auf der quantitativen Analyse der intrazellulären Moleküle beta5t, CCL21 und Aire in frisch hergestellten Maus-TECs liegt.

Protokoll

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Alle Mausversuche wurden mit Genehmigung des Animal Care and Use Committee des National Cancer Institute durchgeführt (ASP21-431, ASP21-432 und EIB-076-3).

1. Herstellung der Thymuszellsuspension

HINWEIS: Die Ontogenese der Maus beeinflusst die Effizienz der enzymatischen Freisetzung von TECs aus dem Thymus. Im Folgenden werden drei Methoden je nach Alter der Maus beschrieben.

  1. Für postnatale Mäuse, die älter als 3 Wochen sind
    1. Entnehmen Sie den Thymus (zwei Thymuslappen) von einer Maus. Legen Sie den Thymus in 5 ml RPMI1640 mit 10 mM HEPES in eine 60 mm große Kunststoffschale auf Eis.
    2. Entfernen Sie Blut, Nicht-Thymusgewebe und Fett mit einer gebogenen Pinzette mit feiner Spitze unter einem Präpariermikroskop. Den Thymus mit einer Präparierschere in kleine Stücke (ca. 1-2 mm groß) schneiden.
    3. Übertragen Sie die Thymusstücke in ein konisches 15-ml-Röhrchen, das 3 ml 1 mg/ml Kollagenase/Dispase und 1 μg/ml DNase-Lösung in RPMI1640 enthält, die 2 % fötales Rinderserum (FBS) enthält. In einem Wasserbad oder einem Wärmeblock bei 37 °C 20 min inkubieren.
    4. Vorsichtig mit einer 3-ml-Transferpipette aus Kunststoff mischen. Inkubieren Sie weitere 20 Minuten, falls die Gewebefragmente noch sichtbar sind.
    5. Vorsichtig mit einer 3-ml-Transferpipette aus Kunststoff mischen. Inkubieren Sie weitere 10 Minuten, falls die Gewebefragmente noch sichtbar sind.
    6. Vorsichtig mit einer 3-ml-Transferpipette aus Kunststoff mischen. Fügen Sie 5 mL 5 mM EDTA in 1x HBSS mit 1% FBS hinzu.
    7. Filtrieren Sie die Zellsuspension durch ein 60 μm Nylonnetz und in ein neues konisches 50-ml-Röhrchen. Die Zellsuspension wird bei 350 × g bei 4 °C 5 min lang zentrifugiert.
    8. Resuspendieren Sie das Zellpellet in 10 ml FACS-Puffer (1x HBSS mit 1 % Rinderserumalbumin [BSA] und 0,1 %NaN 3).
    9. Lagern Sie die Zellen auf Eis und bestimmen Sie die Zellzahl mit Hilfe eines Zellzählers.
  2. Für neugeborene Mäuse im Alter von 1 bis 2 Wochen
    1. Führen Sie Schritt 1.1.1 aus.
    2. Entfernen Sie Blut und Nicht-Thymusgewebe mit einer Präparierpinzette unter einem Präpariermikroskop. Den Thymus in ein 1,5 mL Kunststoffröhrchen mit 200 μl RPMI1640 mit 10 mM HEPES umfüllen und den Thymus mit einer Präparierschere in kleine Stücke (ca. 1-2 mm groß) schneiden.
    3. Lassen Sie die Thymusfragmente am Boden des Röhrchens absetzen und entfernen Sie dann vorsichtig die Suspension mit einer 200-μl-Mikropipette.
    4. Die Thymusstücke werden in ein 5-ml-Polypropylen-Rundbodenröhrchen überführt, das 2 mL 0,5 mg/mL Kollagenase/Dispase und 1 U/mL DNase-Lösung in RPMI1640 enthält, die 2 % FBS enthält. In einem Wasserbad oder einem Wärmeblock bei 37 °C 10 min inkubieren.
    5. Vorsichtig mit einer 3-ml-Kunststoff-Transferpipette mischen und dann mit einer 1-ml-Mikropipette mit einer Kunststoffspitze zur weiteren Homogenisierung mischen.
    6. Fügen Sie 2 ml 5 mM EDTA in 1x HBSS mit 1% FBS hinzu. Filtern Sie die Zellsuspension durch ein 60 μm Nylonnetz und in ein konisches 50-ml-Röhrchen. Fügen Sie 16 ml RPMI1640 hinzu, die 10 mM HEPES enthalten.
    7. Die Zellsuspension 350 × g bei 4 °C für 5 min zentrifugieren. Das Zellpellet in 10 mL FACS-Puffer resuspendieren.
    8. Lagern Sie Zellen auf Eis und bestimmen Sie die Zellzahl mit Hilfe eines Zellzählers.
  3. Für embryonale Mäuse und neugeborene Mäuse bis zu einem Alter von 1 Woche
    1. Entnehmen Sie den Thymus (zwei Thymuslappen) von einer Maus. Legen Sie den Thymus in eine 60 mm große Plastikschale und entfernen Sie Blut, Nicht-Thymusgewebe und Fett mit einer gebogenen Pinzette mit feiner Spitze unter einem Präpariermikroskop.
    2. Legen Sie den Thymus in 0,2 ml RPMI1640 mit 10 mM HEPES in ein 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen. Entsorgen Sie die Flüssigkeit mit einer 200-μl-Mikropipette.
    3. Fügen Sie 0,5 ml 0,5 mg/ml Kollagenase/Dispase und 1 μl DNase-Lösung in RPMI1640 mit 2 % FBS hinzu. In einem Wasserbad oder einem Wärmeblock bei 37 °C 10 min inkubieren. Vorsichtig mit einer 1-ml-Mikropipette mit einer Kunststoffspitze mischen.
    4. Fügen Sie 0,5 mL 5 mM EDTA in 1x HBSS mit 1% FBS hinzu. Filtern Sie die Zellsuspension durch ein 60 μm Nylonnetz und in ein neues konisches 15-ml-Röhrchen. Fügen Sie 9 ml RPMI1640 hinzu, die 10 mM HEPES enthalten.
    5. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 350 × g bei 4 °C für 5 min. Resuspendieren Sie das Zellpellet in 1-3 mL FACS-Puffer
      6. .
    6. Lagern Sie Zellen auf Eis und bestimmen Sie die Zellzahl mit Hilfe eines Zellzählers.
  4. Alternative Methode: Liberase-Verdau
    1. Führen Sie die Schritte 1.1.1 und 1.1.2 aus.
    2. Lassen Sie die Thymusfragmente am Boden des Röhrchens absetzen und entfernen Sie dann vorsichtig die Suspension mit einer 200-μl-Mikropipette. Übertragen Sie die Thymusstücke in ein 5-ml-Röhrchen mit 1 mL 0,5 U/mL Liberase und 1 U/mL DNase in RPMI1640 mit 10 mM HEPES. In einem Wasserbad oder einem Wärmeblock bei 37 °C 15 min inkubieren.
    3. Vorsichtig mit einer 1-ml-Mikropipette mit einer Kunststoffspitze mischen. Inkubieren Sie weitere 15 Minuten, falls die Gewebefragmente noch sichtbar sind.
    4. Vorsichtig mit einer 1-ml-Mikropipette mit einer Kunststoffspitze mischen. Fügen Sie 1 ml 5 mM EDTA in 1x HBSS mit 1% FBS hinzu.
    5. Filtrieren Sie die Zellsuspension durch ein 60 μm Nylonnetz und in ein neues konisches 50-ml-Röhrchen. Fügen Sie 18 ml RPMI1640 hinzu, die 10 mM HEPES enthalten.
    6. Die Zellsuspension wird 5 min lang bei 350 × g, 4 °C zentrifugiert. Die Zellen werden in 10 mL FACS-Puffer (1x HBSS mit 1 % BSA und 0,1 % NaN3) resuspendiert.
    7. Lagern Sie Zellen auf Eis und bestimmen Sie die Zellzahl mit Hilfe eines Zellzählers.

2. Antikörperfärbung von Thymuszellen

  1. 16 × 106 Zellen in ein 5-ml-Röhrchen aus Polystyrol mit rundem Boden geben. Die Zellen bei 350 × g bei 4 °C 5 min zentrifugieren. Entsorgen Sie den Überstand.
  2. Geben Sie 10 μl Arbeitskonzentration des monoklonalen Anti-Fc-Rezeptor-Antikörpers (mAb, Klon 2.4G2) in FACS-Puffer hinzu, um die unspezifische Bindung von färbendem IgG an den Fc-Rezeptor der Zelloberfläche zu blockieren. Bei 4 °C 5 min inkubieren.
  3. Jeweils 40 μl Arbeitskonzentrationen von anti-CD45 mAb (hämatopoetisch zellspezifisch; z. B. BV421-markiert), anti-EpCAM mAb (epithelzellspezifisch; z. B. PE-Cy7-markiert), anti-Ly51 mAb (cTEC-detektierend; z. B. AF647-markiert) und Ulex europaeus Agglutinin I (UEA-1) (mTEC-detektierend; z. B. AF594-markiert) in FACS-Puffer hinzufügen. Bereiten Sie parallel Röhrchen für einfarbig gefärbte Zellen und ungefärbte Zellen für die Einrichtung eines Durchflusszytometers vor.
  4. 45 Min. bei 4 °C inkubieren. Alle 10 Min. gut mischen. 2 mL FACS-Puffer hinzufügen.
  5. Küvetten 350 × g bei 4 ΰC 5 Min. zentrifugieren. Den Überstand verwerfen.
  6. Fügen Sie 1 μl Ghost Dye Violet 510 hinzu (zur Unterscheidung lebensfähiger Zellen von toten Zellen in der durchflusszytometrischen Analyse von fixierten und permeabilisierten Zellen). Verwenden Sie unverdünntes Ghost Dye Reagenz; Gut mischen. 30 min bei 4 °C inkubieren; Alle 10 Min. gut mischen.
  7. Fügen Sie 2 ml FACS-Puffer hinzu. Zellen 350 × g bei 4 °C für 5 min zentrifugieren. Entsorgen Sie den Überstand.
  8. Fixieren Sie die Zellen, indem Sie 1 ml 2% Paraformaldehyd (PFA) in PBS hinzufügen und 10 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubieren.
  9. 3,5 ml PBS in das Röhrchen geben und die Zellen 8 Minuten lang 700 × g bei 4 °C zentrifugieren. Den Überstand verwerfen.
  10. Permeabilisieren Sie die Zellen, indem Sie 1 ml intrazellulären Fixierungs-/Permeabilisierungspuffer hinzufügen und 20 Minuten lang bei 4 °C inkubieren.
  11. Die Zellen werden 8 Min. lang 700 × g bei 4 °C zentrifugiert. Den Überstand verwerfen.
  12. Fügen Sie 1 ml 1x Permeabilisierungspuffer hinzu. Die Zellen bei 700 × g bei 4 °C 8 min zentrifugieren. Entsorgen Sie den Überstand.
  13. Jeweils 100 μl Arbeitskonzentrationen von Anti-Beta5t-Antikörpern oder Anti-CCL21-Antikörpern oder 40 μl Arbeitskonzentrationen von Anti-Aire-Antikörpern (z. B. AF488-markiert) in 1x Permeabilisierungspuffer geben, gut mischen und 60 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.
  14. Fügen Sie 1 ml 1x Permeabilisierungspuffer hinzu. Die Zellen bei 700 × g bei 4 °C 8 min zentrifugieren. Entsorgen Sie den Überstand.
  15. Wiederholen Sie Schritt 2.14.
  16. 100 μl Arbeitskonzentrationen von Anti-Kaninchen-IgG (z. B. AF555-markiert) zugeben und 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.
  17. Fügen Sie 1 ml 1x Permeabilisierungspuffer hinzu. Die Zellen bei 700 × g bei 4 °C 8 min zentrifugieren. Entsorgen Sie den Überstand.
  18. Die Zellen in 200 μl FACS-Puffer resuspendieren und gut mischen.
  19. Lagern Sie die Zellen im Dunkeln bei 4 °C bis zur durchflusszytometrischen Analyse.
  20. Filtern Sie die Zellen vor der durchflusszytometrischen Analyse durch ein 60-μm-Nylonnetz.

Ergebnisse

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Die Analyse erfordert ein Durchflusszytometer, das die Detektion von mindestens sechs Fluoreszenzkanälen (für CD45, EpCAM, Ly51, UEA1, Ghost Dye und beta5t, CCL21 und/oder Aire) sowie Vorwärts- und Seitenstreuparameter ermöglicht. Repräsentative durchflusszytometrische Profile von Kollagenase/Dispase-verdauten Thymuszellen von 0 Tage alten Mäusen und 2 Wochen alten Mäusen sind in Abbildung 1 bzw. Abbildung 2 dargestellt. In beiden Abbildungen zeigt das Punktdiagramm in Panel A die Intensität der Vorwärtsstreuung (FSC) und die Fluoreszenzintensität des Ghost Dye Violet 510 der gesamten Partikelsignale. Mehr als 90 % der Partikelsignale stellen lebensfähige Zellen dar, wie durch negative Färbung mit dem Ghost Dye-Reagenz und durch Vorwärtsstreuung, die die Zellgröße reflektiert, beurteilt wird. Panel B zeigt die Fluoreszenzsignale der Zelloberfläche von lebensfähigen Thymuszellen für CD45, ein Molekül, das von hämatopoetischen Zellen exprimiert wird, und EpCAM, ein Molekül, das von Epithelzellen exprimiert wird. Eine kleine, aber markante Zellpopulation ist CD45-EpCAM+, die somit TECs darstellt.

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Abbildung 1: Repräsentative durchflusszytometrische Profile von Kollagenase/Dispase-verdauten Thymuszellen von 0 Tage alten Wildtyp-C57BL/6-Hintergrundmäusen. (A) Vorwärtsstreuintensität und Ghost Dye Violet 510 Fluoreszenzintensität der gesamten Partikelsignale. Das rote Feld zeigt die Signale lebensfähiger Zellen an. (B) Fluoreszenzsignale lebensfähiger Zellen (roter Kasten in Feld A) für CD45 und EpCAM. Das rote Feld zeigt CD45- EpCAM+ TECs an. (C) Ly51- und UEA1-Zelloberflächen-Färbesignale in TECs (roter Kasten in Panel B) zeigen zwei Hauptpopulationen: Ly51hohe UEA1 niedrige Zellen, angereichert mit cTECs, und Ly51niedrige UEA1 hohe Zellen, die mit mTECs angereichert sind. (D-F) Detektion von (D) beta5t, (E) CCL21 und (F) Aire in cTECs (obere Panels) und mTECs (untere Panels), wie in panel C definiert. Graue Histogramme zeigen Kontrollprofile, die nur mit (D,E)-Sekundärantikörpern gefärbt wurden, und (F), die mit Zellen von Aire-defizienten Mäusen gefärbt wurden. Abkürzungen: FSC = Vorwärtsstreuung; TECs = Thymus-Epithelzellen; cTECs = kortikale TECs; mTECs = medulläre TECs. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 2: Repräsentative durchflusszytometrische Profile von Kollagenase/Dispase-verdauten Thymuszellen von 2 Wochen alten Wildtyp-Mäusen mit C57BL/6-Hintergrund. (A) Vorwärtsstreuintensität und Ghost Dye Violet 510 Fluoreszenzintensität der gesamten Partikelsignale. Das rote Feld zeigt die Signale lebensfähiger Zellen an. (B) Fluoreszenzsignale lebensfähiger Zellen (roter Kasten in Feld A) für CD45 und EpCAM. Das rote Feld zeigt CD45- EpCAM+ TECs an. (C) Ly51- und UEA1-Zelloberflächen-Färbesignale in TECs (roter Kasten in Panel B) zeigen zwei Hauptpopulationen: Ly51hohe UEA1 niedrige Zellen, angereichert mit cTECs, und Ly51niedrige UEA1 hohe Zellen, die mit mTECs angereichert sind. (D-F) Detektion von (D) beta5t, (E) CCL21 und (F) Aire in cTECs (obere Panels) und mTECs (untere Panels), wie in panel C definiert. Graue Histogramme zeigen Kontrollprofile, die nur mit (D,E)-Sekundärantikörpern gefärbt und mit (F)-FITC-markiertem Isotyp-angepasstem IgG gefärbt wurden. Abkürzungen: FSC = Vorwärtsstreuung; TECs = Thymus-Epithelzellen; cTECs = kortikale TECs; mTECs = medulläre TECs; FITC = Fluorescein-Isothiocyanat. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Ly51 und UEA1 Zelloberflächen-Färbesignale, wie in Panel C gezeigt, zeigen zwei Hauptpopulationen in TECs: eine Population mit relativ hohem Ly51-Gehalt und niedrigem UEA1-Gehalt, angereichert mit cTECs, und eine weitere relativ niedrige Population in Ly51 und hoher Gehalt an UEA1, angereichert mit mTECs21,22,23,24,25. Im embryonalen und neonatalen Stadium, einschließlich des 0-Tage-Alters, ist die Häufigkeit von cTECs größer als die von mTECs. In den postnatalen Stadien dominiert die Häufigkeit von mTECs, hauptsächlich weil die Effizienz der cTEC-Freisetzung aus dem Thymus extrem niedrig wird (etwa 1% der cTECs und 10% der mTECs können in eine Einzelzellsuspension zurückgeholt werden)17.

Fixierung und Permeabilisierung von Zellen ermöglichen den Nachweis von intrazellulären Molekülen innerhalb von TECs. Panel D zeigt eine beta5t-Expression, die in der Mehrzahl der cTECs, aber nicht in mTECs nachgewiesen wurde; Panel E zeigt den Nachweis von CCL21 in einem Teil der mTECs, aber nicht in cTECs, und Panel F zeigt Aire, exprimiert in einer Subpopulation von mTECs.

Zusätzliche durchflusszytometrische Profile von intrazellulären Molekülen in Maus-TECs finden Sie in veröffentlichten Artikeln; für beta5t6,20, CCL2114,16,26 und Aire27,28, sowie für zusätzliche intrazelluläre Moleküle, einschließlich Keratin22,29 und Fezf211,30.

Diskussion

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Kollagenase, mit oder ohne Dispase, wird häufig zur Verdauung von Mausthymus zur Herstellung der TECs 4,5,9,18,21 verwendet. Liberase, das eine Mischung aus Proteasen einschließlich Kollagenase enthält, wird auch zur Verdauung des Thymus zur Herstellung von TECsverwendet 17,22. Die Verwendung von Kollagenase und Liberase führt zu im Wesentlichen gleichwertigen Ausbeuten und Qualitäten von cTECs und mTECs aus dem Thymus der Maus, obwohl je nach Produktcharge der Enzyme geringfügige Unterschiede auftreten können. Trypsin wird auch für einen effizienten Thymusverdau verwendet 21,23, obwohl gezeigt wurde, dass viele Zelloberflächenmoleküle, einschließlich EpCAM und CD80, die von TEC exprimiert werden, anfällig für den Trypsinverdausind 21. Für die enzymatische Verdauung des Thymus wird häufig DNase zugesetzt, um die Viskosität aufgrund der DNA-Freisetzung aus geschädigten Zellen zu verringern17,21.

Die enzymatische Verdauung des Thymus ist essentiell für die Befreiung von TECs aus dem Thymus. Der Thymus sollte ausreichend verdaut werden, bis Gewebsfragmente unsichtbar werden und die Zellsuspension homogen erscheint. Die Verdauung sollte jedoch nicht zu lange auf sich warten lassen, da eine übermäßige enzymatische Behandlung die Zellen schädigt und die Lebensfähigkeit der Zellen verringert. Bei jedem Experiment ist es wichtig, genau auf die Inkubationszeit und die Pipettierstärke während der Thymusverdauung zu achten. Es ist auch wichtig zu wissen, dass die derzeitige enzymatische Aufschlusstechnologie nur die Freisetzung eines kleinen Teils der TECs ermöglicht, wie in der Einleitung beschrieben und wie zuvor berichtet 17,18,19.

Da TECs in Gesamtthymuszellsuspension selten sind, erfordert die durchflusszytometrische Analyse von TECs unter Verwendung der Gesamtthymuszellsuspension die Färbung vieler Zellen, typischerweise 8 × 106 bis 16 × 106 Zellen pro Messung.

TECs, die aus enzymverdauten Thymuszellen gewonnen werden, können mit anti-CD45-Magnetkügelchen22 und/oder Percoll-Dichtegradientenzentrifugation31 angereichert werden. Diese Anreicherungsverfahren sind zeitsparend, insbesondere wenn TECs anschließend über einen durchflusszytometrischen Zellsortierer aufgereinigt werden. Es sollte auch beachtet werden, dass die Anti-CD45-Anreicherung eine Subpopulation von TECs entfernen würde, die eng mit CD45-exprimierenden Thymozytenassoziiert sind 20 , und die Percoll-Zentrifugation eine unerwartet dichte Subpopulation von TECs entfernen würde.

In Bezug auf die Fixierung von TEC ist bekannt, dass die PFA-Behandlung die Zellen schrumpft und die Vorwärtsstreuintensität in der durchflusszytometrischen Analyse reduziert. Ein schonendes Pipettieren der Zellen unmittelbar nach der Zugabe von 2% PFA und der anschließenden Zugabe von PBS kann dazu beitragen, eine übermäßige Zellschrumpfung zu verhindern.

Für die durchflusszytometrische Analyse erfordert ihre Abgrenzung angesichts des seltenen Auftretens von TECs im Thymus einen anderen Ansatz als bei Thymozyten oder Splenozyten. Die erste Klassifizierung basiert auf der Verwendung von CD45, einem hämatopoetischen Pan-Marker, der auf Thymozyten und anderen hämatopoetischen Zellen, einschließlich dendritischer Zellen und Makrophagen, ubiquitär ist. Umgekehrt fehlt bei TECs, die nicht hämatopoetischen Ursprungs sind, die CD45-Expression. Stattdessen exprimieren TECs EpCAM auf ihrer Oberfläche, was eine einfache Gating-Strategie von CD45-negativ und EpCAM-positiv zur Unterscheidung von TECs ermöglicht. In unserer durchflusszytometrischen Analyse beginnen wir mit der Definition dieser Population und stellen anschließend eine angemessene Skalierung der Vorwärts- und Seitenstreuparameter sicher, da die Größendiskrepanz zwischen TECs und Thymozyten erheblich ist und die TEC groß und hochfluoresziert sind.

Anschließend wird das Augenmerk auf die Evaluierung von cTEC- und mTEC-Markern innerhalb der CD45-negativen EPCAM-positiven Population gerichtet. Aufgrund der geringen Größe dieser Population ist dieser Schritt für die Kompensation von cTECs und mTEC unerlässlich. Die Untersuchung einer vollständig gefärbten Platte (z. B. cTEC-Marker Ly51 und mTEC-Marker UEA-1 zusammen mit TEC-definierendem CD45 und EpCAM) stellt außerdem sicher, dass die Streuskalierung angemessen ist. Bei der Einrichtung der Durchflusszytometrie besteht unser primäres Ziel darin, positive und negative Populationen für jeden Antikörper zu unterscheiden.

Bei der Co-Färbung von Aire, beta5t und CCL21 werden unterschiedliche Populationen innerhalb der TEC-Untergruppen identifiziert. Angesichts der selektiven Expression von Aire durch mTECs konzentrieren wir uns auf die vierfarbige Färbung von CD45-negativen/EPCAM-positiven/UEA-1-positiven/Ly51-negativen Zellen. Hier werden UEA-1-positive Zellen verwendet, um die Negativkontrolle für Aire zu etablieren, was eine eindeutige Identifizierung von Aire-positiven Zellen ermöglicht. Ein ähnlicher Ansatz wird für CCL21 gewählt, das in mTEC ausgedrückt wird. Umgekehrt wird für beta5t, das ausschließlich durch cTECs exprimiert wird, eine vergleichbare Gating-Strategie angewendet, wobei der Schwerpunkt auf Ly51-positiven Zellen innerhalb der vierfarbigen Färbung liegt, um die Hintergrundwerte für beta5t zu bestimmen. Die anschließende Analyse von Proben, die mit Anti-Beta5t gefärbt sind, erleichtert die Identifizierung einer positiven Population.

Anti-beta5t-Antikörper und Anti-CCL21-Antikörper sind Kaninchen-Antikörper, daher sollten diese Antikörper nicht ohne vorherige Fluoreszenzmarkierung gemischt werden. Die Arbeitskonzentrationen von Antikörpern sollten durch eine durchflusszytometrische Analyse von Kontrollzellen (z. B. TECs von Wildtyp- und Knockout-Mäusen) vorbestimmt werden, die mit seriellen Verdünnungen von Antikörpern gefärbt wurden.

In der durchflusszytometrischen Analyse werden cTECs und mTECs häufig durch die Zelloberflächenexpression von Ly51 oder CD205 für cTECs und von UEA1 und CD80 für mTECs definiert. Es sollte jedoch bedacht werden, dass cTECs und mTECs letztendlich durch ihre mikroanatomische Lokalisation im Thymus definiert werden müssen. Im embryonalen Thymus deuten neue Erkenntnisse darauf hin, dass die Expression von Ly51 und CD205 nicht auf cTECs beschränkt ist, sondern sich auf andere Populationen von TECs erstreckt, einschließlich cTEC/mTEC-bipotenter Vorläuferzellen und unreifer mTECs32,33. Darüber hinaus bleibt die Ly51-Expression in cTECs während der Embryogenese und der perinatalen Periode im Vergleich zur postnatalen Periode33 gering, wie auch in Abbildung 1 und Abbildung 2 gezeigt.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die durchflusszytometrische Analyse von enzymatisch freigesetzten Einzelzellsuspensionen von TECs trotz der begrenzten Effizienz der Freisetzung von TECs eine leistungsfähige Technik für die quantitative Analyse von TECs und ihren Subpopulationen mit Einzelzellauflösung bietet. Insbesondere ist die durchflusszytometrische Analyse intrazellulärer Moleküle in einzelliger TEC-Suspension nützlich, um die Expression einer Vielzahl von Molekülen zu untersuchen, die für die Entwicklung und Funktion von TECs und ihren Subpopulationen wichtig sind.

Offenlegungen

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Die Autoren haben keine Interessenkonflikte.

Danksagungen

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Wir danken Dr. Izumi Ohigashi für das Lesen des Manuskripts. Diese Arbeit wurde unterstützt durch das Intramurale Forschungsprogramm ZIA BC 011806 der National Institutes of Health, des National Cancer Institute und des Center for Cancer Research.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Kollagenase/Dispase Roche11097113001
Liberase TMRoche5401127001
Foxp3 / Transkriptionsfaktor-Färbepuffer-SeteBioscience00-5523-00
Ghost Dye Violet 510 Tonbo13-0870-T500
BV421 monoklonaler Anti-Maus-Antikörper gegen Maus, Klon 30-F11BD Horizon563890
Alexa Fluor 647 Anti-Maus Ly51 monoklonaler Antikörper, Klon 6C3BioLegend108312
PE/Cy7 Anti-Maus EpCAM/CD326 monoklonaler Antikörper, Klon G8.8BioLegend118216
DyLight 594 Ulex Europaeus Agglutinin I (UEA1)Vector LaboratoriesDL-1067-1
Alexa Fluor 488 monoklonaler Antikörper gegen Maus Aire, Klon 5H12eBioscience53-5934-82
Anti-Maus Psmb11/beta5t monoklonaler Kaninchen-Antikörper, Klon CPTC-PSMB11 (Maus)-1NIH NCICPTC-PSMB11 (Maus)-1https://proteomics.cancer.gov/antibody-portal
Anti-Maus CCL21/Exodus 2 Kaninchen polyklonaler AntikörperBio-RadAAM27
Alexa Fluor 555 Anti-Kaninchen-IgG-Antikörper mit hoher kette Ziege rekombinanter AntikörperInvitrogenA27039
Anti-Maus CD32/CD16 – Aufgereinigt (Fc-Block-Antikörper)Leinco TechnologiesC247
Nylon Mesh 60 MikronKomponentenversorgungW31436
Ausrüstung
ThermomixerEppendorfHeizblock
Cellometer Auto 2000 ZellviabilitätszählerNexcelomViabilitätszähler
LSRFortessa ZellanalysatorBD BiosciencesDurchflusszytometerFünf Laser (355, 408, 488, 595 und 637 nm)
FACSDiva Softwareversion 9.0.1BD BiosciencesDurchflusszytometrische Analyse
FlowJo 10.9.0BD BiosciencesDurchflusszytometrische Datenanalyse
Antikörperverdünnungsrate (Arbeitskonzentration)Verdünnungspuffer
Anti-Maus CD32/CD16 – Aufgereinigt (Fc-Block-Antikörper)1:40FACS-Puffer
BV421 monoklonaler Anti-Maus-Antikörper CD45:25FACS-Puffer
PE/Cy7 Anti-Maus EpCAM/CD326 monoklonaler Antikörper1:100FACS-Puffer
Alexa Fluor 647 Anti-Maus Ly51 monoklonaler Antikörper1:100FACS-Puffer
DyLight 594 Ulex Europaeus Agglutinin I (UEA1)1:400FACS-Puffer
Anti-Maus CCL21/exodus 2 Kaninchen polyklonaler Antikörper1:2001x Permeabilisierungspuffer
Anti-Maus Psmb11/beta5t Kaninchen monoklonaler Antikörper, Klon CPTC-PSMB11(Maus)-11:10001x Permeabilisierungspuffer
Alexa Fluor 555 Anti-Kaninchen IgG schwerkettiger rekombinanter Antikörper 1:4001x Permeabilisierungspuffer
Verwendungszweck
RPMI1640 mit 10 mM HEPES Für die Zellvorbereitung
RPMI1640 mit einem Gehalt von 2 % FBSFür die Zellvorbereitung
FACS Puffer (1x HBSS mit 1 % BSA  und 0,1% Natriumazid)Zur Zellvorbereitung und Antikörperfärbung
1 mg/ml Kollagenase/Dispase und 1U/ml DNase-Lösung in RPMI1640 mit 2% FBS Fürden Enzymaufschluss
2% PFA in PBSZur Zellfixierung
Fixierungs-/Permeabilisierungspuffer (1 Teil Fixierungs-/Permeabilisierungskonzentrat mit 3 Teilen Fixierungs-/Permeabilisierungsverdünnungsmittel)Zur Zellfixierung
1x Permeabilisierungspuffer (1 Teil 10X Konzentrat mit 9 Teilen destilliertem Wasser)Für die Färbung interzellulärer Antikörper 
Lebensfähige Zellen 1

Referenzen

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Schlagwörter

DurchflusszytometrieIntrazellul re F rbungThymus von M usenZellisolationkortikale TECsmedull re TECsBeta5t ExpressionCCL21 Nachweis

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