Dieses Protokoll stellt eine schnelle und nicht-letale Methode zur Gewinnung von Nebenschilddrüsen von Schweinen dar. Das Verfahren besteht aus drei Hauptschritten: Schweinepräparation mit Anästhesie, einseitige Thymusentnahme und Ex-vivo-Identifizierung und Extraktion der intrathymischen Nebenschilddrüse.
Ein Abonnement von JoVE ist erforderlich, um diesen Inhalt anzuzeigen. Melden Sie sich an oder beginnen Sie noch heute mit einer kostenlosen Testphase.
Methodenartikel
Beschaffung von Nebenschilddrüsen von lebenden Spenderschweinen und Ex-vivo-Identifizierung
* These authors contributed equally
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Hypoparathyreoidismus, der häufig auf chirurgische Komplikationen zurückzuführen ist, stört die Kalziumhomöostase stark und führt zu behindernden Symptomen. Die derzeitigen Behandlungen bieten nur eine begrenzte Linderung, was den Bedarf an alternativen Therapien wie der Nebenschilddrüsentransplantation unterstreicht. In dieser Studie wird eine einfache Methode zur Entnahme von lebendgespendeten Nebenschilddrüsen von Schweinen vorgestellt, die in der Transplantationsforschung, insbesondere im Bereich der Xenotransplantation, eingesetzt werden kann. Das Verfahren umfasst drei Hauptschritte: die Aufbereitung des Schweins mit Anästhesie, die einseitige Thymusentnahme sowie die Ex-vivo-Identifizierung und Extraktion der intrathymischen Nebenschilddrüse. Das Protokoll verwendet Landrassenschweine mit Verfahren, die eine ethische Behandlung und Genesung nach der Operation gewährleisten. Wir extrahierten erfolgreich Nebenschilddrüsen und bestätigten ihre Lebensfähigkeit und Integrität durch anschließende Analysen. Die PTH-Spiegel im Gewebeüberstand überstiegen 1.000 pg/ml, und die Immunfluoreszenzfärbung unterschied Nebenschilddrüsen von Thymusgewebe, was die Zuverlässigkeit des Verfahrens bestätigte. Dieses Protokoll bietet eine schnelle, nicht-letale und ethisch einwandfreie Methode für die Entnahme von Nebenschilddrüsen von Schweinen, die die anatomischen Unterschiede zwischen Schweinen und Menschen berücksichtigt. Es bietet einen nachhaltigen Ansatz mit erheblichen Auswirkungen auf die Hypoparathyreoidismus-Forschung und die Xenotransplantation.
Einleitung
Dieses Protokoll stellt eine schnelle und nicht-letale Methode zur Entnahme von Nebenschilddrüsen aus Schweinen dar. Der Hypoparathyreoidismus, der durch eine unzureichende Parathormonsekretion gekennzeichnet ist, stört die Kalziumhomöostase kritisch1. Diese Erkrankung, überwiegend eine chirurgische Komplikation nach Parathyreoidektomie oder Thyreoidektomie, äußert sich durch Symptome wie Asthenie, chronische Schmerzen, Tachykardie, Krampfanfälle und sogar Nierenerkrankungen im Endstadium2. Gelegentlich entsteht es durch seltene Autoimmun- oder genetische Erkrankungen. Die derzeitigen Behandlungen, hauptsächlich orale Calcium- und Vitamin-D-Supplementierung oder rekombinantes Parathormon, lindern systemische Symptome wie Müdigkeit und Depression nur teilweise 3,4. Der wachsende Bedarf an Parathormon-Allotransplantation als potenzielles Heilmittel für schweren Hypoparathyreoidismus unterstreicht die Notwendigkeit der Etablierung einheitlicher Transplantationsprotokolle 5,6,7,8,9. Die präklinischen Studien zur Nebenschilddrüsentransplantation sind jedoch nach wie vor begrenzt, und es fehlen standardisierte Tiermodelle. Darüber hinaus erhöht der jüngste Aufschwung auf dem Gebiet der Xenotransplantation10,11 das Interesse an klinischen Anwendungen der Xenotransplantation, insbesondere im Bereich der endokrinen Zelltherapie12,13. Schweinemodelle der Nebenschilddrüsen-Xenotransplantation sind jedoch aufgrund der Komplexität der Identifizierung von Nebenschilddrüsengewebe bei Schweinen eine Herausforderung. Es besteht daher die Notwendigkeit, eine reproduzierbare, nachhaltige und ethische Technik zur Entnahme von Nebenschilddrüsen von Schweinen bereitzustellen, um die Nebenschilddrüsen-Xenotransplantation weiterzuentwickeln.
Im Gegensatz zum Menschen, der typischerweise vier Nebenschilddrüsen hinter der Schilddrüse hat, besitzen Schweine bei den meisten zwei Nebenschilddrüsen, die sich jeweils im kranialen Teil des Thymus befinden. Frühere Studien, die darauf abzielten, Nebenschilddrüsen bei Schweinen zu lokalisieren, stützten sich entweder auf letale Methoden zur ex vivo-Identifizierung oder auf Fluorophor-basierte Techniken, die bei der Xenotransplantation möglicherweise schwer umzusetzen sind 14,15,16. Wir schlagen hier eine einfache und nicht-letale Technik vor, die für die Xenotransplantation geeignet ist und auf zwei Schlüsselschritten basiert: der Entnahme des Schweinethymus und der ex vivo iIdentifizierung der Nebenschilddrüse mittels Transillumination. Diese Technik könnte sowohl für die Erforschung der Nebenschilddrüsenphysiologie als auch für die Transplantation nützlich sein.
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Protokoll
Alle Tierversuche wurden von der Ethikkommission der Universität Lille genehmigt (referenziert #20491-20190219161313).
1. Anästhesie für Schweine
- Verabreichen Sie Buprenorphin (0,015 mg/kg, intramuskulär) 30 Minuten vor der ersten Inzision, um eine präoperative Analgesie zu erhalten.
- Führen Sie eine intramuskuläre Injektion von Ketamin (50 mg/kg) und Xylazin (3 mg/kg) durch, um eine Sedierung einzuleiten. Verabreichen Sie 5% Isofluran über Inhalation für 3 bis 5 Minuten, um die Anästhesie zu vertiefen.
- Beurteilen Sie die Tiefe der Anästhesie, indem Sie den Lidschlussreflex und den Schluckreflex überprüfen. Intubieren Sie das Schwein und positionieren Sie es in Rückenlage auf dem Operationstisch. Reduzieren Sie die Isoflurankonzentration durch Inhalation auf 2 % zur Aufrechterhaltung der Anästhesie.
- Überwachen Sie kontinuierlich die Herzfrequenz und die Sauerstoffsättigung mit einem tragbaren Veterinärmonitor mit mehreren Parametern, um eine optimale Anästhesietiefe und physiologische Stabilität während des gesamten Eingriffs zu gewährleisten.
2. Darstellung des Interessengebiets
- Rasieren und reinigen Sie den Halsbereich, der sich vom Unterkieferbereich bis zum Brustbein erstreckt.
- Tragen Sie antiseptische Seife auf, gefolgt von Chlorhexidin, um ein steriles Feld zu gewährleisten. Trocknen Sie die gesamte Fläche gründlich ab.
- Positionieren Sie sterile Abdecktücher, um den vorderen Halsbereich für chirurgische Eingriffe zu isolieren.
3. Exposition des Schweinethymus
- Führen Sie mit einem Skalpell einen 10 cm langen vertikalen Schnitt entlang der weißen Gebärmutterhalslinie durch. Präparieren Sie den Bereich vorsichtig mit einer Metzenbaum-Schere, um die Schilddrüsenmuskulatur zu trennen und ein klares Operationsfeld zu schaffen.
- Platzieren Sie einen selbsthaltenden Retraktor zwischen dem Omohyoidmuskel und dem Schilddrüsenknorpel, um die Dissektion des Bindegewebes zu erleichtern und den Thymus freizulegen.
HINWEIS: Vermeiden Sie übermäßigen Druck auf die Luftröhre, um Verletzungen zu vermeiden. - Legen Sie nach und nach den kranialen Teil des Thymus frei und trennen Sie ihn vorsichtig von der Halsschlagader, in der sich der Vagusnerv, die Vena jugularis interna und die Arteria carotis communis befinden.
HINWEIS: Um Verletzungen zu vermeiden, verwenden Sie Elektrokoagulation, um eine Blutstillung zu erreichen.
4. Entnahme des Schweinethymus
- Nach der Freisetzung entnehmen Sie den kranialen Teil des Thymus, der typischerweise 5 - 8 cm misst.
- Spülen Sie den extrahierten Thymus in isotonischer Kochsalzlösung, um die Identifizierung der Nebenschilddrüse zu erleichtern.
HINWEIS: Dieser Schritt ist entscheidend für die Verbesserung der Visualisierung und Differenzierung der ausgeprägten Textur der Nebenschilddrüse
5. Identifizierung der intrathymischen Nebenschilddrüse ex vivo
- Glätten Sie das Thymusgewebe sanft, um die Identifizierung der Nebenschilddrüsen zu erleichtern.
HINWEIS: Die Nebenschilddrüse weist eine charakteristische Textur auf, insbesondere im Vergleich zum umgebenden Gewebe. Die fibrotische Kapsel der Nebenschilddrüse ist fester und ähnlich groß wie eine Erbse. - Verwenden Sie eine Lichtquelle, um die Nebenschilddrüse durch Durchleuchtung zu identifizieren.
HINWEIS: Das Gefäßsystem, das die Nebenschilddrüse umgibt, sollte deutlich sichtbar sein, um die Unterscheidung zu erleichtern. - Schneiden Sie die Kapsel vorsichtig heraus und extrahieren Sie die gesamte Nebenschilddrüse. Mit einer Debakey-Pinzette für eine schonende Handhabung und einer Metzenbaum-Schere für eine präzise Dissektion. Isolieren Sie die Drüse vom umgebenden Thymusgewebe.
- Legen Sie die isolierte Nebenschilddrüse in eine Kühllösung und halten Sie sie bei 4 °C, um ihre Lebensfähigkeit für nachfolgende Eingriffe zu erhalten.
- Betten Sie das Gewebe für die weitere Verarbeitung in Paraffin ein.
6. Chirurgischer Verschluss und Erwachen
- Nach der Entnahme der Nebenschilddrüse verschließen Sie die Operationsstelle in Schichten. Naht von Muskeln und Unterhautgewebe mit resorbierbaren Nähten. Verschließen Sie die Haut mit nicht resorbierbaren Nähten.
- Entwöhnen Sie das Schwein allmählich von der Narkose. Wenn Sie das Bewusstsein wiedererlangt haben, überwachen Sie das Schwein auf unmittelbare postoperative Komplikationen.
- Verabreichen Sie Analgetika und Antibiotika gemäß postoperativem Protokoll (Buprenorphin 0,03 bis 0,05 mg/kg und Clamoxyl 15 mg/kg für 48 Stunden). Die Schweine zur Genesung unter tierärztlicher Aufsicht in ihre Haltungseinrichtung zurückbringen.
7. Protokoll der Immunfärbung
- Entparaffinierung und Dehydratisierung von in Paraffin eingebetteten Proben: Xylol für 5 Minuten, Xylol für 10 Minuten, 100 % Ethanol für 5 Minuten, 90 % Ethanol für 7 Minuten 30, 70 % Ethanol für 7 Minuten 30, 50 % Ethanol für 5 Minuten, destilliertes Wasser für 5 Minuten und Phosphatpuffer-Kochsalzlösung (PBS) für 5 Minuten.
- Führen Sie die Antigengewinnung durch, indem Sie die Proben in Citratpuffer pH 6 bei 650 W für 9 Minuten in der Mikrowelle erhitzen. Lassen Sie die Proben 20 Minuten lang im Puffer abkühlen. Dreimal jeweils 5 Minuten lang mit PBS spülen.
- Inkubieren Sie die Proben, umschlossen mit einem Dako-Stift, bei Raumtemperatur für 20 Minuten mit Proteinblocklösung, um die unspezifische Bindung zu blockieren.
- Die Proben werden über Nacht bei 4 °C mit dem Primärantikörper (PTH-Antikörper (H-7), Maus-IgG-α-human, sc-398856, 1:100 ) inkubiert, verdünnt in 1 % Rinderserumalbumin (BSA). Zweimal mit PBS waschen für jeweils 5 Minuten.
- Inkubieren Sie 1 h und 30 min bei Raumtemperatur mit dem Sekundärantikörper (Alexa Fluor 488, Ziegen-α-Maus, A11001, 1:500), verdünnt in 1 % Rinderserumalbumin. Zweimal mit PBS und einmal mit doppelt destilliertem Wasser 5 Min. waschen.
- Montieren Sie die Objektträger mit DAPI-Lösung und lagern Sie die Objektträger bei 4 °C.
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Ergebnisse
Zu den primären Ergebnissen dieser Studie gehören die erfolgreiche Extraktion von Nebenschilddrüsen aus Landrassenschweinen und die anschließende Analyse zur Bestätigung ihrer Lebensfähigkeit und Integrität. Die Ergebnisse werden wie folgt zusammengefasst. Die Identifizierung des Nebenschilddrüsengewebes wurde intraoperativ durch Transillumination bestätigt (Abbildung 1A). Nach der Extraktion wurden zwei kleine Proben des Gewebes entnommen (jeweils ca. 10%). Eine Probe wurde in eine...
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Diskussion
Dieses Protokoll stellt eine schnelle und nicht-letale Methode zur Entnahme von Nebenschilddrüsen bei Schweinen dar. Der wichtigste Schritt innerhalb des Protokolls besteht darin, den Schweinethymus zu lokalisieren, um eine vollständige Entnahme für weitere ex vivo-Untersuchungen zu gewährleisten. Sobald der Thymus extrahiert ist, kann die Nebenschilddrüse durch Durchleuchtung leicht identifiziert werden.
Eine der größten Herausforderungen dieser Tech...
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Danksagungen
Wir danken der Französischen Gesellschaft für Diabetes und der Fondation pour la Recherche Médicale für die Unterstützung und Forschungsförderung.
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Equipment | |||
| 22G Kurzer peripherer Katheter | Smiths Medical | 5060 | |
| Basic Set II, Crêpe | Hartmann | 9389253 | |
| Bupaq (bupré norphine) | Virbac | ||
| Clippers Favorita II | Aesculap Schermaschinen | GT104 | |
| Einwegskalpelle | Swann-Morton | 0510 | |
| Elektrodenspatel | Erbe | 21191-002 | |
| Elektrochirurgie-Generator BE VIO 200p | Erbe | 10140-400 | |
| Euroklav 23 VS+ | MELAG | 10056 | |
| Schwerkraftinfusion 3-Wege-Ventil mit mobiler Luer-Lock-Spitze | Care Fusion | A64-3V | |
| Griff mit zwei Knöpfen für Elektroden Slim-Line | Erbe | 20190-065 | |
| Isofluran Funnel Fill Vaporizer | Supera Anästhesie Innovationen | VAP3000 | |
| Isoran (Isofluran) | Axience | ||
| Ketamidor (ké tamin) | Axience | ||
| Light Ceiling Double | RIMSA | PENTA81+30E | |
| Medisorb Kohlendioxid-Absorptionsmittel | Vyaire | 8570043 | |
| Mersutures 0 | Ethicon | F2520 | |
| Mikrotom | LEICA RM2255 | ||
| Miller Blade | Opticlar | 600.020 | |
| Sauerstoffkonzentrator | DeVilbiss | 525KS | |
| Multiparameter-Veterinärmonitor | Mindray | IPM 10 | |
| Wiederverwendbare Laryngoskopgriffe | Opticlar | 600.080 | |
| Anästhesiebeatmungsgerät für Kleintiere | Midmark | 91806001 | |
| Chirurgische Instrumente | Kohler medizintechnik | ||
| Operationstisch | Vetinox | TA700005 | |
| Trachealröhre | Smiths Medical | 100/179/070 | |
| Vicryl 2-0 | Ethicon | JV453 | |
| VMS | Midmark | 91800003 | |
| Materialien und Reagenzien | |||
| DMEM F-12 Medium | ThermoFischer | 11320033 | |
| Parathormon Antikörper | SantaCruz | sc-398856 | |
| Schneller intraoperativer Pth-Assay | Beckman Coulter | A16972 |
Referenzen
- Gafni, R. I., Collins, M. T. Hypoparathyroidism. N. Engl. J. Med. 380, 1738-1747 (2019).
- Gosmanova, E. O., Houillier, P., Rejnmark, L., Marelli, C., Bilezikian, J. P. Renal complications in patients with chronic hypoparathyroidism on conventional therapy: a systematic literature review: Renal disease in chronic hypoparathyroidism. Rev. Endocr. Metab. Disord. 22, 297-316 (2021).
- Frey, S., et al. Impact of permanent post-thyroidectomy hypoparathyroidism on self-evaluation of quality of life and voice: results from the national qol-hypopara study. Ann. Surg. 274, 851-858 (2021).
- Büttner, M., Krogh, D., Siggelkow, H., Singer, S. What are predictors of impaired quality of life in patients with hypoparathyroidism. Clin. Endocrinol. (Oxf). 97, 268-275 (2022).
- Gadelha, D. D., Filho, W. A., Brandão, M. A. J., Montenegro, R. M. Is parathyroid allotransplantation a viable option in the treatment of permanent hypoparathyroidism? A review of the literature. Endocrine. 80 (2), 253-265 (2022).
- Sakane, E. N., Vieira, M. C. C., Vieira, G. M. M., Maeda, S. S. Treatment options in hypoparathyroidism. Arch. Endocrinol. Metab. 66, 651-657 (2022).
- Zhang, J. L. H., Appelman-Dijkstra, N. M., Schepers, A. Parathyroid allotransplantation: A systematic review. Med. Sci. 10, 19(2022).
- Goncu, B., et al. Graft survival effect of HLA-A allele matching parathyroid allotransplantation. J. Investig. Med. Off. Publ. Am. Fed. Clin. Res. 69, 785-788 (2021).
- Barczyński, M., Gołkowski, F., Nawrot, I. Parathyroid transplantation in thyroid surgery. Gland Surg. 6, 530-536 (2017).
- Montgomery, R. A., et al. Results of two cases of pig-to-human kidney xenotransplantation. N. Engl. J. Med. 386, 1889-1898 (2022).
- Loupy, A., et al. Immune response after pig-to-human kidney xenotransplantation: a multimodal phenotyping study. The Lancet. 402, 1158-1169 (2023).
- Goncu, B., et al. Xenotransplantation of microencapsulated parathyroid cells as a potential treatment for autoimmune-related hypoparathyroidism. Exp. Clin. Transplant. Off. J. Middle East Soc. Organ Transplant. 21, 901-912 (2023).
- Hasse, C., et al. Parathyroid xenotransplantation without immunosuppression in experimental hypoparathyroidism: long-term in vivo function following microencapsulation with a clinically suitable alginate. World J. Surg. 24, 1361-1366 (2000).
- Oster, M., et al. Fast and reliable dissection of porcine parathyroid glands - A protocol for molecular and histological analyses. Ann. Anat. - Anat. Anz. 219, 76-81 (2018).
- Hyun, H., et al. Structure-inherent targeting of near-infrared fluorophores for parathyroid and thyroid gland imaging. Nat. Med. 21, 192-197 (2015).
- Klute, K. Contribution to the topography and histology of porcine parathyroid glands. , Justus Liebig University of Giessen. Beitrag zur Topographie und Histologie der Epithelkörperchen des Schweines. Ph.D. thesis. Justus Liebig-Universität zu Giessen (1959).
- Arndt, H. On the topography of epithelial cells in pigs with special consideration of the suitability of pigs for the production of organo-therapeutic epithelial cell preparations. Z. Anat. 81, (Zur Topographie der Epithelkörperchen beim Schwein mitbesonderer Berücksichtigung der Eignung des Schweines für die Gewinnungorgano-therapeutischer Epithelkörperchenpräparate) 191-197 (1926).
- Butylina, M., Föger-Samwald, U., Gelles, K., Pietschmann, P., Sipos, W. Challenges in establishing animal models for studying osteoimmunology of hypoparathyroidism. Front. Vet. Sci. 10, 1163903(2023).
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Nachdrucke und Genehmigungen
