Bewertung der Reparaturaktivität von DNA-Doppelstrangbrüchen mit Hilfe von Hochdurchsatz- und quantitativen Lumineszenz-basierten Reporter-Assays

Zusammenfassung

Wir präsentieren Protokolle zur Bewertung der Kompetenz des Doppelstrangbruch-Reparaturwegs in Zellen unter Verwendung einer Reihe von lumineszenzbasierten extrachromosomalen Reportersubstraten.

Zusammenfassung

Die Reparatur von DNA-Doppelstrangbrüchen (DSBs) ist entscheidend für die Aufrechterhaltung der Genomstabilität und der Zellviabilität. Die DSB-Reparatur (DSBR) in Zellen wird durch mehrere Mechanismen vermittelt: homologe Rekombination (HR), nicht-homologe Endverbindung (NHEJ), Mikrohomologie-vermittelte Endverbindung (MMEJ) und Einzelstrang-Annealing (SSA). Zelluläre Assays sind unerlässlich, um die Leistungsfähigkeit und Modulation dieser Signalwege als Reaktion auf verschiedene Reize zu messen.

Hier stellen wir eine Reihe von extrachromosomalen Reporter-Assays vor, die jeweils die Rekonstitution eines Nanoluziferase-Reportergens über einen der vier wichtigsten DSBR-Signalwege in Zellen messen. Nach transienter Transfektion in interessierende Zellen kann die Reparatur von signalwegspezifischen Reportersubstraten in weniger als 24 Stunden durch den Nachweis von Nanoluciferase (NanoLuc) Lumineszenz gemessen werden.

Diese robusten Assays sind quantitativ, sensitiv, titraierbar und eignen sich für ein Hochdurchsatz-Screening-Format. Diese Eigenschaften bieten breite Anwendungen in der DNA-Reparaturforschung und Wirkstoffforschung und ergänzen das derzeit verfügbare Toolkit an zellulären DSBR-Assays.

Einleitung

DNA-Doppelstrangbrüche (DSBs) stellen eine besonders toxische Klasse von DNA-Schäden¹ dar, aufgrund derer Zellen mehrere DSB-Reparaturwege (DSBR) entwickelt haben, um diese Läsionen zu reparieren. Die vier wichtigsten DSBR-Mechanismen sind die homologe Rekombination (HR), die nicht-homologe Endverknüpfung (NHEJ), die mikrohomologievermittelte Endverknüpfung (MMEJ) und das Einzelstrangglühen (SSA)^2,3. DSBR-Signalwege tragen zur Aufrechterhaltung einer gesunden Gewebeentwicklung und -physiologie bei und schützen vor Krankheiten wie Krebs. Darüber hinaus bergen diese Reparaturmechanismen therapeutisches Potenzial für die Entwicklung von niedermolekularen Modulatoren in der Präzisionsonkologie. Zum Beispiel hat die Ausrichtung auf die DNA-Polymerase θ (Polθ), ein zentrales Enzym im MMEJ-Reparaturweg, aufgrund seiner synthetischen Letalität bei HR-Mangel bei Krebs Interesse geweckt⁴.

Das Verständnis von DSBR hat daher weitreichende klinische Implikationen, und es werden funktionelle zelluläre Assays benötigt, die in der Lage sind, die Aktivität aller wichtigen DSBR-Signalwege zu messen⁵. Die Assays müssen sowohl für genetische als auch für pharmakologische Untersuchungen geeignet sein und in allen interessierenden Zellmodellen eingesetzt werden können. Um die Entwicklung niedermolekularer Wirkstoffe zu unterstützen, müssen die Assays hochempfindlich und titraierbar sein, eine schnelle Durchlaufzeit aufweisen und auf Hochdurchsatzformate skalierbar sein, die für das Wirkstoffscreening geeignet sind.

Im Allgemeinen wurde DSBR bisher mit fluoreszenzbasierten Reporter-Assay-Systemen gemessen, die stabil in das Zellgenom integriert waren⁶. Obwohl die physiologische Rekapitulation des chromosomalen DSBR ein deutlicher Vorteil ist, sind solche Assays auf ein Wirtsmodell beschränkt, in das der Reporter integriert ist, nutzen eine arbeitsintensive Probenvorbereitung und -analyse mittels Durchflusszytometrie und weisen einen begrenzten Durchsatz, eine begrenzte Durchlaufzeit, Robustheit und Empfindlichkeit auf, alles wesentliche Merkmale, die für die Wirkstoffforschung erforderlich sind.

Im Folgenden beschreiben wir eine Reihe von DSBR-Reporter-Assays, die eine Bewertung der vier wichtigsten DSBR-Signalwege ermöglichen. Die Suite der Reporter-Assay-Substrate ist in Abbildung 1 skizziert und in einer kürzlich erschienenen Veröffentlichung^{näher beschrieben 7}. Sie sind extrachromosomal und ermöglichen ihre Einführung in Zellen durch einfache vorübergehende Transfektion, und der Einbau eines Nanoluziferase-Reportergens⁸, das durch die Interaktion mit spezifischen DSBR-Mechanismen rekonstituiert werden muss, erzeugt Sensitivität, Robustheit und Skalierbarkeit. Die folgenden DSBR-Reportersubstratvarianten sind im Protokoll enthalten (Abbildung 1):

Resektionsunabhängiges MMEJ: Dieses lineare Substrat besteht aus einer Kernregion doppelsträngiger DNA (dsDNA) mit einzelsträngigen DNA-Überhängen (ssDNA), die resezierte DNA-Enden^{nachahmen 9}. Vier Nukleotid-Mikrohomologien an den Enden der ssDNA-Regionen kodieren für das Startcodon für das Reportergen. Die Reparatur dieses Substrats durch MMEJ stellt den offenen Leserahmen (ORF) des Reportergens wieder her.

Resektionsabhängige MMEJ: Das Exon des N-terminalen Reportergens wird durch ein Segment unterbrochen, das ein Stoppcodon enthält, das von 8 Basenpaaren (bp) Mikrohomologien flankiert wird. Vor der MMEJ-vermittelten Reparatur ist eine nukleolytische Endresektion erforderlich, um das intakte Reportergen wiederherzustellen.

Stumpfer NHEJ: Das Reportergen wird in N- und C-terminale Abschnitte aufgeteilt, wobei letzterer dem Promotor vorgeschaltet ist. Das DSB wird unter Verwendung von EcoRV hergestellt und erfordert eine direkte Ligation (ohne Endverarbeitung) durch NHEJ, damit beide Reportergenteile wieder verbunden und der Reporter-ORF wiederhergestellt werden kann.

Nicht stumpfes NHEJ: Das DSB befindet sich in einem Intron und hat je nach Wahl des Restriktionsenzyms kohäsive oder nicht-kohäsive Enden. Die Reparatur dieses Substrats durch NHEJ erfordert eine Ligation, der eine Endverarbeitung vorausgeht.

Lange Vorlage HR: Das N-terminale Exon des Reportergens wird durch ein DNA-Segment unterbrochen, das Restriktionsstellen enthält, die 22 bp der ursprünglichen Reportergensequenz ersetzen. Um diese Sequenz wiederherzustellen, wird bei der Reparatur durch HR die Homologievorlage mit 2,5 Kilobasen (kb) verwendet, die stromabwärts des C-terminalen Exons platziert sind.

Kurzvorlage HR: Die Restriktionsstelle, die zur Erzeugung des DSB benötigt wird, ersetzt einen Teil der nativen Reportergensequenz und führt ein In-Frame-Stoppcodon ein. Wie die lange Template-Version benötigt auch dieses HR-Substrat das Downstream-Homologie-Template (360 bp) für eine genaue Reparatur und Wiederherstellung des Reporter-ORF.

SSA: Dieses Substrat enthält ein vorzeitiges Stoppcodon, das sich im N-terminalen Exon des Reportergens befindet. Die Entfernung dieses Stoppcodons und die Wiederherstellung der intakten Reportergensequenz erfordert eine Reparatur durch SSA, die eine bidirektionale Langstreckenresektion vor dem Alignment der Homologien beinhaltet.

Zur Erzeugung des DSB können einige der Reportersubstrate mit I-SceI verdaut werden (Abbildung 1). Dadurch wird ein lineares Substrat mit nicht-kohäsiven Enden in den resektionsabhängigen MMEJ-, nicht-stumpfen NHEJ-, Long-Template-HR- und SSA-Reportern erzeugt, die Tandem-I-Sce I-Stellenin invertierten Orientierungen aufweisen. Im kurzen Template-HR-Reportersubstrat erzeugt der Aufschluss der einzelnen I-Sce I-Stellekohäsive Enden. Die nicht-stumpfen NHEJ-, resektionsabhängigen MMEJ-, Long-Template-HR- und SSA-Plasmide können auch mit HindIII verdaut werden, wodurch komplementäre kohäsive Enden erzeugt werden.

Wir stellen Protokolle für die Generierung der Reporter-Assay-Substrate zur Verfügung und beschreiben, wie die Assays durchgeführt werden können, und liefern Details darüber, wie sie zur Quantifizierung von DSBR verwendet werden können, einschließlich titrierbarer Reaktionen auf kleine Moleküle, der Bewertung der zellulären Potenz, der On-Target-Aktivität und der Selektivität des Signalwegs.

Protokoll

1. Vorbereitung und Qualitätskontrolle (QC) von Reportersubstraten

HINWEIS: Die Plasmide, die für die Reportersubstrate kodieren, können in Standardstämmen von Escherichia coli (z. B. DH5α und Derivate) vermehrt und durch Plasmidisolierung zurückgewonnen werden. Details zu den Plasmiden (Größe und Antibiotikaresistenz) sind in Tabelle 1 und Abbildung 1 beschrieben.

Abbildung 1: Schematische Darstellung von extrachromosomalen NanoLuc-basierten DSBR-Reporter-Assays. Schematische Darstellung von DSBR-Reportersubstraten, einschließlich ihrer Position innerhalb jedes Quellplasmids, der Hauptsequenzmerkmale und des endgültigen Layouts nach der pfadspezifischen Reparatur. Der resektionsunabhängige MMEJ-Substratkern wird durch Aufschluss mit XhoI/HindIII aus dem Ausgangsplasmid herausgeschnitten, wonach die Kappen an beide Enden ligiert werden müssen, um das Substrat für MMEJ herzustellen. Das stumpfe NHEJ-Reportersubstrat wird durch Exzision aus dem Quellplasmid mit EcoRV erzeugt. Die resektionsabhängigen MMEJ-, nicht-stumpfen NHEJ-, Long-Template-HR- und SSA-Reportersubstrate werden durch Linearisierung der Quellplasmide entweder mit I-SceI (das nicht-kohäsive Enden erzeugt) oder HindIII (das kohäsive Enden erzeugt) erzeugt. Das kurze Template-HR-Reportersubstrat wird durch Linearisierung des Quellplasmids mit I-SceI erzeugt (wodurch kohäsive Enden erzeugt werden). Die Reparatur jedes Reportersubstrats durch den Ziel-DSBR-Signalweg rekonstituiert eine intakte Nanoluziferase ORF, die für funktionelles NanoLuc kodiert. Diese Abbildung wurde von Rajendra et ^al.7 übernommen. Abkürzungen: DSBR = Double Strang Break Repair; NanoLuc = Nanoluziferase; MMEJ = Mikrohomologie-vermittelte Endverbindung; NHEJ = nicht-homologe Endverbindung; HR = homologe Rekombination; SSA = Einzelstrangglühen; ORF = offener Leserahmen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

1. Aufbereitung des resektionsunabhängigen MMEJ-Reportersubstrats (Abbildung 1 und Abbildung 2A-C)
   1. Vorbereitung von ssDNA/dsDNA-Kappen (Abbildung 2A)
      1. Die vier in Tabelle 2 aufgeführten Oligonukleotide werden einzeln in Annealing-Puffer (20 mM Tris pH 7,5, 50 mM NaCl in molekularbiologischem Wasser) resuspendiert, um eine Stammlösung bei 100 μM zu erzeugen.
      2. Annealing von ss/dsDNA-Kappen
         1. Mischen Sie je 50 μl der langen und kurzen Oligonukleotide (100 μM Stammlösung) für die linke Kappe aus Schritt 1.1.1.1 in einem 0,2 mL Röhrchen.
         2. Wiederholen Sie den Vorgang für Oligonukleotide mit rechter Kappe.
         3. Mit einem Thermocycler wird jede Oligonukleotidmischung 5 Minuten lang bei 99 °C inkubiert und dann auf 10 °C bei 1 °C/min heruntergefahren.
            HINWEIS: Dadurch werden die geglühten linken und rechten Kappen hergestellt.
      3. (QC, fakultativ) Nachweis des Oligonukleotid-Annealings durch Elektrophorese
         1. Elektrophorese von 100 ng jedes Produkts aus Schritt 1.1.1.2 zusammen mit einzelnen Oligonukleotiden aus Schritt 1.1.1.1 und einer DNA-Leiter mit niedrigem Molekulargewicht in einem 20%igen Acrylamid-Tris-Borat-EDTA (FSME)-Gel bei 200 V für 80 min.
         2. Färben Sie das Gel mindestens 10-15 Minuten lang mit einem FSME-Laufpuffer, der einen geeigneten fluoreszierenden DNA-Farbstoff zur Visualisierung von ssDNA und dsDNA enthält.
         3. Visualisieren Sie die Fluoreszenz auf einem Geldokumentationssystem (Abbildung 2A).
            HINWEIS: Die Schritte 1.1.1.3.1 bis 1.1.1.3.3 werden verwendet, um zu überprüfen, ob die Kappen korrekt geglüht haben. Die scheinbaren Größen für die linke und rechte Kappe sollten ~120 bp bzw. ~175 bp betragen.
   2. Reinigung des Reportersubstratkerns (Abbildung 2B)
      1. Mischen Sie 100 μg des Reporterkernplasmids mit 4 μl HindIII und 4 μl XhoI (4 μg/μg Plasmid für jedes Enzym) und 20 μl 10x Puffer. Das Gesamtvolumen wird mit doppelt destilliertem Wasser (ddH₂O) auf 200 μl gebracht und bei 37 μC für 2 h bis über Nacht inkubiert, um das Plasmid zu verdauen.
         HINWEIS: Für den Aufschluss größerer oder kleinerer Mengen ist die Reaktion proportional zu skalieren.
      2. Die Verdauungsreaktion wird 20 Minuten lang bei 80 °C inkubiert, um die Restriktionsenzyme zu erhitzen und zu inaktivieren.
      3. 40 μl alkalische Phosphatase (2 U/μg Plasmid) und 27 μl 10x Puffer werden dem Reaktionsgemisch aus Schritt 1.1.2.2 zugegeben. Bei 37 °C für 2 h inkubieren, um das Plasmid zu dephosphorylieren.
         HINWEIS: Skalieren Sie die Reaktion nach Bedarf nach oben oder unten.
      4. Geben Sie 60 μl 6x Ladefarbstoff in die Reaktion aus Schritt 1.1.2.3. Elektrophorese zusammen mit einer DNA-Leiter mit hohem Molekulargewicht in einem 1,5 % (w/v) Agarose-Tris-Acetat-EDTA (TAE)-Gel, das eine fluoreszierende dsDNA-Färbung enthält, bei 120 V für 2,5 h oder bis die Banden ausreichend aufgelöst sind.
      5. Visualisieren Sie die Fluoreszenz auf einem Geldokumentationssystem (Abbildung 2B).
      6. Entfernen Sie das Reporterkernfragment (~1,5 kb) mit einem sauberen Skalpell aus dem Gel und achten Sie darauf, dass es nicht mit dem Vektorrückgrat (~2,5 kb) kontaminiert wird.
      7. Extrahieren Sie das Reporterkernfragment mit einem Gelextraktionskit gemäß den Anweisungen des Herstellers.
      8. Messung der DNA-Konzentration und -Qualität (A_260/280) mittels Spektrophotometrie.
   3. Ligation des Reportersubstratkerns mit ssDNA/dsDNA-Kappen und Aufreinigung des endgültigen Reportersubstrats (Abbildung 2C)
      1. Mischen Sie 30 μg des Reporterkernfragments aus Schritt 1.1.2.7 mit 3,85 μl jeder geglühten linken und rechten Kappe aus Schritt 1.1.2 (ca. 6:1 molares Verhältnis der cap:core-DNA), 30 μl 10x Ligase-Puffer und 1,5 μl T4-DNA-Ligase (20 U/μg DNA). Das Gesamtvolumen der Reaktion wird mit ddH₂O auf 300 μl gebracht und über Nacht bei 16 °C inkubiert, um die Kappen zum Reporterkernfragment zu ligieren.
         HINWEIS: Skalieren Sie die Reaktion nach Bedarf nach oben oder unten.
      2. (QC, fakultativ) Elektrophorese 200 ng des resultierenden Produkts aus Schritt 1.1.3.1 zusammen mit dem Reportersubstratkern und einer DNA-Leiter mit hohem Molekulargewicht in einem 0,7 % (w/v) Agarose-TAE-Gel, das einen fluoreszierenden dsDNA-Farbstoff enthält, bei 120 V für mindestens 1,5 h. Stellen Sie sicher, dass die Bande, die dem ligierten Produkt entspricht, etwas langsamer migriert als der nicht ligierte Reportersubstratkern (Abbildung 2C).
         HINWEIS: In diesem QC-Schritt wird überprüft, ob die Ligation der Kappen an das Reporterkernfragment korrekt erfolgt ist.
      3. Reinigen Sie die DNA aus der Verdauungsreaktion in Schritt 1.3.1. unter Verwendung der bevorzugten Methode (z. B. einer bead-basierten oder säulenbasierten Methode) gemäß den Anweisungen des Herstellers.
         HINWEIS: Der Reinigungsschritt 1.1.3.3 reduziert das Vorhandensein von unligierten Kappen erheblich.
   4. Messung der DNA-Konzentration und -Qualität (A_260/280) durch Spektrophotometrie.
2. Präparation von stumpfem NHEJ-Reportersubstrat (Abbildung 1 und Abbildung 2D,E)
   1. Mischen Sie 100 μg des Reporterkernplasmids mit 5 μl EcoR V(5 U/μg Plasmid) und 20 μl 10x Puffer. Das Gesamtvolumen wird mit ddH₂O auf 200 μl gebracht und 2 Stunden bis über Nacht bei 37 μC inkubiert, um das Plasmid zu verdauen.
      HINWEIS: Für den Aufschluss größerer oder kleinerer Mengen ist die Reaktion proportional zu skalieren.
   2. Die Verdauungsreaktion wird 20 Minuten lang bei 65 °C inkubiert, um das Restriktionsenzym zu erhitzen und zu inaktivieren.
   3. Geben Sie 50 μl 6x Ladefarbstoff in die Reaktion aus Schritt 1.2.2. Elektrophorese zusammen mit einer DNA-Leiter mit hohem Molekulargewicht in einem 1,5 % (w/v) Agarose-TAE-Gel, das einen fluoreszierenden dsDNA-Farbstoff enthält, bei 120 V für 2 h oder bis die Banden ausreichend aufgelöst sind.
   4. Visualisierung der Fluoreszenz auf einem Gel-Dokumentationssystem (Abbildung 2D).
   5. Entfernen Sie das Reportersubstrat (~1,7 kb) mit einem sauberen Skalpell aus dem Gel und achten Sie darauf, dass es nicht mit dem Vektorrückgrat (~2,6 kb) kontaminiert wird.
   6. Extrahieren Sie das Reporterkernfragment mit einem Gelextraktionskit gemäß den Anweisungen des Herstellers (Abbildung 2E).
   7. Messung der DNA-Konzentration und -Qualität (A_260/280) mittels Spektrophotometrie.
3. Präparation von I-SceI-basierten Reportersubstraten (Abbildung 1)
   HINWEIS: Zu diesen Substraten gehören resektionsabhängiges MMEJ (Abbildung 2F), nicht-stumpfes NHEJ (Abbildung 2G), langes Template HR (Abbildung 2H), kurzes Template HR (Abbildung 2I) und SSA (Abbildung 2J).
   1. Mischen Sie 100 μg des Reporterkernplasmids mit 50 μl I-SceI (5 U/μg Plasmid) und 60 μl 10x Puffer. Das Gesamtvolumen mit ddH₂O auf 600 μl bringen und 2 h bis über Nacht bei 37 ΰC inkubieren, um das Plasmid zu verdauen.
      HINWEIS: Für den Aufschluss größerer oder kleinerer Mengen ist die Reaktion proportional zu skalieren. Nicht-stumpfe NHEJ-, resektionsabhängige MMEJ-, Long-Template-HR- und SSA-Plasmide können ebenfalls mit HindIII verdaut werden, wodurch komplementäre kohäsive Enden erzeugt werden.
   2. Die Aufschlussreaktion wird 20 Minuten lang bei 65 °C inkubiert, um I-SceI durch Hitze zu inaktivieren. Während dieses Schritts ist die Temperatur auf 80 °C zu stellen, wenn stattdessen HindIII für den Aufschluss verwendet wurde.
   3. Die DNA aus der inaktivierten Verdauungsreaktion in Schritt 1.3.2 wird mit der bevorzugten Methode (z. B. einer kügelchenbasierten oder säulenbasierten Methode) gemäß den Anweisungen des Herstellers aufgereinigt.
   4. Messung der DNA-Konzentration und -Reinheit (A._260/280) mittels Spektrophotometrie.
4. Qualitätskontrolle von Reportersubstraten
   1. Elektrophorese 200 ng des Reportersubstrats zusammen mit einer DNA-Leiter mit hohem Molekulargewicht in einem 0,7 % (w/v) Agarose-TAE-Gel, das eine fluoreszierende dsDNA-Färbung enthält, bei 120 V für 2 h oder bis die Banden ausreichend aufgelöst sind. Laden Sie das ursprüngliche ungeschnittene Reporterplasmid als Kontrolle daneben.
   2. Stellen Sie sicher, dass die definierten Banden der richtigen Größe für jedes Reportersubstrat eingehalten werden (siehe Tabelle 1 und Abbildung 2F-J).

Abbildung 2: Gelelektrophoretische Analysen der Erzeugung von DSBR-Reportersubstraten. (A-C) Repräsentative Bilder aus der gelelektrophoretischen Analyse von Zwischenprodukten und dem endgültigen Konstrukt, die für die Erzeugung des resektionsunabhängigen MMEJ-Reportersubstrats erforderlich sind. Die benachbarten Bilder in den Feldern (A) und (C) stammen aus denselben Gelen; irrelevante Fahrspuren wurden weggelassen. (D,E) Repräsentative Bilder aus der gelelektrophoretischen Analyse auf Quellplasmid, EcoRV-verdaute Produkte und gelextrahiertes Endkonstrukt, die für die Erzeugung des stumpfen NHEJ-Reportersubstrats erforderlich sind. (F-J) Repräsentative Bilder aus der gelelektrophoretischen Analyse von Quellplasmiden und linearisierten DSBR-Konstrukten für die I-SceI-verdauten Reportersubstrate: resektionsabhängiges MMEJ, nicht-stumpfes NHEJ, langes Template HR, kurzes Template HR, SSA. Abkürzungen: DSBR = Double Strang Break Repair; MMEJ = Mikrohomologie-vermittelte Endverbindung; NHEJ = nicht-homologe Endverbindung; HR = homologe Rekombination; SSA = Einzelstrangglühen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

2. Transiente Transfektion von DSBR-Reportersubstraten

HINWEIS: Ein Überblick über den experimentellen Arbeitsablauf von Assays und einige mögliche Permutationen sind in Abbildung 3 dargestellt. Das folgende Protokoll beschreibt ein Experiment mit HEK-293-Zellen, bei dem diese mit dem Reportersubstrat rückwärts transfiziert werden. Die folgenden Zahlen können entsprechend der Anzahl der pro Platte zu verwendenden Wells nach oben oder unten skaliert werden. Die folgenden Schritte wurden für einen Assay berechnet, der in einer 96-Well-Platte durchgeführt wurde; Siehe Diskussion für weitere Überlegungen.

Abbildung 3: Experimenteller Arbeitsablauf für DSBR-Reporter-Assays. Die interessierenden Zellen werden mit dem linearisierten DSBR-Substrat (kodiert für ein NanoLuc-ORF, das durch ein spezifisches DNA-Reparaturereignis repariert werden muss) und einem Firefly-Plasmid (Transfektionskontrolle) transfiziert. Dann, 6-24 Stunden nach der Transfektion, können die Firefly-Lumineszenz und die NanoLuc-Lumineszenz nacheinander nach Zugabe von Nano-Glo Dual-Luciferase-Reagenzien abgelesen werden. Beispielpermutationen zu den Kernschritten (in hellblauen Kästchen dargestellt) können verwendet werden, um zu testen, wie sich genetische Modulation (Knockout, Knockdown oder Überexpression) oder pharmakologische Behandlung auf die Kompetenz des DSBR-Signalwegs in Zellen auswirkt. Abkürzungen: DSBR = Double Strang Break Repair; NanoLuc = Nanoluziferase; WT = Wildtyp; KO = K.O. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

1. (Fakultativ) Bei der Beurteilung des Einflusses von Verbindungen auf den Reporterassay dispensieren Sie im Vehikel gelöste Verbindungen (z. B. Dimethylsulfoxid [DMSO]) in Vertiefungen einer 96-Well-Platte gemäß einem vordefinierten experimentellen Layout. Normalisieren Sie die Fahrzeugkonzentration in allen Wells.
   HINWEIS: Technische Replikate werden empfohlen. Einbeziehen von Kontrollwells (z. B. nur Fahrzeuge).
2. In einem 1,5-ml-Röhrchen werden das in den Schritten 1.1, 1.2 oder 1.3 erzeugte verdünnte Firefly-Kontrollplasmid (Kontroll-Luciferase) und das NanoLuc DSBR-Reportersubstrat (Reporter-Luciferase) in 500 μl Transfektionspuffer verabreicht. Verwenden Sie 0,66 μg Kontroll-Luciferase-Plasmid pro 1 × 10⁶ Zellen. In Tabelle 3 sind die zu verwendenden Mengen des NanoLuc DSBR-Reportersubstrats aufgeführt.
   HINWEIS: Ein Positivkontrollplasmid, das die Reporter-Luziferase konstitutiv exprimiert, kann zur Validierung des Geräteaufbaus und der Transfektionsbedingungen oder zur Überprüfung auf unspezifische Auswirkungen auf die Reporter-Luziferase selbst verwendet werden. Als Ausgangspunkt empfehlen wir 0,1 μg Reporter-Luciferase-Plasmid und 0,66 μg Kontroll-Luciferase-Plasmid pro 1 × 10⁶ Zellen.
3. Geben Sie ein lipidbasiertes Transfektionsreagenz zu der verdünnten DNA aus Schritt 2.2 in einem vom Hersteller empfohlenen Verhältnis (z. B. 1:2, μg DNA:μL-Reagenz für das in der Materialtabelle beschriebene Reagenz), mischen Sie es gut, indem Sie es kurz vortexen, und inkubieren Sie es 10 Minuten lang bei Raumtemperatur.
4. Ernten Sie Zellen durch Trypsinisierung, resuspendieren Sie sie in frischem Medium, das 10 % fötales Rinderserum (FBS) enthält, und zählen Sie sie.
5. 3 × 10⁶ Zellen in ein 15-ml-Röhrchen überführen und in 8,5 ml Medium resuspendieren.
6. Den DNA-Transfektionsmix aus Schritt 2.3 in die Zellsuspension geben und mehrmals durch Inversion mischen.
7. Platte: 80 μl Zellsuspension (ca. 2,7 × 10,⁴ Zellen) pro Well.
   HINWEIS: Die Suspension, die Zellen und DNA-Transfektionsmischung enthält, kann entweder durch manuelles Pipettieren oder unter Verwendung eines automatisierten Liquid Handlers für Experimente mit höherem Durchsatz auf die Platte abgegeben werden.
8. Bei 37 °C/5 % CO₂ 24 h inkubieren.

3. Nachweis von Lumineszenz

1. Vorbereitung der Reagenzien
   1. Befolgen Sie die Anweisungen des Herstellers für die Herstellung und Zugabe von Reporter- (NanoLuc) und Kontroll-(Firefly) Luziferase-Reagenzien, die die Substrate für beide Luziferasen (Furimazin bzw. 5'-Fluoroluciferin) liefern:
   2. Bereiten Sie das Kontroll-Luziferase-Reagenz vor. Nach Herstellerangaben rekonstituieren und durch Inversion mischen, bis sich das Luciferase-Substrat gründlich aufgelöst hat.
   3. Bereiten Sie das frische Reporter-Luciferase-Reagenz gemäß den Anweisungen des Herstellers vor. Berechnen Sie die Reagenzmenge, die für die Zugabe von 80 μl/Vertiefung erforderlich ist, und fügen Sie Substrat in ein geeignetes Volumen des Assay-Puffers im Verhältnis 1:100 hinzu (Luciferase-Substrat:Puffer). Für eine 96-Well-Platte 88 μl Luciferase-Substrat in 8.800 μl Puffer verdünnen und durch Inversion mischen.
      HINWEIS: Diese Mengen beinhalten eine Selbstbeteiligung von ca. 10 %. Nach der Rekonstitution kann das Kontroll-Luciferase-Reagenz gemäß den Anweisungen des Herstellers für die zukünftige Verwendung gelagert werden. Das Reporter-Luciferase-Reagenz muss für jede Verwendung frisch zubereitet werden.
2. Serielle Detektion der Lumineszenz von Kontroll- und Reporter-Luziferasen (96-Well-Platte)
   1. Lassen Sie die Platte und die Luziferase-Reagenzien Raumtemperatur erreichen.
   2. Geben Sie 80 μl Kontroll-Luciferase-Reagenz pro Vertiefung hinzu.
   3. Schütteln Sie die Platte 3 Minuten lang auf einem Schwinger bei 450 U/min.
   4. Messen Sie das Luziferase-Lumineszenzsignal mit einem Lumineszenzplatten-Reader.
      HINWEIS: Leseemission bei 580 nm (80 nm Bandpassfilter) oder die gesamte Lumineszenz pro Well. Diese Lumineszenz wird als Maß für die Transfektionseffizienz und die Zelldichte verwendet und kann auch Aufschluss über die zelluläre Toxizität geben, die durch die Testbehandlungen verursacht wird.
   5. Geben Sie 80 μl Reporter-Luciferase-Reagenz pro Vertiefung hinzu.
      HINWEIS: Dieses Reagenz hemmt die Kontroll-Luziferase; Es enthält auch das Substrat für den Reporter Luciferase.
   6. Schütteln Sie die Platte 3 Minuten lang auf einem Schwinger bei 450 U/min.
   7. Lassen Sie den Teller 7 Minuten bei Raumtemperatur ruhen.
   8. Messen Sie das Reporter-Luziferase-Lumineszenzsignal mit einem Lumineszenzplatten-Reader.
      HINWEIS: Leseemission bei 470 nm (80 nm Bandpassfilter) oder alternativ Gesamtlumineszenz pro Well. Diese Lumineszenz gibt Aufschluss über die Menge an Reportersubstrat, die durch den interessierenden DSBR-Signalweg repariert wurde.
   9. Exportieren Sie Lumineszenzmesswerte für die nachgelagerte Analyse.

4. Datenanalyse

1. Teilen Sie das Lumineszenzsignal der Reporter-Luziferase (NanoLuc) durch das Kontroll-Luziferase (Firefly)-Lumineszenzsignal, das aus derselben Vertiefung stammt, um das Assay-Signal zu berechnen. Wenden Sie diese Berechnung auf alle Bohrlöcher an, wie in Gleichung (1) gezeigt.
   (1)
2. Berechnen Sie den Durchschnitt der Assay-Signale für die Kontroll-Wells (z. B. nur Fahrzeug).
3. Normalisieren Sie die Assay-Signale für Test-Wells auf den Durchschnitt der Kontroll-Wells unter Verwendung von Gleichung (2), um die Reparatur (%) pro Well zu berechnen.
   (2)
4. (Optional, Kurvenanpassung) Wenn Sie mehrere Verbindungsdosen testen, stellen Sie die berechnete Reparatur (%) gegen die Verbindungskonzentration dar und passen Sie eine Dosis-Wirkungs-Kurve unter Verwendung eines nichtlinearen Regressionsmodells an. Verwenden Sie diese Kurve für die anschließende EC_{50-Interpolation} .

Ergebnisse

Die Reparatur jedes Reporter-Assays kann mit dem gleichen Verfahren nachgewiesen und quantifiziert werden. Die korrekte Reparatur eines Substrats durch seinen verwandten Reparaturweg in Zellen rekonstituiert ein intaktes, funktionsfähiges ORF-kodierendes NanoLuc. Dieses Lumineszenzsignal kann mit einem Plattenlesegerät detektiert werden.

Die Co-Transfektion mit einem intakten Plasmid, das für die Firefly-Luziferase kodiert, dient als Transfektionskontrolle. Dieses Steuerelement dient zwei Zwecken. Erstens bietet es einen Standard, auf den das NanoLuc-Signal normalisiert werden kann, da es durch die Modulation von DSBR entweder mit genetischen oder pharmakologischen Mitteln nicht gestört werden sollte. Zweitens kann es einen Hinweis auf zelluläre Störungen außerhalb des Ziels geben, die das Luciferase-Signal beeinflussen, wie z. B. Zellzyklusmodulation, Auswirkungen auf die Transkription/Translation oder allgemeine Toxizität.

Das Verhältnis von NanoLuc zu Firefly dient als Surrogatanzeige der Reparatur. Lumineszenzwerte können exportiert und analysiert werden, indem die beiden Luciferase-Signale aus demselben Well normalisiert werden. Im Falle von Studien zur genetischen Störung (z. B. Vergleich von Wildtyp- und KO- oder Non-Targeting- und Ziel-siRNA) wird die Reparatur in der Regel auf die Elternprobe (Wildtyp-Zellen oder Zellen, die mit Non-Targeting-Kontroll-siRNA behandelt wurden) normalisiert. Im Falle der pharmakologischen Modulation werden die Werte einer mit Verbindungen behandelten Probe auf den Wert normiert, der durch die Vehikelbehandlung erzeugt wird.

Die vollständige Validierung der beschriebenen Reporter-Suite wurde kürzlich veröffentlicht⁷. Daten, die die Charakterisierung der genetischen und pharmakologischen Modulation von DSBR veranschaulichen, sind in Abbildung 4 dargestellt (adaptiert von ⁷). Polθ ist der Schlüsselmediator von MMEJ und es wird vorhergesagt, dass der Verlust oder die Hemmung dieses Enzyms spezifisch zelluläres MMEJ abträgt ^3,10. Anhand einer Zelllinie, in der POLQ, das für Polθ kodierende Gen, ausgeschaltet wurde¹¹, zeigt der resektionsunabhängige MMEJ-Reporter-Assay, dass MMEJ tatsächlich fast vollständig unterdrückt ist. Die Auswertung der NanoLuc- und Firefly-Lumineszenzsignale zeigt, dass der beobachtete Reparaturdefekt durch eine Verringerung des NanoLuc-Signals (kodiert durch das Reportersubstrat) angetrieben wird, während das Firefly-Signal (Kontrolle) ungestört bleibt (Abbildung 4A-C). Im Gegensatz dazu zeigt die Beurteilung der NHEJ-Kompetenz mit dem NHEJ-Reporter mit stumpfem Ende, dass der POLQ-Knockout die Reparatur des Reportersubstrats nicht hemmt (Abbildung 4D-F). Zusammengenommen unterstützen diese genetischen Daten die spezifische Rolle von Polθ bei der MMEJ-vermittelten Reparatur. Diese Beobachtungen werden pharmakologisch vollständig mit ART558 rekapituliert^12,13, einem kürzlich berichteten hochwirksamen und spezifischen Inhibitor der Polymerasedomäne von Polθ (Abbildung 4G), bei dem eine titrierbare Hemmung von MMEJ beobachtet wird, die auf eine spezifische Abnahme des NanoLuc- und nicht des Firefly-Signals zurückzuführen ist (Abbildung 4H). Darüber hinaus gibt es in Übereinstimmung mit genetischen Daten keinen Einfluss auf NHEJ (Abbildung 4I,J). Zusammengenommen zeigen diese Daten, wie diese Reporter verwendet werden können, um die genetische Modulation von DSBR-Signalwegen zu charakterisieren und die zelluläre Potenz und Ziel-/Signalwegspezifität kleiner Moleküle zu zeigen.

Abbildung 4: Auswirkungen des genetischen Knockouts und der pharmakologischen Hemmung von Polθ auf MMEJ- und NHEJ-Reportersignale. eHAP1 WT- und POLQ^(-)- Zellen wurden mit einem Firefly-Kontrollplasmid und mit (A-C) dem resektionsunabhängigen MMEJ-Reporter oder (D-F) NHEJ-Reporter mit stumpfem Ende transfiziert. Der Prozentsatz der MMEJ- oder NHEJ-Reparatur ist das Verhältnis der NanoLuc-Lumineszenz zur Firefly-Lumineszenz, normiert auf die DMSO-behandelte Kontrolle, 24 Stunden nach der Transfektion. Die Daten stellen den Mittelwert ± SEM von drei biologischen Replikaten dar, die jeweils durchschnittlich 8 technische Replikate enthalten. HEK-293-Zellen wurden mit einem Firefly-Kontrollplasmid und (G,H) dem resektionsunabhängigen MMEJ-Reporter oder dem (I,J) stumpfen NHEJ-Reporter transfiziert und mit dem Polθ-Polymerase-Inhibitor ART558 behandelt. Der Prozentsatz der Reparatur ist das Verhältnis der NanoLuc-Lumineszenz zur Firefly-Lumineszenz, normiert auf die DMSO-behandelte Kontrolle, 24 Stunden nach der Transfektion. Die prozentuale Hemmung der einzelnen Lumineszenzsignale in (G) und (I) wurde relativ zur DMSO-behandelten Kontrolle berechnet und in (H) bzw. (J) gezeigt. Die Daten stellen den Mittelwert ± SEM von 2 biologischen Replikaten dar, die jeweils durchschnittlich 4 technische Replikate enthalten. Diese Abbildung wurde von Rajendra et ^al.7 übernommen. Abkürzungen: NanoLuc = Nanoluciferase; MMEJ = Mikrohomologie-vermittelte Endverbindung; NHEJ = nicht-homologe Endverbindung; WT = Wildtyp. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 5: Hemmung des HR-Reportersignals durch den RAD51-Inhibitor CAM833. (A) HEK-293-Zellen wurden mit dem Long-Template-HR-Reportersubstrat, einem Firefly-Luciferase-Kontrollplasmid, transfiziert und mit dem RAD51-Inhibitor CAM833^{behandelt 14}. Die Lumineszenz von NanoLuc und Firefly wurde 16 h nach der Transfektion gemessen. Der Prozentsatz der HR-Reparatur ist das Verhältnis der NanoLuc-Lumineszenz zur Firefly-Lumineszenz, normiert auf die DMSO-behandelte Kontrolle. Gestrichelte Linien zeigen die prozentuale HR-Hemmung und die CAM833-Konzentration an der Kurve EC₅₀. Die Daten stellen den Mittelwert ± SEM von 2 biologischen Replikaten dar, die jeweils durchschnittlich 4 technische Replikate enthalten. (B) Die prozentuale Hemmung der einzelnen Lumineszenzsignale in (A) wurde im Vergleich zur DMSO-behandelten Kontrolle berechnet. Gestrichelte Linien zeigen den prozentualen Anteil der NanoLuc- und Firefly-Hemmung bei 3,33 μM CAM833 (EC₅₀). Die Abnahme des Firefly-Signals bei CAM833-Konzentrationen ≥ 10 μM ist ein Hinweis auf die Toxizität der Verbindung bei hohen Dosen; Eine Reduktion des NanoLuc-Signals wird jedoch bei Konzentrationen beobachtet, bei denen das Firefly-Signal nicht beeinflusst wird, was darauf hindeutet, dass CAM833 eine On-Target-HR-Hemmung induziert. Diese Abbildung wurde von Rajendra et ^al.7 übernommen. Abkürzungen: NanoLuc = Nanoluciferase; HR = homologe Rekombination. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Reporter-Substrat		Quell-Plasmid (Größe in KB, Widerstand)	DSB-Generierung			Erwartete Größe des endgültigen Reportersubstrats (kb)
Resektionsunabhängige MMEJ		4.0, Kan	Resektion von 3'-Schwänzen durch Ligatur der Kappen			1.6
Resektionsabhängige MMEJ		6.5, Kan	I-SceI (nicht kohäsiv), HindIII (kohäsiv)			6.5
Stumpfer NHEJ		4.3, Kan	Stumpfe Enden nach Exzision aus dem Plasmid durch EcoRV			1.7
Nicht stumpfer NHEJ		6.7, Kan	I-SceI (nicht kohäsiv), HindIII (kohäsiv)			6.5
Lange Vorlage HR		9.2, Kan	I-SceI (nicht kohäsiv), HindIII (kohäsiv)			9.2
Kurzvorlage HR		9.3, Ampere	I-SceI (zusammenhängend)			9.3
SSA		9.5, Kan	I-SceI (nicht kohäsiv), HindIII (kohäsiv)			9.5

Tabelle 1: Reportersubstrat-Plasmide. Abkürzungen: DSB = Doppelstrangbruch; MMEJ = Mikrohomologie-vermittelte Endverbindung; NHEJ = nicht-homologe Endverbindung; HR = homologe Rekombination; SSA = Einzelstrangglühen; Kan = Kanamycin; Amp = Ampicillin.

Sequenz (5'-3')			Lieferant	Reinigung	Funktion
5'[Phos]TCGAGGACTTGGTCCAGGTT GTAGCCGGCTGTGTGTCGCCAGTCC CCAACGAAATCTTCGAGTGTGAAGACCAT			Sigma	SEITE	Linke Kappe, langes Oligonukleotid
5'[Phos]GCCGGCTACAACCTGGACCAAGTCC			Sigma	SEITE	Linke Kappe, kurzes Oligonukleotid
5'[Phos]AGCTTTATTGCGGTAGTTTATCA CAGTTAAATTGCTAACGCAGTCAGTGG GCCTCGGCGGCCAAGCTAGGCAATCC GGTACTGTTGGTAAAGCCACCATGG			Sigma	SEITE	Rechte Kappe, langes Oligonukleotid
5'[Phos]CGAGGCCCACTGACTGCGTTA GCAATTTAACTGTGATAAACTACCGCAATAA			Sigma	SEITE	Rechte Kappe, kurzes Oligonukleotid

Tabelle 2: Oligonukleotide für Kappen zur Erzeugung von resektionsunabhängigem MMEJ-Reportersubstrat. Abkürzungen: ssDNA = einzelsträngige DNA; dsDNA = doppelsträngige DNA; MMEJ = Mikrohomologie-vermittelte Endverbindung; PAGE = Elektrophorese des Polyacrylamid-Gels. Mikrohomologien sind unterstrichen.

Reporter-Assay	NanoLuc Reportersubstrat DNA (μg DNA/1x106 Zellen)	Glühwürmchenkontrolle: Luciferase-Plasmid (μg DNA/1x10,6 Zellen)
Resektionsunabhängige MMEJ	0.5	0.66
Resektionsabhängige MMEJ	1	0.66
Stumpfer NHEJ	0.5	0.66
Nicht stumpfer NHEJ	0.5	0.66
Lange Vorlage HR	1	0.66
Kurzvorlage HR	2	0.66
SSA	1	0.66

Tabelle 3: DNA-Mengen für die transiente Transfektion von NanoLuc-Reportersubstraten und Firefly-Kontroll-Luciferase-Plasmid (HEK-293, 96-Well-Plattenformat). Abkürzungen: MMEJ = Microhomology-mediated End Joining; NHEJ = nicht-homologe Endverbindung; HR = homologe Rekombination; SSA = Einzelstrangglühen.

Diskussion

Hier haben wir Protokolle für die Generierung und Implementierung einer Reihe von extrachromosomalen Lumineszenz-basierten Reportern zur Messung der zellulären Kompetenz der vier wichtigsten DSBR-Signalwege (HR, NHEJ, MMEJ und SSA) ^beschrieben7. Reportersubstrate können durch transiente Transfektion in Zellen eingeführt und zur Beurteilung der DSBR-Aktivität verwendet werden, indem eine empfindliche und robuste plattenbasierte Auslesung der NanoLuc-Lumineszenz verwendet wird, die bei Interaktion mit verwandten zellulären DSBR-Signalwegen rekonstituiert wird.

Mehrere Stufen der Generierung von Reportersubstraten, der Transfektion der Substrate in Zellen und der Dateninterpretation sind entscheidend für die erfolgreiche Durchführung dieser Assays. Obwohl zur Erzeugung der Reportersubstrate Standardtechniken der Molekularbiologie verwendet werden, gewährleistet die Visualisierung des Prozesses durch Gelelektrophorese die höchste Qualität und Reinheit der Substrate vor der Transfektion. Da diese Assays auf transienter Transfektion beruhen, gelten für diese Methoden gängige Überlegungen. Dazu gehören die Optimierung der Aussaatdichte, der Transfektionsbedingungen (einschließlich Reagenzien und DNA-Mengen) und die Beurteilung der Eignung für Vorwärts- und Rückwärtstransfektionsformate. Diese Reporter-Assays wurden erfolgreich mit einer Reihe von Elektroporations- und Lipofektionsprotokollen durchgeführt, und die Optionen sollten vor der Durchführung dieser Assays vollständig untersucht werden. Es sollte auch darauf geachtet werden, die NanoLuc- und Firefly-Signale der Komponenten zu untersuchen und nicht nur das Komposit-Reparatursignal, das durch Normalisierung des NanoLuc-Signals (Reportersubstrat) auf das Firefly-Signal (Steuerung) abgeleitet wird. Artefakte können dadurch entstehen, dass das Verhältnis durch Änderungen im Firefly-Signal gesteuert wird. Zum Beispiel sollte die Beurteilung der Hemmung im Dosis-Wirkungs-Modus mit einer hochspezifischen Verbindung das NanoLuc-Signal auf titrierbare Weise unterdrücken, ohne das Firefly-Signal zu stören, das stabil bleiben sollte (Abbildung 4G,H). In Fällen, in denen Firefly-Signale gestört sind, können nützliche Auswirkungen auf die Reparatur jedoch immer noch bestimmt werden, indem ein Dosisfenster identifiziert wird, in dem das Firefly-Signal nicht beeinflusst wird (Abbildung 5).

Im Vergleich zu den am häufigsten verwendeten DSBR-Reporter-Assays haben diese extrachromosomalen Lumineszenz-basierten Reporter-Assays einige deutliche Vorteile. Da die DSBR-Signalwege hochgradig konserviert sind, können die Assays auch dann über die DSBR-Kompetenz und die Wahl des Signalwegs berichten, selbst wenn die zelluläre Maschinerie zwischen den Zellmodellen variiert. Dies eröffnet die Bewertung von DSBR für jedes Modell, das für den Benutzer von Interesse ist, solange im Voraus optimale transiente Transfektionsbedingungen festgelegt werden.

Die Verwendung von Nanoluciferase als Reportergen bietet auch Vorteile gegenüber fluoreszierenden Optionen, die traditionell in DSBR-Reporterassays verwendet werden. NanoLuc reift schnell und Lumineszenz wird mit einem Platten-Reader⁸ mit hoher Empfindlichkeit detektiert. In Verbindung mit der Geschwindigkeit der Substratreparatur (da die Reportersubstrate in Zellen mit reparaturbereiten DSB-Enden transfiziert werden) ist dieses Format des DSBR-Reporterassays ideal für die schnelle Abwicklung und quantitative Robustheit, die für das Screening kleiner Moleküle im Rahmen einer industriellen Wirkstoffforschungskaskade erforderlich sind. In der Tat haben wir kürzlich die Implementierung des resektionsunabhängigen MMEJ-Reporterassays in der Entdeckungskaskade beschrieben, die zur Identifizierung von niedermolekularen Inhibitoren der Polθ-Polymerasedomäne¹³ verwendet wird.

Es gibt auch Flexibilität bei der Implementierung der Reporter-Assays, um spezifische Fragen zu genetischen und pharmakologischen Störungen von DSBR zu beantworten (Abbildung 3). Zum Beispiel können Zellen vor der Transfektion der Reportersubstrate 48-72 h lang mit siRNA gegen ein Gen von Interesse transfiziert werden. Alternativ können die Auswirkungen einer Genüberexpression auf DSBR-Signalwege getestet werden, indem eine Plasmidtransfektion 24-48 Stunden vor der Transfektion der Reportersubstrate durchgeführt wird. Für pharmakologische Studien beschreibt das vorliegende Protokoll bereits, wie die Verwendung kleiner Moleküle in den Standard-Arbeitsablauf integriert werden kann, aber alternative Formate können Änderungen in den Behandlungsregimen der Verbindung beinhalten, wie z. B. Vorinkubationen oder Auswaschungen.

Die Skalierbarkeit der transienten Transfektion könnte auch groß angelegte Screening-Ansätze unterstützen, bei denen die Batch-Transfektion von Reportersubstraten vor dem Screening durchgeführt wird. Darüber hinaus kann auch die Dauer des Assays von der Transfektion bis zum Auslesen variiert werden. Obwohl die Standarddauern 16-24 Stunden betragen können, können einige Assays in nur 6 Stunden ausgelesen werden⁷. Bedenken hinsichtlich der Toxizität von kleinen Molekülen oder siRNAs, die die Lebensfähigkeit der Zellen beeinträchtigen können, sollten bei der Bestimmung der Assay-Dauer ebenfalls berücksichtigt werden.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die in dieser Studie skizzierten und in einer kürzlich erschienenen Veröffentlichung⁷ vollständig beschriebenen Assays eine schnelle und robuste Bewertung der zellulären DSBR-Kompetenz ermöglichen. Sie sind hochempfindlich und titraierbar, so dass sie sowohl für genetische als auch für pharmakologische Studien geeignet sind. Entscheidend ist, dass die Reportersubstrate, da sie durch transiente Transfektion in Zellen eingeführt werden können, das Potenzial haben, in jedem transfizierbaren Zellmodell von Interesse verwendet zu werden, anstatt durch stabile Integration auf bestimmte Zelllinien beschränkt zu sein, wie es bei chromosomalen DSBR-Reportern der Fall ist. Eine deutliche Einschränkung dieser extrachromosomalen Reporter-Assays besteht jedoch darin, dass die fehlende Integration in das Genom den physiologischen, chromatinisierten Kontext der DNA-Reparatur und die damit verbundenen regulatorischen Signale und Orchestrierung möglicherweise nicht vollständig rekapituliert¹⁵. Zu diesem Zweck ergänzen extrachromosomale Reporter-Assays die bestehenden Methoden der DSBR-Bewertung und erweitern das Instrumentarium an Ressourcen, die sowohl für die Grundlagenforschung als auch für die Wirkstoffforschung geeignet sind.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
10x FSME-Puffer	Thermo Fisher	AM9863
20% TBE-Acrylamid Gel	Invitrogen	EC6315BOX
50x TAE Puffer	Fisher Scientific	BP13321
6x Gel Loading Dye, Purple	NEB	B7024S
96-well weiße Platte (mit transparentem Boden und Deckel)	Porvair	204012
Agarose	Cleaver Scientific	CSL-AG500
AMPure XP beads	Beckman Coulter	A63881	Für die kügelchenbasierte Aufreinigung von DNA
Antarktische Phosphatase und 10X Puffer	NEB	M0289L
CLARIOstar	BMG Labtech	430-101	Plate
Reader Countess II Automatisierter Zellzähler	Thermo Fisher	AMQAX1000	Zellzähler
Kundenspezifische Oligonukleotide	Sigma-Aldrich	Sonderanfertigung	Für resektionsunabhängiges MMEJ-Substrat. Siehe Tabelle 2.
D300e	Tecan	30100152	DMSO-basierter Compound-Dispenser
D300e D4+ Kassette	Tecan	30097371	Kassette mit hohem Volumen für D300e Compound-Dispenser
D300e T8+ Kassette	Tecan	30097370	Kassette mit geringem Volumen für D300e Compound-Dispenser
Dimethylsulfoxid, Zellkulturqualität	Sigma-Aldrich	D2650-100ML	Vehikel für Compounds, verwendet in Abbildung 4 und Abbildung 5
DSBR-Meldequellen-Plasmide	Artios		Verfügbar für die akademische Gemeinschaft auf Anfrage
EcoRV-HF und 10x CutSmart Puffer	NEB	R3195M
Ethanol absolut	VWR	20821.365
Fötales Rinderserum	PAN-Biotech	P30-3031
GeneRuler Ultra Low Range DNA-Leiter	Thermo Fisher	SM1211	Niedermolekulare DNA-Leiter
HEK-293 Zellen	ATCC	CRL-1573	Beispiel-Zelllinie, die im Protokoll verwendet wird
HindIII-HF und 10x CutSmart Puffer	NEB	R3104M
HyClone Wasser in Molekularbiologiequalität	Fisher Scientific	10275262
I-SceI und 10x Tango Puffer	Invitrogen	ER1771
Isopropanol	VWR	20842.33
JetPRIME Reagenz und Puffer	PolyPlus	114-15	Transfektionsreagenz auf Lipidbasis
MegaStar 1.6	VWR	521-1749	Zentrifuge für 15 oder 50 mL Röhrchen
MEM Eagle	PAN-Biotech	P04-08056	Nährmedium für HEK-293
Zellen Mikrotiterplatte Schüttler	Fisherbrand	15504070	Mikrotiterplatten-Orbitalschüttler
MicroStar 17R	VWR	521-1647	Zentrifuge für 1,5 oder 2 mL Röhrchen
MultiDrop	Thermo Fisher	5840300	Reagenziendispenser auf Zell- oder Wasserbasis
MultiDrop Standard Kassette	Thermo Fisher	24072670	Kassette für MultiDrop Reagenziendispenser
NanoDLR Stop & Glo Puffer und Substrat	Promega	N1630 oder N1650	Reporter Luciferase (NanoLuc) Reagenz zum Löschen der Firefly-Lumineszenz und zum Nachweis von NanoLuc-Lumineszenz. Teil des Nano-Glo Dual-Luciferase Reporter Assay System Kits
ONE-Glo EX Luciferase Assay Puffer und Substrat	Promega	N1630 oder N1650	Control Luciferase (Firefly) Assay Reagenz zum Nachweis von Firefly. Teil des Nano-Glo Dual-Luciferase Reporter Assay System Kits
PBS (ohne Calcium oder Magnesium)	PAN-Biotech	P04-36500
pGL4 Firefly Plasmid (oder ähnlich)	Promega	E1310 (oder gleichwertig)	Firefly Kontrollplasmid
pNL1.1 NanoLuc Plasmid (oder ähnlich)	Promega	N1091 (oder gleichwertig)	NanoLuc Kontrollplasmid, zur Anpassung von Geräteeinstellungen/Optimierungsexperimenten
QIAquick Gel-Extraktionskit	Qiagen	28706
Quick-Load Purple 1 kb DNA-Leiter	NEB	N0552S	DNA-Leiter mit hohem Molekulargewicht
Natriumacetat (3 M), pH 5,5	Thermo Fisher	AM9740	Zur pH-Einstellung während der Gelextraktion mit dem QIAquick Gel-Extraktionskit
SYBR Gold (10.000x)	Invitrogen	S11494	Zur Visualisierung von ssDNA und dsDNA
SYBR Safe (10.000x)	Invitrogen	S33102	Nur zur Visualisierung von dsDNA
T4 DNA-Ligase und 10x Ligase-Puffer	NEB	M0202L
Trypanblau-Färbung 0,4	Invitrogen	T10282	Zur Messung der Viabilität während der Zellzählung
Trypsin-EDTA-Lösung; 0,25 % Trypsin und 0,53 mM EDTA	Sigma-Aldrich	T4049-100ML
XhoI und 10x CutSmart Puffer	NEB	R0146M