Methodenartikel

Poröse substratbasierte Elektroporation mit transepithelialer elektrischer Impedanzüberwachung

DOI:

10.3791/66971

⸱

27. September 2024

 ,  ,  , 
1Department of Mechanical and Materials Engineering, University of Nebraska-Lincoln, 2Department of Biomedical Engineering, Michigan State University, 3Institute for Quantitative Health Science and Engineering (IQ), Michigan State University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Die Elektroporation mit porösen Substraten (PSEP) kombiniert eine konsistente Abgabe mit hohem Durchsatz und einer hohen Zellviabilität. Die Einführung von transepithelialen elektrischen Impedanzmessungen (TEEI) gibt Einblick in die Zwischenprozesse von PSEP und ermöglicht eine markierungsfreie Verabreichung. In diesem Artikel wird eine Methode zur gleichzeitigen Durchführung von PSEP-Verabreichungsexperimenten und TEEI-Messanalysen erläutert.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Elektroporation poröser Substrate (PSEP) ist eine aufstrebende Methode der Elektroporation, die einen hohen Durchsatz und eine gleichmäßige Abgabe bietet. Wie viele andere Arten der intrazellulären Verabreichung stützt sich PSEP stark auf Fluoreszenzmarker und Fluoreszenzmikroskopie, um eine erfolgreiche Verabreichung zu bestimmen. Um einen Einblick in die Zwischenschritte des Elektroporationsprozesses zu erhalten, wurde eine PSEP-Plattform mit integrierter transepithelialer elektrischer Impedanzüberwachung (TEEI) entwickelt. Die Zellen werden in kommerziell erhältlichen Inserts mit porösen Membranen kultiviert. Nach einer Inkubationszeit von 12 Stunden, um die Bildung einer vollständig konfluenten Zellmonoschicht zu ermöglichen, werden die Inserts in Transfektionsmedien gelegt, die sich in den Vertiefungen des PSEP-Geräts befinden. Die Zellmonoschichten werden dann einer benutzerdefinierten Wellenform unterzogen, und die Abgabeeffizienz wird durch Fluoreszenzmikroskopie bestätigt. Dieser Arbeitsablauf kann mit TEEI-Messungen zwischen Puls- und Fluoreszenzmikroskopie erheblich verbessert werden, um zusätzliche Daten über den PSEP-Prozess zu sammeln, und diese zusätzlichen TEEI-Daten werden mit Verabreichungsmetriken wie Verabreichungseffizienz und Durchführbarkeit korreliert. In diesem Artikel wird ein Protokoll für die Durchführung von PSEP mit TEEI-Messungen beschrieben.

Einleitung

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Die Elektroporation ist eine Technik, bei der Zellen einem elektrischen Feld ausgesetzt werden, wodurch temporäre Poren in der Zellmembran entstehen, durch die Frachten, einschließlich Proteine, RNA und DNA, gelangen können 1,2. Die am weitesten verbreitete Variante ist die Bulk-Elektroporation (BEP). Die BEP wird durchgeführt, indem eine Küvette mit einem Elektrolyten gefüllt wird, der Millionen von Zellen enthält, der Elektrolyt einer Hochspannung ausgesetzt wird und die Fracht durch Diffusion oder Endozytosein die Zellen gelangt 1. BEP bietet viele Vorteile, darunter einen hohen Durchsatz und zahlreiche kommerziell erhältliche Systeme. Es gibt jedoch Einschränkungen bei der BEP-Lieferung. Eine inkonsistente Zellpositionierung relativ zu den Elektroden und die Abschirmung des elektrischen Feldes von benachbarten Zellen führen zu einer signifikanten Variabilität der Exposition gegenüber elektrischen Feldern während BEP 3,4. Die für BEP erforderliche hohe Spannung hat auch einen erheblichen negativen Einfluss auf die Lebensfähigkeit der Zellen5. Seit ihrer Einführung im Jahr 20116 besteht ein wachsendes Interesse an einer Elektroporationsmethode, die als poröse Substratelektroporation (PSEP) bezeichnet wird, obwohl sie manchmal auch mit anderen Namen bezeichnet wird, darunter lokalisierte Elektroporation und Nano- oder Mikroelektroporation 1,7,8. Im Gegensatz zur Zellsuspension von BEP wird PSEP an Zellen durchgeführt, die an einem porösen Substrat haften. Nicht nur, dass für die Mehrzahl der menschlichen Zelllinien9 ein adhärenter Zustand bevorzugt ist, sondern die Poren im Substrat fokussieren sich auch auf den elektrischen Strom, wodurch das elektrische Transmembranpotential (TMP) in spezifischen Regionen der Zellmembranlokalisiert wird 10,11. Diese Lokalisierung ermöglicht eine signifikante Reduzierung der angelegten Spannung, eine Verringerung der Beschädigung und eine Erhöhung der Zellviabilität. Diese Kombination von Effekten hilft, die Porenentwicklung der Zellmembran zu kontrollieren, was zu einer konsistenteren und effizienteren Abgabe führt 1,5,12.

In einer kürzlich durchgeführten Studie wurde ein PSEP-Gerät mit einem vergoldeten Elektrodenarray mit sechs Vertiefungen zum Halten von kommerziell erhältlichen porösen Membraneinsätzen13 vorgestellt (Abbildung 1A,B), eine Praxis, die erstmals von Vindis et al. eingeführt wurde14. Das Gerät kann Impulse anlegen und die elektrische Impedanz über die Zellmonoschicht, die als transepitheliale elektrische Impedanz (TEEI) bezeichnet wird, in Echtzeit messen13. Die Benutzeroberfläche des Geräts ermöglicht die vollständige Kontrolle über die Wellenform und Polarität der Elektroporation. Wichtig ist, dass Echtzeit-Impedanzmessungen verwendet werden können, um die Verabreichungsergebnisse vorherzusagen, ohne dass teure Reagenzien oder Fluoreszenzmarker erforderlich sind, ein Konzept, das als markierungsfreie Verabreichung bekannt ist15.

Die PSEP-Plattform besteht aus zwei großen kundenspezifischen elektrischen Komponenten: dem Hauptkörper des Geräts, in dem sich der Impulsgenerator und die TEEI-Messgeräte befinden, und dem Elektrodenarray, in das die porösen Substrate eingebracht werden und die Elektroporation stattfindet. Diagramme für alle kundenspezifischen Elektronikgeräte und 3D-gedruckten Komponenten finden Sie auf GitHub: https://github.com/YangLabUNL/PSEP-TEEI. Neben der kundenspezifischen Elektronik ist auch ein Computer erforderlich, damit die Plattform ordnungsgemäß funktioniert. Die benutzerdefinierte Software erfordert MATLAB (Version 2021a oder höher), um ausgeführt zu werden, und Microsoft Excel, um Daten für die Analyse zu speichern und darauf zuzugreifen. Das Programm steuert die kundenspezifische Elektronik und stellt die grafische Benutzeroberfläche (GUI) zum Anpassen von Einstellungen zur Verfügung. Diese Programme wurden auch auf GitHub zur Verfügung gestellt: https://github.com/YangLabUNL/PSEP-TEEI.

Vorläufige Daten deuten darauf hin, dass dieser Prozess für verschiedene Arten von adhärenten Zellen möglich ist (Abbildung 1C), aber in diesem Artikel wird nur die Präparation von A431-Zellen unter Verwendung von Parametern behandelt, die von Brooks et al. als optimal für diese Zelllinie befunden wurden.13. Da die Propidiumiodid (PI)-Fracht zytotoxisch ist, werden außerdem zwei Experimente durchgeführt, das erste mit einem hochkonzentrierten PI-Transfektionsmedium zur Quantifizierung der Verabreichungseffizienz und das zweite nur mit Zellkulturmedien zur Messung von TEEI über längere Zeiträume. Bei diesen Experimenten werden identische Elektroporationswellenformen verwendet, so dass die Ergebnisse korreliert werden können (Abbildung 1D).

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Abbildung 1: Montagediagramm des Elektrodenarrays und grundlegende Daten. (A) CAD-Modell eines Einsatzes in einer Vertiefung des Elektrodenarrays. (B) CAD-Modell des Elektrodenarrays. (C) Impedanzerhöhung aufgrund von PSEP für ausgewählte Zelllinien, n = 3 pro Zelllinie. Fehlerbalken: Standardfehler des Mittelwerts. (D) Liefereffizienz vs. TEEI erhöhen die Korrelationsdaten. Die Verabreichungseffizienz wurde berechnet, indem die Anzahl der Zellen, die sowohl in PI- als auch in Calstein-Bildern aus Verabreichungsexperimenten markiert waren, durch die Gesamtzahl der mit Hoechst identifizierten Zellen dividiert wurde. Die Zellzahl wurde mit einer benutzerdefinierten CellProfiler-Pipeline bestimmt, n = 6 pro Spannung. Fehlerbalken: (x- und y-Achse) Standardfehler des Mittelwerts. Diese Abbildung wurde mit Genehmigung von Brooks et al.13 übernommen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Protokoll

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Die Einzelheiten zu den Reagenzien und der in der Studie verwendeten Ausrüstung sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Vorbereitung der Reagenzien und Zellkultur

  1. Bereiten Sie das Zellkulturmedium vor, indem Sie 50 ml fötales Rinderserum (FBS) und 5 ml Penicillin-Streptomycin in einen 500-ml-Behälter mit Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) geben. Elf 50-ml-Aliquote herstellen, um das Kontaminationsrisiko zu verringern, und bei 4 °C kühlen.
  2. 1 ml Fibronektin im humanen Plasma mit 25 μg/ml in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gemäß den Anweisungen des Herstellers herstellen.
  3. 15 ml 0,1 mg/ml Propidiumiodid in DMEM-Stammlösung herstellen, um Experimente mit unterschiedlichen Ladungskonzentrationen zu ermöglichen.
  4. Kultivieren Sie A431-Zellen in einem T75-Kolben, der 12 ml des vorbereiteten Zellkulturmediums enthält. Die Zellen wurden alle 1-2 Tage passageiert, um eine Konfluenz von 50 % aufrechtzuerhalten.

2. Vorbereitung der Probe

  1. Fibronektin-Beschichtung
    1. Wählen Sie zwölf Einsätze und zwei 24-Well-Platten. Platzieren Sie die Einsätze in einer Well-Platte, so dass zwei Reihen mit je sechs Vertiefungen entstehen. Stellen Sie die zweite Vertiefungsplatte für später beiseite.
    2. Stellen Sie 1.300 μl 1 μg/ml Fibronektinlösung her, indem Sie 52 μl Fibronektin-Stammlösung und 1.248 μl PBS in einem 1,5-ml-Röhrchen mischen.
    3. Verteilen Sie 100 μl der Fibronektinlösung in jede Einlage. Inkubieren Sie die Einsätze in der Well-Platte bei 37 °C für 3 h.
  2. Einstellen der Zellkonzentration für eine optimierte Zelldichte
    1. Etwa 1 Stunde vor Abschluss der Fibronektin-Inkubation den T75-Kolben mit A431-Zellen für die Zellextraktion aus dem Inkubator nehmen.
    2. Entfernen Sie das Medium mit einem Aspirator aus dem Kolben und waschen Sie es mit 5 ml PBS. Entfernen Sie das PBS auf die gleiche Weise und fügen Sie 3 ml Trypsin hinzu. Inkubieren Sie 3-4 Minuten lang, bevor Sie auf die Seite des Kolbens klopfen, um die Zellen vollständig zu lösen.
    3. Geben Sie 6 ml Zellkulturmedium in den Kolben, mischen Sie kräftig mit einer Pipette, um alle verbleibenden Zellen zu lösen, und geben Sie den Inhalt in ein 15-ml-Zentrifugenröhrchen. Bei 100 x g und 20 °C 5 min zentrifugieren.
    4. Entfernen Sie das Zellkulturmedium und das Trypsin mit einem Aspirator aus dem Zentrifugenröhrchen und achten Sie darauf, das Zellpellet nicht zu beschädigen. Geben Sie 1 ml Medium in das Zentrifugenröhrchen und pipettieren Sie hin und her (ohne Blasen zu erzeugen), um das Zellpellet aufzubrechen und die Zellen wieder zu suspendieren.
    5. Pipettieren Sie 10 μl der Zellsuspension, 40 μl Zellkulturmedium und 50 μl Trypanblau-Farbstoff in ein 200-μl-Röhrchen und mischen Sie es mit einer Pipette gründlich.
    6. Entfernen Sie 10 μl der Farbstoffmischung und injizieren Sie sie in ein Hämozytometer. Zählen Sie die Zellen mit der 10%igen Verdünnung der Farbstoffmischung, um die Gesamtzellzahl im 15-ml-Zentrifugenröhrchen zu schätzen.
      HINWEIS: Für dieses Protokoll wird von einer Konzentration von 5.000.000 Zellen/ml ausgegangen.
    7. Multiplizieren Sie die gewünschte Aussaatdichte mit der Oberfläche der Insert-Membran, dividieren Sie durch die gezählten Zellen/ml in der Suspension und multiplizieren Sie mit 1.000, um die erforderlichen Mikroliter Zellsuspension pro Insert zu berechnen.
      1. Um die Gesamtmenge der benötigten Zellsuspension zu ermitteln, multiplizieren Sie diese Zahl mit 10 (um genügend Zellen für 9 Proben zu gewährleisten, da 3 der 12 Einsätze zellfreie Kontrollen sind) und runden Sie auf die nächste ganze Zahl auf. In diesem Fall werden für dieses Experiment insgesamt 135 μL der Zellsuspension benötigt.
    8. Stellen Sie 2.000 μl angepasste Zelllösung her, indem Sie die zuvor berechneten 135 μl der Zellsuspension mit 1.865 μl Zellkulturmedium in einem separaten 15-ml-Zentrifugenröhrchen mischen.
  3. Zellen aussäen
    1. Entfernen Sie das überschüssige Fibronektin von jedem Einsatz, sobald die Fibronektin-Inkubation abgeschlossen ist.
    2. Waschen Sie die Einsätze zweimal, indem Sie jedem Einsatz 100 μl steriles destilliertes Wasser hinzufügen. Entfernen Sie das Wasser in der gleichen Reihenfolge, in der es hinzugefügt wurde, um eine gleichmäßige Waschzeit zwischen den Einlegeeinlagen zu gewährleisten.
    3. Waschen Sie den Einsatz erneut, indem Sie jedem Einsatz 100 μl Zellkulturmedium hinzufügen. Entfernen Sie das Medium in der gleichen Reihenfolge, in der es hinzugefügt wurde, um eine gleichmäßige Waschzeit zwischen den Einlegern zu gewährleisten.
    4. Einsätze von Zellproben
      1. Keimzellen durch Pipettieren von 200 μl angepasster Zelllösung in jeden Einsatz. Um eine gleichmäßige Konfluenz zwischen den Einsätzen zu gewährleisten, mischen Sie die Zelllösung vor der Verteilung im Zentrifugenröhrchen und mischen Sie sie nach der Verteilung erneut in jedem Einsatz.
    5. Einsätze für Negativkontrollen
      1. Pipettieren Sie 200 μl Zellkulturmedium in jeden Einsatz. Um die Konsistenz mit den Zellprobeneinsätzen zu gewährleisten, verwenden Sie die Pipette, um das Zellkulturmedium in jedem Einsatz zu mischen.
  4. Markierung und Inkubation
    1. Zeichnen Sie mit einem Permanentmarker eine Linie, die die zweite Well-Platte in zwei Spalten unterteilt, die drei Wells breit sind (für Bedingungen, die in dreifacher Ausführung ausgeführt werden). Trennen Sie jede Spalte in Zeilen. Beschriften Sie jeden Bereich im Raster mit relevanten Parametern.
    2. Geben Sie 1 ml Zellkulturmedium in jede Vertiefung, um eine Einlage für das Experiment zu erhalten. Übertragen Sie die Einsätze aus der Präparationsvertiefungsplatte an die entsprechende Stelle in der beschrifteten Versuchsvertiefungsplatte und inkubieren Sie mindestens 12 h lang bei 37 °C.

3. Experimentelles Vorgehen

  1. Experiment zur Auslieferung
    1. Pipettieren Sie 1,5 ml der 0,1 mg/ml PI-Lösung in jede Vertiefung im Elektrodenarray. Platzieren Sie einen Einsatz in jeder Vertiefung des Elektrodenarrays und setzen Sie die Füße des Einsatzes in die Ausrichtungsnuten ein, sodass der Einsatz bündig mit der Oberseite der Vertiefung abschließt (Abbildung 1A, B).
    2. Schrauben Sie die obere Elektrodenleiterplatte (PCB) an die Oberseite der Elektrodenarray-Vertiefungen und verbinden Sie das Elektrodenarray mit dem PSEP-Gerät.
    3. Stellen Sie das Elektrodenarray für mindestens 1 h in den 37 °C heißen Inkubator, damit sich die Temperatur ausgleichen kann.
    4. Klicken Sie auf das Dropdown-Menü neben "Membran" in der oberen linken Ecke der GUI und klicken Sie auf 400 nm GBO. Wiederholen Sie diesen Schritt für "Elektrolyt", "Zellen", "Zellaussaatdichte" und "Zelldauer" und wählen Sie DMEM, A431, 200 bzw. 12 aus.
      HINWEIS: Diese Werte dienen nur zu Aufzeichnungszwecken und haben keinen Einfluss auf die Funktion des Geräts. Bitte stellen Sie sicher, dass Sie diese Werte bei Bedarf anpassen, um eine korrekte Datenverfolgung zu gewährleisten.
    5. Geben Sie 1 in das Bearbeitungsfeld "Post-Pulse-Zeitdauer (min)" auf der rechten Seite der GUI ein, um die Standard-Nach-Puls-Messzeit auf 1 Minute zu ändern. Behalten Sie alle anderen Einstellungen im Standardzustand bei.
      HINWEIS: Die Standard-Impulsparameter erzeugen eine Rechteckwellenform mit 30 Volt, 20 Hz, 1 ms Dauer und 200 Impulsen. Die standardmäßigen TEEI-Messparameter sind 0,5 Volt und 100 Hz, 1.000 Hz, 10.000 Hz und 100.000 Hz.
    6. Klicken Sie auf die Schaltfläche Ausführen und geben Sie die entsprechenden Namen für die Bohrlöcher 1-3 und 4-6 ein, wenn Sie dazu aufgefordert werden. Klicken Sie auf OK , um das Experiment zu starten.
    7. Nehmen Sie das Elektrodenarray aus dem Inkubator und übertragen Sie die Einsätze zurück an die ursprünglichen Positionen in der Experimentvertiefungsplatte, wenn die Ausführung des Programms abgeschlossen ist.
    8. Mischen Sie 2 μl Hoechst 33342 und 5 μl Calcein AM mit 123 μl Zellkulturmedium in einem 200 μl Röhrchen.
    9. Pipettieren Sie vorsichtig 10 μl der Färbelösung in jeden Post-Puls-Einsatz und legen Sie die Einsätze für 5 Minuten zurück in den Inkubator.
    10. Übertragen Sie die Well-Platte in den Plattenhalter eines Fluoreszenzmikroskops mit einem Objektiv mit 5-facher Vergrößerung. Bild mit Hellfeld und der Fluoreszenz jedes Flecks. Zentrieren Sie den Einsatz über dem Objektiv, bevor Sie die Kamera auslösen.
      HINWEIS: Die Anregungswellenlängen für PI, Calcein AM und Hoechst 33342 betragen 558 nm, 495 nm bzw. 353 nm. Die Emissionswellenlängen betragen 575 nm, 519 nm bzw. 465 nm.
  2. TEEI-Messexperiment
    1. Pipettieren Sie 1,5 ml des Zellkulturmediums in jede Vertiefung im Elektrodenarray. Platzieren Sie die Zellprobeneinsätze in den Vertiefungen 1-3 und die Kontrolleinsätze in den Vertiefungen 4-6, wobei Sie die Füße des Einsatzes in die Ausrichtungsrillen einpassen, so dass der Einsatz bündig mit der Oberseite der Vertiefung abschließt.
    2. Schrauben Sie die obere Elektrodenplatine an die Oberseite der Elektrodenarray-Vertiefungen und verbinden Sie das Elektrodenarray mit dem PSEP-Gerät.
    3. Stellen Sie das Elektrodenarray für mindestens 1 h in den 37 °C heißen Inkubator, damit sich die Temperatur ausgleichen kann.
    4. Klicken Sie auf das Dropdown-Menü neben "Membran" in der oberen linken Ecke der GUI und klicken Sie auf 400 nm GBO. Wiederholen Sie diesen Schritt für "Elektrolyt", "Zellen", "Zellaussaatdichte" und "Zelldauer" und wählen Sie DMEM, A431, 200 bzw. 12 aus.
      HINWEIS: Diese Werte dienen nur zu Aufzeichnungszwecken und haben keinen Einfluss auf die Funktion des Geräts. Bitte stellen Sie sicher, dass Sie diese Werte bei Bedarf anpassen, um eine korrekte Datenverfolgung zu gewährleisten.
    5. Belassen Sie alle verbleibenden Einstellungen im Standardzustand.
      HINWEIS: Die Standard-Impulsparameter erzeugen eine Rechteckwellenform mit 30 Volt, 20 Hz, 1 ms Dauer und 200 Impulsen. Die standardmäßigen TEEI-Messparameter sind 0,5 Volt und 100 Hz, 1.000 Hz, 10.000 Hz und 100.000 Hz.
    6. Klicken Sie auf die Schaltfläche Ausführen und geben Sie die entsprechenden Namen für die Bohrlöcher 1-3 und 4-6 ein, wenn Sie dazu aufgefordert werden. Klicken Sie auf OK , um das Experiment zu starten.
    7. Nehmen Sie das Elektrodenarray aus dem Inkubator und übertragen Sie die Einsätze zurück an die ursprünglichen Positionen in der Experimentvertiefungsplatte, wenn die Ausführung des Programms abgeschlossen ist.
    8. Mischen Sie 2 μl Hoechst 33342, 5 μl Calcein AM und 10 μl PI mit 113 μl Zellkulturmedium in einem 200 μl Reaktionsgefäß.
    9. Pipettieren Sie 10 μl der Fleckenlösung in jeden Post-Puls-Einsatz und legen Sie die Einsätze für 5 Minuten zurück in den Inkubator.
    10. Übertragen Sie die Well-Platte in den Plattenhalter eines Fluoreszenzmikroskops mit einer 5-fach-Objektivlinse. Bild mit Hellfeld und der Fluoreszenz jedes Flecks. Zentrieren Sie den Einsatz über dem Objektiv, bevor Sie die Kamera auslösen.
      HINWEIS: Die Anregungswellenlängen für PI, Calcein AM und Hoechst 33342 betragen 558 nm, 495 nm bzw. 353 nm. Die Emissionswellenlängen betragen 575 nm, 519 nm bzw. 465 nm.

4. Datenanalyse

  1. Analysieren von Bilddaten mit der CellProfiler-Pipeline
    1. Verwenden Sie den benutzerdefinierten CellProfiler-Workflow, der unter GitHub:https://github.com/YangLabUNL/PSEP-TEEI bereitgestellt wird, um die Bilder des Bereitstellungs- und TEEI-Messexperiments zu verarbeiten.
  2. TEEI-Analyse
    1. Klicken Sie in der GUI auf die Registerkarte Analyse .
    2. Schalten Sie die Impedanztypanzeige am unteren Rand der GUI auf TEEI um.
    3. Klicken Sie auf den Pfeil im oberen linken Feld, um alle Experimentnamen in der Datendatei anzuzeigen. Wählen Sie alle Zellprobendaten aus dem TEEI-Messexperiment aus.
    4. Klicken Sie auf den Pfeil im nächsten Feld rechts, um alle Experimentnamen in der Datendatei anzuzeigen. Wählen Sie alle Einfügedaten aus der TEEI-Messung aus.
    5. Klicken Sie auf Ausführen. Es erscheint eine Basisabbildung mit ausgewählten Zellprobendaten mit der niedrigsten Messfrequenz.
    6. Klicken Sie im Feld für Beispieloptionen auf der rechten Seite der GUI auf den Pfeil, um alle ausgewählten Einfügedaten anzuzeigen. Ausreißer können entfernt werden, indem Sie die entsprechenden Daten auswählen und unten auf Entfernen klicken.
      HINWEIS: Alle Daten, die durch den letzten Klick auf die Schaltfläche Entfernen aus der Analyse entfernt wurden, können mit der Schaltfläche Rückgängig abgerufen werden.
    7. Klicken Sie auf Fertig , um zur nächsten Abbildung zu gelangen, wenn die gewünschten Daten in der Abbildung angezeigt werden.
    8. Wiederholen Sie die Schritte 4.2.6 und 4.2.7 für die verbleibenden Zellprobendaten und Kontrolldaten. Wenn der endgültige Datensatz mit einem Klick auf "Fertig" bestätigt wurde, erscheint die vollständige Analysezahl.
    9. Speichern Sie die Analysezahl.

Ergebnisse

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Das vorliegende Protokoll etabliert eine Methode zur Verwendung von TEEI-Messungen, um die Zwischenprozesse der Elektroporation zu untersuchen und Vorhersagen über die Verabreichung zu treffen, insbesondere für die A431-Zelllinie und die PI-Fracht. Während die Modifikation dieses Protokolls in diesem Artikel weiter diskutiert wird, ist es wichtig zu beachten, dass sich die spezifischen Werte zwar ändern können, die allgemeinen Trends in der Reaktion jedoch konsistent bleiben. Zum Beispiel entsprechen TEEI-Daten, die unter den ursprünglichen Ausgangswert fallen, dem Zelltod, während der maximale Anstieg des TEEI-Werts über dem Minimum der Verabreichungseffizienzentspricht 13. Diese allgemeinen Trends und ihre Auswirkungen werden im Folgenden untersucht.

Wie in Abbildung 2A gezeigt, können bei der Verwendung der PSEP-Plattform eine Reihe von TEEI-Mess- und Zellbildgebungstrends auftreten. Das ideale Ergebnis dieses Protokolls besteht darin, eine Kurve zu erzeugen, die den optimierten gesunden Daten in Abbildung 2Ai ähnelt. Dies wird als ideales Ergebnis bezeichnet, da es keinen Einbruch unter den Ausgangswert gibt, was auf einen sehr geringen oder gar keinen Zelltod hinweist. Darüber hinaus weist die optimierte fehlerfreie Kurve den größten Anstieg des TEEI vom Minimum aus auf, was auf ein hohes Maß an Liefereffizienzhinweist 13. Diese Schlussfolgerungen werden durch die Post-PSEP-Bildgebung der Zellmonoschicht unterstützt, die einen vernachlässigbaren Zelltod und eine gesunde, vollständig konfluente Zellmonoschicht zeigt (Abbildung 2Aiii). Darüber hinaus kann ein erfolgreiches Verabreichungsexperiment mit identischen PSEP-Wellenformen durch die in Abbildung 2B gezeigten Bilder charakterisiert werden. Die richtige Anwendung der Elektroporationswellenform und die Ladungskonzentration führen zu einem hohen Maß an Verabreichungskonsistenz und Zellviabilität.

Die Gesundheit und Konfluenz der Zellmonoschicht sind entscheidend für die erfolgreiche Anwendung von TEEI-basierten Verabreichungsvorhersagen16,17. Selbst bei einer optimierten Wellenform führt eine ungesunde oder unvollständige Zellmonoschicht zu einer verminderten TEEI-Antwort, wie die optimierten ungesunden Daten in Abbildung 2Aii zeigen. Es ist jedoch zu beachten, dass die Bilder für dieses Ergebnis (Abbildung 2Avi) immer noch der Interpretation der TEEI-Antwort von Brooks et al. entsprechen.13. Es gibt keinen Einbruch unter den Ausgangswert, was auf einen Zelltod nahe Null hinweist (Abbildung 2C,D). Darüber hinaus wirkt sich die reduzierte Erhöhung gegenüber dem Minimum negativ auf die Verabreichungseffizienz aus, da weniger Zellen in der Monoschicht die Gesamt-PI-Abgabe reduzieren (Abbildung 2C,D).

Wenn eine nicht optimierte Wellenform angewendet wird, ist es möglich, eine noch deutlichere Abnahme der TEEI-Reaktion zu erzielen. Abhängig von der Gesamtenergie und dem Zeitrahmen, in dem sie angewendet werden, können unoptimierte Wellenformen zu Ergebnissen führen, die von einer verminderten Effizienz bis hin zur nahezu vollständigen Vernichtung der Zellmonoschicht reichen (Abbildung 2Ai,iii,v). Sowohl die unoptimierte als auch die sehr unoptimierte Kurve zeigen einen signifikanten Rückgang gegenüber dem Ausgangswert, was auf einen erheblichen Zelltod hindeutet. Zunehmend unoptimierte Wellenformen behindern jedoch die Zellregeneration, was zu einer verminderten Verabreichungseffizienz führt.

Die Verabreichungseffizienz wurde berechnet, indem die Anzahl der Zellen, die sowohl in PI- als auch in Calstein-Bildern aus Verabreichungsexperimenten markiert waren, durch die Gesamtzahl der mit Hoechst identifizierten Zellen dividiert wurde. Der Tod wurde berechnet, indem die in TEEI-Messexperimenten mit PI markierten Zellen durch die Gesamtzahl der mit Hoechst identifizierten Zellen dividiert wurden. Die Zellenanzahl wurde mithilfe einer benutzerdefinierten CellProfiler-Pipeline für beide Metriken bestimmt.

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Abbildung 2: TEEI-Reaktionskurven und Bildgebung für häufige Bedingungen. (A) (i) TEEI-Antwortdaten, die die prozentuale TEEI-Änderung für optimierte und nicht optimierte Bedingungen veranschaulichen. (ii) Vergleich der TEEI-Reaktion zwischen gesunden und ungesunden Monoschichten unter optimierten Wellenformbedingungen. iii-v) Repräsentative Bildgebung potenzieller Ergebnisse für optimierte und nicht optimierte Wellenformbedingungen, die Zelltod (rot) und lebende Zellen (grün) zeigen. (vi) Repräsentative Bildgebung einer ungesunden Monoschicht nach Anwendung optimierter Wellenformbedingungen, die den Zelltod (rot) und lebende Zellen (grün) zeigen. (B) Bilder, die die erfolgreiche PI-Verabreichung (rot), lebende Zellen (grün) und Zellkernpositionen (blau) zeigen. Alle Bilder werden zur besseren Schärfe aufgehellt. Maßstabsbalken: 1000 μm. (C) TEEI-Abnahme vom Ausgangswert vor dem PSEP auf das Minimum nach dem PSEP und Anstieg vom Minimum nach dem PSEP auf den Spitzenwert nach dem PSEP für gegebene Spannungen. (D) Übertragungseffizienz und Zelltodprozentsätze für gegebene Spannungen. Fehlerbalken stellen das SEM dar (n = 6). (C,D) Reproduktion von Brooks et al.13 mit Genehmigung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Diskussion

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Abbildung 2C zeigt, dass TEEI-Anstiege von der Minimal- und die Abnahme gegenüber dem Ausgangswert für jede PSEP-Wellenformspannung aufgetragen werden. Die TEEI-Erhöhung erzeugt einen Parabolbogen, der einen Spitzenwert von etwa 20 Volt erreicht, bevor er abnimmt, während die TEEI-Abnahme gegenüber der Grundlinie mit steigender Spannung exponentiell ansteigt. Der Förderwirkungsgrad und der Todesprozentsatz in Abbildung 2D spiegeln diese Trends wider, wobei der Förderwirkungsgrad parabolisch ansteigt und einen Spitzenwert von etwa 30 Volt erreicht, während der Tod exponentiell zunimmt, wenn die Wellenformspannung erhöht wird.

Eine Hypothese für den zugrundeliegenden Mechanismus, der den TEEI-Anstieg verursacht, ist die Elektroosmose durch die negativ geladenen Substrat-Mikrokanäle, ein Phänomen, das durch das Anlegen eines elektrischen Feldes verursacht wird18,19. Unabhängig davon, ob die TEEI-Reaktion auf einen mechanischen Reiz durch Zellschwellung aufgrund einer elektroosmotischen Flüssigkeitsströmung zurückzuführen ist, ein Faktor, der bekanntermaßen bei der Elektroporation20 auftritt, oder auf den elektrischen Reiz der Wellenform selbst, ist klar, dass die Gesundheit und Vollständigkeit der Monoschicht von größter Bedeutung ist, um den richtigen Spannungsabfall über die Zellmembran zu erreichen, der für die Elektroporation erforderlich ist. Aus diesem Grund sind die kritischsten Schritte bei dieser Methode die Zellaussaat und die Sicherstellung der korrekten Bildung von Zellmonoschichten. Dies kann durch die Bildgebung der Zellmonoschicht und durch den TEEI-Ausgangswert bestätigt werden. Bei A431-Zellen liegt die durchschnittliche TEEI bei etwa 7 Ω cm², während HEK293T Zellen im Durchschnitt bei etwas niedrigeren 5 Ω cm² liegen (Abbildung 2Aii), was wahrscheinlich auf morphologische Unterschiede zurückzuführen ist, die zu Unterschieden im Zell-Zell-Verbindungsbereich führen.

Aufgrund des elektrischen Feldes, das für die Elektroporation des porösen Substrats erforderlich ist, kommt es zu einer Elektrolyse, wodurch die Elektroden korrodieren12,21. Dies war besonders deutlich für die untere Elektrode, da sie in diesem Experiment positiv geladen war, um positiv geladenes PI zu liefern. Durch Experimente wurde festgestellt, dass die untere Leiterplatte etwa 20 Mal verwendet werden kann, bevor signifikante negative Auswirkungen einen Austausch erfordern13. Um das Elektrodenarray für die Wiederverwendung zu reinigen, entfernen Sie die restlichen Zellkultur- oder Transfektionsmedien mit einem Aspirator aus den Kammern. Füllen Sie jede Kammer zu drei Vierteln mit 70 % Ethanol und platzieren Sie die obere Elektrodenplatine so auf dem Elektrodenarray, dass die oberen Elektroden untergetaucht sind. Lassen Sie das Ethanol mindestens 10 Minuten im Elektrodenarray, bevor Sie das Ethanol entfernen und das Elektrodenarray zum Trocknen beiseite stellen.

Es ist möglich, die gekauften Einsätze wiederzuverwenden, indem die Substrate entfernt, die Einlage sterilisiert und das Substrat durch ein Substrat ersetzt wird, das aus einer anderen Quelle stammt. 6-Well-Einsätze mit der gleichen Porendichte und dem gleichen Durchmesser sind kommerziell erhältlich und können zur Ernte von vier Ersatzsubstraten in 24-Well-Einsatzgröße verwendet werden. Sobald die zuvor verwendeten Einsätze sterilisiert sind, geben Sie 10 μl ultraviolett lichtgehärtetes Epoxidharz in eine frische Petrischale. Tauchen Sie die Substratseite des Einsatzes in das Epoxidbecken, um die Unterseite zu beschichten, und legen Sie vorsichtig ein neues Substrat über das Loch im Einsatz. Vergewissern Sie sich visuell, dass das Epoxidharz einen vollständigen Ring bildet, um sicherzustellen, dass die Verbindung keine Lücken aufweist. Härten Sie 30 s lang unter UV-Licht aus und lagern Sie die generalüberholten Einsätze in einer sauberen 24-Well-Platte, um eine Beschädigung der neuen Substrate vor der Wiederverwendung zu vermeiden.

Wie bereits erwähnt, wird zwar die Hypothese aufgestellt, dass der beobachtete TEEI-Anstieg in mehreren Zelltypen auftritt, aber er wurde nur mit den Zelllinien A431 und HEK293T13 nachgewiesen (Abbildung 1C), die beide adhärente Zellen sind. Das Verfahren kann modifiziert werden, indem verschiedene Zelllinien ausgewählt werden, indem Membranen mit unterschiedlichen Poreneigenschaften ausgewählt werden, die Fibronektinbeschichtung durch ein anderes extrazelluläres Matrixprotein ersetzt wird, indem die Konzentration angepasst wird, oder indem die Fracht geändert wird. Wenn jedoch Änderungen am Aufbau des Experiments vorgenommen werden, kann es erforderlich sein, die Wellenform neu zu optimieren. Zur Optimierung der Wellenform kann ein TEEI-Messexperiment durchgeführt werden, bei dem nur ein Wellenformparameter, wie z. B. die Spannung, zwischen jeder Gruppe von drei Abtastwerten geändert wird. Wählen Sie die optimale Spannung, indem Sie den größten Anstieg der TEEI über mindestens neun gesunde Proben identifizieren. Wiederholen Sie diesen Vorgang für jeden Wellenformparameter, und verwenden Sie die neu optimierten Werte, wenn Sie mit dem nächsten Parameter fortfahren. Denken Sie daran, dass es mehrere lokale Optima für Wellenformparameter geben kann (d. h. die optimale Spannung für eine Impulsdauer muss nicht die optimale Spannung für eine andere Impulsdauer sein und so weiter).

Die Vorteile der Elektroporation von porösen Substraten sind weitreichend. Während andere Methoden der intrazellulären Verabreichung schon seit geraumer Zeit existieren, haben nur wenige einen hohen Durchsatz mit einem hohen Maß an Kontrolle kombiniert, das PSEP besitzt 1,13. Darüber hinaus bietet der Einsatz von TEEI-Messungen auf der Plattform einen Einblick in die Zwischenschritte des Elektroporationsprozesses. Die TEEI-Messwerte geben Aufschluss über den Zustand der Zellen, leiten die Auswahl der Elektroporationsparameter und ermöglichen weitere Einblicke in spezifische Zellverhaltensweisen und -mechanismen13,17. Durch die TEEI-Messungen ist die Plattform auch in der Lage, markierungsfrei zu verabreichen13, was eine schnelle Optimierung mit einem geringeren Bedarf an teuren Biomarkern und Reagenzien bei jedem Experiment ermöglicht. Diese Beiträge auf dem Gebiet der intrazellulären Verabreichung machen es zu einem erstklassigen Kandidaten als Verabreichungsplattform für die biologische Grundlagenforschung und biomedizinische Anwendungen.

Offenlegungen

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Die Autoren erklären, dass kein Interessenkonflikt besteht.

Danksagungen

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Wir danken für die finanzielle Unterstützung durch die NSF (Awards 1826135, 1936065, 2143997), die NIH National Institutes of General Medical Sciences P20GM113126 (Nebraska Center for Integrated Biomolecular Communication) und P30GM127200 (Nebraska Center for Nanomedicine), die Nebraska Collaborative Initiative und die Voelte-Keegan Bioengineering Support. Das Gerät wurde in der NanoEngineering Research Core Facility (NERCF) hergestellt, die teilweise von der Nebraska Research Initiative finanziert wird.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
15 mL konisches ZentrifugenröhrchenThermo Scientific339651
2-Chip-Einweg-HämozytometerBulldog BioDHC-N01
75 cm2 GewebekulturflascheFisherbrandFB012937
A431 ZellenATCCCRL-1555
Calcein AMInvitrogenC3099
Klasse II Typ A2 BiosicherheitswerkbankLabgardNU-543-600
Custom ComponentsYangLabhttps://github.com/YangLabUNL/PSEP-TEEI
Einweg-Zentrifugenröhrchen (50 ml)fisherbrand05-539-6
DMEMGibco11965092
fötales RinderserumGibcoA5670401
Flüssigkeitsabsaugsystemvacuubrand20727403
HERACELL 240iThermo Scientific51026331
Hoechst 33342Thermo Scientific62249
Menschliches Plasma-FibronektinSigma-AldrichFIBRP-RO
Inverses FluoreszenzmikroskopZeiss491916-0001-000
Inverses MikroskopLabomedTCM 400
PBScytivaSH30256.02
PCR-Röhrchen 200 & Mikro; LSarstedt72.737
Penicillin / StreptomycinGibco15140148
Pipette (0,2-2 µ L)fisherbrand EliteFBE00002
Pipette (100-1000 & Mikro; L)fisherbrand EliteFBE01000
Pipette (20-200 & Mikro; L)fisherbrand EliteFBE00200
Pipette (2-20 & Mikro; L)fisherbrand EliteFBE00020
Propidium IodidInvitrogenP1304MP
Reaktionsröhrchen 1,5 mLSarstedt72.690.300
Sorvall ST 16R ZentrifugeThermo Scientific75004240
Thincert (24-Well)Greiner Bio-One662 6410,4 &Mikro; M Porendurchmesser, 2x106 cm-2 Porendichte, transparente
PET-Gewebekulturplatte (24-Well)fisherbrandFB012929
Trypan Blue SolutionSigma-AldrichT8154-20mL
TrypsinGibco15090046

Referenzen

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