In dieser Arbeit stellen wir ein Protokoll für einen Antikörper-abhängigen, zellvermittelten Zytotoxizitäts-Assay (ADCC) unter Verwendung eines ADCC-Bioassay-Kits vor. Diese Methode bietet ein wertvolles Werkzeug, um den ADCC-Mechanismus aufzuklären und das therapeutische Potenzial von Antikörpern in der Krebsimmuntherapie zu bewerten.
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Methodenartikel
Bewertung der Antikörper-abhängigen, zellvermittelten Zytotoxizität in Krebszellen mit Hilfe des Antikörper-abhängigen zellvermittelten Zytotoxizitäts-Reporter-Bioassays
* These authors contributed equally
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Die Methode zur antikörperabhängigen, zellvermittelten Zytotoxizität (ADCC) stellt ein wichtiges Instrument dar, um die Wirksamkeit therapeutischer Antikörper in der Krebsimmuntherapie zu beurteilen. Die Bewertung der ADCC-Aktivität in Krebszellen ist für die Entwicklung und Optimierung von Antikörper-basierten Behandlungen unerlässlich. In dieser Arbeit schlagen wir einen methodischen Ansatz vor, bei dem ein ADCC-Bioassay-Kit zur quantitativen Bewertung der ADCC-Reaktion mit Schilddrüsenkrebszellen als Effektorzellen verwendet wird. Das Protokoll beinhaltet die Co-Kultur von Effektorzellen mit Zielkrebszellen in unterschiedlichen Verhältnissen in Gegenwart eines therapeutischen Antikörpers. Das in diesem Experiment verwendete ADCC-Bioassay-Kit enthält die gentechnisch veränderten Effektorzellen, die ein Luciferase-Reportergen unter der Kontrolle von NFAT-Reaktionselementen (Nuclear Factor of Activated T-cell) exprimieren. Nach der Bindung des Oberflächenantigens an die Zielzellen mit den Antikörpern und Effektorzellen setzen die Effektorzellen Luciferase frei, was eine Quantifizierung der Zytotoxizität durch Messung des Lumineszenzsignals ermöglicht. Im Gegensatz zu herkömmlichen ADCC-Assays konnte bei dieser Methode die Bindung des Zielantigens an Antikörper und Effektorzellen nachgewiesen werden, was in kurzer Zeit zu zuverlässigen Ergebnissen führen kann.
Einleitung
Die Antikörper-abhängige, zellvermittelte Zytotoxizität (ADCC) ist ein wichtiger Mechanismus, durch den Antikörper immunvermittelte zellabtötende Wirkungen ausüben 1,2,3. Die Immunzellen werden durch Bindung an den therapeutischen Antikörper aktiviert, der mit Oberflächenantigenen der Zielzellen interagiert, um Granzyme, Perforin, freizusetzen, was zum Tod der Zielzellen führt. Zu diesen Immunzellen gehören die natürlichen Killerzellen (NK) und die Neutrophilen 2,3,4,5,6,7. Der ADCC-Assay hat sich zu einem wichtigen Instrument entwickelt, um die Wirksamkeit von therapeutischen Antikörpernzu bewerten 8,9.
Beim herkömmlichen ADCC-Assay werden mononukleäre Zellen des peripheren Blutes (PBMCs) oder natürliche Killerzellen als Effektorzellen verwendet, um die Wirksamkeit eines therapeutischen Antikörpers zu überwachen, indem die Zelltodrate des Ziels quantifiziert wird. Unsere Methode verwendet ein ADCC-Bioassay-Kit, das gentechnisch veränderte Effektorzellen enthält, die ein Luciferase-Reportergen unter der Kontrolle von NFAT-Reaktionselementen (Nuclear Factor of Activated T-cell) exprimieren. Anschließend quantifizieren wir die Bindung des Oberflächenantigens an die Zielzellen mit dem Antikörper und den Effektorzellen. Diese Methode basiert darauf, dass die ADCC-Reaktion in kurzer Zeit abläuft, ohne dass humane PBMC-Zellen benötigt werden. Zu den experimentellen Schritten gehört die Co-Kultur von Effektorzellen mit Zielzellen in Gegenwart von therapeutischen Antikörpern.
Während der Inkubation bindet der therapeutische Antikörper an das Zielantigen auf der Oberfläche der Zielzellen, was zur Bindung der Effektorzellen und des Fc-Fragments eines Antikörpers führt. Dadurch wird das NFAT-Response-Element aktiviert und Lumineszenzsignale für die quantitative Beurteilung der ADCC-Reaktion freigesetzt.
Vor der Durchführung des Experiments muss die Expression des Zielantigens in den Zielzellen entweder durch Durchflusszytometrie oder Western Blot bestätigt werden. Die Zielzellen werden kultiviert und vor dem Experiment 24 Stunden lang in 96-Well-Platten abgefüllt. Unterschiedliche Konzentrationen eines therapeutischen Antikörpers werden zusammen mit unterschiedlichen Zellzahlen von Effektorzellen addiert, um das berechnete Effektor-Zielzell-Verhältnis zu erreichen.
Zu den wichtigsten Schritten dieser Methode gehören (1) die Vorbereitung von Zielzellen und Effektorzellen, (2) das Verhältnis von Effektor zu Zielzelle, (3) die Herstellung unterschiedlicher Konzentrationen des Antikörpers und (4) die Variation der Inkubationsdauer. Nach der Inkubation werden die Lumineszenzsignale mit einem Luminometer gemessen, das eine quantitative Ablesung der ADCC-Aktivität ermöglicht. Im Vergleich zu anderen Methoden zur Messung der ADCC ist diese Methode relativ einfach zu bedienen und die Ergebnisse sind genau.
Der ADCC-Reporter-Bioassay zeigt die Bindung des Zielantigens, des therapeutischen Antikörpers und der Immunzellen an der Aktivierung des ADCC-Signalwegs an. Diese Bindung aktiviert die Gentranskription über den NFAT-Signalweg in den von Effektorzellen gezüchteten Jurkat-Zellen mit stabil exprimierendem FcγRIIIa-Rezeptor, der V158-Variante (High-affinity). Das NFAT-Response-Element vermittelt die Expression von Luciferase in den Effektorzellen 10,11. Die biologische Aktivität des Antikörpers im Wirkmechanismus (MOA) von ADCC wird durch das Luciferase-Signal quantifiziert, das über den NFAT-Signalweg erzeugt wird. Das Luziferase-Signal in den Effektorzellen - FcγRIIIa-Rezeptor-exprimierenden Jurket-Zellen - wird mit einem Lumineszenz-Reader quantifiziert (Abbildung 1). Das Signal-Rausch-Verhältnis des Assays ist hoch.
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Protokoll
1. Nachweis der EGFR- und VEGFR-Expression in Zielzellen
HINWEIS: Verwenden Sie Western Blotting, um die Expression des Zielantigens in den Zielzellen nachzuweisen.
- Probenvorbereitung
- Kultivieren Sie die Zellen (humane Schilddrüsenkrebszelllinien BHT-101 und SW-1736) in T75-Kolben mit Medium des Roswell Park Memorial Institute (RPMI), das mit 10 % fötalem Rinderserum (FBS), 1 % L-Glutamin und 1 % Antibiotika (Penicillin-Streptomycin) ergänzt wurde.
- Ernten Sie die Zellen, wenn sie zu 80 % konfluent sind, indem Sie das Kulturmedium entfernen und die Zellen mit PBS waschen. Fügen Sie 5 ml PBS hinzu und verschrotten Sie die Zellen mit einem Zellschaber, um die Zellen aus dem Kulturkolben zu entfernen. Übertragen Sie die Zellen in ein konisches 15-ml-Röhrchen.
- Zählen Sie die Zellen mit einem Zellzähler.
- Aliquot 5 × 106 der BHT-101- und SW-1736-Zellen in konische 15-ml-Röhrchen.
- Schleudern Sie die Zellen bei 135 × g für 5 min bei Raumtemperatur herunter. Entfernen Sie den Überstand PBS.
- Lysieren Sie das Zellpellet, indem Sie 100 μl RIPA-Lysepuffer mit Protease-Phosphatase-Inhibitoren für 5 Minuten auf Eis hinzufügen. Das Lysat wird in ein 2-ml-Röhrchen überführt, 15 Minuten lang bei 15.000 × g zentrifugiert und der Überstand in ein neues 2-ml-Röhrchen überführt.
- Messen Sie die Proteinkonzentration des Zelllysats mit einem Bicinchoninsäure (BCA)-Assay-Kit.
- Aliquotieren Sie 70 μg Protein aus Zelllysat aus jeder Probe, fügen Sie 2x Laemmli-Probenpuffer hinzu, der mit 10 % 2-Mercaptoethanol ergänzt ist, und kochen Sie die Proben 5 min lang bei 100 °C zur Denaturierung der Proben.
- Gelelektrophorese und Membrantransfer
- Bereiten Sie 8 % Natriumdodecylsulfat (SDS) Polyacrylamid-Gel mit destilliertem Wasser (4,7 ml), 30 % Acrylamid (2,7 mL), 1,5 M Tris-Puffer, pH 8,8 (2,5 mL), 10 % Natriumdodecylsulfat (0,1 ml), 10 % Ammoniumpersulfat (100 μl) und TEMED (10 μl) vor.
- 70 μg der denaturierten Proben werden im 8%igen SDS-Polyacrylamid-Gel 20 min lang bei 80 V und 100 min bei 120 V geführt.
- Übertragen Sie das Protein auf dem Gel für 90 Minuten auf eine Membran aus Polyvinylidenfluorid (PVDF) bei 100 V.
- Nach dem Übertragen die Membran 1 h lang mit 7 % Magermilch verdünnt in TBS-T-Puffer (20 mM Tris pH 7,6, 140 mM NaCl, 0,2 % Tween-20) blockieren.
- Inkubation von Antikörpern
- Inkubieren Sie die blockierte Membran über Nacht bei 4 °C mit dem anti-epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptor (EGFR) der Maus und dem anti-vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor-Rezeptor (VEGFR) des Kaninchens (verdünnt bei 1:1.000 in 7 % Magermilch).
- Waschen Sie die Membran nach der Inkubation gründlich mit Tris-gepuffertem Kochsalzlösungs-Tween (TBS-T) Puffer (20 mM Tris pH 7,6, 140 mM NaCl, 0,2% Tween-20) für 7 min und wiederholen Sie dies 4x.
- Inkubieren Sie die Membran mit dem HRP-konjugierten Sekundärantikörper (verdünnt bei 1:4.000 in 7%iger Magermilch (TBS-T)) für 1 h.
- Waschen Sie die Membran nach der Inkubation 7 Minuten lang gründlich mit TBS-T-Puffer und wiederholen Sie den Vorgang 4 Mal.
- Nachweis von Proteinen
- Inkubieren Sie die Membran in chemilumineszierendem HRP-Substrat, das hergestellt wurde, indem Sie 1 mL HRP-Substratperoxidlösung mit 1 mL HRP-Substrat Luminol-Reagenz (beide Reagenzien stammen aus dem Chemilumineszenz-Substrat-Kit) für 2 Minuten mischen.
- Visualisieren Sie die Membran mit einem bildgebenden System.
2. Vorbereitung der Zielzellen
- Kultivieren Sie die Ziel-T-Zellen, BHT-101- und SW-1736-Zellen exponentiell, bis 80 % konfluent in RPMI-Medien sind, ergänzt mit 10 % FBS, 1 % L-Glutamin und 1 % Antibiotika (Penicillin-Streptomycin) in T-75-Kolben.
- Waschen Sie die Zellen nach dem Entfernen des Mediums einmal mit PBS. Inkubieren Sie die Zellen 5 Minuten lang mit 1 ml nicht-enzymatischem Zelldissoziationspuffer, um die adhärenten Zellen zu entfernen. Fügen Sie PBS hinzu, um die Reaktion des nicht-enzymatischen Zelldissoziationspuffers zu stoppen. Schleudern Sie die Zellen 5 Minuten lang bei 135 × g herunter und fügen Sie 5 ml PBS hinzu.
HINWEIS: Hier verwenden wir einen nicht-enzymatischen Zelldissoziationspuffer, um die Integrität des Membranoberflächenproteins zu erhalten. - Zählen Sie die Zellen und säen Sie sie mit 15.000 Zellen/Wells in weißen 96-Well-Mikroplatten aus Polystyrol mit klarem, flachem Boden aus.
3. Herstellung unterschiedlicher Konzentrationen des therapeutischen Antikörpers
- Um diesem Protokoll zu folgen, verwenden Sie Cetuximab (chimärer Anti-EGFR-Antikörper), um EGFR zu binden, und verwenden Sie Bevacizumab (humanisierter Anti-VEGF-A-Antikörper) als Negativkontrolle.
- Bereiten Sie den ADCC-Bioassay-Puffer vor, indem Sie 1,4 ml Serum mit niedrigem IgG-Gehalt in 33,6 ml RPMI-1640 (im Kit enthalten) geben.
- Verwenden Sie ADCC Bioassay Puffer für die Verdünnung von Antikörpern. Bereiten Sie 400 μl jedes Antikörpers in drei verschiedenen Konzentrationen vor: 30 μg/ml, 3 μg/ml und 0,3 μg/ml (3x Konzentration), um die Endkonzentration von 10 μg/ml, 1 μg/ml und 0,1 μg/ml für eine Breitbandabdeckung zu erhalten und die optimale Dosis zu ermitteln.
HINWEIS: Die endgültigen Antikörperkonzentrationen basieren auf 25 μl kultivierten Zielzellen, 25 μl Effektorzellen und 25 μl Antikörper in jeder Vertiefung einer 96-Well-Platte.
4. Vorbereitung der Effektorzellen
- Lagern Sie die Effektorzellen vor Gebrauch bei -80 °C.
- Heizen Sie den ADCC Bioassay Puffer vor der Verwendung mindestens 30 min in einem 37 °C warmen Wasserbad vor.
- Tauen Sie die ADCC Bioassay Effektorzellen aus einer kalten Lagerung von -80 °C auf, indem Sie sie in ein 37 °C warmes Wasserbad legen (ca. 2-3 min). Schütteln Sie das Fläschchen vorsichtig und inspizieren Sie es visuell, aber drehen Sie es während des Auftauvorgangs nicht um.
- Übertragen Sie 630 μl Effektorzellen in ein 15-ml-Röhrchen mit 3,6 ml ADCC-Assay-Puffer. Gut mischen, indem Sie das Röhrchen 2x vorsichtig umdrehen.
5. Inkubation von Effektorzellen mit Antikörper- und Zielzellen
- Nach der Inkubation über Nacht entfernen Sie das Medium aus den Zielzellen (15.000 Krebszellen pro Vertiefung) und fügen Sie 25 μl des ADCC-Bioassay-Puffers und 25 μl Cetuximab (EGFR-Antagonist) und Bevacizumab (VEGF-Antagonist) hinzu, um die Endkonzentration von 0,1 μg/ml, 1 μg/ml oder 10 μg/ml der Zielzellen in jeder Vertiefung gemäß Abbildung 2 zu erhalten.
- Geben Sie 75.000 Effektorzellen in 25 μl ADCC-Bioassay-Puffer pro Well in die 96-Well-Mikroplatte mit den Zielzellen. Die Vertiefungen, die als No mAb gekennzeichnet sind, fungieren als No-Antikörper-Kontrolle (Abbildung 2).
- Geben Sie ADCC Bioassay-Puffer in die als AB gekennzeichneten Vertiefungen (ADCC Bioassay-Puffer) zur Blindkontrolle.
- Inkubieren Sie die Platte 6 Stunden lang.
6. Quantitative Auslesung der ADCC-Aktivität
- Bereiten Sie das Luciferase-Assay-Reagenz 4 h vor der Messung vor, indem Sie Luciferase Assay-Puffer zum Luciferase-Assay-Substrat (lyophilisiert) hinzufügen.
- Nach 6 Stunden Inkubation von Zielzellen, Antikörpern und Effektorzellen geben Sie 75 μl des Luciferase-Assay-Reagenzes in jede Vertiefung und inkubieren Sie 30 Minuten lang.
- Messen Sie nach der Inkubationszeit das Lumineszenzsignal in jeder Vertiefung mit einem Luminometer, das eine quantitative Anzeige der ADCC-Aktivität liefert.
- Berechnen Sie für die Datenanalyse die Faltinduktion wie folgt:
Falteninduktion = RLU (Antikörper-induziert - Hintergrund) / RLU (keine Antikörperkontrolle - Hintergrund).
Wobei RLU die relative Lumineszenzeinheit ist; Antikörper-induziert sind die Vertiefungen B3 bis B8 und C3 bis C8; Keine Antikörperkontrolle = B2 und C2; Hintergrund = Durchschnittliche RLU von Vertiefung A2 bis A5 (Abbildung 2).
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Ergebnisse
Die Expression von EGFR und VEGFR in den Zielzellen BHT-101 und SW-1736 wurde mittels Western Blot nachgewiesen. Sowohl in BHT-101- als auch in SW-1736-Zellen wurde eine EGFR-Expression nachgewiesen, nicht jedoch eine VEGFR-Expression (Abbildung 3).
Mit dem ADCC-Bioassay-Kit konnten wir die ADCC-Reaktion des Anti-EGFR-Antikörpers Cetuximab unter Verwendung der EGFR-positiven Zelllinien BHT-101 und SW-1736 als Zielzellen nachweisen. Bevacizumab, ein VEGF-Inaktivato...
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Diskussion
In dieser Arbeit haben wir die ADCC Bioassay-Methode zur Beurteilung der ADCC-Reaktion eines therapeutischen Antikörpers vorgestellt. Die Methode ist unkompliziert und verwendet ein einfaches "Add-Mix-Read"-Format für die Messung.
Vor der Durchführung des Experiments muss die Expression des Zielantigens in den Zielzellen entweder durch Durchflusszytometrie oder Western Blot bestätigt werden. Die Durchflusszytometrie ist ein besseres Werkzeug zum Nachweis des ...
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Offenlegungen
Alle Autoren erklären, dass keine Interessenkonflikte bestehen.
Danksagungen
Wir danken Prof. Zeng (IMCB, A*STAR) für die Unterstützung dieser Arbeit. Diese Studie wurde von der Youth Foundation der National Natural Science Foundation of China (NSFC) (82202231) und dem Medical and Health Science and Technology Project der Provinz Zhejiang, China (2021KY110,2024KY824) unterstützt.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 0,5 % Trypsin-EDTA | Gibco | 15400-054 | 10x in PBS verdünnen, um 0,05 % Trypsin herzustellen |
| 1x Tris-Puffer Kochsalzlösung (TBS) | 1. BASE | BUF-3030-1X1L | Für die Membranwäsche im Western Blotting |
| 1,5 M Tris-Puffer, pH 8,8 | 1. BASE | BUF-1419-1L-pH8,8 | Für die Herstellung von SDS-Gel |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma Aldrich | M7522-100ML | Für die Probenvorbereitung von Western Blotting |
| 30% Acrylamid/Bis-Lösung | Bio-Rad | #1610158 | Für die SDS-Gelvorbereitung |
| 4x Laemmli Buffer | Bio-Rad | #1610747 | Für die Probenvorbereitung von Western Blotting |
| 96-Well-Mikroplatten aus weißem Polystyrol mit klarem flachem Boden | Corning Incorporated | 3610 | Für ADCC-Assays |
| ADCC Bioassay Effektorzellen (0,65 mL) | Promega | G7011 | Enthält im ADCC-Reporter-Bioassay-Core-Kit (Promega G7010), 1 x 1 Fläschchen |
| ADCC-Reporter-Bioassay-Core-Kit | Promega | G7010 | Erwähnt als ADCC-Bioassay-Kit für ADCC-Assay in diesem Experiment |
| Ammoniumpersulfat | Sigma Aldrich | A3678-25G | Für die SDS-Gelherstellung |
| Bevacizumab (humanisierter Anti-VEGF-Antikörper) | MVASI-Verwendung | als Negativkontrollantikörper in ADCC-Asssay | |
| BHT-101 | Leibniz-Institut DSMZ | ACC279 | Humane anaplastische papilläre Schilddrüsenkrebszelllinie |
| Bio-Glo Luciferase Assay Puffer | Promega | G7941 | Enthält im ADCC Reporter Bioassay Core Kit (Promega G7010), 1 x 10 mL |
| Bio-Glo Luciferase Assay Substrat (lyophilisiert) | Promega | G7941 | Enthält im ADCC Reporter Bioassay Core Kit (Promega G7010), 1 x 1 Fläschchen |
| Zellschaber | GenFollower GD00235 | Zur Entnahme von Zellen aus Kulturflasche | |
| Cetuximab (chimärer Anti-EGFR-Antikörper) | ERBITUX-Verwendung | als therapeutischer Antikörper im ADCC-Assay | |
| Chemilumineszierendes HRP-Substrat | Merck Millipore | WBKLS0500 | Für den Proteinnachweis in Western Blotting |
| Destilliertes Wasser | Gibco | 15230-162 | Für die Herstellung von SDS-Gel |
| Fötales Rinderserum (FBS) | Gibco | 10270-106 | Nährmedienergänzung |
| iBright CL1500 Bildgebungssystem | Thermo Scientific | 2462621100038 | Für den Proteinnachweis in Western-Blotting-L-Glutamin |
| , 200 mM | Gibco | 25030-081 | Nahrungsergänzungsmittel für Nährmedien |
| Serum mit niedrigem IgG-Gehalt | Promega | G7110 | Enthält im ADCC-Reporter-Bioassay-Core-Kit (Promega G7010) 1 x 4 mL |
| Megafuge 8R | Thermo Scientific | 42876589 | Zentrifuge |
| Maus monoklonale Anti-EGFR-Antikörper | BD Biosciences | 610016 | Primärer Antikörper im Western Blotting |
| Monoklonale Anti-VEGFR-Antikörper der Maus | BD Biosciences | 571194 | Primärer Antikörper im Western Blotting |
| nicht-enzymatischer Zelldissoziationspuffer | Sigma Aldrich | C5789-100ML | Für die Zellentnahme aus dem T75-Kolben |
| Penicillin-Streptomycin | PAN Biotech | P06-07100 | Antibakteriell für Nährmedien |
| Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS), pH 7,2, steril filtriert | 1. BASE | CUS-2048-1x1L | Verwendung als Waschlösung für Zellen |
| Pierce BCA Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 | Zur Messung der Proteinkonzentration |
| Protease- und Phosphatasehemmer | Thermo Scientific | A32959 | Für den Proteinaufschluss in der Probenvorbereitung für Western Blotting |
| PVDF Membran (Immobilin-P) | Merck Millipore | IPVH00010 | Für den Proteintransfer beim Western Blotting |
| Kaninchen Anti-Maus IgG, Fcγ HRP-konjugierter Sekundärantikörper | Jackson ImmunoResearch | 315-035-046 | Sekundärantikörper im Western Blotting |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI) Medium | Capricorn Scientific | RPMI-XA | Zellkulturmedien |
| RPMI-1640 | Promega | G7080 | Enthält im ADCC-Reporter-Bioassay-Core-Kit (Promega G7010), 1 x 36 mL |
| Magermilchpulver | Merck Millipore | 70166-500G | Zur Membranblockierung beim Western Blotting |
| Natriumdodecylsulfat | 1. BASE | BIO-2050-500g | Für die Herstellung von SDS-Gel |
| SW-1736 | Cytion | 300453 | Plattenepithelkarzinom des menschlichen Schilddrüsenkrebses Zelllinie |
| T75 Kulturflaschen | SPL Lifesciences | 70075 | Zellkulturflasche |
| Tecan Multimode Reader Modell Spark 10M | Tecan | 1607000294 | für Luminizenz-Quantifizierung |
| TEMED | Bio-Rad | #1610801 | Für die Herstellung von SDS-Gelen |
| Tween-20 | Promega | H5151 | Für die Membranwäsche im Western Blotting |
| Vi-cell XR Zellviabilitätsanalysator | Beckman Coulter | AL15072 | Zellzähler |
Referenzen
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