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Methodenartikel

In-vitro-Modell, das die Steifigkeit und den Fluss des Substrats integriert, um die Reaktionen von Endothelzellen zu untersuchen

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DOI:

10.3791/67081

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19. Juli 2024

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1Chemical Engineering Department, Northeastern University, 2Bioengineering Department, Northeastern University, 3Laboratoire de BioMécanique et BioIngénierie (BMBI), UMR CNRS, Sorbonne Universités, Université de Technologie of Compiègne (UTC), 4Harvard John A. Paulson School of Engineering and Applied Sciences, Harvard University, 5Neuroscience Department, Albert Einstein College of Medicine

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Wir synthetisierten und charakterisierten ein abstimmbares gelatinebasiertes Substrat für die Kultivierung von vaskulären Endothelzellen (ECs) unter relevanten vaskulären Flussbedingungen. Diese biomimetische Oberfläche repliziert sowohl physiologische als auch pathologische Zustände und ermöglicht so die Untersuchung mechanischer Kräfte auf das EC-Verhalten und erweitert unser Verständnis der vaskulären Gesundheit und der Krankheitsmechanismen.

Zusammenfassung

Wir stellen ein innovatives in vitro-Modell vor, das darauf abzielt, die kombinierten Auswirkungen von Gewebesteifigkeit und Scherspannung auf die Funktion von Endothelzellen (EC) zu untersuchen, die für das Verständnis der Gefäßgesundheit und des Auftretens von Krankheiten wie Atherosklerose entscheidend sind. Traditionell haben Studien die Auswirkungen von Scherspannung und Substratsteifigkeit auf ECs unabhängig voneinander untersucht. Dieses integrierte System kombiniert jedoch diese Faktoren, um eine genauere Simulation der mechanischen Umgebung des Gefäßsystems zu ermöglichen. Ziel ist es, die EC-Mechanotransduktion über verschiedene Gewebesteifigkeitsstufen und Strömungsbedingungen mit Hilfe von humanen ECs zu untersuchen. Wir beschreiben das Protokoll für die Synthese von Gelatinemethacrylat (GelMA)-Hydrogelen mit einstellbarer Steifigkeit und deren Aussaat mit ECs, um eine Konfluenz zu erreichen. Darüber hinaus beschreiben wir den Entwurf und die Montage einer kostengünstigen Strömungskammer, ergänzt durch numerische Strömungssimulationen, um physiologische Strömungsbedingungen zu erzeugen, die durch laminare Strömung und geeignete Scherspannungsniveaus gekennzeichnet sind. Das Protokoll enthält auch eine Fluoreszenzmarkierung für die konfokale Mikroskopie, die die Beurteilung der EC-Reaktionen sowohl auf die Gewebecompliance als auch auf die Flussbedingungen ermöglicht. Indem kultivierte ECs mehreren integrierten mechanischen Stimuli ausgesetzt werden, ermöglicht dieses Modell umfassende Untersuchungen, wie Faktoren wie Bluthochdruck und Alterung die EC-Funktion und EC-vermittelte Gefäßerkrankungen beeinflussen können. Die Erkenntnisse aus diesen Untersuchungen werden dazu beitragen, die Mechanismen, die Gefäßerkrankungen zugrunde liegen, aufzuklären und effektive Behandlungsstrategien zu entwickeln.

Einleitung

Das Endothel, das die innere Oberfläche der Blutgefäße auskleidet, spielt eine entscheidende Rolle bei der Aufrechterhaltung der Gefäßgesundheit. Endothelzellen (ECs) sind von zentraler Bedeutung für die Regulierung verschiedener kardiovaskulärer Funktionen, einschließlich der Kontrolle des Gefäßtonus, der selektiven Permeabilität, der Blutstillung und der Mechanotransduktion 1,2. Die Forschung hat die EC-Dysfunktion fest mit einer primären Rolle bei der Entstehung von Atherosklerose in Verbindung gebracht. Bemerkenswert ist, dass ECs an den Grenzflächen, an denen sie mit dem Blutfluss und dem darunter liegenden Gefäßgewebe interagieren, auf verschiedene mechanische Kräfte treffen 3,4. Mehrere Studien haben eine EC-Dysfunktion mit abnormalen Veränderungen mechanischer Faktoren in der vaskulären Umgebung in Verbindung gebracht, wie z. B. der Scherspannung des Fluids durch den Blutfluss und der Gewebesteifigkeit 5,6,7.

Frühere Forschungen haben jedoch nur begrenzte Aufmerksamkeit erhalten, um die kombinierten Auswirkungen von Gewebesteifigkeit und Scherspannung auf die EC-Funktion zu verstehen. Um die Fähigkeit zu verbessern, Forschungsergebnisse in wirksame Behandlungen für Atherosklerose und andere Herz-Kreislauf-Erkrankungen umzusetzen, ist es unerlässlich, die in diesem Bereich verwendeten zellulären Modelle zu verbessern. Bedeutende Fortschritte wurden bei der Humanisierung zellulärer Modelle erzielt, indem menschliche ECs verwendet und sie entweder Scherspannungen oder Substraten mit unterschiedlichen Steifigkeitsgraden ausgesetzt wurden 8,9,10. Die Einführung und Verfeinerung zellulärer Modelle, die dynamische Strömungsumgebungen mit EC-Substraten mit einstellbaren Steifigkeitseigenschaften integrieren, ist jedoch nur langsam vorangeschritten. Die Herausforderung besteht darin, nicht quellende EC-Substrate zu entwickeln, um Veränderungen der Fließparameter innerhalb des Strömungskanals zu verhindern und gleichzeitig die Kultivierung intakter und gut haftender EC-Monoschichten zu erleichtern. Ein In-vitro-Modell, das in der Lage ist, diese Hindernisse zu überwinden, könnte effektivere Untersuchungen darüber ermöglichen, wie Bluthochdruck, Alterung und Flussbedingungen gemeinsam die EC-Mechanotransduktion, die Gefäßgesundheit und letztendlich die Entwicklung von Atherosklerose beeinflussen. Es wurden verschiedene Methoden entwickelt, um Scherspannungen auf Zellen anzuwenden und gleichzeitig die Substratsteifigkeit zu kontrollieren, darunter rotierende Platten und mikrofluidische Geräte. Bei der Drehplattenmethode werden Zellen zwischen zwei Platten platziert und durch die Rotationsbewegung der Platten eine Schubspannung aufgebracht. Diese Methode ist weniger kompliziert und bietet ein schnelles Modell. Es leidet jedoch unter einer Variation der räumlichen Schubspannung, mit null Schubspannung in der Mitte und maximaler Schubspannung an der Peripherie11.

Auf der anderen Seite stellen mikrofluidische Geräte die neue Generation von Werkzeugen dar, die in der Lage sind, die Steifigkeit des Substrats und die Fließbedingungen zu steuern. Diese Systeme eignen sich zur Nachahmung von Mikrogefäßen unter laminaren Strömungsbedingungen. Die Untersuchung der Atherosklerose mit solchen Geräten ist jedoch unpraktisch, da Atherosklerose in großen Gefäßen mit gestörter Strömung auftritt11. Ziel dieser Arbeit ist es, einen Beitrag zum kritischen Forschungsbereich der EC-Studien zu leisten, indem ein kostengünstiges System vorgestellt wird, das in der Lage ist, die Auswirkungen unterschiedlicher Steifigkeitsniveaus in EC-Substraten unter verschiedenen Strömungsbedingungen zu untersuchen. Das System integriert Substrate mit unterschiedlichen Steifigkeiten, um pathologische und physiologische Blutgefäße nachzuahmen. Dieses Protokoll beschreibt das Verfahren zur Herstellung von Hydrogelen auf Gelatinebasis ohne Schwellung und Steifigkeitsniveaus von 5 kPa bzw. 10 kPa, die die physiologische bzw. pathologische Steifigkeit darstellen. Zusätzlich wird der Aufbau einer Parallelplatten-Strömungskammer detailliert beschrieben, die in der Lage ist, diese Substrate zu integrieren. Computational Fluid Dynamics (CFD) wurde eingesetzt, um die Scherspannung und die Strömungsbedingungen zu bewerten. Die Vorbereitung von Hydrogelen für die EC-Kultur und die Durchführung eines 6-stündigen Strömungsexperiments werden beschrieben, gefolgt von einer Diskussion über die Immunfärbung nach dem Experiment.

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Protokoll

1. Synthese von GelMA

  1. Bereiten Sie eine 0,2 M Lösung wasserfreies Natriumcarbonat und eine 0,2 M Lösung Natriumbicarbonat vor.
  2. Mischen Sie 46 mL Natriumbicarbonatlösung mit 15 mL Natriumcarbonatlösung und fügen Sie 139 mL deionisiertes (DI) Wasser hinzu. Stellen Sie den pH-Wert bei Bedarf mit 0,1 M NaOH und HCl auf 9,5 ein.
  3. 10 g Gelatine vom Typ A mit 300 Blüten aus Schweinehaut werden mit 100 ml Karbonat-Bicarbonat-Puffer in einer Konzentration von 10 % w/v zugesetzt.
  4. Die Gelatine im 55 °C warmen Wasserbad auflösen, während die Lösung mit einem Magnetrührer bei 700 U/min gerührt wird. Sobald sie vollständig aufgelöst ist, stellen Sie den pH-Wert der Gelatinelösung mit 0,1 M NaOH auf 9,5 ein.
  5. Um die Methacrylierung einzuleiten, geben Sie 938 μl Methacrylanhydrid (MAH) tropfenweise in die Lösung. Verbessern Sie die anfängliche Verteilung von MAH in der Gelatinelösung, indem Sie es an verschiedenen Stellen injizieren, einschließlich unterschiedlicher Tiefen und radialer Abstände vom Zentrum.
  6. Wickeln Sie das Reaktionsgefäß in Alufolie ein, um Lichteinwirkung zu vermeiden. Halten Sie die Temperatur bei 55 °C und rühren Sie die Lösung 1 h lang bei 500 U/min, um die Reaktion abzuschließen (Abbildung 1A)12.
    HINWEIS: Die Reaktion stoppt bei einem pH-Wert unter 7,4.
  7. Ein 2-Liter-Becherglas mit 1,8 l Aceton und ein 0,6-Liter-Becherglas mit 0,3 l Aceton werden vorbereitet.
  8. Die resultierende GelMA-Lösung wird tropfenweise in das 2-Liter-Becherglas gegeben, während sie bei 200 U/min gerührt wird, um eine Ausfällung zu induzieren13. Um die Sammlung des gefällten Produkts zu maximieren, platzieren Sie einen Edelstahlstab oder Spatel als Keimbildungsstelle, um die Übertragung zu erleichtern.
  9. Übertragen Sie das Produkt aus dem größeren Becherglas in das kleinere und lassen Sie es 10 Minuten ruhen, bevor Sie mit dem Trocknungsschritt fortfahren. Das gefällte GelMA sollte als weiße Fasern erscheinen.
  10. Sammeln Sie das Produkt auf saugfähigem Papier, trocknen Sie es in einem Vakuumofen bei Raumtemperatur (RT) und lagern Sie es bis zur weiteren Verwendung bei -20 °C.
    HINWEIS: Weitere Einzelheiten zur chemischen Charakterisierung des Produkts mittels protonischer Kernspinresonanz (1H NMR) finden Sie in einer zuvor veröffentlichten Arbeit8.

2. Versalzung von Glas

HINWEIS: Das Anbringen von Hydrogelen an Objektträgern sorgt für eine flache und ebene Oberfläche, die die Handhabung erleichtert und die Stabilität bei strömungsbedingter Scherbelastung gewährleistet. Die Funktionalisierung des Glases mit 3-(trimethoxysilyl)propylmethacrylat ist notwendig, um die Oberflächeneigenschaften zu verbessern und die kovalente Bindung von Hydrogelen während des Polymerisationsprozesses zu ermöglichen.

  1. Schneiden Sie einfache Objektträger (1 mm Dicke) mit einem Glasschneider präzise in Stücke, die den endgültigen Hydrogelabmessungen ähneln. Waschen Sie die geschnittenen Objektträger mit Seife, um Oberflächenverunreinigungen und Ablagerungen zu entfernen, die die Behandlung der Glasoberfläche behindern könnten.
    HINWEIS: Falls erforderlich, beschallen Sie die Objektträger 5 Minuten lang in Ethanol und trocknen Sie sie dann an der Luft.
  2. Eine 0,5%ige Lösung von 3-(Trimethoxysilyl)propylmethacrylat in absolutem Ethanol herstellen. Bereiten Sie eine 10%ige Eisessiglösung in VE-Wasser vor. Mischen Sie die Lösungen, um eine Endkonzentration von 3 % Eisessig zu erreichen.
    HINWEIS: Die Eisessiglösung kann in großen Mengen zubereitet und gelagert werden.
  3. Ordnen Sie die Objektträger in einem Glasbehälter an, um sicherzustellen, dass die Glasflächen nicht blockiert werden. Gießen Sie die resultierende Lösung über die Objektträger und bewahren Sie sie etwa 5 Minuten lang auf einer Wippe bei 80 U/min auf, damit die Reaktion abgeschlossen ist. Stellen Sie sicher, dass beide Seiten der Objektträger modifiziert sind, indem Sie alle eingeschlossenen Luftblasen entfernen.
  4. Nachdem die Reaktion abgeschlossen ist, aspirieren Sie die Lösung und waschen Sie die Objektträger 2x mit Ethanol. Trocknen Sie die Dias an der Luft und lagern Sie sie im Dunkeln bei RT.
    HINWEIS: Die Objektträger behalten ihre Modifikation unter diesen Bedingungen 1 Monat lang.

3. Hydrogel-Vorbereitung

  1. Herstellung von Hydrogelen unter Verwendung eines Redox-induzierten Polymerisationsverfahrens für freie Radikale.
    1. Montieren Sie zweiteilige Formen aus Polytetrafluorethylen (PTFE) mit einer geeigneten Tiefe und Öffnungsfenstern von 10 mm2 , um das endgültige Substrat zu formen. Berücksichtigen Sie eine 25%ige Schrumpfung der Höhe des Hydrogels nach der Polymerisation während des Designprozesses. Stellen Sie sicher, dass die Formen flach und an der unteren und oberen Platte fest befestigt sind, um ein Auslaufen zu verhindern.
      HINWEIS: Die entworfenen Formabmessungen sind absichtlich 10 % größer als die vorgesehene Hydrogelgröße. Dieses Design dient mehreren Zwecken: Es verhindert Schäden an den Seiten bei der Formtrennung, verbessert die Oberflächenebenheit des Hydrogels, indem es Verunreinigungen oder Blasen an die Seiten drückt, und kompensiert die erwartete Schrumpfung von 25 % nach der Äquilibrierung aufgrund des Synäreseeffekts, bei dem hochvernetzte Hydrogele nach der Äquilibrierung Wasser abstoßen, was zu einer Schrumpfung führt. Die Schrumpfungsmenge ist im Protokoll8 festgelegt.
    2. Um sicherzustellen, dass Hydrogele eine gleichmäßige Oberfläche und eine konstante Höhe haben, hängen Sie modifizierte Objektträger an die obere Platte der Form, um eine schmale Öffnung zum Einspritzen der Polymerlösung zu ermöglichen. Verwenden Sie ein Deckglas, um die modifizierten Objektträger aufzuhängen (Abbildung 1B).
    3. Um das Deckglas herzustellen, schneiden Sie einfaches mikroskopisch kleines Glas 20 % größer als die Form. Befestigen Sie zwei Abstandshalter an den kürzeren Seiten. Berechnen Sie die Dicke des Abstandhalters wie folgt:
      Dicke des Abstandhalters = 1,33 x endgültige Geldicke + 1 (Dicke des modifizierten Glases) - Tiefe der Form
    4. Tragen Sie eine dünne Schicht zellverträgliches Dichtfett auf die längeren Seiten des Deckglases auf, und zwar auf der gleichen Fläche, an der die Abstandhalter angebracht sind.
    5. Befestigen Sie den modifizierten Glasschieber am Deckglas zwischen den beiden Abstandshaltern.
    6. Platzieren Sie das Deckglas so auf der Form, dass die Abstandshalter auf der Form sitzen und das modifizierte Glas in die Form hineinragt. Dieser Aufbau bietet einen Abstand von 1,33 der Höhe des endgültigen Hydrogels zwischen dem modifizierten Glas und dem Boden der Form.
    7. GelMA in DI-Wasser mit 4 % w/v für 5 kPa bzw. 10 kPa Hydrogele auflösen und in ein 45 °C warmes Wasserbad legen.
      HINWEIS: GelMA ist ein wärmeempfindliches Polymer und die Aufrechterhaltung der Lösungstemperatur bei 45 °C verhindert eine Verfestigung vor der Polymerisation und reduziert die Viskosität der Lösung, was für die Herstellung von flachen Hydrogelen von entscheidender Bedeutung ist.
    8. TEMED (24 mM für 5 kPA Hydrogel, 6,25 mM für 10 kPa Hydrogel) zur Polymerlösung geben und gründlich mischen.
      HINWEIS: TEMED allein leitet die Polymerisation nicht ein, stellen Sie also sicher, dass Formen, Pipetten und Lösungen vorbereitet sind, bevor Sie fortfahren.
    9. APS (24 mM für 5 kPA Hydrogel, 24,5 mM für 10 kPa Hydrogel) zur GelMA-Lösung geben und gründlich mischen.
      HINWEIS: Die Zugabe von APS leitet die Polymerisation ein, und Hydrogele können sich schnell bilden, was ein sofortiges Handeln erfordert, um defekte Hydrogele zu verhindern. Weitere Details zu Steifigkeitsmessungen finden sich in einer bereits veröffentlichten Arbeit8.
    10. Pipettieren Sie die resultierende Lösung vorsichtig in die Öffnung zwischen dem aufgehängten Objektträger und der Form bei RT und lassen Sie sie vernetzen. Die Kapillarkraft treibt die Polymerlösung in die Form. Vermeiden Sie das Hinzufügen von Blasen zu den Gelen und beenden Sie das Pipettieren, wenn eine kleine Menge Lösung in der Pipettenspitze verbleibt.
      HINWEIS: Während der Polymerisation reagieren Methacrylatgruppen von GelMA mit Methacrylatrückständen auf den modifizierten Objektträgern, was zu einer chemischen Bindung des Hydrogels an das Glas führt.
    11. Nach 15 Minuten ist die Reaktion abgeschlossen. Lösen Sie das Substrat mit einem scharfen Gegenstand, z. B. einer Nadel, von der Form und schieben Sie das Substrat vom Deckglas weg, um es zu trennen.
    12. Übertragen Sie die Hydrogele in eine 1x phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) in eine 100 mm Petrischale, die mit einer Plastikfolie verschlossen ist, und äquilibrieren Sie bei 37 °C, um verbleibende Reaktanten und Nebenprodukte zu entfernen.
    13. Da das Hydrogel etwas größer ist als die endgültigen Abmessungen, schneiden Sie überschüssiges Gel an den Seiten so ab, dass es den für das Durchflusskammerfenster erforderlichen Abmessungen entspricht.
    14. Verwenden Sie die Durchflusskammer, um die Abmessungen des Hydrogels zu überprüfen. Stellen Sie sicher, dass das Hydrogel richtig in die Strömungskammer passt, ohne Lücken zwischen dem Hydrogel und der Form oder ohne Defekte, die die Fließmuster beeinträchtigen könnten. Wenn es Formunregelmäßigkeiten gibt, die das Strömungsmuster in der Flusskammer beeinflussen und zu ungünstigem Zellverhalten führen können, bewahren Sie das Hydrogel für statische Bedingungen auf.
    15. Geben Sie vier Hydrogele zur Sterilisation in eine Petrischale, die 1x PBS enthält.
  2. Sterilisieren Sie das Hydrogel wie unten beschrieben mit 70% Ethanol.
    1. Bereiten Sie Lösungen mit 25 %, 50 % und 70 % Alkohol für eine allmähliche Hydrogel-Dehydrierung vor.
      HINWEIS: Wenn keine allmähliche Dehydrierung durchgeführt wird, können steifere Hydrogele schrumpfen und brechen, während sich auf der Oberfläche weicherer Hydrogele Falten bilden können.
    2. Aspirieren Sie die 1x PBS-Lösung aus der Petrischale, die Hydrogele enthält. Geben Sie 25%ige Ethanollösung in jede Petrischale, um die 5 kPa und 10 kPa Hydrogele 15 Minuten lang einzutauchen.
    3. Aspirieren Sie die 25%ige Alkohollösung. Geben Sie 50%ige Alkohollösung in jede Petrischale, um die 5 kPa und 10 kPa Hydrogele 15 Minuten lang einzutauchen.
    4. Aspirieren Sie die 50%ige Alkohollösung. Geben Sie 70%ige Alkohollösung in jede Petrischale und tauchen Sie die 5 kPa- und 10 kPa-Hydrogele 5 Minuten lang ein. Stellen Sie die Petrischale bei 100 U/min auf einen Shaker.
    5. Lassen Sie die 5 kPa Hydrogele 40 min und die 10 kPa Hydrogele 20 min lang unter Wasser.
      HINWEIS: Es wurde beobachtet, dass die 5-kPa-Hydrogele im Vergleich zu 10-kPa-Hydrogelen anfälliger für Verunreinigungen sind.
    6. Übertragen Sie die Proben auf eine 6-Well-Platte in einer Biosicherheitswerkbank und waschen Sie die Hydrogele 2x-3x mit sterilem PBS.

4. Beschichtung von Hydrogelen

  1. Bereiten Sie eine 60 μg/ml Gelatinelösung vor, indem Sie 3 mg Gelatine in 50 ml sterilem PBS (1x mit Magnesium- und Calciumsalz) auflösen. Die Lösung in einem Wasserbad bei 37 °C für 30 min erhitzen oder bis sich die gesamte Gelatine vollständig aufgelöst hat.
  2. Sterilfiltrieren Sie die Beschichtungslösung mit einem 0,2 μm Spritzenvorsatzfilter. Aspirieren Sie die 1x PBS-Lösung aus jeder Vertiefungsplatte und fügen Sie Gelatinelösung zu jeder Vertiefung hinzu, um eine vollständige Abdeckung jedes Hydrogels zu gewährleisten. Um das Risiko einer Kontamination zu minimieren, geben Sie 40 Einheiten/ml Penicillin und 10 μg/ml Streptomycin in die Beschichtungslösung.
  3. Inkubieren Sie jede Well-Platte 45 Minuten lang in einem 37 °Cund 5 % CO 2 -Inkubator. Waschen Sie die Hydrogele mit 1x PBS-Lösung.
  4. PBS aspirieren und Zellkulturmedien hinzufügen.
  5. Bewahren Sie die Hydrogele nicht länger als zwei Tage in Zellkulturmedien auf und inkubieren Sie sie in einem 37 °C, 5 % CO2 -Inkubator bis zur Aussaat der Zellen.
    HINWEIS: Trotz der hervorragenden Zelladhäsionseigenschaften von Fibronektin gibt es Bedenken hinsichtlich seiner Verwendung, da ECs endogenes Fibronektin unter atherosklerotischen Bedingungen ablagern, was zu einer proinflammatorischen Reaktion führen kann. Um chemisch stimulierte Zellreaktionen zu vermeiden, verzichten wir auf den Einsatz von Fibronektin. Darüber hinaus zeigten Orr et al., dass die Fibronektin-Beschichtung im Vergleich zur Kollagen-I-Beschichtung atherogene Gene hochreguliert. Insbesondere beobachteten sie erhöhte Expressionsniveaus des interzellulären Adhäsionsmoleküls 1 (ICAM-1), des vaskulären Zelladhäsionsmoleküls 1 (VCAM-1) und des Kernfaktors-κB (NF-κB)14.

5. Aussaat von Zellen auf den Substraten

  1. Bereiten Sie die Zellsuspension gemäß den verfügbaren Ablöseprotokollen vor und zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer8.
  2. Saugen Sie das Medium gründlich aus den Hydrogelen ab. Fügen Sie jeder Probe 50.000 Zellen/cm2 hinzu. Geben Sie jeder Probe ein geeignetes Volumen der Zellsuspension, um einen Zellüberlauf zu verhindern.
    HINWEIS: Steifere Substrate sind hydrophobier; Minimieren Sie daher die Zeit zwischen den Schritten, um die Benetzbarkeit und die Dispersion der Zellsuspension auf der Substratoberfläche zu verbessern.
  3. Inkubieren Sie zellgesäte Hydrogele in einem 37 °C und 5 % CO2 -Inkubator für 2 h. Geben Sie den Proben Zellkulturmedien hinzu, sobald die Zellen an den Gelen befestigt sind.

6. Herstellung der Strömungskammer

HINWEIS: Der Ansatz für die Konstruktion der Durchflusskammer ist kostengünstig und erfordert nur minimales Fachwissen für Herstellung und Verwendung.

  1. Verwenden Sie Polymethylmethacrylat für die Herstellung von Kammern, um die Strömungsqualität, die Integrität des Hydrogels unter Scherbeanspruchung und potenzielle Echtzeit-Biomarkerstudien während der Strömungsexperimente visuell zu beurteilen. Das Kammerdesign wurde mit Hilfe von CAD-Software (Computer Aided Design) erstellt. Die Durchflusskammer wurde zum Patent angemeldet, und Einzelheiten zu diesem Gerät können im vorliegenden Protokoll nicht offengelegt werden.
  2. Rechnerische Bewertung der Strömungsverhältnisse in der Strömungskammer
    1. Montieren Sie die einzelnen Komponenten der geplanten Strömungskammer (. SLDPRT-Dateien), um das endgültige Kammer-Setup zu erstellen.
    2. Zeichnen Sie eine Linie entlang der Mittellinie der Strömung, die tangential zur Hydrogeloberfläche verläuft, um die Scherspannung zu analysieren. Schließen Sie die Einlass- und Auslassöffnungen, um ein geschlossenes Regelvolumen zu definieren.
    3. Öffnen Sie die Strömungssimulation über die Registerkarte Add-Ins in der CAD-Software. Öffnen Sie auf der Registerkarte Strömungssimulation die Funktion Assistent, um die Eigenschaften einzugeben. Geben Sie das Einheitensystem an und stellen Sie den Druck und die Spannungseinheiten auf dyn/cm2 ein.
    4. Überprüfen Sie den Flüssigkeitsfluss und die Schwerkraft in den physikalischen Merkmalen. Stellen Sie die Schwerkraft in der Z-Komponente auf -9,8 ein. X- und Y-Komponenten sollten Null sein.
    5. Wählen Sie Intern als Analysetyp in Geometry Handling. Wählen Sie Wasser als Standardflüssigkeit aus.
      HINWEIS: Gehen Sie davon aus, dass sich das Medium wie Wasser verhält.
    6. Wählen Sie Laminar und Turbulent als Strömungstyp aus. Definieren Sie die Wand als adiabatische Wand und geben Sie die Oberflächenrauheit in Wandzustand ein.
    7. Stellen Sie die Temperatur unter Anfangsbedingungen auf 37,5 °C (310,65 K) ein. Definieren Sie den Rechenbereich in Strömungssimulationsprojekten, und stellen Sie sicher, dass er das gesamte Regelvolumen abdeckt.
    8. Wählen Sie alle Wände aus, die mit dem Fluid verbunden sind, um den Fluid-Teilbereich zu definieren. Legen Sie unter Randbedingung die Innenfläche des Einlassdeckels als Einlassvolumenstrom fest und geben Sie die Durchflussrate (Q) und den gleichmäßigen Durchfluss an. Weisen Sie dann die Innenfläche der Dichtung des Auslassdeckels als statischen Druck zu.
    9. Bestimmen Sie die globale Netzgröße auf der Grundlage der verfügbaren Rechenressourcen. Klicken Sie auf Ausführen , um die Simulation zu starten.
    10. Überprüfen Sie nach Abschluss die gewünschten Ergebnisse, einschließlich Schubspannungsdiagramme und Strömungssimulationen.
    11. Wiederholen Sie die Schritte 6.2.8 bis 6.2.10 mit unterschiedlichen Durchflussraten, um die angewendete Schubspannung mit unterschiedlichen Raten zu berechnen. Verwenden Sie die Regressionsanalyse, um die Beziehung zwischen Durchflussrate und Schubspannung zu ermitteln.
    12. Bewerten Sie die Toleranz des Systems gegenüber Schwankungen der Hydrogelabmessungen, um den Realismus der Simulation zu verbessern.

7. Führen Sie eine gleichmäßige laminare Strömung durch

  1. Nach der Kultivierung der Zellen auf den 5 kPa und 10 kPa Hydrogelen ist die Konfluenz der Zellmonoschicht in einem 37 °C und 5 % CO2 -Inkubator sicherzustellen. Auf jedem Hydrogel sollte eine Monoschicht von Zellen erreicht werden.
  2. Sterilisieren Sie autoklavierbare Komponenten des Parallelplatten-Durchflusskammersystems (Edelstahlschrauben, Spatel, Pinzette, Dichtung und das Medienreservoir) mit einem 30-minütigen Schwerkraft-Autoklavenzyklus. Sterilisieren Sie andere Teile (Acrylkomponenten und Reservoirversiegelung/-dämpfer) unter UV-Lichteinstrahlung.
  3. Montieren Sie das Durchflusskammergerät in einer Biosicherheitswerkbank. Sichern Sie Hydrogelproben im Gerät und sorgen Sie so für Gleichmäßigkeit. Verwenden Sie einen Füllstoff in der gleichen Größe wie die Hydrogele, wenn nicht genügend Proben für den Durchfluss zur Verfügung stehen.
  4. Befeuchten Sie die Innenfläche der Kammer und die Hydrogeloberflächen vor, um die Blasenbildung zu minimieren und ein Austrocknen der Zellen während des Zusammenbaus zu verhindern.
  5. Geben Sie genügend Medien in den Einlassbehälter, so dass 20 % bis 30 % des Mediums nach der Montage in den Auslassbehälter fließen können. Verschließen Sie den Einlassbehälter luftdicht mit einem Dämpfer.
    HINWEIS: Der Druckaufbau im Einlassbehälter treibt den Durchfluss an, und eventuelle Luftlecks verändern die Durchflussraten. Überprüfen Sie, ob die Versiegelung defekt ist, wenn sich Blasen im Außenschlauch bilden.
  6. Stellen Sie die Auslassklappe auf Atmosphärendruck ein, um die Druckdifferenz zu ermitteln. Stellen Sie das Gerät und die Behälter in einen 37 °C, 5 % CO2 -Inkubator. Schließen Sie den Geräteschlauch an eine Schlauchpumpe an, die sich außerhalb des Inkubators befindet (Abbildung 1C).
  7. Schalten Sie die Pumpe ein, um mit der Anwendung von 3,6 dyn/cm2 zu beginnen. Erhöhen Sie die Flussrate schrittweise in Schritten von 2 ml/min (z. B. erreichen Sie 85 mL/min von 65 mL/min nach 10 Minuten), bis Sie ca. 8 dyn/cm2 auftragen.
  8. Erhöhen Sie die Durchflussrate weiter in Schritten von 2,5 ml/min, bis eine Scherspannung von 12 dyn/cm2 erreicht wird.
    HINWEIS: Lassen Sie den Zellen Zeit, sich an die dynamischen Bedingungen anzupassen, da eine schnelle Erhöhung der Durchflussrate Zellen ablösen und die Monoschicht beschädigen kann.
  9. Stoppen Sie nach 6 Stunden den Durchfluss, nehmen Sie das Gerät aus dem Inkubator und zerlegen Sie die Durchflusskammer. Übertragen Sie anschließend die Hydrogelproben auf eine Sechs-Well-Platte.
  10. Waschen Sie die Proben mit eiskaltem PBS und fixieren Sie die Zellen entweder für die Immunfärbung oder lysieren Sie sie für die Proteinisolierung.

8. Immunfärbeaufbau für die konfokale Mikroskopie mit hoher Vergrößerung

HINWEIS: Um die Effizienz der Studie zu erhöhen, wurde eine Methode zur Immunfärbung kleiner Portionen von Hydrogelen entwickelt, die die Untersuchung mehrerer biologischer Ziele in einer einzigen Probe ermöglicht.

  1. Bereiten Sie Biopsiestempel oder bevorzugte Schneidwerkzeuge mit Durchmessern von 3 oder 4 mm vor.
  2. Verwenden Sie eine Pipettenspitzenbox als Färbekammer. Befeuchten Sie die Kammer, um die Verdunstung der Färbelösung während einer längeren Inkubation zu kontrollieren, indem Sie ein feuchtes Papiertuch auf den Boden des Pipettenspitzenkastens legen.
  3. Reduzieren Sie den Antikörperverbrauch, indem Sie kleine Lösungspools für einzelne Proben erstellen. Decken Sie das Tip-Box-Rack mit transparenter Folie ab und drücken Sie die Folie mit einer Fingerspitze vorsichtig gegen die Rack-Löcher, um Grübchen zu bilden. Füllen Sie die Grübchen mit 70 μl PBS.
  4. Übertragen Sie ein einzelnes Hydrogel in eine leere Petrischale und schneiden Sie es mit einem Biopsiestempel oder einem bevorzugten Schneidwerkzeug. Verwenden Sie ein Mikroskop, um einen repräsentativen Probenbereich zu schneiden. Schneiden Sie einen vollen Gelzylinder, um Probleme mit der konfokalen Mikroskopie zu vermeiden.
  5. Legen Sie die geschnittenen Hydrogelproben in die in Schritt 8.3 entstandenen Grübchen. Führen Sie die Färbung gemäß dem Standardprotokoll15 durch. Nach der abschließenden Färbewäsche erhalten Sie eine Silikonkautschukplatte, die der Dicke des Hydrogels entspricht.
    HINWEIS: Verwenden Sie vorzugsweise ein Blatt mit einer klebrigen Seite, um die Versiegelung zu verbessern. In dieser Studie wurden Aktinfasern mit einem fluoreszierenden Sekundärantikörper gefärbt, der in einer Verdünnung von 1:20 an Phalloidin konjugiert war.
  6. Schneiden Sie die Gummiplatte in 15 mm x 15 mm große Quadrate. Stanzen Sie ein 6 mm großes Loch mit einem Biopsiestanzer oder einem bevorzugten Schneidwerkzeug.
  7. Erstellen Sie einen Probenbehälter, indem Sie das Gummi auf ein Mikroskopie-Deckglas (Nr. 1.5) aufkleben. Geben Sie 10 μl nasses Einbettmedium zu den Grübchen, solange die Probe noch vorhanden ist, und inkubieren Sie sie 10-15 Minuten lang im Dunkeln.
    HINWEIS: Für diese Studie enthielt das Einbettmedium 0,9 μg/ml 4',6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI), um das Färbeprotokoll zu verkürzen.
  8. Nehmen Sie die Probe aus der Färbekammer und legen Sie sie in das in Schritt 8.7 erstellte Gefäß. Tragen Sie 1-2 μl Eindeckmedium auf die Probe auf.
    HINWEIS: Die Menge des Einbettmediums wirkt sich auf die Bildqualität bei hohen Vergrößerungen aus. Übermäßige oder unzureichende Einhängemedien können die Bildschärfe beeinträchtigen.
  9. Positionieren Sie ein weiteres Deckglas darauf und drücken Sie vorsichtig, um sicherzustellen, dass die Probe das Glas berührt. Lagern Sie die Proben bei 4 °C im Dunkeln bis zur Mikroskopie-Bildgebung.

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Ergebnisse

Abbildung 1 zeigt den Versuchsaufbau und skizziert den Prozess der GelMA-Synthese durch eine Methacrylationsreaktion. Das resultierende Produkt wurde dann zur Herstellung des Hydrogelsubstrats verwendet, auf das ECs gesät wurden. Anschließend wurden die Zellen für ein 6-stündiges Strömungsexperiment bei 12 dyn/cm2 in die Strömungskammer eingeführt.

1Die H-NMR-Spektroskopie wurde verwendet, um den Erfolg der Methacrylationsreaktion zu beurteil...

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Diskussion

Das Gefäßsystem ist eine dynamische Umgebung, in der verschiedene Kräfte das zelluläre Verhalten maßgeblich beeinflussen. Biologische Vorgänge bei Herz-Kreislauf-Erkrankungen zu untersuchen, ohne diese Kräfte zu berücksichtigen, wäre ungenau. Daher sind zelluläre Modelle, die in der Lage sind, die gefäßmechanische Umgebung nachzuahmen, von entscheidender Bedeutung. Forscher haben bereits erhebliche Fortschritte bei der Aufklärung der Wirkung dieser Kräfte auf das zelluläre Verhalten erzielt11. Um ...

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Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass eine vorläufige Patentanmeldung (Nr. 63/634,853) mit dem Titel Flow Chamber with a Mechanically Tunable Substrate eingereicht wurde und dass keine weiteren konkurrierenden Interessen bestehen.

Danksagungen

Die Autoren danken Robert Egan für seine Hilfe bei der Herstellung der Strömungskammer. Die Autoren danken Lucas McCauley für seine Hilfe während der Experimente. Darüber hinaus möchten sie sich bei den Kerneinrichtungen des Institute for Chemical Imaging of Living Systems (CILS) der Northeastern University für die Gewährung des Zugangs zu konfokalen Mikroskopen bedanken. Die Autoren würdigen die finanzielle Unterstützung durch die National Institutes of Health (NIH 1R01EB027705 für SB) und die National Science Foundation (NSF CAREER Awards: DMR 1847843 to SB und CMMI 1846962 to EE).

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
(Trimethoxysilyl)Propylmethacrylat, Tetramethylethylendiamin (TEMED)Invitrogen15524-010Hydrogel Fabrication
3-(Trimethoxysilyl)PropylmethacrylatSigma-Aldrich440159Glasversalzung
4',6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI)-haltige EindeckmedienVector LaboratoriesH-1200Immunfärbung
AcetonThermo Fisher ScientificsA18-4GelMA Synthese
Alexa Fluor 555 Phalloidin Cell Signaling Technology8953SImmunfärbung
von Ammoniumpersulfat (APS)Bio-Rad1610700Hydrogel Fabrication
Klare kratz- und UV-beständige gegossene Acrylplatte (45/64'')McMaster-CARR8560K165Flow Chamber Fabrication
Konfokales MikroskopCarl Zeiss Meditex AGZeiss LSM 800Immunfärbung
Covidien Monoject Rigid Pack 60 mL Spritzen ohne NadelnFisher   22-031-375Strömungsexperiment
EC-Wachstumskit American Type Culture Collection (ATCC)PCS-100-041Zellkultur-Ethanol
200 Proof DeconLabs2701Glasversalzungsgelatine
Typ A (300 bloom) aus SchweinehautSigma-AldrichG1890GelMA-Synthese
EisessigsäureThermo Fisher Scientifics9526-33Glasversalzung
Hochreines Hochtemperatursilikon GummiplatteMcMaster-Carr87315K74Herstellung der Durchflusskammer
Endothelzellen der menschlichen Nabelvene (HUVEC)American Type Culture Collection (ATCC)PSC-100-010Zellkultur
M3x30mm Maschinenschrauben Sechskantschraube Rundkopfschraube 304 Edelstahl Befestigungsschrauben Schrauben 20 StückUxcellB07Q5RM2TPHerstellung
der DurchflusskammerMasterflex L/S Digital Drive mit Easy-Load® 3 Pumpenköpfe für Präzisionsschläuche; 115/230 VACVWR#MFLX77921-65Strömungsexperiment 
Masterflex L/S Präzisions-Pumpenschlauch, Puri-Flex, L/S 25; 25 ftVWR#MFLX96419-25Strömungsexperiment 
Methacrylanhydrid (MAH)Sigma-Aldrich276685GelMA Synthese
ParaformaldehydThermo Fisher Scientifics043368.9MZellkultur
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)Gibco14080-055Allgemein
NatriumbicarbonatFisher ChemicalS233-3GelMA Synthese
NatriumcarbonatFisher ChemicalS263-500GelMA Synthese
SOLIDWORKS Version für den Bildungsbereich
SOLIDWORKS Student Edition Desktop, 2023SolidWorksN/AFlow Chamber
Design Vascular Basal MediumAmerican Type Culture Collection (ATCC)PCS-100-030Zellkultur

Referenzen

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