Method Article

Isolierung, Charakterisierung und proteomische Analyse von aus Plasma gewonnenen extrazellulären Vesikeln zur Entdeckung kardiovaskulärer Biomarker

DOI:

10.3791/67083

⸱

January 31st, 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cardiology, Angiology and Pulmonology, University Hospital Heidelberg, 2Heart and Vascular Center, Semmelweis University, 3Core Facility for Mass Spectrometry and Proteomics, Centre for Molecular Biology at Heidelberg University (ZMBH), 4German Centre for Cardiovascular Research (DZHK), Partner site Heidelberg/Mannheim

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dieser Artikel beschreibt eine Methodik zur Isolierung, Charakterisierung und Quantifizierung von extrazellulären Vesikeln (EV) aus humanem Plasma und stellt einen Arbeitsablauf für die markierungsfreie Analyse des EV-Proteoms mittels Flüssigchromatographie-Tandem-Massenspektrometrie (LC-MS/MS) vor.

Abstract

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Extrazelluläre Vesikel (EV) sind aus Zellen gewonnene, von Lipiddoppelschichten umschlossene, nicht replizierbare Nanopartikel. EV gewinnt derzeit aufgrund ihrer Rolle bei der Regulierung der interzellulären Kommunikation in der kardiovaskulären Forschung an Aufmerksamkeit und dient möglicherweise als wertvoller Biomarker für Herz-Kreislauf-Erkrankungen. Das EV-Proteom und sein Potenzial als Biomarker in der kardiovaskulären Diagnostik sind jedoch nach wie vor wenig verstanden. Dieses Protokoll stellt eine standardisierte Methode zur Isolierung und Quantifizierung von aus Plasma gewonnenen EV und zur Analyse ihrer Proteinfracht anhand von Plasmaproben von Patienten dar, die sich in der Chest Pain Unit eines großen Universitätsklinikums vorstellen. Nach der routinemäßigen Phlebotomie werden EV durch differentielle Ultrazentrifugation aus dem Plasma isoliert. Die Anreicherung spezifischer EV-Markerproteine in EV-Isolaten wird durch Immunblotting visualisiert, und die durchschnittliche Größenverteilung und die EV-Plasmakonzentrationen werden durch Nanopartikel-Tracking-Analyse quantifiziert. Schließlich wird die Hochleistungsflüssigkeitschromatographie-Tandem-Massenspektrometrie zur markierungsfreien Analyse des EV-Proteoms eingesetzt. Dieses Protokoll bietet somit einen umfassenden Ansatz, um aus Plasma gewonnene EV als potenzielle Träger kritischer biologischer Informationen zu untersuchen und zu nutzen sowie ihr Potenzial als neuartige Biomarker zu erforschen.

Introduction

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Extrazelluläre Vesikel (EV), die nach ihrer Nomenklatur nicht einheitlich definiert sind, sind Nanopartikel, die von einer Lipiddoppelschicht umgeben sind und von verschiedenen Zelltypen freigesetzt werden, denen die Fähigkeit zur Replikation fehlt1. Zu dieser vielfältigen Gruppe gehören Exosomen, eine Subpopulation von EV endosomalen Ursprungs, die typischerweise einen Durchmesser von etwa 40 nm bis 160 nmhaben 2. EVs, die in zahlreichen Körperflüssigkeiten nachgewiesen werdenkönnen 3, erleichtern die interzelluläre Kommunikation, indem sie verschiedene aktive Biomoleküle wie Proteine, mRNA, microRNA und Lipide übertragen. So liefern EV durch zellspezifische Oberflächenmarker und Biomoleküle Informationen über ihre Herkunftszelle, wobei ihre Eigenschaften stark vom Zustand der Elternzelle und ihrer Umgebung beeinflusst werden4. Diese Eigenschaften haben zu einem wachsenden Interesse an der potenziellen Rolle von EV als Biomarker geführt, insbesondere im Zusammenhang mit Herz-Kreislauf-Erkrankungen.

Zahlreiche in vitro und in vivo Studien haben gezeigt, dass myokardialer hypoxischer Stress zu einer erhöhten Freisetzung von EV 5,6,7 führt. Die derzeitige Forschung zu EV-Fracht hat sich weitgehend auf EV-gebundene microRNA konzentriert, die das Potenzial hat, als Biomarker bei der Diagnose verschiedener Herz-Kreislauf-Erkrankungen zu dienen 8,9,10. Im Gegensatz dazu sind die Beweise für das zirkulierende EV-Proteom nach wie vor relativ spärlich, da noch weniger Studien die Plasma-EV bei kardiovaskulären Patienten untersuchen. In zwei umfassenden Studien zu plasmaabgeleiteten EV von Patienten mit Myokardinfarkt identifizierten die Autoren ein spezifisches Ischämie-induziertes EV-Proteomprofil mit potenzieller diagnostischer Relevanz 6,11.

Die methodische Verarbeitung von EV hat sich in der Vergangenheit als herausfordernd erwiesen, und derzeit gibt es keine endgültige Empfehlung für den optimalen Ansatz zur Isolierung, Charakterisierung und Quantifizierung von EV. Zu den häufig verwendeten Methoden zur EV-Isolierung gehören die differentielle Ultrazentrifugation, die Dichtegradientenzentrifugation und Filtrationsmethoden wie die Größenausschlusschromatographie1. Gemäß den aktuellen Konsensusrichtlinien sollte die Charakterisierung von EV-Isolaten den Nachweis von mindestens drei typischen EV-Oberflächenproteinmarkern wie Tetraspaninen oder Annexinen in Kombination mit einer bildgebenden Modalität1 umfassen. Um die EV-Fracht auf Proteinebene zu untersuchen, werden am häufigsten antikörperbasierte Methoden wie Western Blot oder ELISA eingesetzt.

Angesichts der methodischen Herausforderungen, die mit der Isolierung und Verarbeitung von zirkulierendem EV verbunden sind, stellt dieses Protokoll einen umfassenden Weg von der Patientenrekrutierung und Probenentnahme bis zur anschließenden EV-Isolierung, Charakterisierung und Quantifizierung von Plasma-EV-Isolaten dar. Darüber hinaus zeigt diese Studie einen Workflow für die sofortige Isolierung von aus Plasma gewonnenen EV von Patienten, die sich in der Notaufnahme (Chest Pain Unit) eines Tertiärversorgungszentrums im Südwesten Deutschlands vorstellen, gefolgt von der markierungsfreien Analyse des krankheitsspezifischen Plasma-EV-Proteoms mittels Flüssigchromatographie-Tandem-Massenspektrometrie (LC-MS/MS). Ziel ist es, eine Hochdurchsatzanalyse zu ermöglichen, um differentiell angereicherte EV-gebundene Proteine über eine große Kohorte von Patienten mit verschiedenen ischämischen, angeborenen oder (auto-)immunen kardiovaskulären Erkrankungen bei der Erstdiagnose und während des Fortschreitens und/oder Abklingens der Erkrankung zu identifizieren. Dieser proteomische Screening-Ansatz zielt darauf ab, Muster der EV-spezifischen Proteinanreicherung zu identifizieren, die mit unterschiedlichen Krankheitspfaden verbunden sind, mit dem ultimativen Ziel, neuartige EV-gebundene Protein-Biomarker aufzudecken, um die aktuelle Diagnostik und therapeutische Überwachung bei Herz-Kreislauf-Erkrankungen zu verbessern.

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Protocol

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Für dieses Protokoll wurde eine beispielhafte Patientenkohorte rekrutiert, bestehend aus drei gesunden Kontrollpatienten ohne Anzeichen einer offensichtlichen oder zugrunde liegenden kardiovaskulären Erkrankung und zwei Patienten mit nicht-ST-erhöhtem Myokardinfarkt (NSTEMI). Die vorherige Genehmigung wurde durch das Institutional Review Board der Medizinischen Fakultät der Universität Heidelberg erteilt (IRB-Zulassung #S-351/2015), und vor der Rekrutierung wurde von allen Patienten eine schriftliche Einwilligung eingeholt. Die Patienten wurden aus der Abteilung für Brustschmerzen der Klinik für Kardiologie des Universitätsklinikums Heidelberg auf der Grundlage des ersten klinischen Erscheinungsbildes, der Anamnese und der Ergebnisse der diagnostischen Untersuchungen rekrutiert.

Zu den Einschlusskriterien für gesunde Kontrollpatienten gehörten ein atypisches oder unspezifisches klinisches Erscheinungsbild, kardiale Biomarkerwerte innerhalb normaler Grenzen, keine kardiovaskulären Erkrankungen in der Vorgeschichte und normale Befunde bei weiteren diagnostischen Tests. Zu den Ausschlusskriterien gehörten eine Vorgeschichte von Malignitäten oder zytostatischen Therapien innerhalb der letzten fünf Jahre, Hämodialyse, familiäre Hyperlipidämie-Syndrome und jegliche Vorgeschichte von Herz-Kreislauf-Erkrankungen. Die Diagnose NSTEMI erfolgte nach den aktuellen Leitlinien12, wobei die hämodynamisch relevante Koronarstenose durch eine Koronarangiographie bestätigt wurde. Für jeden Patienten wurden bis zu 36 ml Blut aus der Antekubitalvene in Citrat-supplementierte Entnahmeröhrchen über die Standardphlebotomie13 entnommen, und die Blutproben wurden sofort bei 4 °C zur weiteren Verarbeitung transportiert. Einzelheiten zu den in dieser Studie verwendeten Reagenzien und Geräten sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. EV-Isolierung mittels Differenzzentrifugation

HINWEIS: Zur Isolierung von EV aus menschlichen Plasmaproben wurde ein differentielles Zentrifugationsprotokoll verwendet. Es wurden zwei Ultrazentrifugationszyklen (UC) mit zunehmender Zentrifugalkraft durchgeführt, um die Reinheit des resultierenden EV-Granulats zu maximieren.

  1. Plasma-Isolierung
    1. Beginnen Sie mit der Verarbeitung von Vollblutproben, die innerhalb von 120 Minuten nach der Entnahme auf 4 °C gekühlt werden, um die Integrität der Plasma-EV zu gewährleisten. Verwenden Sie mit Citrat ergänzte Blutentnahmeröhrchen (0,106 mol/L Citrat), um eine Gerinnung zu verhindern.
    2. Verdünnen Sie 9 ml citriertes Vollblut 1:1 in eiskalter, phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), um die Viskosität zu verringern. Geben Sie 5 mL Dichtegradientenmedium (1,077 g/ml) zur Trennung während der Zentrifugation hinzu.
    3. Bei 600 × g für 25-30 min bei 4 °C zentrifugieren. Pipettieren Sie die Plasmafraktion vorsichtig von der Oberseite jeder Säule in spezielle Zentrifugationsröhrchen ab. Fahren Sie mit den nächsten Schritten fort oder frieren Sie bei -80 °C ein.
  2. Entfernung von Zelltrümmern und apoptotischen Körpern
    1. Das Plasma wird bei 20.000 × g für 15 min bei 4 °C mit einer Ultrazentrifuge mit festwinkligem Rotor ohne Bremsen zentrifugiert. Am Boden des Röhrchens sollte sich ein sichtbares Kügelchen aus Zelltrümmern und apoptotischen Körpern bilden.
  3. Isolierung von Elektrofahrzeugen
    1. Den Überstand in ein neues Röhrchen umfüllen. Ultrazentrifugieren Sie bei 100.000 × g für 2 h bei 4 °C, ohne zu bremsen, um EV zu isolieren, das ein sichtbares Pellet an der Rohrwand bildet.
    2. Pipettieren Sie den Überstand vorsichtig mit einer elektronischen Pipette ab, wobei etwa 1 ml EV-abgereichertes Plasma übrig bleibt. Wechseln Sie für das restliche Plasma zu einer 1000-μl-Pipette und pipettieren Sie langsam, um das EV-Pellet nicht zu stören. Kippen Sie das Röhrchen während des Pipettierens allmählich, um sicherzustellen, dass kein Plasma im Röhrchen verbleibt.
  4. Vorbereitung für die nachgelagerte Analyse
    1. Resuspendieren Sie das isolierte EV-Pellet gemäß den Anforderungen der nachgelagerten Analyse: Für die Nachverfolgung von Nanopartikeln resuspendieren Sie das EV-Pellet aus 9 ml Vollblut in 200 μl PBS; für LC-MS/MS: resuspendiertes EV, isoliert aus 36 mL Vollblut in 50 μl 1x RIPA-Puffer mit 1 % Protease-/Phosphatase-Inhibitor
    2. Übertragen Sie das resuspendierte EV-Pellet in ein 1,5-2-ml-Röhrchen. Bis zur weiteren Analyse bei -80 °C lagern oder bei Bedarf fortfahren.

2. Analyse der Nanopartikel-Verfolgung

HINWEIS: Die Quantifizierung der durchschnittlichen EV-Größenverteilung in menschlichen Plasmaproben wurde mit Hilfe der Nanoparticle Tracking Analysis (NTA) durchgeführt, einer laserbasierten Detektionsmethode, die die Brownsche Bewegung von Nanopartikeln analysiert.

  1. Arbeitsverdünnungen für NTA
    1. Verdünnen Sie die EV-Stammlösung (EV-Pellet, resuspendiert in 200 μl PBS) mit eiskaltem PBS im Verhältnis 1:10, 1:50, 1:100 und 1:200. Erstellen Sie verschiedene Arbeitsverdünnungen, um die am besten geeignete Verdünnung zu bestimmen, um eine endgültige Zählung von 10-100 Nanopartikeln pro Frame während der Nanopartikelverfolgung zu erreichen.
  2. Ausführen von NTA
    1. Schalten Sie das NTA-Gerät ein und starten Sie die entsprechende Software auf dem angeschlossenen Computer. Platzieren Sie die Kammer in der Laserschatulle und klicken Sie auf Kamera starten , um sie zu aktivieren.
    2. Ziehen Sie 1 ml PBS in eine Spritze. Stecken Sie die Spritze in den vorderen Schlauch und spülen Sie das Schlauchsystem gründlich, um sicherzustellen, dass keine Luft in der Kammer verbleibt. Überwachen Sie die Kamera, um Luftblasen oder kontaminierende Partikel zu erkennen.
    3. Die vorbereitete EV-Arbeitsverdünnung wird in einer 1-ml-Spritze aufgezogen und in die Kammer injiziert.
    4. Passen Sie die Bildschirmverstärkung auf den Registerkarten "Aufnahme " und " Prozess " an die Helligkeit des Monitors an. Ändern Sie die Kameraebene , um Nanopartikel auf dem Bildschirm deutlich zu unterscheiden.
    5. Legen Sie auf der Registerkarte Prozess einen geeigneten Nachweisschwellenwert fest, um die Empfindlichkeit für die Unterscheidung von Partikeln und Hintergrundgeräuschen anzupassen. Halten Sie diesen Wert für alle Messungen innerhalb desselben Experiments konstant.
    6. Fokussieren Sie die Kamera mit dem Rad auf jeder Seite des Instruments, bis die Nanopartikel auf dem Bildschirm scharf erscheinen.
    7. Stellen Sie für alle Messungen in den Hardware-Einstellungen eine konstante Temperatur (idealerweise 22 °C) ein, da die Brownsche Bewegung temperaturabhängig ist.
    8. Klicken Sie auf die Schaltfläche Ausführen , um die Messung zu starten. Geben Sie die Proben-ID und das Lösungsmittel in das Pop-up-Fenster ein.
    9. Nehmen Sie für jeden Beispiellauf mindestens drei 30-Sekunden-Videos auf. Schieben Sie die Probe zwischen den Messungen vor, um eine repräsentative Probe der Nanopartikellösung zu erfassen. Wenn eine Spritzenpumpe verfügbar ist, stellen Sie diese auf eine konstante Geschwindigkeit ein und nehmen Sie kontinuierlich auf.
    10. Nach der Aufzeichnung berechnet die Software automatisch die Konzentration und Größenverteilung der Nanopartikel. Klicken Sie auf Ändern , um den für die Probe verwendeten Verdünnungsfaktor einzugeben, und speichern Sie die Ergebnisse mit einem Klick auf Exportieren.
  3. Datenanalyse
    1. Analysieren Sie die Ergebnisse anhand der Ausgabedateien in einer Statistiksoftware.

Markierungsfreie Analyse des EV-Proteoms mittels Flüssigchromatographie-Tandem-Massenspektrometrie (LC-MS/MS)

ANMERKUNG: Die markierungsfreie EV-Proteomanalyse wurde durch initiale Proteintrennung durch Gelelektrophorese von EV-Proteinen nach Membranlyse durchgeführt. Nach dem In-Gel-Proteinverdau mit Trypsin wurden die Peptide mittels LC-MS/MS analysiert, wobei die einzelnen Spektren mit einer humanen Proteomdatenbank abgeglichen wurden. Insbesondere wenn eine ungezielte Analyse von EV-Lysaten gewünscht wird, wird eine Schrotflintenproteomik ohne vorherige Auswahl eines spezifischen Molekulargewichtsbereichs empfohlen, wodurch die Schritte 3.1.1 bis 3.1.7 dieses Protokolls überflüssig werden.

  1. In-Gel-Trypsin-Verdauung
    1. Bereiten Sie eine Lösung von EV vor, die in 1x RIPA-Puffer resuspendiert ist, indem Sie Laemmli-Ladepuffer gemäß den Anweisungen des Herstellers hinzufügen (siehe Materialtabelle). Die Proben 5 Minuten lang bei 95 °C kochen.
    2. Laden Sie die EV-Proben, ergänzt mit einem Ladepuffer, zusammen mit einer Proteinleiter auf 4 %-12 % Bis-Tris-Gele für die Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE)14. Färben Sie das Gel 1-4 h lang mit Coomassie Blue, um Proteinbanden sichtbar zu machen. Entfärben Sie das Gel mit Wasser, indem Sie es über Nacht inkubieren.
    3. Mit einer Skalpellklinge werden Coomassie-gefärbte Banden aus Gelregionen, die interessante Proteine enthalten, exzisiert.
    4. Waschen Sie die Gelstücke mit 60 μL 1:1 (v/v) 50 mM Triethylammoniumbicarbonatpuffer (TEAB) und Acetonitril (ACN), pH 8,5, für 10 min. Schrumpfen Sie die Gelstücke dreimal für jeweils 10 min in 60 μL ACN. Erneut mit 60 μL 50 mM TEAB, pH 8,5 waschen.
    5. Reduzieren Sie die Proteine mit 10 mM Dithiothreitol (DTT) in 100 mM TEAB bei 57 °C für 30 min und dehydrieren Sie die Gelstücke.
    6. Alkylat die Proteine mit 10 mM Jodacetamid (IAA) in 100 mM TEAB bei 25 °C für 20 min im Dunkeln.
    7. Waschen Sie die Gelstücke mit 60 μL 100 mM TEAB und schrumpfen Sie sie zweimal für jeweils 10 min in 60 μL ACN.
    8. Geben Sie 50 mM TEAB-Trypsinlösung, entsprechend konzentriert, zu den trockenen Gelstücken. 4 h bei 37 °C inkubieren. Die Reaktion durch Zugabe von 20 μl 0,1 % Trifluoressigsäure (TFA) abschrecken.
    9. Extrahieren Sie die resultierenden Peptide, indem Sie 30 μl 1:1 (v/v), 0,1 % TFA und ACN für 30 Minuten inkubieren. Dehydrieren Sie die Gele 20 min lang mit 20 μl ACN und waschen Sie sie dann erneut mit 30 μl 100 mM TEAB für 20 min.
    10. Schrumpfen Sie das Gel zweimal mit 20 μL ACN für jeweils 20 min.
    11. Der bei jedem Extraktionsschritt gesammelte Überstand wird in einer Vakuumzentrifuge konzentriert und die Probe in 15 μl 0,1 % TFA aufgelöst.
  2. LC-MS/MS-Analyse
    1. Führen Sie Nanoflow-LC-MS/MS-Analysen mit einem hochauflösenden Flüssigkeitschromatographie-Massenspektrometer durch, das mit einem elektrostatischen Ionenfallenanalysator gekoppelt ist.
    2. Verwenden Sie 0,1 % Ameisensäure (FA)/1 % ACN als Lösungsmittel A und 0,1 % FA/89,9 % ACN als Lösungsmittel B.
    3. Trennen Sie die Peptide in einem linearen Gradienten von 25 Minuten: Beginnen Sie mit 3 % Lösungsmittel B, erhöhen Sie B auf 23 % über 21 Minuten, dann auf 38 % über 4 Minuten und fahren Sie mit einer Auswaschung bei 95 % B fort.
    4. Betreiben Sie das Massenspektrometer im datenabhängigen Erfassungsmodus, der automatisch zwischen MS und MS2 wechselt. Erfassen Sie MS-Spektren (m/z 400-1600) mit einer Auflösung von 60.000 bei m/z 400 und erzeugen Sie MS2-Spektren für bis zu 15 Vorläufer mit einer normierten Kollisionsenergie von 27 und einer Isolationsbreite von 1,4 m/z.
  3. Suche in der Proteindatenbank
    1. Durchsuchen Sie die MS/MS-Spektren mit der Swiss-Prot Homo sapiens (UP000005640, Juni 2020) Proteindatenbank und einer angepassten Kontaminantendatenbank (Teil von MaxQuant, MPI Martinsried15,16) mit Proteome Discoverer 2.5 mit Sequest HT.
    2. Konfigurieren Sie die Programmeinstellungen wie folgt: Stellen Sie die Massentoleranz der Fragmentionen auf 0,02 Da und die Massentoleranz der Mutterionen auf 5 ppm ein. Spezifizieren Sie Trypsin als das Enzym, das für die Verdauung verwendet wird, und setzen Sie Carbamidomethyl als feste Modifikation für Cystein, mit Oxidation (Methionin) und Deamidierung (Asparagin, Glutamin) als variable Modifikationen. Umfassen Sie Acetylierung, Methioninverlust und deren Kombination als variable Modifikationen des Proteinterminus.
    3. Quantifizieren Sie Peptide unter Verwendung des Ionenquantifizierermodus für Vorläufer unter Verwendung der Methode des Top-N-Durchschnitts (n = 3) zur Berechnung der Proteinhäufigkeit17.

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Results

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EV wurden aus Plasmaproben (n = 3) von Patienten ohne manifeste Herz-Kreislauf-Erkrankung sowie von Patienten mit Myokardinfarkt ohne ST-Hebung (NSTEMI; n = 2) unter Verwendung des etablierten differentiellen Ultrazentrifugationsprotokolls isoliert. Die adäquate Trennung von EV-Plasma-EV wurde durch Immunblotting der EV-angereicherten Proteine TSG-101, Annexin 5 (Anx5) und CD9 in EV-Isolaten im Vergleich zu EV-abgereichertem Plasma von denselben Patienten bestätigt (Abbildung 1A). Transferri...

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Discussion

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Dieses Protokoll bietet eine praxisnahe, schrittweise und gebrauchsfertige Methodik für die Trennung und Charakterisierung von Plasma-EV sowie eine Einführung in eine unmarkierte Proteomanalyse, die sich für die Integration in die klinische Routine eignet. Eine detaillierte Beschreibung und die strikte Einhaltung einer einheitlichen Methodik für die EV-Isolierung aus Plasmaproben sind wichtig, um die Reproduzierbarkeit der erzielten Ergebnisse zu gewährleisten. Die aktuelle Literatur deu...

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Disclosures

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EG erhielt Honorare für Dozenten von Roche Diagnostics, BRAHMS Thermo Scientific, Bayer Vital GmbH, AstraZeneca, Lilly Deutschland, Boehringer Ingelheim; Er erhielt institutionelle Forschungsstipendien von Roche Diagnostics und Daiichi Sankyo und ist neben den eingereichten Arbeiten als Berater für Roche Diagnostics, BRAHMS Thermo Scientific, Astra Zeneca, Novartis und Boehringer Ingelheim tätig. Das JBK erhielt projektbezogene Fördermittel vom Deutschen Zentrum für Herz-Kreislauf-Forschung (DZHK) und Roche Diagnostics. Die übrigen Autoren erklären, dass kein Interessenkonflikt im Zusammenhang mit der eingereichten Arbeit besteht.

Acknowledgements

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Die Autorinnen danken Heidi Deigentasch, Amelie Werner und Elisabeth Mertz für die organisatorische Unterstützung während dieses Projekts.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
4x Laemmli ProbenverstärkerBio-rad1610747
10x RIPA-BufferAbcamab156034
26,3 mL Polycarbonat Flasche mit Kappe für UltrazentrifugationBeckman Coulter355654
5810R TischzentrifugeEppendorf5811000015
Acetonitril (ACN)Biosolve0001204101BS
Dithiothreitol (DTT)Sigma-Aldrich43816-10ML
Dulbecco's Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)Sigma-AldrichD8537
Ameisensäure 99% ULC/MS 100Biosolve0006914143BS
Histopak - 1077Sigma-Aldrich10771
Jodacetamid (IAA)Sigma-AldrichI6125-5G
Massenspektrometer Orbitrap Q Exactive HFThermo Fisher ScientificIQLAAEGAAPFALGMBDK
MOPS SDS LaufpufferThermo FisherB0001
NanoSight NS300Malvern Panalytical NS300
Nanosight NTA 3.2 SoftwareMalvern Panalytical 
NuPAGE 4  Bis 12 %, Bis-Tris ProteingeleInvitrogenNP0323
Optima XPN-80 bodenstehende UltrazentrifugeBeckman Coulter521-4180
PageRuler Plus Prestained Protein LadderThermo Fisher Scientific26619
Protease/Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X)Cell Signaling Technology5872S
ProteinmarkerThermo Fisher26616
Proteome Discoverer 2.5Thermo Fisher
Q Exactive Plus Hybrid Quadrupol-Orbitrap MassenspektrometerThermo Fisher ScientificIQLAAEGAAPFALGMBDK
Quick stain coomasssieServa35081.01
ReproSil-Pur 120 C18-AQ, 1.9 µ m 1 gDr. Maischr119.aq.0001
SDS-PAGE kommerzielles GelThermo FisherNW00100BOX
S-Monovette  Citrat 9NC 0,106 mol/l 3,2%Sarstedt02.1067.001
Speed vac concentratorSavant
Swiss-Prot (Uniprot) Homo sapiens (UP000005640, Juni 2020) ProteindatenbankUniProthttps://www.uniprot.org/proteomes/UP000005640
Triethylammoniumbicarbonat-Puffer (TEAB)Sigma-AldrichT7408
Trifluoressigsäure (TFA) für HPLC >99%, 100 mLSigma-Aldrich302031-100ML
Trypsin MS-GradeThermo Fisher90058
Typ 50.2 Ti FestwinkelrotorBeckman Coulter337901
UHPLC Dionex Ultimate 3000Thermo FisherScientific ULTIM3000RSLCNANO
WasserBiosolve0023214102BS

References

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