Nanofibrilläre Basalmembran-Imitation aus rekombinant funktionalisierter Spinnenseide in maßgefertigten Gewebekultureinsätzen

Zusammenfassung

Gewebekultureinsätze mit Kunststoffmembranen sind der goldene Standard in Zellkulturlaboren als durchlässige Stützen zur Etablierung von Zellschichten und Modellen von Barrieregeweben. Hier stellen wir eine einfache Methode vor, um die Kunststoffmembran durch eine biologisch relevantere Membran zu ersetzen, die aus einem rekombinanten funktionalisierten Spinnenseidenprotein besteht.

Zusammenfassung

Die Replikation von Gewebebarrieren ist entscheidend für die Generierung relevanter In-vitro-Modelle zur Bewertung neuartiger Therapeutika. Heutzutage geschieht dies üblicherweise mit Hilfe von Gewebekultureinsätzen mit einer Kunststoffmembran, die eine apikale und eine basale Seite erzeugt. Diese Membranen unterstützen nicht nur die Zellen, sondern sind auch weit davon entfernt, ihr natives Gegenstück, die Basalmembran, nachzuahmen, bei der es sich um eine nanofibrilläre, proteinbasierte Matrix handelt. In dieser Arbeit zeigen wir einen einfachen Weg, um die biologische Relevanz der Gewebekultureinlagen erheblich zu verbessern, indem die plastische Membran durch eine aus einem rein rekombinanten funktionalisierten Spinnenseidenprotein ersetzt wird. Die Seidenmembran bildet sich durch Selbstorganisation und haftet spontan an einem membranfreien Gewebekultureinsatz, wo sie die Zellen stützen kann. Kundenspezifische Gewebekultureinsätze können mit einem Standard-3D-Drucker gemäß den Anweisungen im Protokoll gedruckt werden, oder es können stattdessen kommerzielle Einsätze gekauft und verwendet werden. Dieses Protokoll zeigt, wie das Kultursystem mit Seidenmembranen in Inserts aufgebaut ist und wie anschließend die gleichen Zellkultivierungstechniken implementiert werden können, die bei traditionellen, kommerziell erhältlichen Inserts angewendet werden.

Einleitung

In-vitro-Modelle, die Gewebebarrieren replizieren können, haben aufgrund ihrer Anwendbarkeit bei der Erprobung neuartiger Therapeutika und der Erleichterung des Verständnisses grundlegender Krankheitsmechanismen zunehmende Aufmerksamkeit erhalten ^1,2. Um die native Mikroumgebung genau nachzubilden, ist es wichtig, die Funktion der Basalmembran (BM), eines hochspezialisierten extrazellulären Matrixkomplexes (ECM), zu rekapitulieren. Das BM kommt in fast jedem Gewebe des menschlichen Körpers vor, wo es Endothel- und Epithelzellen unterstützt und sie vom darunter liegenden Gewebe trennt ^2,3. Neben der physischen Unterstützung reguliert und erhält das BM auch biochemische Signale zwischen den Zellen und dem umgebenden Gewebe. Diese wichtigen Funktionen machen es notwendig, Gerüste zu entwerfen, die der Struktur sowie den mechanischen und funktionalen Eigenschaften des nativen BM³ ähneln.

Eine der gebräuchlichsten Methoden, die BM in vitro nachzuahmen, ist heute die Verwendung von kommerziell erhältlichen Gewebekultur-Inserts (TC-Inserts). Dabei handelt es sich im Wesentlichen um Kunststoffzylinder mit einer durchlässigen Membran, die die Kammer in apikale und basolaterale Seiten ^4,5 teilt. Die Membranen in kommerziellen Einsätzen sind zwar einfach zu verwenden, aber in der Regel starr, spurgeätzt und bestehen aus Polymeren wie Poly(carbonat) (PC) und Poly(ethylenterephthalat) (PET)^3,4,6. Sie sind flexibel in Bezug auf Durchmesser, Porendichte und Größe und können beschichtet werden, um die Zelladhäsion zu verbessern, aber es fehlen alle anderen relevanten Merkmale des BM, wie z. B. vergleichbare Dicke⁶, vernetzte Porosität, faserige Architektur und relevanter Elastizitätsmodul³.

Die Standardisierung von TC-Einsätzen und ihre einfache Handhabung haben mehrere Gruppen, darunter auch unsere, dazu inspiriert, die Kunststoffmembran durch ein eher in vivo-ähnliches Gegenstück zu ersetzen (siehe Tabelle 1). Die verwendeten Materialien reichen von Polymeren wie Polydimethylsiloxan (PDMS)⁷, Poly(lactid-co-caprolacton) (PLCL)⁸ und Polycaprolacton (PCL)^4,9,10 bis hin zu proteinbasierten Materialien wie Gelatine ^2,11,12, Kollagen ^5,13 und rekombinanter Spinnenseide 14,15,16,17. Membranen aus diesen Materialien wurden auf verschiedene Weise befestigt, sowohl an handelsüblichen Einsätzen, von denen die Membran entfernt wurde 4,7,8,10,12,13,14,16,18,19,20,21 sowie auf kundenspezifische Einsätze, die im 3D-Druck 1,11,15,17,20 oder im Spritzguss ^9,22 hergestellt werden. Die meisten von ihnen sind jedoch in Bezug auf die Dicke noch weit davon entfernt, dem nativen BM zu ähneln, wobei die Nachbildungen von Hunderten^11,18 bis zu einigen Mikrometern ^{5,10,14,21,22} reichen. Viele von ihnen erfordern auch eine komplexe Formations- und/oder manuelle Befestigungsmethoden 1,7,13,14,18,19,21, was die Skalierung und Replikation in anderen Laboren zu einer Herausforderung macht.

Darin stellen wir eine einfache Methode vor, um eine Seidenmembran zu formen und an Einsätzen zu befestigen, und zeigen, wie Zellen auf beiden Seiten der Membran kultiviert werden können. Die Seidenmembranen werden durch Selbstorganisation des Proteins FN-4RepCT (FN-silk) an der Flüssig-Luft-Grenzfläche einer stehenden Lösung^{gebildet 16,17}. FN-Seide ist eine rekombinant hergestellte Kurzversion von Major Ampullulate Spidroin 1 aus Euprosthenops australis, funktionalisiert mit einem RGD-Motiv, das von Fibronektin²³ abgeleitet ist. Es hat sich gezeigt, dass es sich zu fibrillären Matrizen zusammensetzt, die die Zelladhäsion, das Wachstum und die Migration fördern 15,16,17,23,24,25. Das Verfahren zur Befestigung der Membran auf dem Einsatz beruht auf Spontanadhäsion und hat sich für kommerziell erhältliche Inserts, von denen die Membran entfernt wurde¹⁶, sowie für 3D-gedruckte Inserts aus Polymilchsäure (PLA)¹⁷ und Dental LT¹⁵ als geeignet erwiesen. In diesem Artikel wird beschrieben, wie diese Methode für Einsätze verwendet wird, die mit Dental LT gedruckt wurden. Nachdem die FN-Seidenmembranen auf die Einsätze aufgebracht wurden, können sie im Wesentlichen wie handelsübliche Gewebekultureinlagen behandelt werden. Kurz gesagt, wir stellen eine einfache Methode vor, um in vitro relevantere Modelle von Gewebebarrieren zu generieren, indem Kunststoffmembranen durch eine proteinbasierte FN-Seidenmembran ersetzt werden.

Protokoll

1. 3D-Druck von Beilagen

1. Laden Sie die . STL-Designdatei (JoVe_Silk_Insert.stl) aus der Zusatzdatei 1.
2. Bereiten Sie die Dateien für den Druck vor, indem Sie sie in dem Softwarepaket öffnen, das für die Konvertierung einer . STL-Datei in eine Druckdatei für den verwendeten 3D-Drucker.
3. Verwenden Sie die dedizierte Software, um Stützen hinzuzufügen. Die Stützstruktur wird von der Software entworfen, und die benötigte Menge hängt vom Drucker und der verwendeten Software ab. Richten Sie die Einlage so aus, dass weder die Bauplattform noch die Stützen den Boden berühren.
4. Drucken Sie die gewünschte Anzahl von Einsätzen mit einem biokompatiblen Harz (z. B. Dental LT oder BioMed) oder Filament (z. B. PLA), das für den verwendeten 3D-Drucker geeignet ist.
   HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass das Material einem geeigneten Sterilisationsprozess wie Autoklavieren, Bestrahlung oder Eintauchen in Ethanol standhält.
5. Lösen Sie die gedruckten Einsätze von der Druckplattform und entfernen Sie die gedruckte Stützstruktur vom fertigen Teil.
6. Wenn Sie einen Harzdrucker verwenden, verarbeiten Sie die Einsätze mit dem vom Hersteller bereitgestellten Standardprotokoll.
   HINWEIS: Die Verarbeitung kann je nach verwendetem Harz variieren. Das Protokoll, das für das hierin verwendete Harz verwendet wird, ist in der ergänzenden Datei 2 enthalten.
7. Sterilisieren Sie die Einsätze mit einer Technik, die für das Material Ihrer Wahl geeignet ist.
   HINWEIS: Empfohlen werden Autoklavieren, Bestrahlung oder Eintauchen in 70%iges Ethanol oder eine Kombination davon. Bei Verwendung eines Harzdruckers kann ein umfangreiches Auslaugungsprotokoll erforderlich sein, um eine optimale Biokompatibilität zu erreichen. Eine Empfehlung finden Sie im Protokoll in der Zusatzdatei 2 .
8. Stellen Sie sicher, dass die Einsätze vollständig trocken sind und lagern Sie sie bis zur Verwendung steril.

2. Bildung von FN-Seidenmembranen

1. Füllen Sie eine Box mit Trockeneis und stellen Sie es in den -80 °C heißen Gefrierschrank.
2. Sammeln Sie die FN-Seidenfläschchen aus dem -80 °C Gefrierschrank und legen Sie sie für den Transport in Trockeneis. Bringen Sie die FN-Seidenfläschchen zu einer biologischen Sicherheitswerkbank und führen Sie dort weitere Schritte durch. Legen Sie die FN-Seidenfläschchen zum Auftauen in ein Mikrozentrifugenröhrchengestell, ohne sie übermäßig zu berühren.
3. Während die FN-Seide auftaut, packen Sie die 48-Well-Platte aus. Sobald die FN-Seide vollständig aufgetaut ist, fahren Sie innerhalb von 10 Minuten mit dem nächsten Schritt fort, am besten so früh.
4. Verdünnen Sie die FN-Seidenlösung in gekühltem oder bei Raumtemperatur warmem PBS auf die gewünschte Konzentration, vorzugsweise 1,8 mg/ml. Pipettieren Sie 550 μl FN-Seidenlösung direkt in den Boden einer leeren Vertiefung in der 48-Well-Platte. Pipettieren Sie die FN-Seidenlösung, bis die gewünschte Anzahl von Membranen hergestellt wurde.
   HINWEIS: Vermeiden Sie das Einbringen von Luftblasen und entfernen Sie alle Luftblasen sofort mit einer Pipette. Es dürfen weder Vertiefungen in Reihe A oder F oder Spalte 1 oder 8 noch benachbarte Vertiefungen verwendet werden (siehe Schema in der ergänzenden Abbildung S1).
5. Setzen Sie den Deckel auf die 48-Well-Platte und legen Sie sie in eine größere, sterile Box, um während der Inkubation eine sterile Umgebung zu schaffen.
6. Ziehen Sie die Box vorsichtig aus der biologischen Sicherheitswerkbank und lassen Sie sie über Nacht an einem ungestörten Ort ohne nennenswerten Luftstrom stehen.

3. Aufkleben von FN-Seidenmembranen auf Einsätze

1. Bringen Sie die sterilen Einsätze am nächsten Tag in die biologische Sicherheitswerkbank.
2. Bringen Sie die große sterile Box mit der 48-Well-Platte mit den FN-Seidenmembranen zurück in die biologische Sicherheitswerkbank und führen Sie dort weitere Schritte durch. Heben Sie die 48-Well-Platte vorsichtig aus der großen sterilen Box.
3. Überprüfen Sie die Membranbildung visuell, indem Sie die Trübung in den Vertiefungen beobachten und den Deckel der 48-Well-Platte mit den Membranen öffnen. Nehmen Sie einen Einsatz mit einer sterilen Pinzette auf und führen Sie den Einsatz nach unten auf die Membran, bis die Griffe des Einsatzes die Oberseite der Vertiefung berühren, wie in Abbildung 1 gezeigt. Halten Sie die Unterseite des Einsatzes parallel zur Unterseite der Platte.
4. Wiederholen Sie Schritt 3.3, bis die Einsätze auf alle geformten Membranen abgesenkt wurden. Setzen Sie den Deckel auf die 48-Well-Platte und legen Sie die Platte wieder in die sterile Box. Lassen Sie die Platte 2 h lang bei Umgebungsbedingungen ungestört, damit die Membranen an den Einsätzen haften können.
5. Erwärmen Sie das Wachstumsmedium oder PBS auf 37 °C.
6. Packen Sie eine 24-Well-Platte aus.
7. Nach Ablauf von 2 Stunden nehmen Sie die 48-Well-Platte aus der Box und öffnen Sie den Deckel. Halten Sie mit einer sterilen Pinzette einen Einsatz an den Griffen fest und heben Sie ihn aus der 48-Well-Platte.
8. Füllen Sie den Einsatz direkt nach dem Heben mit vorgewärmtem Nährmedium oder PBS. Verwenden Sie 100 μl Kulturmedium bei der basalen Seitenaussaat oder 200 μl bei apikaler Seitenaussaat. Wenn die Membranen für die spätere Verwendung gelagert werden sollen, verwenden Sie stattdessen 200 μl PBS.
   CHECKPOINT: Wenn die Flüssigkeit über der Membran zurückgehalten wird, war das Anheben erfolgreich. Tropft Flüssigkeit auf die Bank, tritt die Membran undicht und sollte ignoriert werden.
9. Legen Sie den Einsatz in eine leere Vertiefung der 24-Well-Platte.
10. Heben Sie alle Einsätze aus der 48-Well-Platte und übertragen Sie sie auf die 24-Well-Platte. Füllen Sie die Vertiefungen mit 1.000 μl Wachstumsmedium, wenn Sie mit der Zellaussaat oder PBS zur Lagerung fortfahren, während Sie die Platte leicht geneigt halten.
    HINWEIS: Es ist wichtig, dass sich der Rand der Membran unter dem Flüssigkeitsspiegel befindet (Abbildung 2).
11. Wenn Zellen sofort ausgesät werden sollen, fahren Sie mit Abschnitt 4 oder 5 fort, je nachdem, auf welcher Seite der Membran die Zellen ausgesät werden sollen. Wenn nicht, legen Sie den Deckel auf die 24-Well-Platte und stellen Sie sie entweder in den Kühlschrank (4 °C) oder in einen 37 °C-Inkubator. Wenn Sie den PBS in den Inkubator stellen, füllen Sie ihn jeden zweiten Tag auf, um sicherzustellen, dass das benötigte Volumen erhalten bleibt.

4. Zellaussaat auf der apikalen Seite der Membran

HINWEIS: Wenn die Membranen in PBS gelagert wurden, ersetzen Sie das PBS durch vorgewärmtes Kulturmedium, wie in Abschnitt 6 beschrieben.

1. Ernte die Zellen. Bereiten Sie die Zellsuspension so vor, dass die gewünschte Anzahl von Zellen pro Membran in 20-50 μl der Suspension vorhanden ist. Resuspendieren, um die gewünschte Zellkonzentration zu erreichen.
2. Mit einer P100- oder P200-Pipette werden 20-50 μl der Zellsuspension aspiriert. Richten Sie die Pipettenspitze auf die Mitte der Membran, halten Sie die Spitze 1-2 mm von der Oberfläche des Kulturmediums im Inneren des Einsatzes entfernt und drücken Sie langsam auf den Pipettenkolben, um am Rand der Spitze ein Tröpfchen zu erzeugen. Bringen Sie das Tröpfchen mit dem Nährmedium im Inneren des Einsatzes in Kontakt.
   HINWEIS: Halten Sie die Pipette senkrecht zur Arbeitsfläche.
3. Wiederholen Sie Schritt 4.2 für die restlichen Membranen. Resuspendieren Sie den Zellstock nach dem Aussäen von fünf Membranen, um eine homogene Zellverteilung zu gewährleisten. Bewegen Sie die Platte in einem Achtermuster, um eine bessere Zellverteilung auf der Membran zu gewährleisten.
4. Unter Standardbedingungen (37 °C und 5 % CO₂) kultivieren und jeden zweiten Tag das Medium wechseln.

5. Zellaussaat auf der basalen Seite der Membran

HINWEIS: Wenn die Membranen in PBS gelagert wurden, ersetzen Sie das PBS durch 100 μl vorgewärmtes Wachstumsmedium und füllen Sie die Vertiefungen mit 1 mL vorgewärmtem Wachstumsmedium, wie in Abschnitt 6 beschrieben.

1. Ernten Sie die Zellen und bereiten Sie die Zellsuspension so vor, dass die gewünschte Anzahl von Zellen pro Membran in 20 μl der Suspension vorhanden ist. Resuspendieren, um die gewünschte Zellkonzentration zu erreichen.
2. Packen Sie den Deckel einer Petrischale aus und öffnen Sie ihn. Stellen Sie sicher, dass die Höhe der Petrischale ausreicht, um die Einsätze aufzunehmen, ohne dass ihre Böden den Deckel berühren.
3. Heben Sie den Einsatz mit einer Pinzette aus der 24-Well-Platte und lassen Sie das Kulturmedium in den Wells. Drehen Sie den Einsatz mit einer Pinzette in jeder Hand um, so dass die basale Seite nach oben und die apikale Seite zum Arbeitsbereich zeigt. Setzen Sie den umgedrehten Einsatz wie in Abbildung 3C in die Petrischale ein. Wiederholen Sie den Vorgang für die restlichen Einfügungen.
   HINWEIS: Entfernen Sie das Nährmedium nicht auf der apikalen Seite. Es hält die Membran während der Inkubation feucht.
4. Resuspendieren Sie den Zellbestand, um eine gleichmäßige Zellverteilung in der Lösung zu gewährleisten, und aspirieren Sie 20 μl der Zellsuspension mit einer P100- oder P200-Pipette. Richten Sie die Pipettenspitze in Richtung der Mitte der Membran, halten Sie die Spitze 1-2 mm von der Membran entfernt und drücken Sie langsam auf den Pipettenkolben, um am Rand der Spitze ein Tröpfchen zu erzeugen. Halten Sie die Pipette senkrecht zur Membranoberfläche und lassen Sie das Tröpfchen auf die Membran fallen. Wiederholen Sie den Vorgang für die restlichen Membranen.
   HINWEIS: Resuspendieren Sie den Zellvorrat nach dem Aussäen von fünf Membranen, um eine gleichmäßige Zellverteilung zu gewährleisten.
5. Setzen Sie den Deckel auf die Petrischale, bringen Sie die Petrischale und die 24-Well-Platte in den Inkubator und inkubieren Sie die Einsätze mit den Zellen unter Standardbedingungen (37 °C und 5 % CO₂) für 30 min.
6. Bringen Sie die 24-Well-Platte mit dem Nährmedium und die Petrischale in den biologischen Sicherheitsschrank. Öffnen Sie beide Lider und nehmen Sie mit einer Pinzette in jeder Hand einen Einsatz auf und drehen Sie ihn so um, dass die apikale Seite der Membran nun nach oben und die Basalseite nach unten zeigt.
7. Geben Sie mit einer P200-Pipette 200 μl Nährmedium in den Einsatz. Legen Sie den Einsatz in eine der vorgefüllten Vertiefungen der 24-Well-Platte und wiederholen Sie den Vorgang für die restlichen Membranen.
8. Unter Standardbedingungen (37 °C und 5 % CO₂) kultivieren und jeden zweiten Tag das Medium wechseln.

6. Mittlerer Wandel der Kulturen unter subversen Bedingungen

1. Bereiten Sie eine neue 24-Well-Platte mit dem frischen Kulturmedium vor, indem Sie 1.000 μl/Well hinzufügen. Heben Sie mit einer Pinzette einen Einsatz aus der 24-Well-Platte, kippen Sie ihn leicht und entfernen Sie das Medium von der apikalen Seite.
2. Geben Sie 200 μl frisches Nährmedium in den Einsatz. Legen Sie den Einsatz in eine Vertiefung, die mit frischem Nährmedium vorgefüllt ist. Wiederholen Sie den Vorgang für alle Membranen.

7. Mittlerer Wandel der Kulturen unter den Bedingungen der Luftbrücke

1. Heben Sie den Einsatz mit einer Pinzette an und legen Sie ihn in eine leere Vertiefung einer 24-Well-Platte. Wiederholen Sie den Vorgang für vier weitere Membranen.
2. Kippen Sie die 24-Well-Platte leicht und geben Sie langsam 1.000 μl frisches Kulturmedium in jede Plattenvertiefung. Wiederholen Sie den Vorgang für die restlichen Membranen.

8. Messung des transepithelialen elektrischen Widerstands (TEER)

1. Bereiten Sie eine 24-Well-Platte mit 1.000 μl Nährmedium oder PBS in den Wells vor und übertragen Sie die Membranen hinein. Stellen Sie sicher, dass sich 200 μl der entsprechenden Lösung über der Membran befinden.
2. Stabilisieren Sie den Einsatz mit einer Pinzette gut in der Platte, indem Sie vorsichtig auf die Einsatzarme drücken. Führen Sie, ohne die Pinzette zu entfernen, die TEER-Elektrode in die Vertiefung ein und protokollieren Sie die Messung.
3. Entfernen Sie die Elektrode und heben Sie dann die Pinzette an.
4. Wiederholen Sie die Schritte 8.2 bis 8.3 für die restlichen Membranen.

Ergebnisse

Repräsentative Fotos der Einsätze
Fotos der Einsätze vor und nach der Freigabe von der Druckplattform sind in Abbildung 3A,B dargestellt. Ein Bild einer fertigen Wendeschneidplatte, von der die Stütze entfernt wurde, ist in Abbildung 3C dargestellt. Das Ergebnis ist eine Charge von 3D-gedruckten Einsätzen, die zur Sterilisation und anschließenden Verwendung bereit sind.

Heben und Handling von FN-Seidenmembranen
Ein allgemeines Schema der FN-Seidenmembranbildung und des manuellen Anhebens ist in Abbildung 1 dargestellt. Das Ergebnis ist eine Reihe von Einsätzen, an denen eine FN-Seidenmembran befestigt ist. Um die höchste Erfolgsquote beim Anheben intakter Membranen zu gewährleisten, sollten die im Protokoll beschriebenen Schritte genau befolgt werden. Abbildung 4 zeigt Fotos einer Membran im intakten Zustand (A,D) und nach dem Reißen (B,E,F). Der Riss kann mit Hilfe der Hellfeldmikroskopie (Abbildung 4E, F) und/oder durch das Tropfen von Flüssigkeit durch die Membran (Abbildung 4B) sichtbar gemacht werden. Es ist wichtig, die Einsätze senkrecht zur Membran anzuheben und abzusenken, um sicherzustellen, dass die Membran gleichmäßig haftet und sich unter den Einsätzen dehnt. Die Membranadhäsion kann visuell beobachtet werden, wie in Abbildung 4A gezeigt. Wenn der Einsatz wie angewiesen abgesenkt wird und der Flüssigkeitsstand wie in Abbildung 2 gezeigt gehalten wird, bleibt die Membran über lange Kulturzeiträume mit dem Einsatz verbunden.

Hierin wird die Membranbindung an den Einsatz validiert, indem ein Permeationsexperiment 15,16,17 an Membranen durchgeführt wird, die 9 Tage lang unter Standard-Zellkulturbedingungen aufbewahrt wurden. Kurz gesagt, wenn ein fluoreszierendes Molekül auf die Membran gelegt und das Signal in der Lösung darunter gemessen wird, folgt das Permeationsprofil der Seidenmembranen dem eines kommerziell erhältlichen Gewebekultureinsatzes (Abbildung 4C), zeigt keine Leckage über 36 h Permeation und zeigt an, dass die Membran sowohl intakt als auch mit dem Einsatz verbunden bleibt. Ähnliche Experimente wurden zuvor mit Zellen durchgeführt, die auf einer¹⁵ oder beiden Seiten der Seidenmembran¹⁷ ausgesät wurden. Die Stärke der Haftung wurde zuvor mit Hilfe der Makroeindrücke¹⁶ und der Aufblasversuche ^16,17 nachgewiesen. Im Rahmen der Makro-Indentationsexperimente wurde ein Stift verwendet, um die Membran zu dehnen, die unter einer Kraft von 1,4 mN riss, während sie an dem Einsatz¹⁶ befestigt blieb.

Es ist zu beachten, dass die Erfolgsrate beim Heben intakter Membranen mit dem Material und der Nachbehandlung der Einlagen zusammenhängt. Mit diesem Protokoll waren 95 % der Membranen, die mit Einsätzen angehoben wurden, die mit dem verwendeten Harz gedruckt wurden, für die Zellaussaat geeignet, verglichen mit 74 %, wenn stattdessen ein vergleichbares Harz verwendet wurde. Wir spekulieren, dass die Adhäsion durch hydrophobe Wechselwirkungen und Van-der-Waals-Kräfte unterstützt wird und somit die Veränderung der Materialeigenschaften die Stärke der Adhäsion verändert. Dies wird auch durch die Tatsache unterstützt, dass die Membranen nicht gut auf hydrophilen Materialien haften (Daten nicht gezeigt).

Repräsentative Ergebnisse der Zellkultur auf den FN-Seidenmembranen
Immunfluoreszenzbilder von Keratinozyten (HaCaT), die auf der apikalen oder basalen Seite der Membran kultiviert wurden, sind in Abbildung 5 dargestellt. Es wurde beobachtet, dass die adhärenten Zellen (Abbildung 5D.i) an Tag 1 den Kulturbereich gleichmäßig bedeckten, während sie die typische Keratinozyten-Kopfsteinpflastermorphologie aufwiesen (Abbildung 5A.i-B.i). An Tag 3 hatten die Keratinozyten eine konfluente Schicht gebildet (Abbildung 5A.ii-B.ii) und ein Netzwerk von Tight Junctions gebildet (Abbildung 5D.ii), was darauf hindeutet, dass sie physiologische Epithelfunktionen übernahmen. Die hohen Grade der Zellviabilität, die in den FN-Seidenmatrizen^{15, 17, 23, 24} erreicht wurden, wurden auch in dem hierin beschriebenen Seidenmembran-Einsatz-Kulturaufbau gezeigt. Nach 3 Tagen in Kultur waren die Keratinozyten immer noch sehr lebensfähig (Abbildung 5C.i-iv). Darüber hinaus wurde kein Unterschied in der Verteilung der toten Zellen zwischen dem Zentrum (Abbildung 5C.i-ii) und der Peripherie der Membran (Abbildung 5C.iii-iv) beobachtet, was keinen signifikanten Einfluss des Insertmaterials auf die Lebensfähigkeit von HaCaT zeigt. Insgesamt bot das Seiden-Insert-Kultursystem eine ähnliche (Abbildung 5i-ii, v-vi), wenn nicht sogar verbesserte (Abbildung 5iii-iv, vii-viii) Keratinozyten-Viabilität wie ein kommerzielles PET-Membran-Insert-System.

Abbildung 1: Detaillierte Darstellung der Bildung und des Anhebens singulärer FN-Seidenmembranen. (A) Füllen Sie jede zweite Vertiefung (vermeiden Sie die äußere Reihe/Spalte) in eine 48-Well-Platte mit FN-Seidenproteinlösung, wobei (B) sie sich über Nacht an der Flüssig-Luft-Grenzfläche selbst zu einer Membran zusammenfügt. (C) Fassen Sie den Einsatz mit einer Pinzette und senken Sie ihn mit den (D,E)-Führungen an der 3D-gedruckten Einlage langsam auf die Membran ab, um sicherzustellen, dass der Einsatz senkrecht zur Membran abgesenkt wird. Vergrößerung der Adhäsion der Seidenmembran, die einen Querschnitt des Einsatzes (F) direkt über der Membran und (G) zeigt, wenn er die Seidenmembran berührt. Während der 2-stündigen Inkubationszeit heftet sich (H) die Seidenmembran spontan an den Einsatz, der dann (I) verwendet wird, um die Membran von der Grenzfläche zu heben. Abkürzungen: FN = Fibronektin; PBS = phosphatgepufferte Kochsalzlösung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Detaillierte Illustration, die zeigt, wie die FN-Seidenmembran nach dem Abheben von der Formationsplatte zu handhaben ist. (A) Der Einsatz (grau) mit der Membran (violett) direkt nach dem Heben. (B) Flüssigkeit (blau) wird auf die apikale Seite der Membran gegeben, die dann in eine (C) 24-Well-Platte gegeben wird, wobei der längere Teil der Einsatzarme an den Wänden hängt und der kürzere Teil den Einsatz in der Mitte der Platte positioniert. (D) Flüssigkeit wird in die Vertiefung gegeben, um sicherzustellen, dass der Flüssigkeitsstand ausgeglichen und über dem Rand der Membran liegt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Fotos der 3D-gedruckten Einsätze. (A) Die Einsätze direkt nach der Entnahme aus dem 3D-Drucker, die noch an der Bauplatte befestigt sind. (B) Ein Einsatz nach dem Entfernen von der Bauplatte, bevor die Stützen gebrochen werden. (C) Eine Einlage nach dem Entfernen der Stützen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4: Eine FN-Seidenmembran vor und nach dem Brechen. (A) Foto einer intakten Membran, die auf der apikalen Seite 200 μL gefärbtes (blaues) PBS trägt. Der um die Einlage gewickelte Membranrand ist durch weiße Pfeile gekennzeichnet. (B) Foto der gleichen Membran nach dem Reißen. PBS tritt durch die Membran aus. (C) Diagramm, das die Permeation eines fluoreszierenden Moleküls mit einer Kapazität von 3 kDa über einen Zeitraum von 36 h durch eine Seidenmembran oder eine im Handel erhältliche PET-Membran zeigt, die 9 Tage lang unter Standard-Zellkulturbedingungen aufbewahrt wurde. (D) Hellfeldbild einer Membran vor dem Reißen. (E) Hellfeldbild der gleichen Membran nach dem Tearing. Der defekte Bereich wird durch den blauen gestrichelten Umriss angezeigt. (F) Vergrößerte Ansicht des in D gezeigten Risses, wobei der Rand der gerissenen Membran durch blaue Pfeile gekennzeichnet ist. Maßstabsleisten = 1 mm (D,E), 200 μm (F). Abkürzungen: FN = Fibronektin; PBS = phosphatgepufferte Kochsalzlösung; PET = Poly(ethylenterephthalat). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 5: Keratinozyten (HaCaT), kultiviert auf der FN-Seidenmembran. An Tag 1 haben sich die Keratinozyten festgesetzt und die Oberfläche der Membran auf der apikalen (A.i) oder basalen Seite (B.i) gleichmäßig bedeckt (Phalloidin, grün). An Tag 3 wird eine konfluente Monoschicht auf der apikalen (A.ii) oder basalen (B.ii) Seite (Phalloidin, grün) etabliert. (C) Bewertung der Zellviabilität auf der Seidenmembran (i-iv) im Vergleich zu einer kommerziellen PET-Membran (v-viii) in der Mitte (i, ii, v, vi) und Peripherie (iii, iv, vii, viii) der Zellschicht. Lebende Zellen sind in grün (i, iii, v, vii) und tote Zellen in rot (i, iii, v, vii) oder weiß (ii, iv, vi, viii) dargestellt. Die gestrichelte Linie markiert die Membran-Einsatz-Interphase. (D) Im Detail vergrößert, (i) zeigt (weiße Pfeile) die Zelladhäsion an der Membran (Phalloidin, weiß) und (ii) ein Tight-Junction-Netzwerk, das sich nach 3 Tagen in Kultur gebildet hat (ZO-1, weiß). Maßstabsleisten = 1 mm (obere Reihe: A,B), 100 μm (untere Reihe: A,B,CI, II, V, VI), 500 μm (C iii, iv, vii, viii), 50 μm (D). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Tabelle 1: Überblick über frühere Arbeiten, bei denen Membranen in Zellkulturinsertionen integriert wurden. Abkürzungen: PCL = Polycaprolacton; PEGDA = Poly(ethylenglykol)diacrylat; PLGA = Poly(milchsäure-co-glykolsäure); PDMS = Polydimethylsiloxan; PC = Polycarbonat; RSS = Rekombinantes Spinnenseidenprotein; PLCL = Poly(lactid-co-caprolacton); RHSIF = Rekombinante Schleim-Zwischenfilament-Proteine Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Tabelle 2: Überblick über frühere Arbeiten, die die verschiedenen Zelltypen zusammenfassen, die auf den FN-Seidenmembranen kultiviert wurden. FN-4repCT (FN-Seide) ist eine Kurzversion der Schleppleinenseide von Euprosthenops australis, die rekombinant hergestellt und mit einem RGD-Motiv aus Fibronektin auf genetischer Ebene funktionalisiert wird. Dieses Protein wird in allen hier zusammengefassten Fällen verwendet. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Tabelle 3: Fehlerbehebung. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Ergänzende Datei 1: Designdatei (.stl) für den 3D-Druck der Einsätze. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Datei 2: Protokoll für Druck, Nachbehandlung und Sterilisation bei Verwendung des Druckers und des in der Materialtabelle angegebenen Harzes. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung S1: Schematische Darstellung des Musters, das beim Platzieren der FN-Seidenlösung in der 48-Well-Platte verwendet werden soll. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Diskussion

Das hier beschriebene Protokoll skizziert einen einfachen Weg, biologisch relevante Zellkulturinsertionen herzustellen. Es beginnt mit dem Drucken der Inserts, gefolgt von der Bildung und Befestigung von FN-Seidenmembranen und endet mit der Darstellung, wie Zellen sowohl auf der apikalen als auch auf der basalen Seite der Membran ausgesät werden können. Es gibt einen wirklich entscheidenden Schritt in diesem Protokoll, um den langfristigen Erfolg von Zellkulturen zu gewährleisten, und das ist das Absenken und Anheben der Inserts auf die Membran. Die erfolgreiche Durchführung dieser Schritte wird zu einem Seidenmembran-Einsatz-Kultursystem führen, das in der Lage ist, Zellkulturen ähnlich wie kommerziell erhältliche Systeme mit synthetischen Membranen zu widerstehen. Um dies zu gewährleisten, wurden an den Seiten der speziell angefertigten Einsätze Führungsschienen implementiert, die verhindern, dass diese schräg abgesenkt oder seitlich in der Vertiefung verschoben werden, was zu einer ungleichmäßigen Membranhaftung führen würde, die Schwachstellen und in der Folge Leckagen erzeugen würde. Es kommt häufig vor, dass kleinere Probleme auftreten, wenn ein Protokoll zum ersten Mal befolgt wird. Um dem neuen Benutzer zu helfen, sie zu umgehen, sollten sie auftreten, während er das oben beschriebene Protokoll befolgt, haben wir in Tabelle 3 mögliche Probleme und deren Lösungen skizziert.

Es hat sich gezeigt, dass die Membran selbst für die Modellierung verschiedener Barrieregewebe von Vorteil ist (siehe Tabelle 2). Es sollte jedoch darauf hingewiesen werden, dass das Harz, das zum Drucken der hierin enthaltenen Einsätze verwendet wird, nicht ausgiebig auf seine Wirkung auf die Lebensfähigkeit anderer Zelltypen getestet wurde. Obwohl wir bisher keine derartigen Probleme festgestellt haben, ist es möglich, dass das Harz die Lebensfähigkeit und das Wachstum einiger empfindlicher Zellen negativ beeinflussen könnte. Es wird daher empfohlen, einen ähnlichen Viabilitätstest wie den hier vorgestellten durchzuführen, um die Kompatibilität des Harzes mit jedem verwendeten Zelltyp zu überprüfen. Wenn Zytotoxizität auftritt, sollte ein gründlicheres Aushärtungs- und/oder Auslaugungsprotokoll erstellt werden, um zu verhindern, dass nicht ausgehärtete Monomere im Laufe der Zeit auslaugen und die Zellen schädigen. Ein Beispiel für ein solches Protokoll, das für das Harz verwendet wurde, mit dem die Einsätze innerhalb dieses Protokolls gedruckt wurden, findet sich in der Zusatzdatei 2. Dieses Protokoll wurde zuvor verwendet, um Inserts für die Kultivierung von bEnd.3 brain endothelial auf Seidenmembranen für bis zu 8 Tage vorzubereiten¹⁵.

Der Hauptvorteil der in dieser Arbeit vorgestellten Methode besteht darin, dass sie eine einfache Möglichkeit bietet, aktuelle plastische Membranen auf Gewebekultureinsätzen zu ersetzen und somit statische Gewebekulturmodelle zu verbessern. Die Haupteinschränkung besteht darin, dass der Benutzer Zugang zu 3D-Druckgeräten benötigt oder Zeit in einer Einrichtung kaufen muss, um seine Einsätze zu drucken. Dies könnte jedoch bei Bedarf umgangen werden, indem nach der Entfernung der Membranen kommerzielle Gewebekultureinlagen verwendet werden. Darüber hinaus können die Seidenmembranen zwar im Wesentlichen als reguläre Gewebekultureinlagen verwendet werden, sind aber dünner und haben eine Proteinzusammensetzung und sind daher empfindlicher als ihre derzeitigen synthetischen kommerziellen Gegenstücke. Daher müssen sie von den Benutzern sorgfältiger behandelt werden und müssen feucht gehalten werden, um ihre Elastizität zu erhalten. Zu beachten ist, dass die Membranen dem Dehnen und Aufblasen standhalten können^16,17, wodurch sie sich beispielsweise zur Nachahmung von Atembewegungen eignen. Trotzdem ist es wahrscheinlich, dass neue Benutzer einige Membranen in der Anfangsphase zerbrechen werden, aber mit zunehmender Erfahrung im Umgang mit Membranen wird erwartet, dass die Erfolgsquote steigt. Wenn weiterhin Probleme auftreten, sollte der Benutzer zur Fehlerbehebung in Tabelle 3 nachsehen.

In den letzten zehn Jahren wurden mehrere Alternativen zu den kommerziellen Kunststoffeinsätzen vorgestellt (Tabelle 1), und jedes Mal, wenn die Leistung von Zellkulturen verglichen wurde, haben die neuen, biologisch relevanteren Membranen bessere Ergebnisse erzielt als ihre kommerziellen Kunststoff-Pendants 2,5,6,7,14,22. Dies wurde vor allem in Bezug auf eine verbesserte Barrierefunktion^beobachtet 2,5,6,7,14,22, aber auch in Bezug auf die Bildung von mehr nativem Zellwachstum¹⁴ und erhöhte Wechselwirkungen durch die Membran in Co-Kultursystemen 7 . Dieser Trend wurde bereits bei der Etablierung eines Blutgefäßwandmodells für die FN-Seidenmembranen beobachtet. In dieser Studie wurden HDMEC- und glatte Muskelzellen (SMCs) auf gegenüberliegenden Seiten der Membran gezüchtet. Es konnte gezeigt werden, dass die SMCs bei der Co-Kultivierung mit dem HDMEC auf den FN-Seidenmembranen im Vergleich zu den kommerziellen PET-Membranen eine dickere ECM sezernierten. In ähnlicher Weise errichtete das HDMEC eine engere Barriere auf den FN-Seidenmembranen¹⁷. Die verbesserten Zellkulturergebnisse sind wahrscheinlich auf eine verbesserte zelluläre Kommunikation und mehr In-vivo-ähnliche Kultivierungsbedingungen zurückzuführen. Die FN-Seidenmembran kommt der nativen BM in Bezug auf Dicke, Struktur und mechanische Eigenschaften deutlich näher. Die native BM ist zwischen 20 nm und 3 μm²² dünn, die PET-Membranen 10 μm und die FN-Seidenmembranen etwa 1 μm und liegen damit deutlich im nativen Bereich. Die Struktur der FN-Seidenmembran ist ebenfalls nanofibrillär¹⁶, genau wie die native BM²², während die PET-Membran aus Kunststoff mit spurgeätzten Poren besteht, die in der Regel zwischen 0,4 μm und 8 μm Durchmesser^{haben 7}. Die PET-Membranen sind auch viel steifer als die BM und haben einen Elastizitätsmodul von etwa 2 GPa, verglichen mit der BM, die von kPa bis MPa reicht, aber im Allgemeinen mit etwa 250-500 kPa²² angegeben wird. Die FN-Seidenmembranen haben einen Elastizitätsmodul von 115 kPa¹⁶, was innerhalb der nativen Bedingungen liegt. Es sollte auch beachtet werden, dass, sobald Zellen auf der Membran gewachsen sind, ihre Stärke zum dominierenden Faktor wird, nicht die Membran selbst¹⁷. Abschließend ist auch zu beachten, dass die integrierte Funktionalisierung des FN-Seidenproteins dafür sorgt, dass die Zellen direkt an der Membran haften und somit eine Beschichtung nicht notwendig ist. Bei PET-Membranen ist es oft Standard, mit einem EZM-Protein zu beschichten, um eine korrekte Zelladhäsion zu gewährleisten⁷.

Vergleicht man die FN-Seidenmembran mit anderen Ansätzen, die zur Substitution der PET-Membran verwendet werden (siehe Tabelle 1), so ist der Hauptvorteil unserer Methode die Verwendung des rekombinant hergestellten funktionalisierten Seidenproteins. Dies gewährleistet Reproduzierbarkeit und definierte Kulturbedingungen im Gegensatz zu anderen proteinbasierten, tierischen Materialien wie Kollagen. Beachten Sie nochmals, dass die Funktionalisierung des Proteins sicherstellt, dass keine Beschichtungen erforderlich sind, da die Zellen gut an den Membranen haften, da sie¹⁷ sind. Darüber hinaus basiert die hierin beschriebene Herstellung von Membranen auf Seidenbasis auf Selbstorganisation und erfordert keine komplexe Einrichtung oder den Einsatz aggressiver Chemikalien, im Gegensatz zu vielen anderen Techniken, die beispielsweise auf Elektrospinnen beruhen. Durch die spontane Adhäsion der Membran auf dem Einsatz entfällt auch die manuelle Handhabung von zweiteiligen Einsätzen, Verklebungen und Silikon-Montageringen, wodurch die Skalierung vereinfacht und eine einfache Reproduzierbarkeit in jedem Labor ermöglicht wird. Neben der einfachen Herstellung lässt sich unser Verfahren leicht an die experimentellen Bedürfnisse des Benutzers anpassen, da verschiedene Einsatzmaterialien verwendet werden können und die Membrandicke durch Einstellen der Seidenkonzentration der Ausgangslösung eingestellt werden kann¹⁶. Schließlich kann dieses Protokoll unseres Wissens nach die bisher dünnste freistehende Membran liefern, die an einem Gewebekultureinsatz befestigt ist, was die größte Ähnlichkeit mit der nativen Basalmembran ermöglicht.

Das hier vorgestellte Protokoll zur Bildung und Handhabung von Seidenmembranen ist für jeden, der es gewohnt ist, mit Gewebekultureinsätzen in einem Zellkulturlabor zu arbeiten, einfach zu verwenden. Es ist ein einfacher Weg, um von plastischen Membranen zu einem eher in vivo-ähnlichen Gegenstück überzugehen, was die Generierung relevanterer Gewebemodelle unter Verwendung verschiedener Zelltypen ermöglicht (Tabelle 2). Die Seidenmembranen können Zellkulturen auf ihrer apikalen oder basalen Seite sowie beidseitig Co-Kulturen verschiedener Zelltypen unterstützen¹⁷. Die auf den Seidenmembranen entwickelten Barrieregewebemodelle können für das gleiche Anwendungsspektrum wie die Gewebekultureinsätze verwendet werden, einschließlich Wirkstoffscreenings sowie Permeations- und Infektionsstudien. In Fällen, in denen die Wechselwirkung zwischen verschiedenen Zelltypen von Interesse ist, wurde gezeigt, dass sie die TC-Inserts aufgrund ihrer eher in vivo-ähnlichen Eigenschaften übertreffen¹⁷.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
CHEMICALS
Alexa Fluor 488	Invitrogen; Thermo Fisher Scientific	A-21121	Ziege Anti-Maus, Verdünnung 1:500
Alexa Fluor 488 Phalloidin	Invitrogen; Thermo Fisher Scientific	A12379	Verdünnung 1:400
Anti-ZO-1 (1A12) Antikörper	Invitrogen; Thermo Fisher Scientific	33-9100	Maus Anti-Human, monoklonal, Verdünnung 1:200
Dextran, Alexa Fluor 680; 3.000 MW, anionisches	Invitrogen; Thermo Fisher Scientific	D34681	2,5 % (w/v) in 200 μl Kulturmedium
DMEM/F-12	Gibco verdünnt; Thermo Fisher	Scientific 31330095	Ergänzt mit 5 % v/v FBS und 1 % v/v Penicillin-Streptomycin-Ethanol
	Solveco	1326	70% (CAS-Nr. 64-17-5)
Fötales Rinderserum, qualifiziert, hitzeinaktiviert, USA	Gibco; Thermo Fisher Scientific	16140071
FN-silk	Spiber technologies AB		Store bei -80 ° C
Isopropanol, EMPARTA ACS analytisches Reagenz	Supelco	1096342511	≥ 99,5 % (CAS-Nr. 67-63-0)
Lebend-/Totlebensfähigkeits-/Zytotoxizitätskit	Invitrogen; Thermo Fisher Scientific	L3224
PBS	Schwedisches Veterinäramt / Statens veterinä Rmedicinska anstalt	992420	ohne Ca und Mg, filtriertes
Penicillin-Streptomycin (10.000 U/ml)	Gibco; Thermo Fisher Scientific	11548876
MATERIAL
Denthouse	durchsichtiges Harz	#DLCL-01
HaCaT-Zellen	CLS	300493
Nunc mit Zellkulturen behandelte Multischalen 24-Wells	Fisher Scientific	10604903
Nunc mit Zellkulturen behandelte Multischalen 48-	wel Fisher Scientific	10644901
TC-Einsatz, für 24-Well-Platten, PET, transparent	Sarstedt	83.3932.041	Porengröße: 0,4 µ m
ThinCert Zellkultureinsätze, transluente Membran (PET)	Greiner	662640	Porengröße: 0,4 µ m
EQUIPMENT
EVOM Messgerät mit Essstäbchen	World Precision Instruments (WPI) Deutschland, GMBH
Form 3B	FormLabs
Form Wash	FormLabs
Form Cure	FormLabs
Isotemp General Purpose Deluxe Water Baths	Fisherbrand
Inverses Fluoreszenzmikroskop Eclipse Ti	Nikon
Inverses Fluoreszenzmikroskop DMI6000 B	Leica
Laminar-Flow-Haube Ninosafe, Klasse II	Labolutions
Midi CO2  Inkubator, 40 L	Thermo Scientific