Ein multiples integriertes soziales Stressmodell für psychiatrische Störungen bei weiblichen C57BL/6J-Mäusen

Hunderte Millionen Menschen leben mit psychiatrischen Störungen, wobei Angstzustände und depressive Störungen am häufigsten sind. Nach Angaben der Weltgesundheitsorganisation lebten im Jahr 2019 weltweit mehr als 280 Millionen bzw. 301 Millionen Menschen mit Depressionen und Angstzuständen¹. Aufgrund der COVID-19-Pandemie ist die Zahl der Menschen, die von Angstzuständen und depressiven Störungen betroffen sind, innerhalb von nur einem Jahr deutlich gestiegen – um 26 % bzw. 28 %. Bei den Betroffenen ist die Lebenszeitprävalenz psychiatrischer Störungen bei Frauen fast doppelt so hoch wie bei Männern², wobei Frauen schwerere Symptome, größere Funktionsbeeinträchtigungen, atypische depressive Phänotypen, häufigere Rückfälle und ein geringeres Ansprechen auf Medikamente aufweisen ^3,4,5.

Obwohl Geschlechtsunterschiede in vielen Aspekten psychiatrischer Störungen gut dokumentiert sind ^6,7,8, konzentrierte sich die meiste präklinische Forschung überwiegend auf männliche Probanden, vor allem aufgrund des Mangels an geeigneten weiblichen Tiermodellen ^9,10. Infolgedessen ist die Pathogenese dieser Erkrankungen bei Frauen nach wie vor wenig verstanden. Dies unterstreicht die dringende Notwendigkeit, Tiermodelle zu entwickeln, die weibliche Probanden einbeziehen, um die Untersuchung der neurobiologischen Mechanismen zu erleichtern, die psychiatrischen Störungen bei Frauen zugrunde liegen.

Eine zunehmende Anzahl von sozialen Stressmodellen für weibliche Mäuse wurde entwickelt, die auf dem Paradigma des wiederholten sozialen Niederlagenstresses (RSDS) basieren 11,12,13,14. Zum Beispiel beinhalteten zwei kürzlich etablierte RSDS-Modelle bei weiblichen Mäusen eine künstliche Verstärkung der männlichen Aggression durch die Verabreichung von männlichem Urin an weibliche Mäuse und eine chemogenetische Aktivierung der ventrolateralen Unterteilung des ventromedialen Hypothalamus bei männlichen Aggressoren 11,12,13. Es wurde jedoch argumentiert, dass diese induzierten aggressiven Verhaltensweisen nicht natürlich vorkommen und möglicherweise keine relevanten Stressoren für weibliche Mäuse darstellen¹⁰. Darüber hinaus erschwert eine Schwangerschaft, die aus dem Reitverhalten resultiert, nachfolgende mechanistische Studien.

Ein weiteres RSDS-basiertes modifiziertes Modell ist das stellvertretende soziale Niederlagenstress-Paradigma, bei dem weibliche Mäuse visuell Zeugen einer intermännlichen sozialen Niederlage^{sind 12}. Protokolle zur sozialen Niederlage zwischen Weibchen wurden auch bei verschiedenen Nagetierstämmen entwickelt 14,15,16. Trotz einiger Bedenken scheinen die sozialen Stressoren, die in den beiden letztgenannten Modellen verwendet werden, für psychiatrische Störungen beim Menschen ätiologisch relevanter zu sein¹⁴. Ein ideales Depressionsmodell erfordert eine konstruktale (ätiologische) Validität, was bedeutet, dass die im Modell verwendeten stressauslösenden Methoden die realen Ursachen der Störung genau widerspiegeln müssen.

Es wird angenommen, dass die Ätiologie psychiatrischer Störungen multifaktoriell ist und biologische, genetische, umweltbedingte und psychosoziale Faktoren umfasst. Die Manipulation dieser Risikofaktoren bei Labortieren ist essentiell für die Entwicklung relevanter Modelle für die mechanistische Forschung und das Wirkstoffscreening. Sowohl soziale als auch nicht-soziale Tiermodelle, die einen oder mehrere Stressoren simulieren, können Kernsymptome und neurobiologische Veränderungen replizieren, die mit psychiatrischen Störungen beim Menschen verbunden sind. Zum Beispiel induziert das Modell des chronischen milden Stresses (CMS) stabile und effektive neuropathologische und depressive Verhaltensphänotypen durch zufällig abwechselnde Kombinationen mehrerer physischer Stressoren (z. B. nasse Bettwäsche, Schwanzaufhängung, Schwanzklemmung, Fasten)17,18,19,20,21,22,23. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die wiederholte Modellierung mehrerer Risikofaktoren eine praktikable Strategie für die Konstruktion von Paradigmen zur Erforschung psychiatrischer Störungen ist. Das Modell des chronischen sozialen Niederlagenstresses (CSDS) ist eines der am weitesten verbreiteten Paradigmen für Depressionen, das soziale Stressoren simuliert 24,25,26. Obwohl dieses Modell auf die Nachahmung einer einzigen Art von Stressor beschränkt ist, hat seine ätiologische Relevanz zu erheblichen Fortschritten in der translationalen Forschung geführt. Zum Beispiel haben CSDS-basierte Studien Kalium (K⁺)-Kanäle auf dopaminergen Neuronen im ventralen tegmentalen Bereich als Schlüsselziele identifiziert, die die Widerstandsfähigkeit gegen Depressionen vermitteln, und haben KCNQ-Typ-K⁺-Kanalöffner - wie Retigabin (Ezogabin) - als vielversprechende Antidepressiva-Kandidaten sowohl bei depressiven Mäusen als auch bei Patienten mit Depressionen hervorgehoben 27,28,29,30,31. Infolgedessen haben mehrere bahnbrechende Studien versucht, das CSDS-Paradigma zu modifizieren, um weibliche Depressionen zu modellieren, indem sie weibliche Aggression induzierten^11,12. Die oben genannten Beweise unterstützen die Vorstellung, dass die Integration mehrerer sozialer Stressoren bei wiederholter Exposition eine wichtige Richtung für die Entwicklung psychiatrischer Modelle bei weiblichen Tieren darstellt.

In weiblichen C57BL/6J-Mäusen wurde kürzlich ein 10-Tage-Paradigma für multiplen integrierten sozialen Stress (MISS) entwickelt, um psychiatrische Störungen zu modellieren, das zuverlässige ätiologische, Gesichts-, Konstrukt- und prädiktive Validitäten demonstriert³². Um das MISS-Modell zu etablieren, wurden weibliche C57BL/6J-Mäuse jeden Tag an 10 aufeinanderfolgenden Tagen nach dem Zufallsprinzip vier aufeinanderfolgenden Stressoren ausgesetzt: Versagen im sozialen Wettbewerb (Röhrentest), modifizierter stellvertretender sozialer Niederlagenstress, unausweichlicher Überfüllungsstress und anschließende soziale Isolation³². Diese Studie bietet ein detailliertes Protokoll zur Modellierung des MISS-Paradigmas.

Alle Versuchsverfahren wurden vom Ausschuss für Tierpflege und -verwendung der Xuzhou Medical University genehmigt (Zulassungsnummer 202207S127) und in Übereinstimmung mit den Richtlinien der National Institutes of Health für die Pflege und Verwendung von Labortieren durchgeführt. C57BL/6J weibliche Mäuse (7-8 Wochen alt für Probandenmäuse; 10-14 Wochen alt für Siegerkandidaten), C57BL/6J männliche Mäuse (7-8 Wochen alt für aggressives CD1-Screening) und CD1 pensionierte Zuchtmäuse, die in diesen Experimenten verwendet wurden, wurden aus einer kommerziellen Quelle gewonnen. Alle Mäuse wurden unter einem 12-stündigen Hell-Dunkel-Zyklus untergebracht, wobei Futter und Wasser ad libitum zur Verfügung gestellt ^{wurden 33}. Vor Beginn des MISS-Paradigmas wurden grundlegende Verhaltensmessungen durchgeführt - wenn auch nicht unbedingt für jede Kohorte -, um sicherzustellen, dass die nachfolgenden Verhaltensergebnisse auf die Stressbelastung und nicht auf die individuelle Variabilität zurückzuführen waren. Eine Übersicht über das vollständige Protokoll ist in Abbildung 1 dargestellt, und die abgeschlossenen Versuchsaufbauten sind in Abbildung 2 dargestellt. Einzelheiten zu den in dieser Studie verwendeten Reagenzien und Geräten sind in der Materialtabelle enthalten.

1. Gewöhnung

1. Gewöhnung an die Umwelt
   1. Bestimmen Sie einen separaten Raum ausschließlich für das MISS-Protokoll, in dem die Temperatur (23 °C ± 2 °C), die Luftfeuchtigkeit (50 %-60 %) und die Lichtintensität (15-20 Lux) in einem 12-stündigen Hell-Dunkel-Zyklus konstant bleiben.
      HINWEIS: Sofern nicht anders angegeben, sollten Sie während des gesamten Modellierungszeitraums Mäuse in diesem Raum unterbringen.
   2. Standard-Mäusekäfige (L × B × H: 37 cm × 16 cm × 12 cm) mit Stahldrahtdeckeln und Maiskolbeneinstreu vorbereiten.
   3. Verwenden Sie weibliche C57BL/6J-Mäuse im Alter von 7-8 Wochen als Versuchsmäuse. Ordnen Sie die Mäuse nach dem Zufallsprinzip naiven und MISS-Gruppen zu und halten Sie sie bei fünf Mäusen pro Käfig.
      HINWEIS: Wählen Sie für den Versuch weibliche Mäuse mit vergleichbarem Alter und Körpergewicht aus.
   4. Verwenden Sie weibliche C57BL/6J-Mäuse im Alter von 10-14 Wochen als Kandidaten für das Gewinner-Screening³⁰. Halten Sie diese Mäuse in Vierergruppen pro Käfig, um stabile soziale Ränge zu etablieren.
   5. Verwenden Sie männliche CD1-Zuchtmäuse als Aggressorkandidaten. Halten Sie CD1-Mäuse einzeln unter, um die Territorialität zu etablieren und Kämpfe zu verhindern. Verwenden Sie in Kohorten aufgezogene männliche C57BL/6J-Mäuse (5 Mäuse pro Käfig im Alter von 7-8 Wochen) als Eindringlinge für ein aggressives CD1-Screening.
   6. Lassen Sie alle Mäuse sich nach dem Kauf 7 Tage lang an den Transportstress gewöhnen und erholen (Abbildung 1A1).
   7. Halten Sie alle Mäuse mit Futter und Wasser ad libitum zur Verfügung.
2. Gewöhnung an Rohre und Handhabung
   1. Platzieren Sie ein kurzes Acrylrohr (Abbildung 2A; 10 cm lang, 26 mm Innendurchmesser) in jedem Käfig mit weiblichen Probandmäusen und Gewinnerkandidaten. Lassen Sie die Mäuse sich an die Röhren gewöhnen und lernen Sie, sie 3 Tage lang zu passieren.
      HINWEIS: Der Durchmesser des Rohrs sollte gerade ausreichend sein, damit eine erwachsene Maus reibungslos passieren kann, ohne sich umzudrehen.
   2. Behandeln Sie weibliche Probandenmäuse und Gewinnerkandidaten 3 Tage lang 1-2 Minuten/Tag, um Stress im Zusammenhang mit unbekannten Experimentatoren zu reduzieren (Abbildung 1A2).
   3. Markieren Sie am Ende der Gewöhnungsphase den Schwanz jeder Maus mit einem roten oder schwarzen Marker auf Ölbasis.
      HINWEIS: Überprüfen Sie die Markierungen regelmäßig und bringen Sie sie bei Bedarf erneut an.

2. Training für den Tubenwettbewerb, das Siegerscreening und das CD1-Aggressor-Screening

1. Training für Tube-Wettkämpfe
   HINWEIS: Einzelheiten zu diesem Verfahren finden Sie in den vorherigen Berichten ^32,34.
   1. Bereiten Sie weibliche Probandenmäuse, weibliche Gewinnerkandidatinnen, transparente Acrylröhren (Abbildung 2B; 30 cm lang, 26 mm Innendurchmesser), Plastikstäbchen, 75% Ethanol und Papiertücher vor. Reinigen Sie den Tisch, die Tuben und die Kunststoffstäbchen mit 75 % Ethanol, um Geruchsreize zu beseitigen.
   2. Fassen Sie vorsichtig den Schwanz jeder weiblichen Probandenmaus oder Gewinnerkandidatin und legen Sie die Maus auf den Tisch. Lassen Sie es ca. 1 Minute lang frei erkunden, um die Umgebung zu akklimatisieren.
   3. Halten Sie die Maus am Schwanz fest und platzieren Sie sie an einem Ende des Rohrs.
      HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass der Kopf der Maus zum Ende des Rohrs zeigt und die Vorderpfoten den Tisch berühren, um Stress zu minimieren und den Einstieg zu erleichtern.
   4. Lassen Sie den Schwanz los, sobald die Maus in die Röhre eindringt, und lassen Sie sie freiwillig passieren.
      HINWEIS: Berühren Sie mit einem Plastikstäbchen vorsichtig das Heck, wenn die Maus stoppt oder versucht, den Rückwärtsgang einzulegen.
   5. Platzieren Sie die Maus am gegenüberliegenden Ende des Rohrs und wiederholen Sie Schritt 2.1.4. Zählen Sie die Schritte 2.1.3 - 2.1.5 als einen Zyklus.
   6. Die Schritte 2.1.3 und 2.1.5 sind für zwei Zyklen zu wiederholen (Abbildung 1B1).
   7. Bringen Sie die Maus in ihren Heimatkäfig zurück. Reinigen Sie die Tube mit 75 % Ethanol, um Gerüche, Urin und Fäkalien zu entfernen.
      HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Tube sauber, trocken und frei von Alkoholresten ist, bevor Sie sie mit der nächsten Maus verwenden.
   8. Wiederholen Sie die Schritte 2.1.2 bis 2.1.7 für alle weiblichen Mäuse an 3 aufeinanderfolgenden Tagen und stellen Sie sicher, dass sich jede Maus an den Durchgang durch die Röhre gewöhnt hat.
2. Auswahl der Gewinner
   HINWEIS: Einzelheiten zu diesem Verfahren finden Sie in den vorherigen Berichten ^32,34.
   1. Bereiten Sie weibliche Gewinnerkandidatinnen, Tuben (30 cm lang, 26 mm Innendurchmesser), Plastikstäbchen, 75% Ethanol, Papiertücher und einen Timer vor. Reinigen und trocknen Sie das Gerät, um Geruchshinweise zu minimieren.
   2. Trainieren Sie vor dem Screening jede Maus so, dass sie einen Zyklus lang durch die Röhre geht. Zeichnen Sie eine sichtbare Mittellinie auf das Rohr.
   3. Halten Sie beide Mäuse an ihren Schwänzen fest und platzieren Sie sie an gegenüberliegenden Enden der Röhre. Lassen Sie sie in der Mitte eintreten und sich treffen, lassen Sie sie dann gleichzeitig los und starten Sie den Timer.
      HINWEIS: Verwenden Sie für jeden Wettkampf Mäuse aus demselben Käfig.
   4. Identifizieren Sie den "Gewinner" als die Maus, die die andere aus der Röhre schiebt; Vergeben Sie 1 Punkt. Der "Verlierer" erhält 0 Punkte.
      HINWEIS: Verwenden Sie einen Plastikstab, um zu verhindern, dass sich der Gewinner zurückzieht. Wenn beide Mäuse erstarren und sich nicht innerhalb von 1 Minute zurückziehen, berühren Sie vorsichtig den Schwanz jeder Maus mit Plastikstäbchen, um Maßnahmen zu ergreifen.
   5. Kehren Sie die Ausgangspositionen der Mäuse um und wiederholen Sie die Schritte 2.2.3 bis 2.2.4, um das Ergebnis erneut zu bewerten (Abbildung 1B2).
   6. Setzen Sie beide Mäuse in ihren Käfig zurück und reinigen Sie das Röhrchen gründlich mit 75% Ethanol.
   7. Verwenden Sie ein Round-Robin-Format, um jede Maus mit allen anderen Cage Mates abzugleichen, und wiederholen Sie die Schritte 2.2.3 bis 2.2.5 für jedes Paar.
      HINWEIS: Dieser Ansatz gewährleistet ein umfassendes und faires Ranking.
   8. Ordnen Sie Mäuse basierend auf der Gesamtpunktzahl ein. Wählen Sie die Maus mit der höchsten Punktzahl in jedem Käfig als "Gewinner" für nachfolgende Experimente aus.
3. CD1-Aggressor-Screening
   HINWEIS: Einzelheiten zu diesem Verfahren finden Sie im vorherigen Bericht³⁵.
   1. Bereiten Sie CD1-Zuchtmäuse im Ruhestand, männliche C57BL/6J-Mäuse (Eindringlinge) und einen Timer vor.
   2. Platzieren Sie eine männliche C57BL/6J-Maus für 3 Minuten direkt in den Heimkäfig eines CD1-Männchens (ansässiger Aggressor).
      HINWEIS: Der Eindringling kann während der Sitzung nicht entkommen.
   3. Notieren Sie die Latenz bis zum ersten Angriff, die Anzahl der Angriffe und die Dauer aggressiven Verhaltens innerhalb des 3-Minuten-Zeitraums als Indikatoren für die Aggressivität.
   4. Wiederholen Sie die Schritte 2.3.2 bis 2.3.3 einmal täglich an 3 aufeinanderfolgenden Tagen mit täglich wechselnden Eindringlingen (Abbildung 1B3).
   5. Wählen Sie CD1-Mäuse als Aggressoren für weitere Experimente aus, basierend auf zwei Kriterien: (1) Sie müssen in mindestens zwei der drei Sitzungen angegriffen haben, und (2) ihre Angriffslatenz muss in jeder Sitzung weniger als 1 Minute betragen.

3. Modellierung

HINWEIS: Dieser Schritt beinhaltet eine zufällige Exposition gegenüber sozialem Konkurrenzversagen im Röhrentest, modifiziertem stellvertretendem sozialem Niederlagenstress und unausweichlichem Überfüllungsstress, gefolgt von sozialer Isolation, für 10 aufeinanderfolgende Tage.

1. Scheitern des sozialen Wettbewerbs
   HINWEIS: Einzelheiten finden Sie in den vorangegangenen Berichten^32,34.
   1. Bereiten Sie weibliche Probandenmäuse, gescreente "Gewinner"-Mäuse, Röhrchen (30 cm lang, 26 mm Innendurchmesser), Plastikstäbchen, 75 % Ethanol, Papiertücher und einen Timer vor.
   2. Weibliche Versuchsmäuse einzeln unterbringen (1 Maus pro Käfig) und naive Mäuse in Gruppen (5 Mäuse pro Käfig).
      HINWEIS: Bringen Sie die naiven Mäuse zu Beginn der Modellierung in neuartige Gruppenkäfige. Ein Wechsel zu einem neuen Käfig ist während der Modellierungsphase nicht erforderlich.
   3. Reinigen Sie den Tisch, die Tuben und die Kunststoffstäbchen mit 75 % Ethanol, um Geruchsreize zu beseitigen.
   4. Entfernen Sie Mäuse vorsichtig aus ihren Käfigen. Platzieren Sie eine MISS-Maus und eine "Gewinner"-Maus an gegenüberliegenden Enden der Röhre, so dass sie vorwärts gehen und sich in der Mitte treffen. Die MISS-Maus wird vom "Gewinner" aus der Röhre geschoben.
      HINWEIS: Die größere Größe, das höhere Körpergewicht und der dominante soziale Rang des "Gewinners" sorgen dafür, dass die experimentelle MISS-Maus den Röhrenwettbewerb fast immer verliert. Wenn die Mäuse länger als 30 s unbeweglich bleiben, berühren Sie den Schwanz des Gewinners vorsichtig mit einem Plastikstab, um das Schieben zu fördern.
   5. Tauschen Sie die Positionen der beiden Mäuse und wiederholen Sie Schritt 3.1.4. Zählen Sie die Schritte 3.1.4 und 3.1.5 als einen Zyklus.
   6. Bringen Sie die MISS- und "Gewinner"-Mäuse in ihre Heimkäfige zurück. Reinigen Sie den Tisch, das Rohr und den Kunststoffstab, um Gerüche zu entfernen.
   7. Führen Sie eine neuartige Gewinnermaus ein und wiederholen Sie die Schritte 3.1.4-3.1.5 mit derselben MISS-Maus. Jede MISS-Maus durchläuft somit zwei aufeinanderfolgende Zyklen fehlgeschlagener Röhrenkonkurrenz (Abbildung 1C1, Abbildung 2E).
   8. Wiederholen Sie die Schritte 3.1.4 bis 3.1.7 für alle MISS-Mäuse an 10 aufeinanderfolgenden Tagen.
2. Modifizierter stellvertretender sozialer Niederlagenstress
   1. Bereiten Sie gescreente aggressive CD1-Zuchtmäuse im Ruhestand (einzeln untergebracht), männliche C57BL/6J-Mäuse, weibliche MISS-Mäuse und perforierte Acrylabdeckungen vor (Abbildung 2C; L × B × H: 8 cm × 8 cm × 5,5 cm) mit Löchern (5 × 5 in der oberen Platte, 3 × 5 in den Seitenwänden; jedes Loch 0,5 cm Durchmesser).
   2. Platzieren Sie eine weibliche MISS-Maus in den Käfig eines CD1-Aggressors, der unter einer perforierten Acrylabdeckung eingeschlossen ist, um eine stellvertretende Beobachtung aggressiver Wechselwirkungen zu ermöglichen.
      HINWEIS: Überwachen Sie, ob die Acrylabdeckung mit der CD1- oder der MISS-Maus umkippen kann. Die Reduzierung der Maiskolbeneinstreu in den CD1-Käfigen hilft, ein Umkippen zu verhindern.
   3. Führen Sie eine männliche C57BL/6J-Eindringlingsmaus in den Käfig ein, um 10 Minuten lang von der CD1-Maus physisch angegriffen zu werden. Die weibliche MISS-Maus beobachtet die Interaktion durch die perforierte Abdeckung (Abbildung 1C2, Abbildung 2F).
      HINWEIS: Wenn die Eindringlingsmaus schwer verletzt ist, beenden Sie die Sitzung sofort und behandeln Sie das Tier. Die Verwendung von kleinen Maiskolben-Pellets verbessert das immersive Erlebnis für die MISS-Maus, indem sie die Verschiebung der Einstreu während des Kampfes verstärkt.
   4. Entfernen Sie nach 10 Minuten den männlichen Eindringling und gönnen Sie der weiblichen MISS-Maus weitere 5 Minuten sensorische Exposition gegenüber der CD1-Maus.
   5. Wiederholen Sie die Schritte 3.2.3 bis 3.2.4 noch zwei weitere Male mit verschiedenen männlichen Eindringlingen.
   6. Bringen Sie die MISS-Maus in ihren Heimatkäfig zurück. Überwachen und behandeln Sie alle Verletzungen bei den männlichen Eindringlingen.
   7. Reinigen Sie die perforierten Acrylabdeckungen und fegen Sie verschüttete Bettwäsche auf.
   8. Wiederholen Sie die Schritte 3.2.2 bis 3.2.5 mit einem neuartigen CD1-Züchter im Ruhestand an 10 aufeinanderfolgenden Tagen.
3. Unausweichlicher Überfüllungsstress
   1. Bereiten Sie weibliche MISS-Mäuse vor, eine weiße, undurchsichtige Hülle (Abbildung 2D; L × B × H: 14 cm × 10 cm × 20 cm), Standard-Mäusekäfige mit Maiskolbeneinstreu, 75 % Ethanol, Papiertüchern und einem Timer.
   2. Legen Sie die blickdichte Hülle in einen Standardkäfig mit Einstreu.
   3. Führen Sie 12-15 weibliche Mäuse (entweder alle MISS-Mäuse oder gemischt mit anderen Weibchen) täglich für 30 Minuten in die Hülle ein (Abbildung 1C3, Abbildung 2G).
      HINWEIS: Passen Sie die Anzahl der Mäuse an ihre Größe an, um ein Gedränge ohne Trampeln zu gewährleisten. Verhindern Sie ein Entkommen, indem Sie die Hülle bei Bedarf mit einem durchsichtigen perforierten Deckel abdecken.
   4. Bringen Sie die Mäuse in ihre Käfige zurück und reinigen Sie die Hülle mit 75% Ethanol.
   5. Wiederholen Sie Schritt 3.3.3 an 10 aufeinanderfolgenden Tagen.
4. Soziale Isolation
   1. Bereiten Sie weibliche MISS-Mäuse und Standard-Mauskäfige mit Maiskolbeneinstreu vor.
   2. Bringen Sie MISS-Mäuse einzeln unter, wenn sie für den Rest des 10-tägigen Modellierungszeitraums nicht unter sozialem Wettbewerbsversagen, stellvertretendem Niederlagenstress oder Überfüllungsstress leiden (Abbildung 1C4, Abbildung 2H).
      HINWEIS: Naive Mäuse werden vorsichtig am Schwanz in einen provisorischen Käfig gebracht und dann ohne Stressbelastung in ihren Heimatkäfig zurückgebracht. Stellen Sie Futter und Wasser ad libitum bereit, wie bei den MISS-Mäusen.

4. Verhaltenstests

HINWEIS: Verhaltensexperimente werden innerhalb einer Woche nach der Modellierung durchgeführt, um depressive und angstähnliche Verhaltensweisen bei Mäusen zu bewerten. Vor jedem Test werden die weiblichen Mäuse für 1 Stunde in den Verhaltenstestraum (15-20 Lux Beleuchtung) gebracht. Nach jedem Test werden die Mäuse in ihre ursprüngliche Haltungseinrichtung zurückgebracht.

1. Saccharose-Präferenztest
   HINWEIS: Einzelheiten finden Sie in den vorherigen Berichten 36,37,38.
   1. Bereiten Sie weibliche Probandenmäuse, Trinkflaschen (50 ml) mit Kugelschreibrohren, Standard-Mauskäfige mit Stahldrahtdeckeln, Saccharose, eine elektronische Waage, einen Messzylinder, einen Rührstab, Wägepapier, Wasser, ein Notizbuch und einen Stift vor.
   2. Halten Sie alle weiblichen Versuchsmäuse (naive und MISS-Mäuse) einzeln.
   3. Füllen Sie die Flaschen mit Trinkwasser (~2/3 des Volumens).
      HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass keine Flaschen auslaufen, bevor Sie mit dem Experiment beginnen.
   4. Stellen Sie jeder Maus zwei mit Wasser gefüllte Flaschen zur Verfügung, die nebeneinander gestellt werden, damit Sie sich 2 Tage lang daran gewöhnen können.
   5. Bereiten Sie 1% Saccharosewasser (1 g Saccharose pro 99 mL Wasser) vor.
   6. Ersetzen Sie zu Beginn des Tests das Wasser in einer Flasche durch 1%ige Saccharoselösung. Notieren Sie die Anfangsgewichte beider Flaschen.
   7. Erfassen Sie nach 12 h erneut die Flaschengewichte und tauschen Sie die Positionen der Flaschen aus, um Positionsverzerrungen zu vermeiden.
   8. Notieren Sie nach 24 Stunden die endgültigen Gewichte und berechnen Sie die Saccharosepräferenz wie folgt:Saccharosepräferenz (%) = (Saccharoseaufnahme / Gesamtflüssigkeitsaufnahme) × 100
   9. Bringen Sie die Mäuse am Ende des Tests mit normalen Wasserflaschen in ihre Käfige zurück.
   10. Reinigen Sie alle Flaschen und Kugelschreiberrohre gründlich mit Wasser.
2. Test der Heckaufhängung
   HINWEIS: Dieser Test³² kann je nach Versuchsdesign an derselben oder einer gesonderten Kohorte von Mäusen durchgeführt werden. In dieser Studie wurde es 3 Tage nach dem Saccharose-Präferenztest durchgeführt.
   1. Bereiten Sie weibliche Versuchsmäuse, eine Testbox für die Schwanzaufhängung (55 cm hoch × 60 cm breit × 12 cm tief), Klebeband, eine Stoppuhr, 75 % Alkohol und Papiertücher vor.
   2. Richten Sie das Video-Tracking-System³⁹ ein. Definieren Sie eine aktive Zone und starten Sie die Aufnahme.
   3. Reinigen Sie die Testbox mit 75% Ethanol.
   4. Kleben Sie die Maus vorsichtig ~2 cm vom Ende des Schwanzes entfernt ab und hängen Sie sie kopfüber auf, wobei Sie sicherstellen, dass ihr Kopf ~25 cm vom Boden der Box entfernt ist.
      HINWEIS: Minimieren Sie das Schwingen und vermeiden Sie unnötigen Stress.
   5. Aufzeichnen des Verhaltens mit der Tracking-Software³⁵ 6 Min. Verwenden Sie die Immobilitätszeit der letzten 4 Minuten für die Analyse.
      HINWEIS: Immobilität ist definiert als die Abwesenheit von Bewegung, wenn der Körper passiv hängt. Daten ausschließen, wenn die Maus herunterfällt oder nach oben klettert.
   6. Löse das Klebeband vorsichtig und setze die Maus wieder in ihren Heimatkäfig ein.
3. Test im Freigelände
   HINWEIS: Einzelheiten finden Sie in den vorangegangenen Berichten^40,41.
   1. Bereiten Sie weibliche Versuchsmäuse, eine Freifeld-Testbox (40 cm × 40 cm × 40 cm), 75 % Ethanol und Papiertücher vor.
   2. Richten Sie das Video-Tracking-System ein. Unterteile die Arena virtuell in 4 × 4 Unterbereiche; Definieren Sie die zentralen 4 Einheiten als zentrale Zone und den Rest als periphere Zone.
   3. Reinigen Sie die Testbox mit 75% Ethanol.
   4. Platzieren Sie die Maus des Motivs vorsichtig in der Mitte des Felds, wobei der Kopf in die gleiche Richtung zeigt. Lassen Sie es 5 Minuten lang erkunden.
      HINWEIS: Verwenden Sie für den Transfer eine Palette, um den Handhabungsaufwand zu reduzieren.
   5. Erfassen Sie die insgesamt zurückgelegte Strecke und die in der zentralen Zone verbrachte Zeit mit dem Video-Tracking-System.
   6. Bringen Sie die Maus am Ende des Tests wieder in ihren Heimatkäfig zurück und reinigen Sie das Gerät.
4. Erhöhter Plus-Labyrinth-Test
   HINWEIS: Einzelheiten finden Sie im vorherigen Bericht³².
   1. Bereiten Sie weibliche Mäuse, ein erhöhtes Plus-Labyrinth, 75% Ethanol und Papiertücher vor.
      HINWEIS: Das Labyrinth besteht aus zwei senkrechten Laufbahnen (50 cm über dem Boden) mit jeweils zwei Armen (30 cm lang × 5 cm breit). Ein Set hat 15 cm hohe Wände (geschlossene Arme), während das andere Set offen ist. Der mittlere Bereich beträgt 5 cm × 5 cm.
   2. Richten Sie das Video-Tracking-System ein und definieren Sie die offenen Arme, die geschlossenen Arme und den zentralen Bereich.
   3. Reinigen Sie das Labyrinth mit 75% Ethanol.
   4. Platzieren Sie die Maus vorsichtig in der Mitte des Labyrinths mit dem Blick auf einen offenen Arm. Erlauben Sie eine kostenlose Erkundung für 5 Minuten.
      HINWEIS: Verwenden Sie eine Palette, um die Belastung während der Platzierung zu minimieren.
   5. Erfassen Sie die in jedem Arm verbrachte Zeit mit dem Tracking-System.
      HINWEIS: Wenn eine Maus aus dem Labyrinth fällt, schließen Sie ihre Daten aus.
   6. Setze die Maus wieder in ihren Heimatkäfig ein und reinige das Labyrinth gründlich.

Um zu untersuchen, ob die MISS-Exposition depressive Verhaltensänderungen induziert, wurden weibliche C57BL/6J-Mäuse (n = 16 pro Gruppe; Stichprobengröße mittels Power-Analyse bestimmt, siehe Ergänzungsdatei 1 und Ergänzungsdatei 2), die dem MISS-Paradigma ausgesetzt waren, mit den Saccharose-Präferenz- und Schwanzaufhängungstests bewertet, die die Kernsymptome von Depression-Anhedonie bzw. Verhaltensverzweiflung bewerten (Abbildung 3A-F). Im Vergleich zu naiven Kontrollmäusen zeigten MISS-exponierte Mäuse eine signifikante Verringerung der Saccharosepräferenz, ohne dass sich die Wasseraufnahme entsprechend änderte (Abbildung 3C-D). Darüber hinaus zeigten Mäuse in der MISS-Gruppe eine erhöhte Immobilitätszeit im Test der Schwanzaufhängung (Abbildung 3F), was auf eine verstärkte Verhaltensverzweiflung hinweist.

Um zu beurteilen, ob die MISS-Exposition auch zu angstähnlichen Verhaltensweisen führt, wurden Mäuse im freien Feld und mit erhöhten Plus-Labyrinth-Paradigmen getestet. MISS-exponierte Mäuse verbrachten signifikant weniger Zeit in der zentralen Zone des offenen Feldes (Abbildung 4A-C) und in den offenen Armen des erhöhten Plus-Labyrinths (Abbildung 4D,E) im Vergleich zu naiven Kontrollen.

Zusammengenommen zeigen diese Ergebnisse, dass die Exposition gegenüber dem MISS-Paradigma bei weiblichen Mäusen sowohl depressive als auch angstähnliche Verhaltensweisen hervorruft.

Abbildung 1: Schematische Darstellung des MISS-Modells. (A) Gewöhnung: Versuchsmäuse erholten sich 7 Tage lang von Transportstress, gefolgt von 3 Tagen Sondengewöhnung und Handhabung. (B) Training und Screening: (B1) Versuchsmäuse mit Sondentraining wurden darauf trainiert, die Röhre zu durchlaufen, 2 Zyklen pro Tag an 3 aufeinanderfolgenden Tagen. (B2) Schematische Darstellung des Verfahrens des Gewinnerscreenings. (B3) Schematische Darstellung des aggressiven CD1-Screening-Verfahrens für pensionierte Züchter. (C) Modellierungsphase, bestehend aus randomisierter Exposition gegenüber drei Stressoren, gefolgt von sozialer Isolation für 10 aufeinanderfolgende Tage: (C1) Versagen im Sondenwettbewerb. (C2) Stellvertretender sozialer Niederlagenstress. (C3) Unausweichlicher Überfüllungsstress. (C4) Soziale Isolation. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Versuchsaufbau für das MISS-Paradigma. (A) Ein 10 cm langes Acrylrohr (Innendurchmesser: 26 mm), das zur Gewöhnung verwendet wird. (B) Ein 30 cm langes Acrylrohr (Innendurchmesser: 26 mm), das für den Röhrenwettbewerb verwendet wird. (C) Perforierter Bezug (L × B × H: 8 × 8 × 5,5 cm) für stellvertretenden sozialen Niederlagenstress. (D) Die Acrylhülse, die für die Überlastung verwendet wird. (E) Repräsentatives Bild des Röhren-Wettbewerbsverfahrens. (F) Foto eines stellvertretenden sozialen Niederlagen-Stress-Setups. (G) Top-Down-Ansicht des Overcrowding-Stress-Setups. (H) Foto einer Maus, die in sozialer Isolation untergebracht ist. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: MISS-Exposition induzierte depressive Verhaltensweisen bei weiblichen C57BL/6J-Mäusen. (A) Experimenteller Zeitplan. (B) Schematische Darstellung des Saccharosepräferenztests. (C) Saccharosepräferenz bei naiven vs. MISS-exponierte Mäuse (ungepaarter Student's t-Test, t30 = 3,108, **P < 0,01; n = 16 Mäuse pro Gruppe). (D) Gesamtflüssigkeitsaufnahme im Saccharose-Präferenztest (ungepaarter Student-t-Test, t30 = 0,8669, P > 0,05; n = 16 Mäuse pro Gruppe). (E) Schema der Prüfung der Hinterradaufhängung. (F) Immobilitätszeit im Test der Schwanzaufhängung (ungepaarter Student-t-Test, t30 = 2,589, *P < 0,05; n = 16 Mäuse pro Gruppe). Die Fehlerbalken stellen SEM dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4: MISS-Exposition induzierte angstähnliche Verhaltensweisen bei weiblichen C57BL/6J-Mäusen. (A) Repräsentative Aktivitätsverläufe von naiven und MISS-exponierten Mäusen im Freilandversuch. (B) Zeit in der zentralen Zone (ungepaarter Student's t-Test, t30 = 2,365, *P < 0,05; n = 16 Mäuse pro Gruppe). (C) Gesamtstrecke zurückgelegt (ungepaarter Student's t-Test, t30 = 1,467, P > 0,05; n = 16 Mäuse pro Gruppe). (D) Repräsentative Trajektorien im Test mit erhöhtem Plus-Labyrinth. (E) Zeit in offenen Armen (ungepaarter Student's t-Test, t30 = 2,786, **P < 0,01; n = 16 Mäuse pro Gruppe). Die Fehlerbalken stellen SEM dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Ergänzende Datei 1: Normalitäts- und Homogenitätstests für den Saccharosepräferenztest. Die Ergebnisse des Shapiro-Wilk-Tests (Tabelle A) und des Levene-Tests (Tabelle B), die mit SPSS durchgeführt wurden, bestätigten, dass die Daten die Annahmen erfüllten, die für den ungepaarten Student's t-Test erforderlich sind. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Daten normalverteilt waren und eine homogene Varianz aufwiesen, was den Einsatz parametrischer Tests bestätigt. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Datei 2: Schätzung der Stichprobengröße für den Saccharosepräferenztest. (A) Der Stichprobenumfang wurde mit Hilfe eines Online-Stichprobengrößenrechners (https://www.trialstats.com/statbox/index.htm/samplesize/estimation?sid=4) berechnet. (B) Basierend auf experimentellen Daten wurde eine Mindestanzahl von 15 Mäusen pro Gruppe geschätzt, um eine angemessene statistische Aussagekraft zu erreichen. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Die Autoren erklären, dass keine konkurrierenden Interessen bestehen.