Bergmeyer Glukosequantifizierung für mikrobiologische Proben

Summary

Die Bergmeyer-Glukosequantifizierung ist eine spektrophotometrische enzymatische Technik, die hauptsächlich für klinische Tests verwendet wird, bei denen die Glukosemenge genau und empfindlich gemessen wird. Im Folgenden stellen wir ein Protokoll für die Anwendung dieser Methode für mikrobiologische Proben vor.

Abstract

Die Glukosekonzentration ist ein Schlüsselindikator für den Zellstoffwechsel und könnte auf die Gesamtstoffwechselrate, eine Abweichung im Glukosestoffwechsel und in einigen Fällen darauf hinweisen, wie Zellen den Glukosestoffwechsel an den Energiestoffwechsel koppeln. Darüber hinaus sind intrazelluläre und extrazelluläre Glukosespiegel ein Hinweis auf den zellulären Stoffwechselstatus. Enzymatische Techniken, wie z. B. die Bergmeyersche Glukosequantifizierung, sind genauer und empfindlicher als andere Techniken, wie z. B. Dinitrosalicylsäure oder Fluoreszenzmethoden, die üblicherweise in der Mikrobiologie verwendet werden. Obwohl die Bergmeyer-Glukosequantifizierung hauptsächlich im klinischen Bereich eingesetzt wird, kann sie auch auf jede Zelle angewendet werden, wurde jedoch nicht im Detail für Bakterien, Pilze, Hefen oder andere Mikroorganismen berichtet.

Im Folgenden stellen wir eine Methode zur Quantifizierung von Glukose aus Bakterien- und Hefeproben unter Verwendung der enzymatischen Bergmeyer-Glukosequantifizierungsmethode vor. Das Verfahren umfasste die Enzyme Glukoseoxidase, Peroxidase und o-Dianisidindihydrochlorid, die 20 Minuten lang bei 37 °C inkubiert wurden, gefolgt von der Zugabe von Schwefelsäure. Die Extinktion wird dann bei 545 nm gemessen. Es ist wichtig hervorzuheben, dass diese Technik zwar Schwierigkeiten bei der Messung hoher Glukosekonzentrationen (über 60 g/L) bereitet, es jedoch möglich ist, Konzentrationen unter 50 g/L mit Hilfe von Verdünnungsfaktoren zu messen. Dieser enzymatische Ansatz ist wertvoll für die Forschung und Analyse in der Mikrobiologie und anderen wissenschaftlichen Bereichen. Die Präzision und Sensitivität der Methode machen sie hilfreich, um auch geringe Glukosekonzentrationen in mikrobiologischen Proben nachzuweisen.

Introduction

Glukose dient als primäre Energie- und Kohlenstoffquelle für zahlreiche Mikroorganismen, darunter Bakterien, Hefen und Pilze. Diese Mikroorganismen nehmen Glukose über Transporter auf, die sich auf der extrazellulären Membran befinden, wo sie eine Reihe von biochemischen Reaktionen innerhalb des Glykolyse-Stoffwechselwegs durchläuft, um in Pyruvat¹ umgewandelt zu werden. Für die Quantifizierung von reduzierenden Zuckern wie Glukose gibt es verschiedene Techniken. Zum Beispiel können^das Benedict-Reagenz², die Verwendung von 3,5-Dinitrosalicylsäure (DNS)^3,4, das Anthrona-Verfahren⁵ oder das Phenol-Schwefelsäure-6-Verfahren angewendet werden. Mit diesen Methoden wird jedoch in der Probe vorhandener reduzierender Zucker wie Fruktose und Maltose nachgewiesen, der zu dem Signal beitragen und die genaue Quantifizierung eines bestimmten Zuckers erschweren kann.

Darüber hinaus erfordern sie eine strenge Temperaturkontrolle und den Umgang mit gefährlichen Substanzen, was den Prozess erschweren und die Genauigkeit beeinträchtigen kann. Diese Methoden können auch durch andere in der Probe vorhandene Verbindungen gestört werden, was eine genaue Glukosequantifizierung erschwert. Umgekehrt bietet die Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) eine präzisere Alternative, die die Unterscheidung zwischen Glukose und anderen reduzierenden Zuckern ermöglicht, wenn auch mit höheren Betriebskosten. Diese gegensätzlichen Methoden unterstreichen den anhaltenden Bedarf an der Entwicklung genauer und kostengünstiger Glukosequantifizierungstechniken⁷.

Bei der Glukoseoxidase-Peroxidase-Schwefelsäure-Methode (GOX-H₂SO₄) werden zwei Enzyme verwendet, Glukoseoxidase (GOD) und Peroxidase (POD). GOD ist ein Oxidoreduktase-Enzym, das sehr selektiv für die Oxidation von β-D-Glukose⁸ ist. Dieser Komplex wirkt als Katalysator während der Reaktion, die in Gegenwart von Glukose in Gegenwart von Sauerstoff stattfindet, und produziert Gluconsäure und Wasserstoffperoxid (H₂O₂). H₂O₂ wird mittels eines chromogenen Sauerstoffakzeptors, o-Dianisidin, nachgewiesen, der bei Wechselwirkung mit POD dessen Oxidation und H₂O₂ -Freisetzung bewirkt, wodurch verhindert wird, dass Gluconsäure wieder in Glukose umgewandelt wird (siehe Abbildung 1). Die erhaltene Farbe wird durch Zugabe von Schwefelsäure (_H2,_SO4) stabilisiert, wodurch auch die enzymatische Reaktion gestoppt wird, wodurch mögliche Interferenzen vermieden werden, die auftreten könnten, wenn die Reaktion fortgesetzt wird⁹.

Abbildung 1: Überblick über die Glukosequantifizierungsmethode mit dem Enzym Glukoseoxidase, das mit Glukose zu Wasserstoffperoxid (_H2O2) und Gluconsäure reagiert. Anschließend reagiert das Peroxidase-Enzym in Gegenwart von O-Dianisidindihydrochlorid mit H₂O₂. Im letzten Schritt wird Schwefelsäure (_H2SO₄) zugegeben, um die enzymatische Reaktion zu stoppen, was zu einer rosa Farbe führt, die bei 529 nm gemessen wird. Abkürzungen: POD = Peroxidase; GOD = Glukoseoxidase. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Die enzymatische Methode GOX-H₂SO₄ ist eine Technik, die häufig zur Messung der Glukosekonzentration in biologischen Proben verwendet wird, von denen die meisten von klinischem Interesse sind. Nur wenige Studien haben jedoch eine Technik untersucht, die es ermöglicht, die Menge an Glukose in einem Wachstumsmedium zu quantifizieren, um seinen Verbrauch zu bewerten. Daher wird in dem vorliegenden Protokoll die Methode zur Quantifizierung von Glukose mittels der enzymatischen Reaktion von Glukoseoxidase, Peroxidase, o-Dianisidindihydrochlorid und_H2SO4in mikrobiologischen flüssigen Proben vorgestellt, die als Modifikation der von Bergmeyer⁹ durchgeführten Arbeit unter Verwendung von 50%(v/v)_H2SO4und niedrigeren Mengen von Reagenzien entsteht.

Protocol

1. Vorbereitung der Lösung

1. Bereiten Sie 100 ml 0,1 M Phosphatpuffer vor. Wiegen Sie 1,28 g Kaliumdihydrogenphosphat (KH₂PO₄) und 0,1304 g Dikaliumphosphat (K₂HPO₄) ab und geben Sie sie in ein Becherglas. Fügen Sie nun 70 mL entionisiertes Wasser (H₂Odi) hinzu und stellen Sie den pH-Wert mit 1 M Salzsäure (HCl) oder Kaliumhydroxid (KOH) auf 5,5 ein. Füllen Sie die Lösung in einen Messkolben und stellen Sie das endgültige Volumen auf 100 ml ein. Füllen Sie dann die Lösung in einen braunen Behälter um und lagern Sie die Lösung bis zu 3 Monate lang bei 4-8 °C.
   ACHTUNG: Tragen Sie während des gesamten Zubereitungsprozesses Nitrilhandschuhe, um Hautkontakt und mögliche Kontamination zu vermeiden, da o-Dianisidindihydrochlorid potenziell krebserregend ist.
2. Bereiten Sie eine 1%ige w/v-Lösung von o-Dianisidin-Dihydrochlorid vor. Wiegen Sie 0,01 g o-Dianisidindihydrochlorid ab und geben Sie es in ein 2,0-ml-Zentrifugenröhrchen. Fügen Sie mit einer 1.000-ml-Mikropipette 1,0 ml H₂Odi hinzu, um die Verbindung aufzulösen, und mischen Sie dann langsam, indem Sie auf und ab pipettieren. Schützen Sie die Lösung vor Licht, indem Sie den Behälter in Alufolie einwickeln und bei -20 °C lagern, um die Stabilität zu erhalten.
   HINWEIS: Um die Abstützung des Röhrchens während der Messung auf der Analysenwaage zu erleichtern, kann ein 10-ml-Becherglas als zusätzliche Unterstützung verwendet werden. Dies trägt zur Stabilisierung des Rohres bei und gewährleistet eine genaue Messung, indem das Risiko einer Verschiebung oder eines Verkippens minimiert wird, das die auf der Waage erzielten Ergebnisse beeinträchtigen könnte.
3. In einen 100-ml-Meßkolben werden 10 ml Phosphatpufferlösung gefolgt von 1 ml der 1 % v/v o-Dianisidindihydrochloridlösung gegeben. Passen Sie dann das Endvolumen mit Phosphatpuffer auf 100 mL an, um eine Endkonzentration von 0,01 % O-Dianisidin-Puffermischung zu erhalten. Füllen Sie die Lösung in einen braunen Kolben und wickeln Sie ihn mit Alufolie ein, um ihn vor Licht zu schützen. Lagern Sie die Lösung bis zu 3-4 Monate bei 4-8 °C.
   HINWEIS: Die Kühlung ist unerlässlich, um eine Zersetzung zu verhindern, die die Integrität der experimentellen Messungen beeinträchtigen könnte. Um einen Abbau des o-Dianisidin-Puffer-Gemisches zu vermeiden, kann eine kleine Portion von 13 mL (ausreichend für 12 Proben) bis zur Verwendung in ein 14 mL Kunststoffröhrchen auf Eis gegeben werden.
4. 50%ige_H2SO_4-Lösung herstellen. Einen 100 mL Meßkolben mit 30 mL H₂Odi in ein Eisbad stellen und 10 min abkühlen lassen. Dann werden langsam 51 ml H₂SO₄ (98 % v/v) an den Wänden des Kolbens entlang gegossen und vorsichtig geschüttelt, um die Lösung zu homogenisieren. Warten Sie, bis die Mischung abgekühlt ist, da die Reaktion exotherm ist (Wärme erzeugt). Das Endvolumen wird mit H₂Odi auf 100 mL eingestellt und die Lösung in einen Braunkolben aus Glas überführt.
   HINWEIS: Verwenden Sie einen Abzug und befolgen Sie alle Sicherheitsprotokolle, achten Sie darauf, geeignete Schutzausrüstung zu tragen. Bereiten Sie 50 ml 40%ige Calciumcarbonatlösung vor, um mögliche Verschüttungen zu neutralisieren.
5. 50 mM Natriumacetatlösung wird hergestellt, indem 0,04 g Natriumacetat in 5 ml H₂Odi in einem Becherglas gelöst werden. Stellen Sie den pH-Wert mit Eisessig auf 5,1 ein. Zum Schluss stellen Sie das Volumen mit H₂Odi auf 10 mL ein.

2. Vorbereitung der Enzyme

1. Wiegen Sie in einem sterilen 2,0-ml-Mikroröhrchen 0,01 g Glukoseoxidase und mischen Sie es mit 1 ml 50 mM Natriumacetat, pH 5,0, um eine Endkonzentration von 10 mg/ml zu erhalten. Decken Sie das Röhrchen mit Alufolie ab und lagern Sie es bei -20 °C.
   HINWEIS: Die Lösung kann bis zu 2 Monate bei -20 °C gelagert werden.
2. Berechnen Sie das Volumen der Enzymlösung V₂ , das benötigt wird, um die gewünschte Enzymaktivität in jeder Kunststoffküvette (mit einem Gesamtvolumen von 1,5 ml) zu erreichen, unter Verwendung von Gl (1): V₁C₁ = V₂C₂, wobei V₁ 1 1.500 μL, C₁ 28,5 U Enzymaktivität und C₂ (die Konzentration der Enzymlösung) 12.970 U/ml (10 mg des Enzyms [129.000 Einheiten/g] in 1 mL beträgt von H₂Odi).
   V₂ = (1.500 μl × 28,5 U)/12.970 U = 3,29 μl (1)
   HINWEIS: Für ein genaueres Pipettieren kann der Wert auf 3,3 μl gerundet werden.
3. Wiegen Sie in einem neuen 2-ml-Mikroröhrchen 0,0031 g Peroxidase-Enzym und fügen Sie 1 ml Phosphatpuffer mit einem pH-Wert von 5,5 hinzu, um eine Endkonzentration von 3,1 mg/ml zu erreichen. Decken Sie das Mikroröhrchen mit Alufolie ab und lagern Sie es bei -20 °C.
4. Berechnen Sie das Volumen der Peroxidaselösung, das erforderlich ist, um die gewünschte Enzymaktivität pro Küvette mit Gl (1) zu erreichen. Beginnen Sie mit einem Gesamtküvettenvolumen von 1.500 μl und einer Zielenzymaktivität von 1,25 U. Bestimmen Sie dann das erforderliche Volumen der Enzymlösung bei einer Konzentration von 1.551 U.
   V₂ = (1.500 μL × 1,25 U)/1.551 U = 1,208 μL
   HINWEIS: Für eine genauere Pipettiergenauigkeit wurde der Wert auf 1,20 μl gerundet.

3. Glukose-Standard

1. Es wird ein D-Glucose-Standard von 1 g/l hergestellt, indem 0,01 g D-Glucose zu 10 ml H₂Odi in einem Messkolben gegeben werden. Um die Konzentration auf 0,5 g/l zu verdünnen, nehmen Sie 500 μl der Stammlösung und mischen Sie sie mit 500 μl H₂Odi, um ein Endvolumen von 1 ml zu erreichen.
   HINWEIS: Dieser Verdünnungsprozess ist für die Herstellung präziser Standardlösungen unerlässlich.

4. Vorbereitung der Standardkurve

1. Fügen Sie mit einem neuen 2-ml-Mikroröhrchen die in Tabelle 1 angegebenen Puffer- und Glukosevolumina hinzu.
2. Stellen Sie das trockene Thermobad auf 37 °C ein. Sobald die Temperatur stabil ist, fügen Sie 3,3 μl Glukoseoxidase zu allen Röhrchen hinzu und fügen Sie dann 1,2 μl Peroxidase zu jedem Röhrchen hinzu. Inkubieren Sie die Röhrchen bei 37 °C für 20 min.
3. Nach der Inkubation sofort 750 μL 50% H₂SO₄ (v/v) in jedes Mikroröhrchen geben und die Mischung 2 Minuten lang in einem Eisbad abkühlen lassen. Daraus ergibt sich ein Endvolumen von 1.500 μL. Zum Schluss wird die Lösung in eine Kunststoffküvette umgefüllt und die Extinktion bei 529 nm gemessen.

Tabelle 1: Glukose-Kalibrierkurve für die GOX-H₂SO_4-Methode . Abkürzungen: GOD = Glukoseoxidase; POD = Peroxidase; H₂SO₄ = Schwefelsäure. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

5. Untersuchung mikrobiologischer Proben

1. Gewinnen Sie die Probe, indem Sie Bakterien oder Hefen in einem flüssigen Kulturmedium unter bestimmten Bedingungen züchten, einschließlich Temperatur, Rührgeschwindigkeit und Inkubationszeit. Sobald die Kultur die gewünschte optische Dichte (OD) oder Zellkonzentration erreicht hat, entnehmen Sie die Kultur für die weitere Verarbeitung.
   HINWEIS: Pseudomonas reptilivora wurde bei einer konstanten Rührgeschwindigkeit von 300 U/min und 28 °C kultiviert, während Debaryomyces hansenii mit einer Rührgeschwindigkeit von 200 U/min bei 30 °C in einem Orbitalschüttler kultiviert wurde. Im speziellen Fall von D. hansenii wurde auch Speiserapsöl als Induktor für die Lipaseproduktion verwendet.
2. Reinigen Sie den Arbeitsbereich mit einer 70%igen Alkohollösung oder einem geeigneten Reinigungsmittel gemäß den Biosicherheitsprotokollen. Zünden Sie einen Brenner an, um die Asepsis zu gewährleisten.
3. Übertragen Sie 100 μl des Nährmediums mit sterilen Spitzen in ein 1,5 mL oder 2 mL Mikroröhrchen.
4. Zentrifugieren Sie die Proben bei 7.500 × g für 7 min bei 4 °C oder bei 10.000 × g für 7 min ohne Temperaturkontrolle. Entfernen Sie nach dem Zentrifugieren vorsichtig den Überstand, der Glukose in Lösung enthält, und entsorgen Sie das Pellet.
5. Verwenden Sie 0,5 μl des Überstands für Glukosekonzentrationen von 1 bis 20 g/l, mischen Sie dann mit 749,5 μl o-Dianisidin-Puffer, 3,3 μl GOD und dann 1,2 μl POD. Inkubieren Sie die Mikroröhrchen 20 Minuten lang bei 37 °C, wie in Schritt 4.2 beschrieben, und fügen Sie sofort 750 μl 50 % H₂SO₄ hinzu und lassen Sie es 2 Minuten lang in einem Eisbad abkühlen.
   1. Bei Konzentrationen über 20 g/L ist eine 1:1-Verdünnung mit sterilem H₂Odi durchzuführen, bevor Sie fortfahren.
   2. Wurden die überstehenden Proben zuvor bei -80 °C oder -20 °C eingefroren, so sind sie vor der Verwendung bei Raumtemperatur aufzutauen und 30 s lang zu wirbeln. Wenn eine Verdünnung erforderlich ist, steriles H₂Odi verwenden.
   3. Bei Proben mit Glukosekonzentrationen über 30 g/l ist eine 1:1-Verdünnung mit sterilem H₂Odi durchzuführen, was zu einem Verdünnungsfaktor von 2 führt.
6. Berechnen Sie die Gesamtglukosekonzentration in jeder Probe mit Gl (2) in einem Tabellenkalkulationsprogramm.
   (2)
   Wo:
   x = Konzentration von Glukose (g/L) δ = Endreaktionsvolumen (0,0015 L)
   y = Extinktion M.S. = Menge der verwendeten Probe*
   HINWEIS: Die Werte b und m stammen aus der Gleichung, die die Trendlinie der Kalibrierkurve für die Methode modelliert (y = mx + b). *Der MS-Wert muss auf der Probenmenge basieren, die verwendet wurde, um das Verhältnis bei der entsprechenden Verdünnung zu erhalten (d. h. wenn Sie 0,5 μl des Überstands entnehmen, ist M.S. = 0,0000005 L = 0,5 × ^10-6 l); Wenn ein Verdünnungsfaktor (DF) verwendet wird, multipliziert man die erhaltene Extinktion mit dem DF.
   Wenn beispielsweise eine Extinktion von 0,5 erreicht wird und ein DF von 2 verwendet wird, wäre das Ergebnis 1,0. Daher ist y = 1,0, und dieser Wert sollte wie zuvor beschrieben in Gl (2) eingegeben werden.

6. Analytische Validierung

1. Berechnen Sie die analytischen Validierungsparameter der GOX-H₂SO_4-Methode gemäß den vom Nationalen Metrologiezentrum und der mexikanischen Akkreditierungsstelle¹⁰ (CENAM-ema) festgelegten Standards.
   1. Berechnen Sie die Genauigkeit als Prozentsatz des Variationskoeffizienten oder %CV = (S/x) × 100, wobei x der Mittelwert der Stichprobengruppe und S die Standardabweichung mit einem Akzeptanzwert von ≤10 % ist.
   2. Bestimmen Sie die Linearität, indem Sie die Standardkurve an das lineare Modell R² über 0,995 anpassen.
   3. Berechnen Sie die Bestimmungsgrenze (LOQ) anhand der Gleichung: LOQ = yB + 10sB, wobei yB die Analytkonzentration darstellt, die ein Signal erzeugt, das dem Zielsignal entspricht, und 10sB das 10-fache der Standardabweichung des Blindwerts darstellt
   4. Berechnen Sie den systematischen Fehler mit dieser Gleichung: Schräg = x - m, wobei x = Durchschnitt der experimentellen Konzentration und m die theoretische Konzentration ist.
   5. Bestimmen Sie die Genauigkeit als den Grad der Übereinstimmung zwischen einem reellen Wert und einem theoretischen Wert.
      Wiederherstellung % = (CR/KS) × 100
      Dabei ist CR der Durchschnitt der experimentellen Konzentration und CV der Variationskoeffizient der theoretischen Konzentration.

7. Beeinträchtigung durch andere reduzierende Zucker

1. Bewerten Sie vier reduzierende Zucker separat: Glukose, Fruktose, Galaktose und Xylose aus einer 0,5 g/l Stammlösung. Verwenden Sie zusätzlich Trehalose als Negativkontrolle. Befolgen Sie das Protokoll für alle Proben und messen Sie die Extinktion bei 545 und 529 nm.

Results

Die spektrophotometrische Analyse von GOX-H₂SO₄ ergab eine einzige maximale Extinktion bei 529 nm (λmax) (Abbildung 2A), wobei zusätzliche Absorptionswerte bei 545 nm beobachtet wurden. Durch die Analyse der Absorptionswerte bei verschiedenen Glukosekonzentrationen erhielten wir eine Linearität (R²) von 0,9977 für λ529 nm und R² von 0,9967 für λ545 nm (Abbildung 2B). Die Linearität innerhalb eines bestimmten Bereichs bezieht sich auf die Fähigkeit, Ergebnisse zu liefern, die direkt proportional zur Glukosekonzentration in den Proben sind. Dies wurde mit Hilfe des Bestimmungskoeffizienten ausgewertet, der die Genauigkeit des Regressionsmodells (Abbildung 2A) im Absorptionsbereich von 0 bis 1,0 widerspiegelt.

Abbildung 2: Kalibrierkurve und Absorptionsspektren für die Glukosequantifizierung. (A) Die Anpassung des linearen Modells für die Standardkurve mit der vorgeschlagenen GOX-H₂SO_4-Methode mit unterschiedlichen Glukosemengen und zwei Wellenlängen (529 nm und 545 nm) zeigt, dass die Beziehung zwischen den Absorptionen linear bleibt (n = 3, Balken sind als SD angegeben). (B) Direkte Absorptionsprofile der GOX-H₂SO_4-Methode unter Verwendung verschiedener Glukosemengen, wobei das Wellenlängenmaximum 529 nm betrug. Die Zeilen sind wie folgt markiert: (---) war die Leerzeichen, gefolgt von () 0,0005 g/L, () 0,001 g/L, () 0,002 g/L, (---) 0,004 g/L, () 0,006 g/L und () für 0,008 g/L. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Um die Leistungsparameter der Methode zu validieren, wurden verschiedene Zucker getestet: Glukose, Fruktose, Galaktose, Mannose und Xylose. Trehalose wurde als Negativkontrolle verwendet. Alle Proben wurden ähnlich behandelt. Nur Glukose zeigte die Reaktion und Farbe unter den getesteten Zuckern. Die Genauigkeit wurde durch die prozentualen Werte der Wiederfindung bestimmt. Glukose bei 529 nm und 545 nm wies eine gute Linearität und eine gute Genauigkeit auf. Die niedrigste Quantifizierungsgrenze lag bei 2,9 × ^10-7 für die Wellenlänge 529 nm und 4,0 × ^10-7 für die Wellenlänge 545 nm. Der Quantifizierungsbereich für beide Wellenlängen reicht von 0,001 g/L bis 0,08 g/L.

Auf der anderen Seite bleiben die berechneten Werte konsistent mit den vorherigen Ergebnissen, was bestätigt, dass die Datenanalyse genau ist (bei einer Wellenlänge von 529 nm). Die Genauigkeitswerte sind klein, was zeigt, dass die beobachteten Absorptionswerte eng mit den erwarteten Werten aus dem linearen Regressionsmodell übereinstimmen und die Präzision, die durch die Standardabweichung angezeigt wird, gut ist, insbesondere bei höheren Konzentrationen (Tabelle 2).

Tabelle 2. Statistische Analyse- und Validierungsparameter der GOX-H₂SO₄ Methode. (n = 3, nd = nicht bestimmt). Gezeigt werden unter anderem die Validierungsparameter für Glukose bei 545 nm und 529 nm, einschließlich Trehalose als Negativkontrolle. Abkürzungen: SD = Standardabweichung; CV = Variationskoeffizient; LOQ = Bestimmungsgrenze. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Es erhält man eine rosa Farbe (Abbildung 3), die proportional zur Glukosemenge in jeder Küvettenzelle ist. Der Nachweisbereich lag bei 0,01 g/L. Wenn die Glukosekonzentration zu hoch ist (bis zu 30 g/L), kann sich das Röhrchen violett oder violett verfärben, was falsch ist. Daher wird eine Verdünnung empfohlen, bevor Sie fortfahren.

Abbildung 3: Kolorimetrische Assay-Ergebnisse von Glukoseproben (S_{1-S 7}) im Vergleich zu Leerproben (B_{1-B 2}) Diese Färbung hängt mit der Menge an Glukose in der Probe zusammen, wobei B₁ und B₂ die Leerproben sind. Die Intensität der rosa Farbe nimmt mit der Glukosekonzentration zu. Die Konzentrationen sind wie folgt: (S₁) 0,0005 g/L, (S₂) 0,001 g/L, (S₃) 0,002 g/L, (S₄) 0,004 g/L, (S₅) 0,006 g/L, (S₆) 0,008 g/L und (S₇) 0,01 g/L (n = 3). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Die Bewertung des Glukoseverbrauchs durch Debaryomyces hansenii wurde durchgeführt, wobei die Ergebnisse der GOX-H₂SO₄ - und DNS-Methoden verglichen wurden (Abbildung 4). Wie erwartet, zeigte die DNS-Methode eine andere Reaktivität, ein Verhalten, das bei der GOX-H₂SO_4-Methode nicht beobachtet wurde.

Abbildung 4: Verbrauchsprofil von D. hanseii für die Glukosequantifizierung. Verbrauch mit () und ohne () Öl nach der GOX-H₂SO₄ Methode. Bei Verwendung der DNS-Methode mit () und ohne () des Öls betrug die Probenahmezeit 2 h in dreifacher Ausfertigung (n = 3, SD wird als Fehlerbalken dargestellt). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Zusätzlich zu Abbildung 4 stellen wir die statistische Analyse (ANOVA) vor, bei der die beiden verschiedenen Methoden verglichen werden (Tabelle 3).

Tabelle 3: Die ANOVA-Ergebnisse mit den Varianzkomponenten, einschließlich der Varianzen zwischen und innerhalb der Gruppe, zusammen mit den entsprechenden p-Werten. Diese Ergebnisse zeigen, ob es statistisch signifikante Unterschiede zwischen den Methoden über verschiedene Zeitpunkte hinweg gibt. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Ein p-Wert < 0,05 deutet auf einen signifikanten Unterschied zwischen den Methoden hin, was signifikante Unterschiede zwischen den Methoden GOX-H₂SO₄ und DNS-Methoden nach 6, 8 und 12 Stunden zeigt (Tabelle 4 und Tabelle 5).

Tabelle 4: Der Differenzmittelwert eines experimentellen Laufs mit zwei Replikaten von Glukose ohne Öl unter Verwendung der Methoden GOX-H₂SO₄ und DNS. Statistisch signifikante Unterschiede zwischen den einzelnen unabhängigen Tests im Laufe der Zeit sind fett hervorgehoben (Tukey, α = 0,05). Abkürzungen: GOX-H₂SO₄ = Glukoseoxidase-Peroxidase-Schwefelsäure; DNS = 3,5-Dinitrosalicylsäure; KI = Konfidenzintervall. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Tabelle 5: Mittelwert eines Versuchslaufs mit zwei Replikaten von Glukose mit Öl unter Verwendung der GOX-H₂SO₄ - und DNS-Methode. Statistisch signifikante Unterschiede zwischen den einzelnen unabhängigen Tests im Laufe der Zeit sind fett hervorgehoben (Tukey, α = 0,05). Abkürzungen: GOX-H₂SO₄ = Glukoseoxidase-Peroxidase-Schwefelsäure; DNS = 3,5-Dinitrosalicylsäure; KI = Konfidenzintervall. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Darüber hinaus kann die Methode zur Analyse hoher Glukosekonzentrationen (bis zu 100 g/L, unter Verwendung geeigneter Verdünnungsfaktoren, wie in Abbildung 5 gezeigt) angewendet werden, wobei der Glukoseverbrauch durch Pseudomonas reptilivora bewertet wurde.

Abbildung 5: Glukoseverbrauchsprofil von P. reptilivora in Gegenwart hoher Konzentrationen. () verwendete 100 g/l Glukose, () verwendete 55 g/l und schließlich () 10 g/l Glukose (n = 3, SD wird als Fehlerbalken dargestellt). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Die Verwendung eines Blindtests und eines Standards mit bekannter Glukosekonzentration gewährleistet genaue Ergebnisse, unabhängig von möglichen technischen Problemen mit dem bei der Analyse verwendeten Spektralphotometer.

Discussion

Die Quantifizierung von Glukose in Nährmedien ist für das Verständnis des mikrobiellen Wachstums und der Stoffwechselaktivität von entscheidender Bedeutung, da Glukose als primäre Energiequelle für viele Mikroorganismen dient. In dieser Studie haben wir die GOX-H₂SO_4-Methode eingesetzt, um den Glukosespiegel in Nährmedien genau zu messen, mit dem Ziel, mikrobielle Prozesse in Bakterien- oder Hefefermentationen zu optimieren. Unsere Ergebnisse stimmen mit denen von Yuen und McNeill^{überein 11}; Im Gegensatz zu ihnen deuten unsere Ergebnisse jedoch darauf hin, dass die Messwerte bei höheren Glukosewerten genau sind. Ein kritischer Schritt bei den Experimenten ist das Timing nach der Zugabe der POD-Lösung zu den Röhrchen. Die Hinzufügung muss präzise sein; Überschreitet die Einwirkzeit 25 min bei 37 °C ohne Zugabe von H₂SO₄, kann dies zu ungenauen Messwerten führen, wie Bergmeyer⁹ feststellt. Daher wird empfohlen, 50 % H₂SO₄ unmittelbar nach Ablauf der erforderlichen Zeit (20 min) hinzuzufügen, um die Genauigkeit der mit der GOX-H₂SO_4-Methode erzielten Ergebnisse zu gewährleisten.

Die Glukosequantifizierung mit der GOX-H₂SO_4-Methode zeigte eine hohe Genauigkeit und Sensitivität in Kulturmedien, was den aktiven Stoffwechselverbrauch der in dieser Studie vorgestellten Mikroorganismen (P. reptilivora und D. hanseii) widerspiegelt. Diese Ergebnisse sind ein Hinweis auf den Glukoseverbrauch dieser Mikroorganismen im Laufe der Zeit.

Während der DNS-Analyse von P. reptilivora (Daten nicht gezeigt) beobachteten wir, dass es Interferenzen durch organische Säuren gab, die den gegenteiligen Effekt zu dem verursachten, was man vom Glukosekonsum erwarten würde, was zu falschen Ergebnissen führte. Es ist jedoch wichtig klarzustellen, dass Bergmeyer⁶ keine Tests mit mikrobiologischen Proben durchgeführt hat und die genauen Reagenzienmengen für Volumina unter 3,0 mL nicht spezifiziert. Daher stellt diese Methode eine Optimierung und Verbesserung dar, indem das Gesamtreaktionsvolumen auf 1,5 mL reduziert wird. Dieses Volumen könnte durch den Einsatz eines Plattenlesegeräts möglicherweise noch weiter reduziert werden.

Andererseits reagiert die GOX-H₂SO_4-Methode empfindlich auf die in der Probe vorhandene Glukosemenge, reagiert jedoch nicht mit anderen Zuckern wie Trehalose, Fruktose, Galaktose, Xylose und Mannose, die in Tabelle 2 aufgeführt sind. Dies bedeutet, dass die GOX-Methode eine genaue Messung der Glukosekonzentration liefern kann, aber nicht für die Bestimmung des Vorhandenseins oder der Konzentration anderer Zucker als Glukose 8,11,12,13 geeignet ist.

Nach den hier vorgestellten Ergebnissen ist die GOX-H₂SO_4-Methode sehr empfindlich gegenüber der Glukosekonzentration in der Probe und zeigt keine unterschiedlichen Verhaltensweisen zwischen den beiden Mikroorganismen D. hansenii und P. reptilivora, wie es bei der DNS-Methode beobachtet wurde (Tabelle 4 und Tabelle 5). Der Hauptvorteil der GOX-H₂SO_4-Methode besteht darin, dass sie mit Reagenzien mit minimaler Variation entwickelt werden kann und es nicht notwendig ist, Quarz- oder Glaszellen zu verwenden, da die zu analysierende Wellenlänge im Bereich des sichtbaren Lichts liegt. Daher können sowohl Einweg-Kunststoffzellen als auch Kunststoffspitzen verwendet und wiederverwendet werden.

Ein Nachteil dieser Methode ist die Notwendigkeit, neue Kalibrierkurven zu erstellen, wenn die Enzymlösungen oder der Phosphatpuffer mit o-Dianisidin erschöpft sind. Bei den hier vorgestellten Konzentrationen ist es jedoch möglich, mehr als 100 Tests durchzuführen. Ein weiterer Nachteil ist, dass der Rohling H₂O₂ erzeugt, das in Kombination mit H₂SO₄ den Rohling in ein starkes Oxidationsmittel verwandelt, wenn er länger als 24 h stehen gelassen wird. Daher müssen Vorkehrungen getroffen werden. Es wird empfohlen, alle Proben nach der Messung zu verwerfen. Schließlich stellt die Verwendung von Enzymen einen weiteren Nachteil dar, da sie in der Regel bis zu 2 Monate aktiv sind. Wenn der Verdacht auf ein Versagen der Methode besteht, ist dies höchstwahrscheinlich auf einen Enzymabbau zurückzuführen, der die Herstellung einer frischen Enzymlösung erforderlich macht. Ebenso können sich die Lösungen (Enzyme oder Puffer) zersetzen, wenn sie länger als 12 Stunden bei Raumtemperatur belassen werden. Schließlich sollte das Gemisch aus o-Dianisidindihydrochlorid und_H2SO₄ als Sondermüll entsorgt werden.

Die GOX-H₂SO_4-Methode kann in der Lebensmittelindustrie eingesetzt werden, um den Glukosegehalt in verschiedenen Produkten wie Säften, Marmeladen und Milchprodukten genau zu messen und so die Qualität und Einhaltung von Normen sicherzustellen. Es kann auch zur Überwachung von Fermentationen verwendet werden, insbesondere in Prozessen, bei denen Glukose die primäre Kohlenstoffquelle ist, wodurch die Effizienz und die Produktionsausbeute optimiert werden. In der Forschung ist diese Methode wertvoll für die Untersuchung des zellulären Stoffwechsels, da sie die Analyse der Verarbeitung von extrazellulärer Glukose durch Zellen ermöglicht. Darüber hinaus dient es als Grundlage für die Entwicklung von Biosensoren, bei denen es sich um Geräte zur Echtzeit-Glukoseüberwachung handelt.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,5 mL Mikroröhrchen	Eppendorf	-
-2,0 mL Mikroröhrchen	Eppendorf	-	-
CaCO3	Meyer	471-34-1	Calciumcarbonat
D-Glukose	Meyer	50-99-7	D-Glukose
Trockenbad	FisherScientific	11-718-4	Seriennummer 911NO251. Block BxTxH mm/Zoll: 124 x 76 x 39 / 4,9 x 3,0 x 1,5
Glukoseoxidase	Sigma Aldrich	G6125-50KU	Enzympulver
H2O	-	-	Deionisiertes Wasser
H2SO4	Meyer	7664-93-9	Schwefelsäure
HCl	Meyer	7647-01-0	Salzsäure
K2HPO4	Meyer	7758-11-4	Dikaliumphosphat
KH2PO4	Meyer	7778-77-0	Monokaliumphosphat
KOH	Meyer	1310-58-3	Kaliumhydroxid
Lambda 35	PerkinElmer-Spektralphotometer
Mikroröhrchen Zentrifuge	-		--
o-Dianisidindihydrochlorid	Sigma Aldrich	D3252	Chromogene
Peroxidase	Sigma Aldrich	P8125-50KU	Enzympulver-pH-Messgerät
	Hanna	1131	Hanna 1170
Natriumacetat	Meyer	127-09-3	Meyer
Wiegewender	-	-	-