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Methodenartikel

Enthüllung des xenobiotischen Transports und der Auswirkungen in isolierten Mitochondrien: Erkenntnisse aus respirometrischen und enzymatischen Assays

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DOI:

10.3791/67146

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7. März 2025

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1Grupo de Investigación en Bioquímica y Microbiología (GIBIM), Escuela de Química, Universidad Industrial de Santander, 2Centro de Investigaciones en Enfermedades Tropicales - Cintrop. Escuela de Medicina, Departamento de Ciencias Básicas, Universidad Industrial de Santander, Parque Tecnológico y de Investigaciones Guatiguará Km 2 El Refugio Piedecuesta

In diesem Artikel

Zusammenfassung

In dieser Studie wird eine Methodik zur Untersuchung xenobiotischer Effekte auf die mitochondriale Funktion mittels respirometrischer und enzymatischer Assays vorgestellt. Es untersucht die Modulation der Elektronentransportkette in verschiedenen Spezies und bietet Einblicke in die gezielte Entwicklung von Biopestiziden gegen durch Insektenvektoren übertragene Krankheiten.

Zusammenfassung

Mitochondrien werden aufgrund ihrer entscheidenden Rolle bei der Energiegewinnung durch die Elektronentransportkette (ETC) oft als das Kraftwerk der Zelle bezeichnet. Ihre Bedeutung geht jedoch weit über die Energieerzeugung hinaus. Eine Dysregulation der mitochondrialen Bioenergetik kann intrazelluläre Kaskaden auslösen, die sich auf die Gesundheit und die Zellfunktion auswirken. Angesichts ihrer physiologischen Bedeutung besteht ein wachsendes Interesse an der Erforschung des pharmakologischen Potenzials der mitochondrialen Funktion für die Entwicklung neuer Therapien und Bioprodukte. Die Modulation der mitochondrialen Bioenergetik könnte innovative Ansätze zur Bewältigung von Herausforderungen wie neurodegenerativen Erkrankungen, Stoffwechselerkrankungen und Krebs sowie zur Entwicklung von Bioprodukten zur Bekämpfung von Schädlingen und vektorübertragenen Krankheiten bieten.

In dieser Arbeit wird eine Methode zur Bewertung der Auswirkungen von Xenobiotika auf die Elektronentransportkette (ETC) unter Verwendung verschiedener Substrate vorgestellt, darunter Glutamat und NADH für Komplex I, Succinat für Komplex II und Cytochrom c (sowohl oxidiert als auch reduziert) für die Komplexe III und IV. Diese Methode ermöglicht es, die Aktivierung oder Hemmung des Elektronentransports durch mitochondriale Komplexe mit einem Respirometer und einem Spektralphotometer zu bewerten. Die Mitochondrien können aus isolierten Mitochondrien, fragmentierten Zellen oder homogenisiertem Gewebe verschiedener Spezies stammen.

Im Labor wurde die mitochondriale Funktion bei Aedes aegypti und Wistar Ratten analysiert, aber diese Methode ist auch auf andere Spezies anwendbar, wie z.B. Rhipicephalus microplus und Rhodnius prolixus. Dieser Ansatz bildet die Grundlage für Theorien über die Existenz von Entkopplerproteinen und speziesspezifischen oxidierbaren Substratpräferenzen, die von ihren einzigartigen Energieanforderungen beeinflusst werden. Jüngste Erkenntnisse bieten wertvolle Einblicke in innovative Strategien zur Entwicklung von Bioinsektiziden, die auf die Mitochondrienfunktion abzielen und ein erhebliches Potenzial für die effektive Bekämpfung von vektorübertragenen Krankheiten und Schädlingsbefall bieten.

Einleitung

Mitochondrien werden seit jeher als Kraftwerk der Zellen bezeichnet, da sie während des oxidativen Phosphorylierungsprozesses chemische Energie erzeugen 1,2. Neben ihren wichtigsten metabolischen Kernfunktionen sind Mitochondrien auch an vielen anderen zellulären Prozessen beteiligt, die von intrazellulären Ca2+-Regulationsniveaus über Entzündungsprozesse und die Produktion reaktiver Sauerstoffspezies bis hin zu Prozessen zur Induktion des Zelltodsreichen 3. Die mitochondriale Bioenergetik und ihre Dysregulation wurden mit intrazellulären Prozessen in Verbindung gebracht, die die Zellfunktion und die allgemeine Gesundheit beeinflussen. Dies hat ein wachsendes Interesse an der Erforschung des pharmazeutischen Potenzials geweckt, das sich aus der Ausrichtung auf die Mitochondrienfunktion ergibt, um innovative Therapien und sichere Bioprodukte zu entwickeln 4,5,6. Darüber hinaus ist das Verständnis des komplizierten Zusammenspiels mitochondrialer Prozesse und ihrer Auswirkungen auf die zelluläre Funktion von entscheidender Bedeutung, um zielgerichtete Therapien zu entwickeln und Möglichkeiten für die Entwicklung von Bioprodukten zur Kontrolle von vektorübertragenen Krankheiten und Schädlingsbefall aufzuzeigen 7,8.

Die gezielte Ausrichtung auf bestimmte Komponenten der Elektronentransportkette mit Xenobiotika hat sich als Strategie zur Modulation der mitochondrialen Funktion für die Erzeugung von Biopestiziden herausgestellt. Es wurde gezeigt, dass natürliche und synthetische Verbindungen, die in Pestizidformulierungen enthalten sind, wie z. B. auf Nanopartikel basierende Mitochondrien-Pestizide, die mitochondriale Funktion beeinflussen, indem sie das mitochondriale Potenzial und die ATP-Synthese in S. frugiperdaverringern 9.

Darüber hinaus wurden die meisten Carbamat- und Pyrethroid-basierten Produkte als Komplex-I-Inhibitoren bei Mücken berichtet; ihre längere Exposition hat jedoch einige pyrethroidresistente Populationen in Anopheles gambiae hervorgebracht, die oft mit erhöhten Konzentrationen von P450s zusammenhängen, die diese Substrate metabolisieren können10,11. In ähnlicher Weise wurden Pflanzen und ihre ätherischen Öle, Extrakte und Sekundärmetaboliten als potenzielle Insektizide dokumentiert, die in verschiedenen Insektenstadien eine große Bandbreite an Mortalität aufweisen12,13. Die Insektizidaktivität dieser Naturstoffe kann mit der Hemmung des Elektronentransports an einem bestimmten Punkt in der mitochondrialen Atmungskette zusammenhängen, indem sie die Produktion reaktiver Sauerstoffspezies, das mitochondriale Potential ΔΨm und die ATP-Synthese moduliert, die Zelltodprozesse auslösen kann 6,8.

Natürliche Verbindungen als Quellen für die Formulierung von Pestiziden und ihre Auswirkungen auf die Mitochondrien spielen eine entscheidende Rolle bei der Entwicklung neuer und sicherer Biopestizide. In diesem Zusammenhang beschreibt dieses Manuskript eine Methodik, um die Fähigkeit von Xenobiotika zu identifizieren, den Elektronentransport durch mitochondriale Komplexe zu aktivieren oder zu hemmen. Dieser umfassende Ansatz ermöglicht eine präzise Messung der Auswirkungen von Xenobiotika auf die mitochondriale Funktion unter Verwendung einer Vielzahl von Substraten, wobei sowohl Respirometrie- als auch Spektrophotometriemethoden zum Einsatz kommen. Diese Methodik wurde angewendet, um die mitochondriale Funktion von Schlüsselvektorspezies, einschließlich Aedes aegypti, zu analysieren, was zu einer Theorie über das Vorhandensein von Entkopplerproteinen und unterschiedlichen oxidierbaren Substratpräferenzen führte, die für jede Spezies spezifisch sind.

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Protokoll

Alle in diesem Protokoll beschriebenen Methoden wurden von der Ethikkommission "Comité de ética en investigación científica CEINCI" genehmigt: Ethikkommission für wissenschaftliche Forschung der Industrieuniversität Santander. Darüber hinaus entsprachen diese Tests den Arrive-Richtlinien und folgten dem kolumbianischen Gesetz 84 von 1989 (Kapitel IV, Art. 23-26) und der Resolution 8430 (1993, Titel IV, Art. 83-93), die Tierversuche in Kolumbien regeln.

HINWEIS: Es wird dringend empfohlen, das Kapitel über oxidative Phosphorylierung in jedem Biochemie-Buch zu lesen, bevor Sie mit diesem Protokoll beginnen.

1. Reagenzien und Lösungen

  1. Um Mitochondrien der Rattenleber zu isolieren, bereiten Sie 250 ml Mitochondrien-Isolationspuffer vor: 250 mM D-Mannitol, 10 mM HEPES pH 7,2 und 1 mM EGTA. Nehmen Sie 50 mL Isolationspuffer heraus (dies wird als Isolationspuffer ohne BSA bezeichnet) und fügen Sie dann 0,2 g BSA zu den anderen 200 mL hinzu (dies wird als Isolationspuffer mit BSA bezeichnet).
  2. Zur Homogenisierung der Larven von Aedes aegypti 100 ml Puffer vorbereiten: 250 mM Saccharose, 10 mM HEPES, 1 mM EGTA pH 7,2.
  3. Reaktionspuffer vorbereiten: 80 mM Natriumphosphat-Pufferlösung, pH 7,4, 50 μM EDTA.
  4. Bereiten Sie einen Vorrat an Reagenzien vor, die für enzymatische Aktivitäten bei einem pH-Wert von 7,2 verwendet werden, wie unten beschrieben: 25 mM NADH (frisch zubereitet für jeden Assay), 2 M Natriumsuccinat, 4 mM Cytochrom c (frisch zubereitet für jeden Assay), 200 μM Rotenon, 0,5 mM KCN, 6 mM 2,6-Dichlorphenolindophenol (DCPIP), 100 mM Phenazinmethosulfat (PMS) und 60 mM Kaliumferricyanid.
    HINWEIS: Für alle Experimente und die Vorbereitung der Reagenzien wurde Reinstwasser mit einem spezifischen Widerstand von 18,2 MΩΗCM bei 25 °C verwendet. Dieses Wasser wurde mit einem Milli-Q-Reinigungssystem erzeugt, das die Entfernung von organischen, anorganischen und mikrobiellen Verunreinigungen bis zu einem Niveau unterhalb der nachweisbaren Grenzen gewährleistet, wodurch es für hochempfindliche biochemische und molekularbiologische Anwendungen geeignet ist.

2. Leberdissektion, Homogenisierung und Mitochondrienisolierung aus Rattenleber

  1. Legen Sie vor Beginn alle Materialien und Puffer auf Eis und stellen Sie sicher, dass alle Materialien während des gesamten Assays eiskalt sind, um Schäden an den Mitochondrien zu vermeiden.
  2. Geben Sie 10 ml Mitochondrien-Isolationspuffer in ein eiskaltes konisches Röhrchen.
  3. Euthanasieren Sie die männliche Wistar-Ratte durch Enthauptung des Gebärmutterhalses, um den Einsatz von CO2 zu vermeiden, der die Atmungstests beeinträchtigen kann. Zu diesem Zweck hat der Ausschuss für Ethik in der wissenschaftlichen Forschung der Industrieuniversität Santander (CEINCI) die Methoden in der Resolution 13 von 2022 genehmigt.
    HINWEIS: Ratten sollten nicht mehr als 170 g wiegen; Fett kann auch die Atmungsanalysen beeinflussen.
  4. Machen Sie mit einem sterilen Skalpell einen Schnitt (ca. 4-5 cm) durch den Bauchteil der Ratte.
  5. Präparieren Sie die Leber vollständig, sobald der Bauchbereich sichtbar ist. Die Rattenleber ist ein mehrlapuliertes Organ, dunkelrot ca. 10 cm x 5 cm.
  6. Legen Sie die Leber vorsichtig in den eiskalten Isolationspuffer und spülen Sie sie zweimal mit diesem Medium ab.
  7. Die Leber (Größe weniger als 1 cm) mit einer scharfen Schere in einer Petrischale mit 10 ml Isoliermedium fein hacken.
  8. Geben Sie die Lösung in das Potter Elvehjem Gewebehomogenisatorröhrchen und homogenisieren Sie sie mindestens zehnmal vorsichtig mit niedriger Geschwindigkeit (~390 U/min).
  9. Die Lösung in ein konisches Röhrchen überführen und bei 600 x g für 10 min bei 4 °C zentrifugieren.
  10. Nach dem Zentrifugieren wird der Überstand vorsichtig in ein neues konisches Röhrchen gegossen. Entsorgen Sie das Pellet mit einem Teil des Gewebes, Blut und intakten Zellbestandteilen.
  11. Füllen Sie das Röhrchen mit mehr Isolationspuffer (~35 mL) und zentrifugieren Sie bei 6000 x g für 10 min bei 4 °C.
  12. Nach der Zentrifugation wird der Überstand verworfen und das Pellet (Mitochondrien) vorsichtig in einem neuen Isolationspuffer ohne BSA resuspendiert.
    HINWEIS: Für die mitochondriale Resuspension wird empfohlen, eine weiche Bürste zu verwenden.
  13. Dann zentrifugieren Sie bei 7000 x g für 10 min bei 4 °C, verwerfen den Überstand und resuspendieren die isolierten Mitochondrien in 2 mL Isolationspuffer ohne BSA.
  14. Bestimmen Sie die Proteinkonzentration mit der Bradford-Methode oder einer ähnlichenMethode 14.

3. Homogenisierung der Aedes aegypti-Kolonie und der Larven.

HINWEIS: Für dieses Verfahren wurde die Ae. aegypti-Kolonie in Zuchtkäfigen (40 cm × 40 cm × 40 cm) unter insektarischen Bedingungen wie Feuchtigkeit (70 % ± 5 %), Photoperiode (12:12) und Temperatur (27 ± 5 °C) gehalten. Die Eier wurden auf Filterpapier gesammelt.

  1. Stellen Sie sicher, dass die Eier eine Woche vor dem Versuch in Schalen mit gefiltertem und entchlortem Wasser ausgebrütet werden. Identifizieren Sie das Stadium anhand des Häutungsprozesses im Larvenzyklus. Beobachten Sie jeden Häutungsprozess, um seinen Status L1, L2 und L3 zu überprüfen. Wenn die Larve in L3 eindringt, warten Sie maximal 12 Stunden, um das Material einzusammeln.
  2. Sammeln Sie mindestens 100 Larven von Ae. aegypti im Stadium L3-L4 in chlorfreiem Wasser (~30 mL Wasser). Entnehmen Sie die Larven mit einer Pasteurpipette.
  3. Filtern Sie die Larven mit Filterpapier, spülen Sie die gesammelten Larven ab und resuspendieren Sie sie im Aedes aegypti Homogenisierungspuffer (~2 mL).
  4. Füllen Sie die Lösung mit den Larven in das Potter Elvehjem Gewebehomogenisatorröhrchen um und homogenisieren Sie vorsichtig mindestens zehnmal bei ~390 U/min.
  5. Übertragen Sie das homogenisierte Gewebe und filtrieren Sie es durch eine Glaswollespritze, um große Exoskelett-Rückstände zu entfernen.
  6. Bestimmen Sie die Proteinkonzentration mit der Bradford-Methode oder einer ähnlichenMethode 15.
    HINWEIS: Es ist nicht notwendig, Mitochondrien aus Mückenlarven zu isolieren; Es ist möglich, die Wirkung von Xenobiotika anhand des in diesem Schritt erhaltenen Proteinextrakts zu bewerten.

4. Bestimmung der Auswirkungen von Xenobiotika auf die mitochondriale Elektronentransportkette

HINWEIS: Dieses Protokoll wurde entwickelt, um die Wirkung von Xenobiotika auf die mitochondriale Bioenergetik bei isolierten Mitochondrien aus homogenisiertem Rattenleber- und Insektengewebe zu bewerten.

Die Assays sind in zwei unterteilt: polarographisch (NADH und Succinatoxidase) und spektrophotometrisch (NADH-Dehydrogenase - Komplex I, Succinat-Dehydrogenase - Komplex II, Cytochrom-c-Reduktase - Komplex III und Cytochrom-c-Oxidase - Komplex IV).

  1. Polarographische Assays: Verwenden Sie dazu eine hochauflösende Respirometrie, um die vollständige Oxidation von NADH und Succinat durch denO2-Verbrauch zu messen, und melden Sie die Ergebnisse als NADH und Succinatoxidase.
    1. Kalibrieren Sie das Gerät jeden Tag, bevor Sie mit den Assays beginnen. Dieser Schritt kann je nach verwendetem Oxygraphen variieren. Befolgen Sie die Anweisungen des Herstellers.
      1. Für die Oroboros-Kalibrierung wird Reaktionsmedium in die Kammern mit einem Überschuss von mindestens 0,2 mL über dem Volumen der Versuchskammer (2 mL) gegeben, um die Kammer und die Injektionskapillare mit Medium zu füllen.
    2. Schalten Sie die Rührstäbchen nach der Mediumzugabe ein.
    3. Warten Sie, bis sich das Signal der Sauerstoffkonzentration stabilisiert hat, und nehmen Sie es auf.
    4. Für eine Null-Sauerstoff-Kalibrierung fügen Sie Mitochondrien, Zellsuspensionen, Backhefe oder Dithionit (Backhefe wird empfohlen) hinzu, die den Sauerstoffmangel ermöglichen, und zeichnen Sie ihn auf. Warten Sie, bis das Signal Hintergrundwerte erreicht hat (in der Regel ± 2 pmol/ml/s für das O2k-System).
    5. Führen Sie NADH- und Succinatoxidase-Aktivitäten durch, indem Sie den Sauerstoffverbrauch überwachen, wenn Reaktionspuffer, 0,1 mg Protein (mitochondrial oder Larven homogenisiert) und das Substrat (0,17 mM NADH oder 10 mM Natriumsuccinat) in die Kammer gegeben werden.
    6. Verwenden Sie Elektronentransportprotein-Inhibitoren, um zu bestätigen, dass der beobachtete Sauerstoffverbrauch auf die mitochondriale Atmungskette zurückzuführen ist. Die gebräuchlichsten sind Rotenon 1 μM und KCN1mM 16. Fügen Sie in der Oxygraphzelle die Reagenzien gemäß Tabelle 1 hinzu (die Reihenfolge ist wichtig).
  2. Spektrophotometrische Assays
    HINWEIS: Um den Elektronentransport durch die mitochondrialen Komplexe zu beurteilen, wurden enzymatische Assays durchgeführt und mit einem Spektralphotometer und künstlichen Elektronenakzeptoren wie PMS, DCPIP und Cytochrom c gemessen. Es wird empfohlen, ein Enzym pro Tag zu messen. Bereiten Sie Puffer und Reagenzien mindestens einen Tag vor den Assays vor. Einige Verbindungen sind lichtempfindlich; Siehe Tabelle 2 für weitere Empfehlungen.
    1. Für die NADH-Dehydrogenase-Aktivität enthalten die Reaktionssysteme 50 mM Phosphatpufferlösung pH 7,4, 2 mM EDTA, 0,1 mg/ml mitochondriales Protein, 1 μM Rotenon und 1 mM KCN. Geben Sie in die Spektralphotometerzelle die Reagenzien gemäß Tabelle 2 (die Reihenfolge ist wichtig)17. Die empfohlenen Schritte lauten wie folgt:
      1. Bereiten Sie 100 ml Pufferphosphat vor, das mit dem EDTA gemischt ist, und überprüfen Sie, ob sich der pH-Wert nicht ändert. Bewahren Sie den Puffer im Kühlschrank auf, aber es ist zwingend erforderlich, ihn während der Tests bei Raumtemperatur (RT; ca. 25 °C) aufzubewahren.
      2. Bereiten Sie frische Stammlösungen aus Rotenon, KCN, NADH und Kaliumferricyanid vor (stabil bis 4 h). Das empfohlene Volumen beträgt 1 ml konzentrierter Lösungen (siehe erste Spalte der Tabelle).
      3. Wenn die getestete Verbindung eine geringe Löslichkeit in Wasser aufweist, ist eine zusätzliche Kontrolle der Enzymaktivität in das Versuchsdesign aufzunehmen, bei der nur das Lösungsmittel der Verbindung verwendet wird.
      4. Überwachen Sie zunächst die NADH-Dehydrogenase-Aktivität durch die Reduktion von Kaliumferricyanid bei 420 nm. Berechnen Sie seine Konzentration anhand seines molaren Extinktionskoeffizienten von 1,04 mM-1·cm-1. Das Spektralphotometer verfügt über die Möglichkeit, die maximale Aktivität in einer Reaktion zu berechnen. Schauen Sie in der Bedienungsanleitung nach. Teilen Sie anschließend die berichtete Aktivität durch die Konzentration des Proteins, das verwendet wird, um die spezifische Aktivität des Enzyms zu erhalten.
    2. Bewertung der Succinat-Dehydrogenase-Aktivität durch Zugabe von 20 mM Natriumsuccinat und 1 mM Phenazinmethosulfat (PMS) mit 60 μM 2,6-Dichlorphenolindophenol (DCPIP) als künstliche Elektronenakzeptoren. Geben Sie in die Spektralphotometerzelle die Reagenzien gemäß Tabelle 3 (die Reihenfolge ist wichtig)17. Die Empfehlungen lauten wie folgt:
      1. Bereiten Sie den gleichen Puffer vor, der für die NADH-Dehydrogenase verwendet wird. Pflegen Sie es unter den gleichen Bedingungen.
      2. Bereiten Sie frische Stammlösungen von Succinat, PMS und DCPIP vor. Das empfohlene Volumen beträgt 1 ml konzentrierter Lösungen. Bereiten Sie PMS- und DCPIP-Lösungen am selben Tag des Assays vor.
      3. Wenn die getestete Verbindung eine geringe Löslichkeit in Wasser aufweist, ist eine zusätzliche Kontrolle der Enzymaktivität in das Versuchsdesign aufzunehmen.
      4. Überwachen Sie die Succinatoxidation durch die Reduktion von DCPIP bei 600 nm. Berechnen Sie seine Konzentration anhand seines molaren Extinktionskoeffizienten von 21,0 mM-1·cm-1 unter Anwendung des Beerschen Gesetzes. Teilen Sie anschließend die berichtete Aktivität durch die Konzentration des Proteins, das verwendet wird, um die spezifische Aktivität des Enzyms zu erhalten.
    3. Messen Sie die Aktivität der Cytochrom-c-Reduktase (Komplex III) entweder mit NADH oder Succinat als oxidierbare Substrate. Mit diesem Enzym geht der Elektronentransport von Komplex I (unter Verwendung von NADH) oder Komplex II (unter Verwendung von Succinat) an Ubichinon und dann an Komplex III über, der die Elektronen an Cytochrom c weiterleitet. Auf diese Reaktion folgt die Reduktion von Cytochrom c. Bereiten Sie das Reaktionssystem vor, das 50 mM Phosphatpufferlösung, pH 7,4, 2 mM EDTA, 0,1 mg mitochondriales Protein, 50 μM NADH und 0,1 mM KCN enthält. In die Spektralphotometerzelle werden die Reagenzien gemäß Tabelle 4 (die Reihenfolge ist wichtig) hinzugefügt18. Die Empfehlungen lauten wie folgt:
      1. Bereiten Sie den gleichen Puffer vor, der für die NADH-Dehydrogenase verwendet wird. Pflegen Sie es unter den gleichen Bedingungen.
      2. Verwenden Sie das gleiche NADH und KCN aus der NADH-Dehydrogenase.
      3. Wenn die getestete Verbindung eine geringe Löslichkeit in Wasser aufweist, ist eine zusätzliche Kontrolle der Enzymaktivität in das Versuchsdesign aufzunehmen.
      4. Überwachen Sie die Cytochrom-c-Reduktion bei 550 nm und berechnen Sie ihre Konzentration anhand ihres molaren Extinktionskoeffizienten von 19,8 mM-1 cm-1 unter Anwendung des Beerschen Gesetzes. Teilen Sie anschließend die berichtete Aktivität durch die Konzentration des Proteins, das verwendet wird, um die spezifische Aktivität des Enzyms zu erhalten.
    4. Messen Sie die Cytochrom-c-Oxidase (Komplex IV), ausgedrückt als Cytochrom-c-Oxidase-Aktivität. Bereiten Sie dazu eine Systemreaktion vor, die 50 mM Phosphatpufferlösung, pH 7,4, 2 mM EDTA und 0,1 mg mitochondriales Protein enthält (Tabelle 5). Für diese enzymatischen Assays wird Cytochrom c reduziert, indem äquimolare Mengen von Cytochrom c und Natriumdithionit gemischt werden, um eine vollständige Reduktion des Cytochrom c sicherzustellen.
    5. Führen Sie dann die resultierende Mischung durch eine vernetzte Dextran-Gelsäule mit der gleichen phosphatgepufferten Lösung wie die mobile Phase. Anschließend quantifizieren Sie die gesammelten Fraktionen mit einem Spektralphotometer bei 550 nm19. Die Empfehlungen lauten wie folgt:
      1. Verwenden Sie den gleichen Puffer, der auch für die NADH-Dehydrogenase verwendet wird. Pflegen Sie es unter den gleichen Bedingungen.
      2. Wenn die getestete Verbindung eine geringe Löslichkeit in Wasser aufweist, sollte eine zusätzliche Kontrolle der Enzymaktivität in das Versuchsdesign aufgenommen werden.
      3. Überwachen Sie die Cytochrom-c-Oxidation bei 550 nm und berechnen Sie ihre Konzentration anhand ihres molaren Extinktionskoeffizienten von 19,8 mM-1·cm-1 unter Anwendung des Beerschen Gesetzes. Teilen Sie anschließend die berichtete Aktivität durch die Konzentration des Proteins, das verwendet wird, um die spezifische Aktivität des Enzyms zu erhalten.
        HINWEIS: Eine Tabellenkalkulation, die den Prozess der Berechnung der spezifischen Aktivität von Enzymen zeigt, gemessen durch Sauerstoffverbrauch und Spektrophotometrie, ist als Zusatzdatei 1 enthalten.

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Ergebnisse

Bevor Sie die mit diesem Protokoll erzielten Ergebnisse analysieren, ist es wichtig, sich ein wenig über die Biochemie der Elektronentransportkette in den Mitochondrien zu erinnern. Zunächst liefert NADH ein Elektronenpaar an die Oxidoreduktionszentren im Komplex I. Dort beginnt es mit dem Transport von Elektronen, die von Komplex I zu Ubichinon, anschließend zu Komplex III gelangen, der sie an Cytochrom c abgibt, und schließlich zu Komplex IV, wo Sauerstoff der endgültige Elektronenakzeptor ist und ihn zu Wasser reduzie...

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Diskussion

Ein spektrophotometrisches und polarographisches Verfahren mit hochauflösendem O2 wurde eingesetzt, um die Auswirkungen von Xenobiotika auf die Mitochondrienfunktion zu untersuchen. Die Studie untersuchte speziell den Einfluss von ätherischem Cymbopogon flexuosus-Öl und Carvacrol auf die NADH- und Succinatoxidation sowie den Elektronentransport durch die mitochondriale Elektronentransportkette unter Verwendung von zwei verschiedenen biologischen Modellen: isolierte Mi...

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Offenlegungen

Alle Autoren erklären, dass sie keine Interessenkonflikte haben.

Danksagungen

Die Autoren danken der "Vicerrectoría de Investigación y Extensión VIE" der Universidad Industrial de Santander für die Finanzierung der Fördernummer 3739 für das Projekt "Formulierung eines Ixodizids und Ixorepellents, das in einem Labor entwickelt und im Feld validiert wurde, um Zeckenbefall bei Rindern zu verhindern".

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
2,6-DichlorphenolindophenolMerck119814Am selben Tag der Anwendung zubereiten.
Bradford-ReagenzMerckB6916
BSAMerckA7030
CarvacrolMerckW224511
Cytochrom cMerckC2506Lichtempfindlicher Konver bedecken Sie es mit Aluminiumfolie. In Lösung sollte es im Gefrierschrank aufbewahrt werden.
D-MannitolMerckM4125
EGTAMerck>E3889
Ethylendiamintetraessigsäure TetranatriumsalzdihydratMerckE6511
HEPESMerckH3375
KCNMerck60178In Lösung wirkt 2 Wochen lang.
KH2PO4MerckP5655
Multiskan FC Mikroplatten-PhotometerThermo Scientific
Na2HPO4Merck567550
Oroboros O2k Oroboros Instruments10203-03https://www.oroboros.at/index.php/product/o2k-startup/
Phenazinmethosulfat MerckP9625Am Tag der Anwendung vorbereiten.
Kaliumferricyanid Merck244023Am selben Tag der Anwendung zubereiten.
Potter Elvehjem Gewebehomogenisator Röhrchen
RotenonMerck557368Löslich in Ethanol. Lichtempfindliche Konverter decken Sie es mit Aluminiumfolie ab. In Lösung sollte es im Gefrierschrank aufbewahrt werden.
NatriumsuccinatMerckS9637In Lösung sollte es im Gefrierschrank gelagert werden.
SaccharoseMerckS0389
β-Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid, reduziertes DinatriumsalzhydratMerckN8129Lichtempfindlicher Conver mit Aluminiumfolie abdecken. In Lösung sollte es im Gefrierschrank aufbewahrt werden.
, , 51119100

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