Methodenartikel

Ein Mausmodell für mechanotransduktionsgetriebene, menschenähnliche hypertrophe Narbenbildung

DOI:

10.3791/67156

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29. November 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Surgery, University of Arizona, 2Department of Biomedical Engineering, University of Arizona

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In diesem Protokoll wird erklärt, wie ein hypertrophes Narbenmodell für Mausen etabliert werden kann, das die Mechanotransduktionssignalisierung erhöht, um menschenähnliche Narbenbildung zu simulieren. Bei dieser Methode wird die mechanische Spannung an einem Heilungsschnitt bei einer Maus erhöht und mit einem speziellen Gerät reproduzierbares, überschüssiges Narbengewebe für detaillierte histologische und bioinformatische Analysen erzeugt.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hypertrophe Narbenbildung (HTS) ist ein abnormaler Prozess der Wundheilung, der zu einer übermäßigen Bildung von Narbengewebe führt. In den letzten zehn Jahren haben wir gezeigt, dass die Mechanotransduktion – die Umwandlung mechanischer Reize in zelluläre Reaktionen – zu einer übermäßigen Heilung fibrotischer Narben führt. Ein Mausmodell zur Beurteilung der menschenähnlichen hypertrophen Narbenbildung wäre ein wesentliches Instrument, um verschiedene Therapeutika und ihre Fähigkeit, die Narbenbildung zu reduzieren und die Heilung zu verbessern, zu untersuchen. Konkret hat unser Labor ein murines Wundmodell entwickelt, das die mechanische Belastung erhöht, um menschenähnliches HTS zu fördern. Dieses Protokoll verwendet biomechanische Belastungsvorrichtungen aus modifizierten 13-mm-Gaumenexpandern, deren Arme auf beiden Seiten des Schnitts platziert und schrittweise auseinander abgelenkt werden, um während der Heilung eine kontinuierliche Spannung über das Wundbett auszuüben. In fast zwei Jahrzehnten der Anwendung wurde dieses Modell erheblich weiterentwickelt, um die Wirksamkeit und Reproduzierbarkeit zu verbessern. Mit Hilfe des murinen HTS-Modells können signifikante dermale fibrotische Narben induziert werden, die histologisch mit humanen hypertrophen Narben vergleichbar sind. Dieses Mausmodell bietet eine Umgebung für die Entwicklung von Biologika, die an der Behandlung von HTS und mechanotransduktionsbedingten Erkrankungen wie der Fremdkörperreaktion beteiligt sind.

Einleitung

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Die Wundheilung, der Prozess, bei dem der Körper versucht, geschädigtes Gewebe zu reparieren und die Hautbarriere wieder aufzubauen, kann zu einer atypischen Heilung führen, wenn seine Prozesse der Blutstillung, Entzündung, Proliferation und des Umbaus unregelmäßig sind1. Die hypertrophe Narbenbildung (HTS) ist ein Beispiel für eine unregelmäßige Wundheilung, die durch eine übermäßige Ablagerung der extrazellulären Matrix und des Bindegewebes an der Verletzungsstelle gekennzeichnet ist, was zur Bildung einer vergrößerten Narbengewebsfläche führt 1,2,3. Bereiche am Körper, die wiederholten mechanischen Dehnungsstimulationen ausgesetzt sind, wie z. B. um die Gelenke oder im Gesicht, sind anfälliger für die Entwicklung von HTS und Fibrose 4,5,6,7,8,9,10. Wir und andere haben gezeigt, dass die mechanische Dehnung über ein Wundbett die HTS-Bildung durch die Aktivierung von Mechanotransduktionswegen fördert – die Umwandlung mechanischer Reize in zelluläre Reaktionen 9,11.

HTS ist nicht nur mit komplexen biologischen Prozessen verbunden, sondern birgt auch erhebliche soziale, medizinische und wirtschaftliche Herausforderungen für die betroffenen Menschen. Betroffene können mit Selbstwertgefühl und Depressionen zu kämpfen haben, insbesondere wenn sich die Narben in sichtbaren Bereichen wie Gesicht und Händenbefinden 1,9,10,12. Wissenschaftliche Übersichtsartikel zeigen, dass die Prävalenz von HTS in den Vereinigten Staaten zwischen 32 % und 72 % variiert10,13. Die Schwere dieser ästhetischen Bedenken, insbesondere bei schweren Brandverletzungen im Gesichtsbereich, wird durch die zunehmende Zahl von vollständigen Gesichtstransplantationen zur Verbesserung des Aussehens unterstrichen10. Diese Narben können auch funktionelle Beeinträchtigungen verursachen, indem sie die Bewegung einschränken 6,14, und oft ist ein chirurgischer Eingriff erforderlich, um Narben zu entfernen und die Beweglichkeit wiederherzustellen10. Die Kosten für eine HTS-Behandlung können erheblich sein, einschließlich Kosten für Operationen, Behandlungen, Physiotherapie oder sogar Langzeitpflege 1,10. Allein in den Vereinigten Staaten übersteigen die jährlichen Kosten für die Behandlung von HTS 4 Milliarden US-Dollar10.

In Anbetracht der Allgegenwart von HTS und der extremen Maßnahmen, die ergriffen wurden, um seine Komplikationen zu behandeln, bleiben konventionelle Therapien (z. B. chirurgische Exzision, Kortikosteroid-Injektionen und Lasertherapie) sehr variabel 1,2,15,16,17. Während diese Behandlungen in einigen Fällen Linderung verschaffen können, können sie aufgrund der komplexen Natur der Narbenpathologie unzureichend sein. Faktoren wie genetische Unterschiede zwischen Individuen und ein unvollständiges Verständnis der Mechanismen, die HTS antreiben, führen dazu, dass therapeutische Strategien klinisch unbefriedigend bleiben 18,19,20. Die Zukunft der HTS-Therapie scheint in neuen innovativen Ansätzen zu liegen, die auf zellmechanistische Treiber von HTS abzielen, wie z.B. die Mechanotransduktion11,21, von der wir ausführlich gezeigt haben, dass sie eine übermäßige fibrotische Narbenheilung antreibt 5,6,7,8,11,21,22,23,24,25. Konkret hatten wir zuvor ein Mausmodell entwickelt, das die mechanische Belastung von Wunden erhöht, um menschenähnliches HTS9 zu fördern. Nach fast zwei Jahrzehnten der Anwendung wurde das Modell jedoch erheblich weiterentwickelt, um die Wirksamkeit und Reproduzierbarkeit zu verbessern. Dieses Protokoll wird es den Forschern ermöglichen, ein aktualisiertes und optimiertes HTS-Mausmodell optimal zu nutzen, um die Zellpopulationen und Treiber hinter übermäßiger Narbenbildung zu untersuchen. Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist es, Forschern ein Protokoll zur Verfügung zu stellen, das entwickelt wurde, um menschenähnliche hypertrophe Narben bei Mäusen zu erzeugen.

Protokoll

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Für alle Versuche wurde die Genehmigung des Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der University of Arizona eingeholt (Kontrollnummer: 2021-0828). Dieses Protokoll verwendet 15 Wochen alte männliche C57BL/6J-Mäuse, obwohl es auch auf andere Altersgruppen und Stämme 9,26 angewendet werden könnte.

1. Erstellung der biomechanischen Ladevorrichtung HTS

HINWEIS: Das Modifizieren der Gaumenexpander in das HTS-Gerät kann jederzeit vor dem Experiment erfolgen.

  1. Nehmen Sie den unveränderten Gaumenexpander und präsentieren Sie ihn dem Makerspace-Kern oder dem Fertigungskern mit den Spezifikationen gemäß Abbildung 1A,B.
    HINWEIS: Wenn kein Makerspace oder Fertigungskern verfügbar ist, fahren Sie mit den folgenden Schritten fort.
  2. Verwenden Sie ein Mini Universal Bender (MUB) Drahtbiegewerkzeug, um den Gaumenexpander so zu verändern, dass er den Spezifikationen in Abbildung 1A,B entspricht.
  3. Stellen Sie das Gerät flach auf eine Oberfläche, wie in Abbildung 1A1 gezeigt.
  4. Beugen Sie die Arme für die oberen Arme um 90° nach oben und für die unteren Arme um 90° nach unten, wenn das Gerät flach mit dem MUB liegt, wie in Abbildung 1A2 zu sehen. Siehe Abbildung 1A3 für das Erscheinungsbild der Vorrichtung, wenn sie flach auf einer Oberfläche ruht, bei der die Arme nun vollkommen parallel zum Gehäuse der Vorrichtung sind.
  5. Biegen Sie jeden Arm um 90° entlang der Achse der gestrichelten Linie zurück in die Seite, wie in Abbildung 1A4 zu sehen ist. Siehe Abbildung 1A5 für das Gerät nach dem Biegen.

2. Haarentfernung und Erstschnitt am postoperativen Tag 0 (POD 0)

HINWEIS: Reinigen und autoklavieren Sie vor der Operation mehrere Sätze chirurgischer Instrumente (z. B. Präparierschere, Skalpell, Adson-Pinzette, Nadeltreiber). Bereiten Sie sterilisierte 5-0-Nähte für den Gebrauch vor und haben Sie einen chirurgischen Marker zur Hand.

  1. Reinigen Sie den Operationsraum mit 70%igem Ethanolspray.
  2. Legen Sie ein auf 35 °C eingestelltes Heizkissen auf den präoperativen Vorbereitungstisch. Klebe ein saugfähiges Pad über das Heizkissen. Legen Sie ein weiteres saugfähiges Pad über das vorherige Pad (um rasiertes Haar aufzufangen). Kleben Sie den Anästhesiekegel (oder die Anästhesiekegel) auf das saugfähige Pad.
    HINWEIS: [Optional] Wenn ein Tischabzug verfügbar ist, platzieren Sie den Kegel in der Nähe der Arbeitsfläche und schalten Sie die Absaugung ein.
  3. Legen Sie die Maus in die Anästhesie-Induktionskammer mit 1-3% Isofluran und 2 L/min Sauerstofffluss, bis die Mäuse ruhig atmen (2-3 min).
  4. Führen Sie die Nase jeder Maus in die Öffnung des Nasenkegels ein, um die Inhalation einer Anästhesie zu ermöglichen, die aus 1-3% Isofluran mit 2 l/min Sauerstoff besteht. Bestätigen Sie eine angemessene Anästhesie durch das Fehlen einer Reaktion auf ein Zehenklemmen. Tragen Sie eine Augenschmiersalbe auf die Augen der Maus auf.
  5. Verwenden Sie einen Elektrorasierer, um die Haare auf dem Rücken in dem Bereich zu rasieren, wie in Abbildung 1C zu sehen.
  6. Tragen Sie die Enthaarungspaste mit einem behandschuhten Finger oder Wattestäbchen auf die Haut auf und bedecken Sie die rasierte Stelle. Wischen Sie die Paste nach 45 s mit Gaze und dann mit einem Alkoholtupfer ab. Wischen Sie den Rücken mit einem weiteren Alkoholtupfer ab, um die Enthaarungspaste zu entfernen, und hinterlassen Sie einen haarlosen Fleck (Abbildung 1C).
    HINWEIS: Es ist wichtig, eine moderate Menge Paste zu verwenden, die Paste sofort zu entfernen und die Maus nach dem Entfernen der Paste abzuwischen, um Hautverbrennungen durch die Enthaarungspaste zu vermeiden. Die Haut von Mäusen ist dünn und daher anfällig für schnelle chemische Verbrennungen, die sich sowohl auf die Gesundheit der Maus als auch auf die Versuchsqualität nachteilig auswirken können.
  7. Versehen Sie die Maus zur Identifizierung mit einem Ohrmarkierer.
  8. Setzen Sie die Maus nach dem Entfernen der Haare wieder in den Käfig, um eine übermäßige Exposition gegenüber Isofluran zu vermeiden. Überwachen Sie die Maus.
  9. Entfernen Sie das obere saugfähige Pad, das mit Haaren bedeckt ist, um eine saubere präoperative Arbeitsfläche zu haben.
  10. Richten Sie einen separaten chirurgischen Arbeitsbereich ein. Legen Sie ein auf 35 °C eingestelltes Heizkissen auf den Operationstisch. Klebe ein saugfähiges Pad über das Heizkissen. Kleben Sie den Anästhesiekegel (oder die Anästhesiekegel) auf das saugfähige Pad.
  11. Platzieren Sie eine Maus in der Anästhesie-Induktionskammer mit 2-4% Isofluran und 2 L/min Sauerstofffluss, bis die Maus ruhig atmet (2-3 min).
  12. Nehmen Sie die Maus aus der Induktionskammer und legen Sie sie auf die Bedienfläche. Führen Sie die Nase jeder Maus in die Öffnung des Nasenkegels ein, um die Inhalation einer Anästhesie zu ermöglichen, die aus 1-3% Isofluran mit 2 l/min Sauerstoff besteht. Bestätigen Sie eine angemessene Anästhesie durch das Fehlen einer Reaktion auf ein Zehenklemmen. Tragen Sie eine Augenschmiersalbe auf die Augen der Maus auf.
  13. Zur postoperativen Schmerzbehandlung werden 0,05 mg/kg Buprenorphin mit verzögerter Freisetzung subkutan mit einer 21-g-Nadel in die Schulter injiziert.
  14. Desinfizieren Sie den Rücken der Maus mit drei abwechselnden Runden Peeling auf Jod/Chlorhexidin-Basis und Alkoholtupfer. Markieren Sie mit dem chirurgischen Markierungsstift und einem Lineal eine 2 cm lange Linie auf der dorsalen Mittellinie, an der der Schnitt in voller Dicke vorgenommen wird, wie in Abbildung 1D gezeigt.
  15. Verwenden Sie ein Skalpell oder eine Präparierschere (chirurgische Präferenz), um den dorsalen Mittellinienschnitt in voller Dicke durch den markierten Bereich vorzunehmen.
    HINWEIS: Achten Sie darauf, das darunter liegende Gewebe (z. B. Muskeln) nicht zu schneiden, wie in Abbildung 1D zu sehen.
  16. Mit 5-0-Nähten in einem einfachen unterbrochenen Muster schließen Sie den Schnitt, indem Sie die Wunde halbieren, wie in Abbildung 1D gezeigt. Verwenden Sie mindestens 5 gleichmäßig verteilte Nähte.
  17. Schneide eine Telfa-Gaze in ein 3 cm x 1 cm großes Stück. Legen Sie ihn in die Mitte eines Schaum-Klebeverbandes und legen Sie den Klebeverband so auf den Rücken der Maus, dass die Gaze den Schnitt bedeckt, wie in Abbildung 1D gezeigt. Legen Sie einen halbierten Verband auf den Bauch und wickeln Sie ihn umlaufend, bis er auf den Rückenverband trifft.
  18. Nachdem der Verband fertig ist, setzen Sie die Maus in einen separaten sterilen Käfig und überwachen Sie sie, bis sie sich vollständig von der Narkose erholt hat.
  19. Wiederholen Sie den Vorgang mit allen Mäusen, unabhängig von der Versuchsgruppe. Lassen Sie den Schnitt in den nächsten 4 Tagen heilen, bevor Sie mit dem nächsten Schritt beginnen.

3. Platzierung der biomechanischen HTS-Belastungsvorrichtung (POD 4)

HINWEIS: Reinigen und autoklavieren Sie die HTS-Geräte und mehrere Sätze chirurgischer Instrumente vor der Operation (z. B. Präparierschere, Skalpell, Adson-Pinzette, Nadeltreiber, Hautklammer, Hautklammern). Bereiten Sie sterilisierte 5-0-Nähte für den Gebrauch vor. [Fakultativ] Wenn ein Tischabzug verfügbar ist, platzieren Sie den Kegel in der Nähe des Arbeitsbereichs und schalten Sie die Absaugung ein.

  1. Bereiten Sie den Operationsbereich wie in den Schritten 2.1 und 2.2 beschrieben vor.
  2. Betäuben Sie die Maus und führen Sie eine Analgesie durch, indem Sie die Schritte 2.11-2.13 befolgen.
  3. Trennen Sie den Verband mit der Pinzette oder dem Nadeltreiber vom Bauch der Maus, indem Sie das Werkzeug von Seite zu Seite gegen die Bauchseite führen. Lassen Sie das Werkzeug zwischen dem Wickel und der Haut, um den Verband von der Haut abzuheben, und schneiden Sie den Verband mit einer Schere ab.
    HINWEIS: Achten Sie darauf, die Maushaut nicht zu schneiden, den Verband abzureißen oder den Heilungsschnitt zu stören.
  4. Reinigen Sie den Rücken mit einem Alkoholtupfer. Untersuchen Sie den Schnitt auf Wunddehiszenz oder Anzeichen einer Infektion.
  5. Stellen Sie sicher, dass das HTS-Gerät nicht erweitert/erweitert ist und sich in seiner verkleinerten Form befindet, wie in Abbildung 1B gezeigt. Bestreichen Sie die Arme des Geräts leicht mit medizinischem Kleber.
  6. Ziehen Sie mit einer Hand die Haut auf dem Mäuserücken in Querrichtung leicht straff. Platzieren Sie mit der anderen Hand das HTS-Gerät so auf dem Rücken der Maus, dass der Schnitt von jedem Arm des HTS-Geräts gleich weit entfernt ist, wodurch das Gerät über dem Schnitt zentriert wird. Stellen Sie sicher, dass die Haut zwischen den Armen des HTS-Geräts gleichmäßig gespannt ist. Halten Sie das Gerät an Ort und Stelle, bis der Kleber getrocknet ist (~30 s), wie in Abbildung 2A zu sehen.
    HINWEIS: Es ist wichtig, die Haut gleichmäßig straff zu halten, um sicherzustellen, dass die Spannung mit dem Gerät gleichmäßig auf den Schnitt ausgeübt wird. Lassen Sie die Nähte während dieses Vorgangs intakt, da der Prozess des Platzierens des Geräts der Haut eine mechanische Spannung hinzufügt, die den Heilungsschnitt wieder öffnen kann. Die Nähte bleiben bis zum ersten Tag der Dehnung an Ort und Stelle, um sicherzustellen, dass die Wunde geschlossen bleibt.
  7. Befestigen Sie vier Nähte um jeden Arm und durch die Haut, wie in Abbildung 2B gezeigt. Achten Sie beim Nähen darauf, dass die Nadel die Haut in Richtung Schnitt verlässt.
    HINWEIS: Das Einführen der Nadel von der Inzisionsseite des Geräts kann manchmal dazu führen, dass der Schnitt aufgrund der Kraft, die zum Durchstechen der Haut erforderlich ist, aufgerissen wird.
  8. Platzieren Sie nun drei Hautklammern um die Arme und durch die Haut und befestigen Sie das HTS-Gerät auf der Haut, wie in Abbildung 2B gezeigt.
  9. Verbinden Sie die Maus, indem Sie die Schritte 2.17 und 2.18 ausführen.
  10. Wiederholen Sie den Vorgang mit allen Mäusen, unabhängig von der Versuchsgruppe.
    HINWEIS: Alle Mäuse erhalten die gleiche Vorbereitung; Sie werden jedoch in jeder Versuchsgruppe (z.B. control, stretch) zufällig zugeordnet, um eine unverzerrte Verteilung der Mäuse im Versuchsdesign zu gewährleisten. Konkret wird das Gerät sowohl bei Kontroll- als auch bei Stretchmäusen an ihrem Rücken befestigt. Die Geräte der Kontrollmäuse bleiben unberührt, während die Stretch-Mäuse die nächsten Schritte durchlaufen.

4. Erste Dehnung der biomechanischen Belastungsvorrichtung HTS (POD 5)

HINWEIS: Reinigen und autoklavieren Sie vor der Operation mehrere Sätze chirurgischer Instrumente (z. B. Präparierschere, Skalpell, Adson-Pinzette, Nadeltreiber). [Fakultativ] Wenn ein Tischabzug verfügbar ist, platzieren Sie den Kegel in der Nähe der Arbeitsfläche und schalten Sie die Absaugung ein.

  1. Ordnen Sie jede Maus per Ohrmarke zufällig der gewünschten Gruppe zu. Bei Kontrollmäusen entfernen Sie einfach die Nähte am Schnitt und wechseln die Verbände der Wunden (Schritte 1-6 und dann 8-9). Falls gewünscht, entfernen Sie das Gerät zum Zeitpunkt der Dehnung und machen Sie ein Foto mit einem Messwerkzeug zur Skala, um die Narbengröße zu verfolgen.
  2. Bereiten Sie den Operationsbereich vor, betäuben Sie die Maus und entfernen Sie den Verband, indem Sie die Schritte 3.1-3.4 ausführen.
    HINWEIS: Achten Sie darauf, den Verband nicht abzureißen oder den Heilungsschnitt zu stören. Wenn sich ein Arm des HTS-Geräts von der Haut gelöst hat, kleben Sie es leicht wieder an seinen Platz und fügen Sie je nach Größe der Ablösung eine Hautklammer oder Naht hinzu.
  3. Entfernen Sie die Nähte aus der Wunde mit einer Präparierschere oder einer anderen Methode Ihrer Wahl.
  4. Stecken Sie den HTS-Geräteschlüssel in das Gerät, und drehen Sie es, um das Gerät zu erweitern, bis die Haut straff ist, aber nicht die Gefahr besteht, dass die Haut reißt, wie in Abbildung 2C zu sehen.
    HINWEIS: Diese anfängliche Ablenkung kann etwa 4-8 volle Umdrehungen des Schlüssels in Anspruch nehmen, da die Haut zwischen den Armen des Geräts locker sein kann.
  5. Verbinden Sie die Maus, indem Sie die Schritte 2.17 und 2.18 ausführen.

5. Nachfolgende Dehnung der biomechanischen HTS-Ladevorrichtung (POD 7, 9, 11, 13, 15, 17)

HINWEIS: Reinigen und autoklavieren Sie vor der Operation mehrere Sätze chirurgischer Instrumente (z. B. Präparierschere, Skalpell, Adson-Pinzette, Nadeltreiber). [Fakultativ] Wenn ein Tischabzug verfügbar ist, platzieren Sie den Kegel in der Nähe des Arbeitsbereichs und schalten Sie die Absaugung ein.

  1. Bei Kontrollmäusen wechseln Sie einfach die Verbände der Wunden (Schritte 1-5 und dann Schritte 13-14). Falls gewünscht, entfernen Sie das Gerät zum Zeitpunkt der Dehnung und machen Sie ein Foto der Narbe mit einem Messwerkzeug für die Skala, um die Narbengröße zu verfolgen.
  2. Bereiten Sie den Operationsbereich vor, betäuben Sie die Maus und entfernen Sie den Verband, indem Sie die Schritte 3.1-3.4 befolgen.
    HINWEIS: Wenn sich ein Arm eines HTS-Geräts von der Haut gelöst hat, kleben Sie ihn fest und fügen Sie je nach Größe der Ablösung eine Hautklammer oder Naht hinzu.
  3. Stecken Sie den HTS-Geräteschlüssel in das Gerät und drehen Sie es, um das Gerät zu erweitern, bis die Haut straff ist, aber nicht die Gefahr besteht, dass die Haut reißt.
    HINWEIS: Dies kann ca. 4 Umdrehungen oder ~2 mm totale Ablenkung dauern. Wenn das Gerät die maximale Ausdehnung erreicht hat und nicht weiter verlängert werden kann, führen Sie die Schritte 5.4 bis 5.7 aus, um ein neues Gerät abzunehmen und wieder anzuschließen. Andernfalls verbinden Sie die Maus, indem Sie die Schritte 2.17 und 2.18 ausführen.
  4. Wenn das Gerät die maximale Ausdehnung erreicht hat, entfernen Sie das Gerät vom Rücken der Maus, indem Sie die Klammern mit einem Klammerentferner oder einer Schere entfernen, indem Sie die Zacken der Klammern aufhebeln. Entfernen Sie dann die Nähte und entfernen Sie vorsichtig das Gerät.
  5. Reinigen Sie das Gerät mit einem Skalpell, Alkoholtupfern und Papiertüchern. Weichen Sie das Gerät ~20 Minuten lang in 70% Ethanol ein, um die Reinigung zu erleichtern. Verwenden Sie dann den Schlüssel, um das Gerät in seine dünnste Form zu bringen.
  6. Schließen Sie das HTS-Gerät wieder an, indem Sie die Schritte 3.5-3.8 ausführen.
  7. Verbinden Sie die Maus, indem Sie die Schritte 2.17 und 2.18 ausführen.

6. Entnahme des HTS-Gewebes (POD 19)

HINWEIS: Die Entnahme von Gewebe kann zu jedem Zeitpunkt des Prozesses erfolgen. Wir haben Gewebe nach nur 4 Tagen Dehnung entnommen, um frühe Zeitpunkte zu untersuchen; am konsistentesten wird jedoch bei POD 19 (2 Wochen nach Beginn des Stammes) Gewebe entnommen. Reinigen und autoklavieren Sie vor der Operation mehrere chirurgische Instrumente (z. B. Präparierschere, Skalpell, Adson-Pinzette). Um Fotos der Narbe im Laufe der Zeit zu erhalten, kann das Gerät vor jedem Dehnungsschritt entfernt werden, um ein Foto der Narbe zu machen, bevor das Gerät erneut angebracht und die mechanische Belastung wieder eingeleitet wird. [Fakultativ] Wenn ein Tischabzug verfügbar ist, platzieren Sie den Kegel in der Nähe der Arbeitsfläche und schalten Sie die Absaugung ein. Der Laborabzug kann ausgeschaltet werden, wenn das Isoflurangas nicht mehr verwendet wird.

  1. Bereiten Sie den Operationsbereich vor, betäuben Sie die Maus und entfernen Sie den Verband, indem Sie die Schritte 3.1-3.4 befolgen.
  2. Opfern Sie die Maus über eine Gebärmutterhalsluxation.
    HINWEIS: Achten Sie darauf, nicht an der Haut zu ziehen und den Rücken der Maus zu zerreißen.
  3. Verwenden Sie eine Präparierschere oder einen Hautklammerentferner, um die Hautklammern zu entfernen. Schneide die Nähte ab. Entfernen Sie das HTS-Gerät vorsichtig und achten Sie darauf, die Haut nicht zu zerreißen.
  4. Schneide mit einem Skalpell oder einer Schere die Haut um die HTS-Narbe herum auf. Konservieren Sie die Haut für die histologische Analyse in der gewünschten Weise.
    HINWEIS: Wenn die Haut für Transkriptom- oder Proteinanalysen (z. B. qPCR, Western Blot, Einzelzellanalyse) verwendet werden soll, achten Sie darauf, nur das HTS-Narbengewebe herauszuschneiden, um die Menge des umgebenden gesunden Gewebes zu minimieren. Dadurch wird sichergestellt, dass bei der Analyse nur das Narbengewebe erfasst wird.
  5. Kratzen Sie die HTS-Geräte mit einem Skalpell sauber. Legen Sie die Geräte in ein Becherglas mit 70 % Ethanol, um den verbleibenden Klebstoff oder das Gewebe aufzuweichen.
    HINWEIS: Nach dem Einweichen in 70 % Ethanol müssen die Geräte vor dem Autoklavieren möglicherweise erneut abgewischt, abgekratzt und gereinigt werden.

7. Messung der durchschnittlichen Narbenbreite

HINWEIS: Dies wurde mit der Bildanalysesoftware ImageJ erreicht, und die Informationen wurden in einer Tabelle aufgezeichnet.

  1. Öffnen Sie Bilder in ImageJ. Zeichnen Sie die Kanten der Narbe mit dem Polygonwerkzeug nach. Klicken Sie auf Analysieren | Messen , um diesen Bereich zu messen.
    HINWEIS: Die Narbe ist an ihrer Verfärbung und dem Fehlen von Haarfollikeln zu erkennen.
  2. Messen Sie die Länge der Narbe von Ende zu Ende mit dem Segmentwerkzeug . Klicken Sie auf Analysieren | Messen , um diese Länge zu messen.
  3. Messen Sie die Länge von 1 cm oder eine andere standardisierte Längeneinheit im Bild mit dem Segmentwerkzeug . Klicken Sie auf Analysieren | Messen , um diese Länge zu messen.
  4. Nimm in der Tabelle die Fläche der Narbe (in Pixel; px) und dividiere diese durch die Länge der Narbe (px-Länge). Dieses Ergebnis ergibt die durchschnittliche Narbenbreite in Pixeln.
  5. Teilen Sie dieses Ergebnis durch die gemessene Standardlängeneinheit (px-Länge). Das Ergebnis ist die durchschnittliche Narbenbreite in der Einheit der Standardlängeneinheit (z. B. cm), die für das Experiment verwendet wurde.

Ergebnisse

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Um die effektive Nutzung des HTS-Protokolls deutlich zu demonstrieren und erfolgreiche "positive" Ergebnisse zu identifizieren, wurde das Modell wie in Abbildung 3A dargestellt erstellt. In der repräsentativen Studie gab es zwei Gruppen: No Stretch Control (n = 6) und Mechanical Stretch HTS-Gruppe (n = 6), in denen menschenähnliche Mengen an mechanischer Belastung über die Inzision induziert wurden, um ein HTS zu erzeugen, wie in Abbildung 3B,C zu sehen ist. Im Rahmen des in Abbildung 3A-C dargestellten Versuchsplans wurde die Narbe an den PODs 5, 9, 15 und 19 grob fotografiert. Die Narben wurden mit ImageJ nachgezeichnet und auf die durchschnittliche Breite der Narben zu den verschiedenen Zeitpunkten analysiert (Abbildung 3D). Die durchschnittlichen Narbenbreiten wurden in Abbildung 3E über die Zeit und zwischen den Gruppen grafisch dargestellt. Nach Anwendung mechanischer Dehnung bei POD 5, wo sich die Narben zwischen Stretch und Control nicht signifikant unterschieden, zeigte die Stretch Group signifikant breitere Narben als die Control und erreichte eine Peakbreite von 0,99 mm bei POD 9 (p = 0,045). Diese signifikant größere Narbenbreite im Vergleich zur Kontrolle setzte sich bei POD 15 (p = 0,043) und 19 (p = 0,045) fort. Es wird empfohlen, Grobfotografie nur an den Tagen zu machen, an denen das HTS-Gerät entfernt werden muss (d. h. das HTS-Gerät hat die maximale Ausdehnung erreicht und muss wieder angebracht werden oder während der Explantation), da das Gerät die korrekte Fotografie der Narbe blockiert. In diesem Protokoll geben Bilder und Narbenbreitenanalysen über mehrere Zeitpunkte hinweg dem Leser einen klareren Überblick über den Wundverlauf des Modells.

Die Analyse des HTS-Gewebes kann auf verschiedene Weise durchgeführt werden, wie z. B. die IHC-Färbung für fibrotische Marker, die H&E- und Trichrom-Färbung zur Untersuchung der histologischen Narbenbereiche, die Picrosirius-Rot-Färbung zur Beurteilung der Kollagenarchitektur der Narben und andere Methoden zur Wundanalyse - die alle in der Vergangenheit vom Labor verwendet wurden6, 8,21,24,25,27,28 (Abbildung 4). Abbildung 4 zeigt histologische Merkmale des HTS-Gewebes, wie z. B. erhabenes Narbengewebe (Abbildung 4A), Verlust von Adnexstrukturen und Haarfollikeln (Abbildung 4B), Ausrichtung der Kollagenfasern in Richtung mechanischer Belastung (Abbildung 4C) und Kollagenwirbel (Abbildung 4F). Abbildung 4 zeigt auch die immunhistochemische Färbung der Mastzelldichte und des Gefäßsystems von murinem HTS und vergleicht sie mit humanem HTS-Gewebe (Abbildung 4D,E,G,H). Darüber hinaus kann die Analyse der HTS-Narbe mit einer Einzelzellanalyse durchgeführt werden, wenn das Gewebe unmittelbar nach der Exzision entnommen, vorbereitet und in einen Bioinformatikkern gebracht wird.

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Abbildung 1: Präparation des HTS-Geräts und des Rückens der Maus. (A) Modifikationsprozess eines 13 mm Gaumenexpanders zur Herstellung der HTS-Vorrichtung, (1) Darstellung der anfänglichen Expanderstruktur, (2) Biegung der Arme um 90° nach oben für die oberen Arme und nach unten für die unteren Arme, wenn die Vorrichtung flach liegt, (3) Ergebnis der anfänglichen Biegung, bei der die Arme nun perfekt parallel zum Körper der Vorrichtung sind, (4) Biegen der Arme zur Bildung einer Endvorrichtung mit Messungen; Die Arme sollten jeweils um 90° in die Seite gebogen werden, wie in der (5) Endvorrichtung zu sehen. (B) Das vollständig montierte HTS-Gerät aus verschiedenen Winkeln, sowohl nicht ausgefahren als auch ausgefahren. (C) Aufeinanderfolgende Schritte zur Vorbereitung des Rückens der Maus: (1) Anfangszustand mit Fell, (2) nach der Rasur und (3) nach dem Auftragen der Enthaarungspaste. (D) Verfahren zur Erstellung des dorsalen Schnittes: (1) Markieren der Schnittstelle mit einer 2 cm langen Hilfslinie, (2) Vornehmen des Schnitts, (3) Nähen der Wunde, (4) Auftragen der Telfa-Gaze und (5) Befestigung mit einem Klebeverband. (E) Grobfotografie des (1) Schnitts und (2) nach dem Vernähen des geschlossenen Schnitts. Abkürzung: HTS = hypertrophe Narbenbildung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 2: Positionieren und Strecken des HTS-Geräts. (A) Darstellung der korrekten Positionierung des HTS-Geräts auf dem Rücken der Maus, um die korrekte Ausrichtung mit der Inzisionsstelle zu gewährleisten. Das linke Bild zeigt die Platzierung des Geräts aus einer hinteren Position. Das rechte Bild zeigt die Platzierung des Geräts seitlich gesehen. (B) Illustration der Befestigung des HTS-Geräts: (1) Erstplatzierung, (2) Lage der Nähte, (3) Lage der Hautklammern. (C) Demonstration der Dehnung des HTS-Geräts mit dem beschrifteten HTS-Geräteschlüssel: (1) Startkonfiguration, (2) Anwendung von Spannung, (3) der endgültige expandierte Zustand, der so konzipiert ist, dass eine gleichmäßige mechanische Dehnung über den Heilungsschnitt ausgeübt wird, um die hypertrophe Narbenbildung zu fördern, 2 mm Ausdehnung angewendet. (D) Bruttofotografie des Ausübens von Spannung auf das HTS-Gerät mit beschriftetem HTS-Geräteschlüssel. (E) Bruttofotografie der vollständig bandagierten Maus. Abkürzung: HTS = hypertrophe Narbenbildung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 3: Anwendung mechanischer Dehnung zur Entwicklung von Narben. (A) Zeitleiste des experimentellen Verfahrens von der Erstellung der Inzision (POD 0) bis zur Anwendung mechanischer Dehnung (POD 4) und durch die Dehnungsphase (POD 5 bis POD 19), die in der Gewebeexplantation (POD 19) gipfelt. (B) Abbildung der beiden Gruppen: No Stretch Control und Mechanical Stretch HTS-Gruppen. (C) Schnittschema, das den Unterschied in der Gewebereaktion zwischen den Gruppen No Stretch Control und Stretch HTS darstellt. (D) Repräsentative Bruttobilder von Narben der No Stretch Control- und Stretch HTS-Gruppen an postoperativen Tagen (POD 5, 9, 15 und 19), wobei die hypertrophen Narben in einer gelben gestrichelten Linie gezeichnet sind. (E) Quantitative Analyse der durchschnittlichen Narbenbreite im Zeitverlauf, die signifikante Unterschiede in der Narbenentwicklung zwischen der No-Stretch- und der Stretch-Gruppe zeigt, wobei die Fehlerbalken die Standardabweichung darstellen. Signifikante Unterschiede sind mit Sternchen (*) gekennzeichnet. Die statistische Analyse wurde mit Hilfe der Zwei-Wege-Varianzanalyse (ANOVA) durchgeführt. Werte von *p < 0,05 wurden als statistisch signifikant angesehen. Abkürzungen: HTS = hypertrophe Narbenbildung; POD = postoperativer Tag. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 4: Histologie der Narbe. Diese murine Narbenhistologie wurde nach 2 Wochen mechanischer Belastung in unserer zuvor veröffentlichten Arbeit9,26 entnommen. (A) Das größere Bild zeigt die histologische H&E-Bildgebung des Narbenquerschnitts, während das untere rechte Bild eine histologische Trichrom-Bildgebung des Narbenquerschnitts zeigt, die zeigt, wie die Narbenregion angehoben ist. (B) Das größere Bild zeigt die histologische H&E-Bildgebung des Narbenquerschnitts, während das untere rechte Bild eine histologische Trichrom-Bildgebung des Narbenquerschnitts zeigt, die zeigt, wie die Narbenregion einen Verlust von Adnexstrukturen und Haarfollikeln zeigt. (C) Das größere Bild zeigt eine Picrosirius-Rot-Bildgebung des Narbenquerschnitts, während das untere rechte Bild eine trichrome histologische Bildgebung des Narbenquerschnitts zeigt, die ausgerichtete Kollagenfasern in Richtung mechanischer Belastung zeigt. (D) Das größere Bild zeigt die Bildgebung der CD117-Immunhistochemie in murinem HTS-Gewebe, während das untere rechte Bild die Bildgebung der CD117-Immunhistochemie in menschlichem Gewebe zeigt, die eine Mastzelldichte zeigt, die mit humanem HTS-Gewebe vergleichbar ist. (E) Das größere Bild zeigt die Bildgebung der CD31-Immunhistochemie des Gefäßsystems in murinem HTS-Gewebe, während das untere rechte Bild die Bildgebung der CD117-Immunhistochemie in menschlichem Gewebe zeigt, die eine mit humanem HTS-Gewebe vergleichbare Mastzelldichte zeigt. (F) Kollagenwirbel, die in reifen hypertrophen menschlichen Narben im Bild unten rechts zu sehen sind, sind auch in geladenen Mausnarben nach 24 Wochen in der eingekreisten Region in der H&E-Bildgebung von Mäusen zu sehen. (G) Repräsentative Bruttobilder von Narben einer Kontrollgruppe (Inzision + keine Dehnung), einer Dehnungskontrollgruppe (keine Inzision + Dehnung) und einer Dehnungs-HTS-Gruppe. (H) Zeigt eine Immunhistochemie im Vergleich der Kontrollgruppe (Inzision + keine Dehnung) und der Stretch-HTS-Gruppe. Unter Verwendung einer Co-Färbung für fibrotische Marker pEPF, aSMA und YAP mit DAPI kommt es zu einem Anstieg der fibrotischen Marker in der HTS-Gruppe. A-F wurden von Aarabi, S. et al.9 übernommen. G,H wurden von Mascharak, S. et al. übernommen. Nachdruck mit Genehmigung von FASEB26. Abkürzungen: HTS = hypertrophe Narbenbildung; H&E = Hämatoxylin und Eosin; pEPF = Engrailed-positiver Fibroblast; aSMA = Alpha-glattes Muskelaktin; YAP = Ja-assoziiertes Protein; DAPI = 4',6-diamidino-2-phenylindol. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Diskussion

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Das HTS-Mausmodell ist eine kostengünstige und hoch reproduzierbare Methode, um HTS über Mechanotransduktion zu induzieren und potenzielle Therapien zu entwickeln. Während es eine anfängliche Lernkurve gibt, um das Modell effektiv zu nutzen, kann das Protokoll mit etwas Übung von jedem Forscher ohne chirurgische Ausbildung durchgeführt werden. Die Verwendung dieses Modells ermöglicht es den Forschern, die HTS-Bildung und die Rolle der Mechanotransduktion bei der Wundheilung besser zu verstehen, was zu spürbaren Verbesserungen in der Wundversorgung von Patienten führen kann. Die Videodemonstration, die dieses Protokoll begleitet, wird die Lernkurve für die Forscher im Idealfall verkürzen und die reibungslose Implementierung dieses Modells in zukünftige Studien erleichtern. Es gibt jedoch eine Reihe kritischer Schritte im Protokoll, die von einer weiteren Erklärung profitieren könnten, um die Klarheit für die Benutzer zu verbessern.

Chronologisch beginnend mit dem Beginn des Protokolls ist der erste wichtige Schritt das Schließen des chirurgischen Schnitts am postoperativen Tag 0 (POD 0). Es ist zwingend erforderlich, dass der Schnitt vollständig verschlossen wird und die Hautschichten in perfekter Appositionsind 29. Dadurch soll sichergestellt werden, dass der Schnitt richtig heilt und sich nicht öffnet, sobald das Gerät platziert und Spannung über die Wunde induziert wird. Wenn sich die Wunde öffnet (Dehiszenz), sollte das Tier nicht für weitere Versuche verwendet werden.

Wenn Sie das HTS-Gerät auf POD 4 platzieren, ist es entscheidend, dass die Spannung über den Rücken der Maus gleichmäßig verteilt ist. Bei richtiger Platzierung des Geräts ist die ausgeübte Spannung über den gesamten Schnitt gleichmäßig, wodurch das Risiko einer variablen Krafteinwirkung verringert wird, die zu suboptimalen Versuchsergebnissen (ungleichmäßige Narbenbildung) führen könnte. Wenn das Gerät falsch befestigt ist, erhalten Teile des Schnitts nicht gleichmäßig die durchschnittlichen 2 mm Distraktion jeden zweiten Tag, um HTS zu induzieren. Die Ausdehnung des Geräts sollte die Erschlaffung der Haut beseitigen und sie straff machen. Gleichzeitig muss darauf geachtet werden, dass das Gerät nicht überdehnt wird, was zu einem Dehisz der Wunde führen könnte. Werden die Geräte für mehrere Versuchsrunden verwendet, kann sich das rotierende Getriebe, in dem der Schlüssel zum Aus- und Zusammenziehen des Gerätes platziert ist, lösen. In diesem Fall sollte ein neues Gerät hergestellt und das alte Gerät verworfen werden.

Wenn die Belastung bei POD 5 eingeleitet wird, sollte mit der Verabreichung einer Therapie zur Narbenprävention begonnen werden. Therapien wie topische Salben werden in der Regel jeden zweiten Tag verabreicht, wenn die Belastung durch Verteilen über die Inzisionsstelle eingeleitet wird. Hydrogele werden in ähnlicher Weise über die Inzisionsstelle gelegt. Systemische Therapien können entweder über die Schwanzvene oder retroorbital in den Blutkreislauf injiziert werden.

Es ist ratsam, den Rücken der Maus um die Narbe herum auf POD 19 oder vor dem Fotografieren der Narbe zu rasieren und/oder leicht zu enthaaren. Dies verbessert die Sichtbarkeit und die anschließende Analyse der Narbengröße mit ImageJ. Wenn Sie Enthaarungspaste verwenden, sollten Sie sich außerdem für weniger Paste und kürzeren Zeitaufwand entscheiden. Eine übermäßige Exposition des Rückens der Maus gegenüber der Paste kann zu Verätzungen führen, die den Wundheilungsprozess beeinträchtigen können. Die Haut von Mäusen ist dünner als die menschliche Haut und anfälliger für chemische Verbrennungen30.

Das HTS-Mausmodell ist von Natur aus begrenzt, da es keine menschliche Haut verwendet und daher menschliches HTS nicht vollständig rekapitulieren kann. Es hat jedoch eine Reihe von logistischen Vorteilen gegenüber anderen Tiermodellen; Wenn es richtig ausgeführt wird, ist dieses Maus-HTS-Modell zuverlässig, kostengünstig und einfach durchzuführen. Biologisch wird das HTS durch physikalische Erhöhungen der mechanischen Signalübertragung induziert. Andere Modelle von HTS bei Kaninchen induzieren HTS am Ohr oder am Rücken durch thermische und chemische Verletzungen 30,31,32. An der Haut auf der ventralen Seite des Kaninchenohrs sind während der Heilung nicht viele Zellen außer Hautzellen beteiligt, wie z. B. Chondrozyten 1,30. Eine andere Methode ist ein Burn-HTS-Modell an Schweinehaut33, das jedoch in Bezug auf Kosten und Handhabung eine logistische Herausforderung darstellen kann. Das Schweinemodell ist wahrscheinlich am ähnlichsten bei der Rekapitulation des menschlichen HTS; Es ist jedoch eine teure Methode, um erste Ergebnisse zu sammeln. Ein letztes HTS-Modell ist die Xenotransplantation von herausgeschnittener menschlicher HTS-Haut auf Mäuse, aber dies könnte eine Immunantwort auslösen und untersucht nicht die Bildung neuer Narben34.

Die oben genannten Methoden zur Induktion von HTS in Tiermodellen lösen die natürliche Heilungsreaktion des Körpers nicht ausreichend aus, so wie sich menschliche HTS-Narben bilden. Im Gegensatz dazu verwendet das auf Mechanotransduktion basierende Maus-HTS-Modell mechanische Dehnung, um hypertrophe Narbenbildung zu initiieren, was dem menschlichen HTSsehr ähnlich ist 1,9,21. Diese Methode stützt sich auf den physiologischen Prozess der Mechanotransduktionssignalgebung, um die zugrunde liegende Gewebebiomechanik und die Treiber der Zellpopulation hinter der Fibrose zu erfassen. Dieses Modell ist optimal für die Untersuchung biologischer Ziele zur Hemmung oder sogar Induktion von Mechanotransduktionswegen, was möglicherweise zur Entdeckung neuartiger translationaler Therapien führt.

Offenlegungen

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Die Autoren haben keine konkurrierenden Interessen oder andere Konflikte, die mit den Inhalten dieses Artikels verbunden sind.

Danksagungen

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Diese Arbeit wurde unterstützt durch die Center for Dental, Oral, and Craniofacial Tissue and Organ Regeneration Interdisciplinary Translational Project Awards, unterstützt vom National Institute of Dental and Craniofacial Research (U24 DE026914) (G.C.G) und dem Plastic Surgery Foundation Translational Research Grant (837107) (K.C.).

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
100 mL PYREX Griffin BecherMilipore SignmaCLS1000100
Aesculap Exacta MinitrimmerAesculap
AutoClip SystemFine Surgical Instruments12020-00
BD Marke Isopropylalkohol TupferFisher Scientific13-680-63
Buprenorphin SR (0,5 mg/ml)Buprenex, Indivior Inc.12496-0757-1
C57/BL6 weiblich (6– 8 Wochen alt)The Jackson Laboratory000664
Covidien sterile GazeFisher Scientific2187
Covidien TelfaTM nicht klebende PadsFisher Scientific, Covidien1961
Zahnchirurgisches LinealDoWell Dental ProductsS1070
Enthaarungscreme (Nair Haarentferner-Lotion)Church& Dwight, CVS339823
Ethanol 70%ige LösungFisher Scientific64-17-5
ExcelMicrosoft CooperationMicrosoft.comSoftwareprogramm 
ImageJImageJ, Wayne Rasbandimagej.netSoftwareprogramm 
Inhalations-AnästhesiesystemVetEquip922130
Irisschere 4½ Zoll EdelstahlMcKesson43-2-104
Isofluran, USPDechra Veterinary Products17033-094-25
Kaka industrial MUB-1Kaka Industrial 173207Nur notwendig, wenn kein Makerspace oder keine Fertigungshalle verfügbar ist 
Leone Rapid Gaumen Expander - 13 mmGreat Lakes Dental Technologies125-004Der Schlüssel, der zum Erweitern und Befestigen des Geräts erforderlich ist, wird mit diesem Produkt in der Box geliefert
Flüssiges Abdecktuch 75 x 90 cm mit Klebeloch 6 x 9 cmOmnia S.p.A.12.T4362
Medequip Depot Silk Black Braided Sutr 6-0 RxMedequip Depot D707N, Fisher ScientificNCO835822
Nadelhalter 5 Zoll mit gezackten BackenMcKesson43-2-842
Prism 9GraphPad Holdings, LLCgraphpad.comSoftwareprogramm 
Puralube AugensalbeDechra, NDC17033-211-38
R studio DesktopRStudio PBCrstudio.comSoftwareprogramm 
Chirurgischer HautmarkerMcKesson19-1451_BX
Tegaderm, 3 MVWR56222-191Schaum-Klebeverband
Thermo-Peep HeizkissenK& H, Amazon
Gewebezange 4¾ Zoll rostfrei 1 x 2 ZähneMckesson43-2-775
Vetbond (3 M)Saint Paul, MN1469SB

Referenzen

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Wundheilungmechanische Belastungfibrotische Narbebiomechanische BelastungGeweberegenerationFremdk rperreaktionNarbenreduktion

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