Methodenartikel

Isolierung von Chondrozyten und Chondroprogenitoren mittels Fibronektin-Adhäsions- und Migrationsassay

DOI:

10.3791/67160

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4. Oktober 2024

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1Department of Physiology, Christian Medical College, 2Centre for Stem Cell Research (A unit of InStem, Bengaluru), Christian Medical College, 3Department of Orthopedics, Christian Medical College, 4Faculty of Health and Medical Sciences, The University of Adelaide, 5Department of Orthopedics and Trauma, Royal Adelaide Hospital

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Dieses Protokoll beschreibt die Isolierung von Chondrozyten, Fibronektin-Adhäsionsassay-abgeleiteten Chondroprogenitoren (FAA-CPs) und migratorischen Chondroprogenitoren (MCPs) aus menschlichem Gelenkknorpel. Es umfasst enzymatischen Verdau, Fibronektin-Adhäsion und migrationsbasierte Assays zur Isolierung und Charakterisierung dieser Zellen.

Zusammenfassung

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Chondroprogenitorzellen (CPCs), die kürzlich als eigenständige Subpopulation identifiziert wurden, sind aufgrund ihrer mesenchymalen Eigenschaften, ihrer erhöhten Chondrogenese und ihrer begrenzten hypertrophen Merkmale vielversprechend. Die Anreicherung der Vorläuferzellen wird durch differentielle Fibronektin-Adhäsions- und migrationsbasierte Explantat-Assays erreicht, wobei Chondroprogenitoren (FAA-CPs) und migratorische Chondroprogenitoren (MCPs) im Vergleich zu Chondrozyten ein überlegenes Potenzial aufweisen. Dieser Artikel befasst sich mit den Details der Isolierung von residenten Knorpelzellen, nämlich Chondrozyten und Chondroprogenitoren. Während wertvolle Erkenntnisse aus der Chondrozytenforschung zu unserem Verständnis der Knorpelreparatur beitragen, konzentrieren sich die laufenden Bemühungen auf den Einsatz von Chondroprogenitoren und die Erforschung ihres Potenzials als alternativer Therapieansatz. Darüber hinaus bietet dieser Methodenartikel ein detailliertes Schritt-für-Schritt-Protokoll für die Isolierung von drei spezifischen Zelltypen aus Knorpel: Chondrozyten, FAA-CPs und MCPs. Durch die Befolgung standardisierter Verfahren erleichtert dieses Protokoll die erfolgreiche Extraktion dieser Zellsubtypen. Basierend auf umfangreicher Forschung konzentriert sich der Artikel auf die komplizierten Techniken, die zur Isolierung der verschiedenen Untergruppen verwendet werden, und auf die optimierten Kulturbedingungen, die für die Erweiterung und Aufrechterhaltung ihrer Kulturen erforderlich sind. Die Methodik umfasst die enzymatische Isolierung von Chondrozyten aus dem menschlichen Gelenkknorpel, die differentielle Fibronektinadhäsion nach sequenziellem enzymatischem Verdau und migrationsbasierte Explantat-Assays zur Gewinnung knorpelresidenter Zellen.

Einleitung

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Das Aufkommen der zellbasierten regenerativen Therapie stellt einen bedeutenden Ansatz zur Behandlung von Knorpelbeschwerden wie Osteoarthritis (OA) und chondralen Defektendar 1. Diese Erkrankungen, die durch den Abbau oder die Verletzung des Knorpels in den Gelenken gekennzeichnet sind, stellen während der Behandlung erhebliche Herausforderungen dar. Es wird berichtet, dass die Selbstreparatur des Gelenkknorpels aufgrund seiner aneuralen Architektur, der Avaskularität und der geringen mitotischen Aktivität eingeschränkt ist2.

Die am häufigsten verwendeten Zellen für die Regeneration des Knorpelgewebes sind mesenchymale Stammzellen (MSCs) und Chondrozyten3. Mehrere Studien haben jedoch über Einschränkungen bei der Verwendung dieser Zellen zur Regeneration berichtet4. Zu diesen Einschränkungen gehören die terminale Differenzierung von Chondrozyten während einer verlängerten in vitro-Expansion, um die erforderliche Zellzahl zu erreichen, und die hypertrophe Tendenz von MSCs. Diese Faktoren können zur Bildung von Reparaturgewebe mit einer suboptimalen Kombination von Faserknorpel und Hyalin führen 5,6,7,8.

Die Entdeckung der Chondroprogenitorzellen (CPCs) entstand aus der Suche nach alternativen Zellen im Gelenkknorpel9. Sie haben aufgrund ihrer Ähnlichkeit mit MSCs und ihres überlegenen chondrogenen Potenzials immenses Interesse geweckt, während sie gleichzeitig eine reduzierte Hypertrophie aufweisen - eine unverzichtbare Kombination, die gesucht wird10,11. Im Gegensatz zu Chondrozyten wurde berichtet, dass diese Vorläuferpopulationen eine erhöhte Replikations- und Telomeraseaktivität sowie eine erhöhte Expression des neurogenen Locus-Notch-Homolog-Proteins 1 (NOTCH-1) und des SRY-Box-Transkriptionsfaktors 9 (SOX-9) aufweisen12,13,14,15. Es gibt zwei Standardmethoden zur Isolierung von CPCs, die sowohl aus Knorpel als auch aus Meniskus berichtet wurden, einschließlich einer auf der Expression ihres Integrinrezeptors (CD49e/CD29), die durch einen Fibronektin-Adhäsionsassay isoliert wurde - Fibronektin-Adhäsionsassay-abgeleitete Chondroprogenitoren (FAA-CPs), und die andere basierend auf ihrem erhöhten Migrationspotenzial aus Knorpelexplantaten - Migratorische Chondroprogenitoren (MCPs)11,13,16,17,18,19. Zahlreiche in vitro Studien belegen die chondrogene Überlegenheit und reduzierte Hypertrophie sowohl von FAA-CPCs als auch von MCPs im Vergleich zu Chondrozyten und Knochenmark (BM)-MSCs 20,21,22,23.

Jüngste In-vitro-Untersuchungen, bei denen FAA-CPCs mit MCPs verglichen wurden, haben die verbesserte Knorpelregenerationsfähigkeit der letztgenannten Vorläuferpopulation unter normalen Sauerstoffbedingungen gezeigt24. Diese optimistischen In-vitro-Ergebnisse zeigen eine hyalinartige Regeneration und ermutigen zu weiteren In-vivo-Experimenten. Nichtsdestotrotz wurde berichtet, dass beide Populationen von CPCs Knorpel bei OA und anderen osteochondralen Erkrankungen in Tiermodellen effizient reparieren und regenerieren 25,26,27,28,29.

Unser Labor hat aktiv dazu beigetragen, CPC-Isolationstechniken zu standardisieren und ihre phänotypischen Eigenschaften mit Chondrozyten und MSCs zu vergleichen. In diesem Artikel wird ein detailliertes Protokoll vorgestellt, in dem die Schritte zur Isolierung und Kultivierung von knorpelresidenten Zellen, namentlich Chondrozyten, FAA-CPCs und MCPs, erläutert werden.

Protokoll

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Das Protokoll wurde genehmigt und entspricht den entsprechenden Vorschriften und Richtlinien des Institutional Review Board (Forschungs- und Ethikkommission). Nach Einholung einer schriftlichen Einverständniserklärung werden humane tibiofemorale Gelenke von Osteoarthritis (OA)-Patienten (radiologischer Kellgren-Lawrence-Score 4)30 beschafft, die im Rahmen ihrer Behandlung einen totalen Kniegelenkersatz benötigen. Die Gelenke von Patienten mit Anzeichen von Tumoren, Infektionen oder entzündlicher Arthritis (wie rheumatoide Arthritis oder Gicht) wurden von der Studie ausgeschlossen. Es wird sichergestellt, dass alle Verfahren unter sterilen Bedingungen durchgeführt werden, wobei während des gesamten Versuchsprozesses die Standardlaborprotokolle eingehalten werden.

1. Erlangung tibiofemoraler Gelenke

  1. Entnahme von Kniegelenken (tibiofemorale Gelenke) von menschlichen Spendern, die im Rahmen der Behandlung eine Amputation oberhalb des Knies benötigen, oder von Patienten mit Osteoarthritis GradIV 30 (radiologische Evidenz zeigt eine deutliche Verkleinerung des Gelenkspalts bei chondraler Sklerose), die sich einem totalen Kniegelenkersatz unterziehen.
    HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Einwilligungserklärung der Patienten gemäß den Grundsätzen der Deklaration von Helsinki eingeholt wird. Stellen Sie sicher, dass die Regeln der Ethikkommission und des institutionellen Überprüfungsgremiums eingehalten werden.
  2. Schließen Sie alle Gelenke aus, die Symptome einer Infektion oder Entzündung zeigen.

2. Verarbeitung von geernteten Fugen

  1. Legen Sie die entnommenen tibiofemoralen Gelenke unter sterilen Bedingungen in 1x phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS).
  2. Bereiten Sie einen sterilen Bereich unter der Motorhaube vor, indem Sie eine sterile Unterlage platzieren. Übertragen Sie die geernteten Fugen auf den Untergrund.
  3. Stabilisieren Sie die durchtrennten tibiofemoralen Gelenke, indem Sie den subchondralen Knochen mit dem Knorpel nach oben halten.
  4. Entnehmen Sie mit einer Skalpellklinge (Nr. 22) innerhalb von 1-2 h nach der Entnahme des Gelenks rechteckige Knorpelspäne aus den nicht belastenden Bereichen für OA-Patienten.
  5. Ernten Sie die Knorpelabschnitte von 8 mm x 10 mm von der oberflächlichen Schicht in die tiefere Schicht.
  6. Waschen Sie die Knorpelscheiben mit 1x PBS-Lösung und legen Sie sie in eine Petrischale, die 1-2 mL reines DMEM-Medium enthält.
  7. Die Knorpelscheiben mit einer Skalpellklinge (Nr. 22) auf eine Größe von weniger als 1 mm x 1 mm x 1 mm fein hacken.
    HINWEIS: Achten Sie darauf, dass die Knorpelscheiben oder der gehackte Knorpel nicht austrocknen; Legen Sie sie in ein Kulturmedium oder PBS ohne Serum.

3. Isolierung von Chondrozyten

  1. Legen Sie den gehackten Knorpel in einen aufrechten T-25-Kolben, der 10 ml Dulbecco's Modified Eagle Medium F12 (DMEM-F12) mit 0,15 % Kollagenase Typ II für den enzymatischen Verdau enthält. Der Kolben wird 12-14 Stunden lang ungestört in einem CO2 - Inkubator gelagert, wobei die normalen Kulturbedingungenzu gewährleisten sind 31.
    HINWEIS: Es sollte normales DMEM-F12-Medium ohne Spuren von Serum verwendet werden, da das Serum die enzymatische Wirkung inaktiviert.
  2. Nach der Verdauung über Nacht wird das Medium mit den freigesetzten Zellen in ein frisches, steriles Zentrifugenröhrchen mit dem gleichen Volumen an DMEM-F12 + 10 % fötalem Rinderserum (FBS) überführt, wobei ein Zellsieb verwendet wird, um die Zellen von den Trümmern zu trennen. Die freigesetzten Zellen sind die "Chondrozyten".
  3. Die filtrierten Zellen werden bei einer Geschwindigkeit von 1200 x g 5 Minuten lang bei 37 °C zentrifugiert.
  4. Entsorgen Sie den Überstand, ohne das Pellet zu stören. Rekonstituieren Sie das erhaltene Pellet in 1 ml Medium und zählen Sie die freigesetzten lebensfähigen Zellen mit einem Trypanblau-Ausschluss-Assay.
  5. Laden Sie die Chondrozyten in einen T-25-Kolben in einer Konzentration von 10.000 Zellen/cm² und expandieren Sie mit DMEM-F12 mit 10 % FBS auf die erforderliche Durchgangszahl. Weitere Bestandteile des Mediums sind Ascorbinsäure (62 μg/ml), L-Glutamin (2,5 mM/l), Penicillin-Streptomycin (100 IE/ml) und Amphotericin-B (2 μg/ml).
  6. Frischen Sie das Medium alle 3 Tage auf und ernten Sie Zellen an der Subkonfluenz mit 0,125 % Trypsin, das Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) enthält.

4. Isolierung von Chondroprogenitoren, die aus dem Fibronektin-Adhäsionsassay abgeleitet sind (FAA-CPs)

  1. 12 h vor der Freisetzung der Chondrozyten 10 ml 1x PBS mit 1 mM MgCl2 (10 μl) und 1 mM CaCl2 (10 μl) sowie 100 μl Fibronektin (10 μl/ml) herstellen32.
  2. Beschichten Sie die erforderliche Anzahl von Vertiefungen einer 6-Well-Platte (1,5 mL/9,3 cm2) mit der vorbereiteten Lösung.
  3. Die Platte fest verschließen und über Nacht bei 4 °C in den Kühlschrank stellen.
  4. Entnehmen Sie zusätzlich Knorpelspäne auf eine ähnliche Weise wie für die Isolierung von Chondrozyten (Schritte 2.1-2.5).
  5. Die Knorpelspäne werden über Nacht sequentiell enzymatisch verdaut (0,2 % Pronase für 3 h; gefolgt von 0,04 % Kollagenase Typ II für 12 h) in einem bei 37 °C gehaltenen Schüttelwasserbad zur Gewinnung einzelner Chondrozyten durchgeführt.
  6. Nehmen Sie am nächsten Tag die mit Fibronectin beschichtete 6-Well-Platte aus dem Kühlschrank und entfernen Sie überschüssiges Fibronektin.
    HINWEIS: Überschüssiges Fibronektin sollte langsam und sanft entfernt werden, ohne die Beschichtung auf dem Boden der Vertiefung zu stören. Das Vorhandensein von MgCl2 (10 μL) und 1 mM CaCl2 ist entscheidend, um die Anheftung der Zellen zu gewährleisten.
  7. Geben Sie 2-3 ml reines DMEM-F12-Medium in die beschichteten Vertiefungen.
  8. Die freigesetzten Chondrozyten werden mit einer Beladungsdichte von 4000 Zellen/Vertiefung auf die beschichteten Vertiefungen ausgesät und die Platte für einen Zeitraum von 20 Minuten ungestört gelassen.
  9. Entfernen Sie nach der Inkubation das überschüssige Medium und die nicht adhärenten Zellen. Fügen Sie 2-3 ml Standard-Wachstumsmedien hinzu, wie sie für Chondrozyten verwendet werden (DMEM-F12 + 10% FBS).
  10. Halten Sie die adhärenten Zellen 10-12 Tage lang unter Standardkulturbedingungen, um CPC-Klone (Kolonien von >32 Zellen) zu erhalten.
  11. Isolieren Sie mit 0,125 % Trypsin-EDTA für 180 s, plattieren Sie die Klone in einem Verhältnis von 1 Klon/5 cm² neu und expandieren Sie die angereicherten polyklonalen CPs auf die erforderliche Konfluenz. Diese gewonnenen Zellen werden als "FAA-CPCs" bezeichnet.
  12. Kultivieren Sie die Zellen weiter in DMEM-F12-Medium + 10% FBS + transformierendem Wachstumsfaktor Beta 2 (TGFβ2: 1 ng/ml) + Fibroblasten-Wachstumsfaktor (FGF2: 5 ng/ml).
    HINWEIS: Die Inkubation von Zellen auf mit Fibronektin beschichteten Platten sollte 20 Minuten nicht überschreiten, da auch Chondrozyten zu haften beginnen können. Während der 20-minütigen Adhäsionszeit muss das Medium frei von Serum sein. Als nächstes müssen die Zellen, die an Klonen haften, in einem Medium kultiviert werden, das zusätzlich FBS enthält. Die Klone dürfen erst isoliert werden, nachdem sichergestellt wurde, dass jeder Klon mehr als 32 Zellen hat. Dies dient dazu, Transitverstärker zu vermeiden. Eine weitere Expansion der Klone nach der Trypsinisierung sollte die zusätzlich genannten Wachstumsfaktoren einbeziehen. Eine Beladungsdichte von 4000 Chondrozyten/9,3cm2 einer mit Fibronektin beschichteten Platte nach einer 20-minütigen Inkubation mit anschließender Wäsche führt zu einer Adhäsion von insgesamt 80-100 Zellen. Von diesen werden etwa 20 Klone wachsen und innerhalb von 10-12 Tagen eine Verdoppelung der Population um 5 erreichen.

5. Isolierung von migratorischen Chondroprogenitoren

  1. Rasieren Sie Knorpelexplantate (10 mm x 5 mm x 1 mm) aus dem entnommenen Gelenkgelenk und legen Sie sie in eine sterile 6-Well-Platte, die DMEM-F12-Medien mit 10 % FBS und 10 mM Glutamax (2-3 Explantate/Well) enthält33.
  2. Die Platte mit den Explantaten wird 48 Stunden lang in einem CO2 -Inkubator bei 37 °C ungestört gelassen.
  3. Nach 2 Tagen werden die Explantate in ein Zentrifugenröhrchen mit 10 ml 0,1%iger Kollagenaselösung für den enzymatischen Aufschluss überführt. Inkubieren Sie das Röhrchen bei 37 °C für 2 h.
    HINWEIS: Die Explantate müssen vor dem enzymatischen Aufschluss mit 1x PBS gespült werden, da Spuren von Serum die Enzymwirkung inaktivieren können. Tauchen Sie die Explantate zum Waschen in eine Petrischale, die mit 2-3 mL 1x PBS gefüllt ist; Dies dient auch dazu, eine Nichtkontamination mit freigesetzten Chondrozyten zu gewährleisten. Der Umgang mit den Explantaten muss auf ein Minimum beschränkt werden, um eine Belastung der Vorläufer zu vermeiden, die mit der Migration begonnen haben.
  4. Spülen Sie die Explantate nach dem Aufschluss mit 1x PBS und legen Sie sie zurück in die gleichen Vertiefungen der Platte mit frischem DMEM-F12-Medium mit 10 % FBS und 10 mM Glutamax-Medium.
  5. Bewahren Sie die Platte unter Standardkulturbedingungen im Inkubator auf. Achten Sie in den folgenden Tagen auf die Migration von Chondroprogenitoren.
  6. Bei Erreichen der Subkonfluenz werden die MCPs mit 0,125 % Trypsin-haltigem EDTA geerntet.
  7. Erweitern Sie die MCPs mit dem Standard-Expansionsmedium, das DMEM-F12 enthält, das 10 % FBS und 10 mM Glutamax enthält.

6. Phänotypische Charakterisierung von Chondrozyten, FAA-CPs und MCPs

  1. Durchflusszytometrische Analyse (FACS)
    HINWEIS: Die folgenden Schritte werden für die FACS-Analyse der geernteten Zellgruppen befolgt.
    1. Trypsinisieren Sie die Zellen gemäß dem Standardprotokoll mit 0,125 % Trypsin und zentrifugieren Sie sie bei 1200 x g, 5 min, Raumtemperatur, um das Zellpellet zu erhalten.
    2. Entsorgen Sie den Überstand, waschen Sie das Pellet und suspendieren Sie es wieder mit 1x PBS.
    3. Übertragen Sie die Suspension in markierte Röhrchen für FACS.
    4. Teilen Sie die Suspension zu gleichen Teilen in zwei Röhrchen auf: ein "ungefärbtes" Röhrchen, das als Kontrolle dient (Zellsuspension ohne Antikörper) und "gefärbte" Röhrchen, die als Tests dienen (Zellsuspension mit Antikörper).
    5. Befolgen Sie das technische Datenblatt der einzelnen Antikörper/Cluster of Differentiation (CD)-Marker für die Färbung. Zu den Antikörpern zum Vergleich gehören CD105-FITC, CD73-PE, CD90-PE, CD106-APC (positive Expressionsmarker); CD34-PE, CD45-FITC und CD14-FITC (negative Expressionsmarker)34,35; CD166-BB515 und CD146-PE (potentielle chondrogene Marker)36,37.
      HINWEIS: CD-Marker sind lichtempfindlich. Um sicherzustellen, dass die Schritte im Dunkeln ausgeführt werden.
    6. Inkubieren Sie die Zellsuspension mit Antikörper für 30 min im Dunkeln.
    7. Nach der Färbung 1 ml 1x PBS in die Röhrchen geben und bei 1200 x g, 5 min, Raumtemperatur zentrifugieren, um das Zellpellet zu erhalten.
    8. Drei Viertel des Überstands werden verworfen. Das Pellet im restlichen Überstandsinhalt durch sanfte Verreibung wieder suspendieren.
    9. Fahren Sie mit der FACS-Analyse fort.

7. qRT-PCR

HINWEIS: Die qRT-PCR-Analyse der Genexpression umfasst die Bewertung von Kollagen Typ I (COL1A1), Kollagen Typ X (COL10A1) und Runt-related Transcription Factor (RUNX2) für die hypertrophe Expression sowie von SOX-9, Aggrecan (ACAN) und Kollagen Typ II (COL2A1) für die Chondrogenese.

  1. Extrahieren Sie RNA aus den Zellgruppen mit kommerziell erhältlichen Kits gemäß den Anweisungen des Herstellers.
  2. Bewerten Sie nach der Extraktion das Verhältnis A260/A280 und die RNA-Konzentration.
  3. Verwenden Sie 280 ng der extrahierten RNA, um komplementäre DNA (cDNA) zu konstruieren.
  4. Initiieren Sie die qRT-PCR mit Sybr Green, wobei jede Reaktion eine Endkonzentration von 7 ng cDNA auf einem Thermocycler enthält.
  5. Normalisieren Sie die relative mRNA-Expression jedes Gens zum GAPDH-Referenz-Housekeeping-Gen (ΔCt).
  6. Berechnen Sie die relative Expression jedes Gens mit der 2-ΔΔCt-Technik , indem Sie den ΔCt-Wert jedes einzelnen Gens mit dem der FAA-CPs (ΔΔCt) vergleichen37.

8. Differenzierung mehrerer Abstammungslinien

HINWEIS: Im Handel erhältliche differentielle Medien induzieren die Differenzierung der Trilinien in adiogene, osteogene und chondrogene Linien.

  1. Für die adipogene Differenzierung werden Zellen mit einer Beladungsdichte von 1000 Zellen/cm2 in eine Zellkulturplatte gesät und unter Verwendung eines adipogenen Differenzierungsmediums (Mediumwechsel - einmal in 3 Tagen) bis zu einer Subkonfluenz von 80% für 3 Wochen kultiviert.
  2. Für die osteogene und chondrogene Differenzierung ist das 28-Tage-Pelletkultursystem38 anzuwenden.
  3. 0,5 x 106 Zellen bei 400 x g für 12 min bei 37 °C zentrifugieren, um Pellets zu bilden und die Differenzierung mit osteogenem und chondrogenem Differenzierungsmedium einzuleiten.
  4. Fixieren, betten und teilen Sie die Pellets für die bestätigende Färbung (Schritt 9).

9. Konfirmatorische Färbung

  1. Im Falle von Zellen der adipogenen Linie fixieren Sie die Zellen mit gepuffertem Formalin, waschen Sie sie und färben Sie sie mit Oil Red O (0,5%). Färben Sie auch die Kontrollen (kultiviert auf einem Standard-DMEM-Medium mit 10 % FBS).
  2. Beobachten Sie unter dem Mikroskop und nehmen Sie die Bilder auf.
  3. Für die differenzierten osteogenen Zellen färben Sie sich mit Alizarinrot (2%).
    HINWEIS: Für die chondrogenen differenzierten Zellen sind mehrere konfirmatorische Färbeprotokolle anwendbar.
  4. Alcian Blue Färbung: Die fixierten Zellen 5 min lang mit Alcian Blue färben und mit Neutral Red gegenfärben.
  5. Zur Beurteilung des Gehalts an Glykosaminoglykan (GAG) führen Sie eine Safranin O-Färbung durch: Färben Sie die Objektträger mit Wiegerts Eisen-Hämatoxylin, gefolgt von einer anschließenden Inkubation mit saurem Alkohol (1%), schneller grüner Lösung (0,05%), Essigsäure (1%) und Safranin O-Lösung (1%).
  6. Toluidinblau-Färbung: Färben Sie die Objektträger 5 Minuten lang mit Toluidinblau (0,1 %).
  7. PicroSirius Red Färbung: Die Objektträger mit Picrosirius Red (0,1 %) färben und mit Hämatoxylin-Farbstoff gegenfärben.
    HINWEIS: Nach dem Färben die Objektträger mit abgestuftem Alkohol dehydrieren und mit Xylol klären. Montieren Sie Objektträger mit Dibutylphthalat-Polystyrol-Xylol (DPX)-Eindeckmittel, betrachten Sie sie unter einem Mikroskop und nehmen Sie Bilder auf.
  8. Für die immunhistochemische (Typ II Kollagen)-Färbung des chondrogenen differenzierten Pellets werden die Pelletschnitte einer enzymatischen Antigengewinnung mit den Enzymen Pronase (1 mg/ml) und Hyaluronidase (2,5 mg/ml) unterzogen.
  9. Inkubieren Sie die Schnitte mit einem primären monoklonalen Anti-Kollagen-Antikörper der Maus vom Typ II, gefolgt von einem sekundären HRP-markierten Ziegen-Anti-Maus-Antikörper im Maßstab 1:250.
  10. Die Objektträger mit 3,3′-Diaminobenzidin (DAB)-Chromogen einfärben und mit Hämatoxylin gegenfärben.
  11. Beobachten Sie unter dem Mikroskop und nehmen Sie Bilder auf.

10. Bestimmung des GAG/DNA-Gehalts

  1. Die chondrogenen differenzierten Pellets werden 16 h lang mit Papain-Cystein-Lösung bei 65 °C verdaut.
  2. Schätzung der DNA-Konzentration mit dem Picrogreen-Reagenz38 und Erfassung der Fluoreszenzintensität bei Wellenlängen - Anregung: 480 nm, Emission: 520 nm mit einem ELISA-Platten-Reader.
  3. Der Gesamt-GAG-Gehalt ist mit der Dimethylmethylenblau-Farbstoffmethode38 zu bewerten.
  4. Messen Sie die optische Dichte bei 525 nm mit einem ELISA-Platten-Reader.
  5. Normalisieren Sie die GAG-Werte auf die DNA-Werte und berechnen Sie das Gesamt-GAG/DNA-Verhältnis.

Ergebnisse

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Von 86,9 mg Knorpelscheiben wurde eine Chondrozytenzellausbeute von 1,72 x 105 Zellen festgestellt. Nach dem Laden haften die Chondrozyten sofort an, zeigen ein anfänglich abgerundetes Kopfsteinpflaster-Aussehen und gehen bei weiterer Expansion in einen fibroblastischen Zustand über (Abbildung 1 A, B). Die Aussaat dieser Chondrozyten auf Fibronektinplatten führt in der Regel zu einer Adhäsion von 2 %, wobei jede Zelle ein klonales Wachstum durchläuft (Abbildung 2 C,D) und eine Populationsverdopplung von 5 bis zum 10. bis 12. Tag (32 Zellen/Klon) erreicht. Die Klone innerhalb des 10 cm² großen Bereichs werden kombiniert und auf den notwendigen Durchgang zur Herstellung von FAA-CPs erweitert. Knorpelexplantate, die nach der Kollagenase-Inkubation in Kultur gehalten werden, zeigen eine Lockerung der extrazellulären Matrix, und die Migration wird im Allgemeinen bereits am 7. Tag beobachtet (Abbildung 2E). Sowohl FAA-CPs als auch MCPs weisen eine spindelförmige Struktur auf, eine Eigenschaft, die häufig mit BM-MSCs in Verbindung gebracht wird und vor dem Zusammenfluss eine wabenartige Struktur annimmt (Abbildung 1E,F).

Die drei Arten von isolierten Zellen, nämlich Chondrozyten, FAA-CPs und MCPs, werden mit Hilfe der Phasenkontrastbildgebung engmaschig überwacht. Die FAA-CPs werden erst nach Bestätigung von fünf Populationsverdopplungen übertragen.

Die phänotypische Charakterisierung der isolierten und expandierten Zellen umfasst typischerweise die durchflusszytometrische Analyse auf mutmaßliche Marker der Chondrogenese, nämlich CD146 und CD166, sowie die Genexpressionsanalyse auf Marker der Chondrogenese (SOX-9, ACAN, COL2A1), den Faserknorpelmarker COL1A1 und Marker der Hypertrophie (RUNX2 und COL10A1). Alle drei Zellgruppen weisen eine hohe Expression (>95%) von CD105, CD73 und CD90 auf; geringe bis negative Expression von CD34 und CD45; und eine hohe Expression (>98%) von CD166 mit moderater, spenderabhängiger Expression von CD146 (40%-75%) (Abbildung 2A).

Die qRT-PCR-Ergebnisse zeigen eine vergleichbare und hohe Expression von SOX-9, ACAN und auch COL1A1, einem Faserknorpelmarker, da die Zellen vor der Auswertung kultiviert werden (Abbildung 2B). Zur Bestätigung der Chondrogenese wird in allen Zellgruppen eine positive Aufnahme von orange-roten Komplexen in den GAG-haltigen Bereichen nach Safranin O und bläulichen bis violetten Komplexen nach Alcianblau und Toluidinblau beobachtet, mit einem höheren Anteil in den FAA-CP- und MCP-Gruppen. Die immunhistochemische Analyse der chondrogen-differenzierten Pellets für Kollagen Typ II zeigt in allen drei Gruppen eine bräunliche Fibrillenaufnahme (Abbildung 3). Darüber hinaus zeigte die GAG/DNA-Analyse auch eine Bestätigung der chondrogenen Differenzierung mit FAA-CP-Gruppen, die eine höhere Expression zeigten (Abbildung 2C).

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Abbildung 1: Isolierung und Charakterisierung von Chondrozyten und Chondroprogenitoren. Der Studienalgorithmus bildet die Isolierung von drei Zellgruppen und ihre morphologischen Merkmale unter einem Phasenkontrastmikroskop unmittelbar nach der Isolierung und nach einigen Tagen der Expansion ab. (A) Frisch isolierte Chondrozyten heften sich in den frühen Tagen der Kultur an adhärente Kulturen und erhalten mit weiterer Expansion ein fibroblastisches Aussehen (B). (C) Chondrozyten, die einem Fibronektin-Adhäsionsassay unterzogen wurden, zeigen ein klonales Wachstum und erreichen eine Populationsverdopplung von 5 bis zum Tag 10 (D). (E) Chondroprogenitoren wandern am 10. Tag der Kultur vom Rand des Explantats und zeigen ein spindelförmiges Wachstumsmuster mit weiterer Expansion (F). Phasenkontrast-Bildvergrößerung: 10x; Maßstabsbalken: 100 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 2: Molekulare Charakterisierungsdaten. (A) Durchflusszytometrische Analyse auf positive und negative MSC-Marker und potentielle Chondrogenese-Marker. (B) RT-PCR-Expressionsdaten für die drei Zellgruppen für die Genexpressionsanalyse von chondrogenen und hypertrophen Markern. (C) Gesamt-GAG/DNA-Analyse der chondrogenen differenzierten Pellets. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 3: Konfirmatorische Färbung nach chondrogener Differenzierung. Safranin O und immunhistochemische Analyse auf Kollagen Typ II zwischen den drei Zellgruppen. Maßstabsleisten: für 10-fache Vergrößerung, 50 μm; 40-fache Vergrößerung, 200 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Diskussion

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Die potentielle Regeneration des Gelenkknorpels, der hyalines Gewebe enthält, kann durch die Optimierung seiner beiden nativen Zelltypen Chondrozyten und Chondroprogenitoren erreicht werden. Während umfangreiche Forschungen an Chondrozyten wertvolle Einblicke in ihre Rolle bei der Knorpelreparatur geliefert haben, haben Fragen über die Art des regenerierten Gewebes zu Bemühungen geführt, ihren Phänotyp zu verbessern und alternative Therapien zu erforschen3. Chondroprogenitoren, die als relativ junge zelluläre Subpopulation identifiziert wurden, sind aufgrund ihrer inhärenten mesenchymalen Eigenschaften, ihrer erhöhten Chondrogenese und ihrer begrenzten hypertrophen Merkmale vielversprechend12. Die beiden primären Techniken zur Gewinnung und Verbesserung von Vorläuferzellen umfassen die differentielle Fibronektinadhäsion und den migrationsbasierten Explantat-Assay18,32. Die Isolierung von humanen FAA-CPs wurde auch unter Verwendung von Meniskusgewebe beschrieben, wobei ein hohes proliferatives und multipotentes Potenzial berichtetwurde 16,17. In-vitro-Charakterisierungsstudien, die FAA-CPs und MCPs mit Chondrozyten vergleichen, deuten auf ein überlegenes Potenzial für FAA-CPs und MCPs hin, höhere chondrogene und niedrigere hypertrophe Phänotypen zu zeigen, was ein günstiges Profil mit erhöhter GAG-Akkumulation und -Produktion widerspiegelt 15,24,31,39. Begrenzte In-vivo-Studien deuten darauf hin, dass Chondroprogenitoren das Fortschreiten der Osteoarthritis abschwächen und positive Ergebnisse bei der Reparatur von osteochondralen Defekten zeigen können, wenn sie in Verbindung mit Biogerüsten verwendet werden. In den letzten Jahren wurden erhebliche Forschungsanstrengungen unternommen, um das volle Potenzial von Chondroprogenitoren zu verbessern und aufzudecken.

Dieser Artikel enthält ein detailliertes Protokoll für die Isolierung von knorpelresidenten Zellen. Die primären und am häufigsten aus dem Knorpel freigesetzten Zellen sind die Chondrozyten. Bei enzymatisch verdautem Knorpel handelt es sich jedoch um eine heterogene Zellpopulation, die nicht nur Chondrozyten, sondern auch Vorläuferzellen in sehr geringer Konzentration enthält, was eine Anreicherung unter In-vitro-Bedingungen erfordert.

Unter Beobachtung von Indizien, die auf eine Beteiligung dieser Zellen an der Steuerung des Appositionalwachstums hindeuten, nahmen Dowthwaite et al. die Isolierung und Charakterisierung von Chondroprogenitoren vor. Diese Vorläuferzellen wurden aus der oberflächlichen Schicht des Gelenkknorpels durch die Verwendung eines Fibronektin-Adhäsionsassays10 abgeleitet. Diese eigenständige Population wurde aus fötalen Kälbern durch einen Prozess extrahiert, der eine selektive Adhäsion an Fibronektin beinhaltet. Es wurde gezeigt, dass es neben der Expression des Zellschicksalsselektor-Gens Notch-1 eine phänotypische Flexibilität und eine hohe Fähigkeit zur Bildung von Kolonien besitzt. Neben diesen ersten Untersuchungen ergab die Charakterisierung von Vorläuferzellen aus humanem Gelenkknorpel eine erhöhte SOX9- und Notch1-Expression, eine Präferenz für CD49e/CD29 und eine erhöhte Telomeraseaktivität im Vergleich zu reifen Chondrozyten12,32. Dieses Protokoll wurde auch im osteoarthritischen menschlichen Knorpelgewebe etabliert, wobei Berichte zeigen, dass es nicht nur im oberflächlichen Knorpel, sondern auch in den tieferen Schichten des Knorpels vorkommt, wobei viele Gruppen polyklonale Kulturen bis hin zu monoklonalen Kulturen einsetzen 11,12.

Auf der anderen Seite untersuchten Koelling et al. die mögliche Beteiligung von Chondroprogenitoren an der Homing und Migration als Reaktion auf Knorpelverletzungen, die zur Gewebereparatur beitragen18. Darüber hinaus zeigten Seol et al., dass die Vorläuferzellen als Reaktion auf eine Knorpelverletzung eine erhöhte Migration durch das High Mobility Group Box 1 Protein (HMGB1) und die RAGE-vermittelte Chemotaxis19 zeigten. Elsaesser et al. beobachteten auch die überlegene Migrationskapazität von nasalen Chondroprogenitoren im Vergleich zu Chondrozyten und BM-MSCs22. Eine von Joos et al. durchgeführte Studie ergab, dass die Freisetzung von Platelet-Derived Growth Factor-BB (PDGF-BB) und Insulin-Like Growth Factor 1 (IGF-1) die Migration von Chondroprogenitoren verstärkte, während Interleukin 1 beta (IL-1β) und Tumor Necrosis Factor-alpha (TNFα) die Bewegung der Vorläufer nach einer Verletzung hemmten40. Es wurde ein kürzlich veröffentlichter Bericht erstellt, in dem vier verschiedene Methoden der MCP-Isolierung in Bezug auf ihre Isolierungsmethoden und Kulturbedingungen verglichen wurden, und die empfohlene Methode wird in diesem Artikelerläutert 33. Der Ansatz, Vorläuferzellen auf der Grundlage ihrer Migrationsfähigkeit zu isolieren, führte zu Zellen, die nicht nur ein hohes chondrogenes Potenzial aufwiesen, sondern auch ähnliche Eigenschaften wie mesenchymale Stammzellen aufwiesen.

Im Labor wurde nach standardisierten Protokollen eine erfolgreiche Isolierung aller drei Subtypen erreicht. Darüber hinaus haben bahnbrechende Vergleichsstudien die überlegenen Eigenschaften von FAA-CPs im Vergleich zu Chondrozyten gezeigt 12,15,41. Vergleiche zwischen Chondroprogenitoren wurden ebenfalls untersucht, was zeigt, dass MCPs ein höheres Potenzial aufweisen24. Da die drei Subtypen aus demselben Gewebe isoliert werden und der Vorläufer in seiner nativen Form bei der ersten Freisetzung aus dem Gelenkknorpel - der hauptsächlich Chondrozyten enthält - sehr gering vorhanden ist, müssen diese mit In-vitro-Kulturen angereichert werden.

Umfassende Evaluierungsmethoden umfassten die Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FACS), die Reverse-Transkriptions-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR), elektronenmikroskopische Analysen, Studien zur Titration von Wachstumsfaktoren, Zellmarkierungstechniken, Immunprofiling und die Bewertung ihres therapeutischen Potenzials zur Behandlung von Osteoarthritis und chondralen Defekten unter Verwendung von In-vivo-Modellen 12,24,42.

Die aktuellen Befunde deuten darauf hin, dass die Isolierung aller drei Subtypen auch aus osteoarthritischen Gelenken möglich ist, wenn auch mit längerer Expansionsdauer. Insbesondere betonen wir, wie wichtig es ist, die Zugabe von Wachstumsfaktoren während des klonalen Wachstums zu vermeiden, und betonen die entscheidende Notwendigkeit, zusätzliche Faktoren während der Expansion dieser Zellen einzuführen. Entscheidende Schritte, wie z. B. der Zeitpunkt der Inkubation auf Fibronektin-beschichteten Platten, die Zugabe von Wachstumsfaktoren zu verschiedenen Zeitpunkten und die minimale Handhabung von Explantaten, spielen unter anderem eine wichtige Rolle bei der Kultivierung und Expansion der geernteten Zellen. Es ist auch wichtig sicherzustellen, dass die Zellen zu einem bestimmten Zeitpunkt einen Zusammenfluss von nicht mehr als 75 % bis 80 % erreichen.

Das Potenzial von Chondroprogenitoren hat aufgrund ihrer Überlegenheit gegenüber den auf dem Gebiet der Knorpelreparatur häufig verwendeten zellbasierten Therapien, nämlich BM-MSCs und Chondrozyten, großes Interesse geweckt. Diese Vorläuferzellen sind vielversprechend, wobei mehrere In-vivo-Experimente ihre Wirksamkeit bei der Ablösung des derzeitigen Behandlungsstandards unter Beweis gestellt haben. Da es sich um eine kürzlich entdeckte Untergruppe handelt, sind die Charakterisierung und Informationen über ihren Phänotyp noch im Gange, wobei die erste klinische Studie mit FAA-CPs zur Behandlung von chondralen Defekten im Jahr 2024 beginnen soll. Daher sind die Isolierung und Expansion von knorpelabgeleiteten Zellen, insbesondere Chondroprogenitoren, entscheidend und vielversprechend für die zellbasierte Reparatur im Bereich der Knorpelregeneration.

Danksagungen

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Wir danken Frau Bhavini Krishnan und Frau Merin Mary Zachariah für ihren intellektuellen Input und dem Zentrum für Stammzellforschung (eine Einheit von inStem Bengaluru), Abteilung für Physiologie, Christian Medical College, Vellore, für die infrastrukturelle Unterstützung. Die laufenden Projekte werden unterstützt vom Department of Biotechnology (BT/PR32777/MED/31/415/2019), der indischen Regierung, dem Science and Engineering Research Board (CRG/2022/004277), der indischen Regierung und den Fluid Research Grants, Christian Medical College, Vellore.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
22-Skalpell-Klinge GLASS VAN
6-Well-Platte CORNING3516
Alcian BlueTHERMO SCIENTIFICJ6012
Alizarin Red SIGMA130223
Amphotericin-B (2 μ g/mL).GIBCO15240062
Ascorbinsäure (62 μ g/mL)SIGMA ALDRICHA4544-25G
BC CytoFLEX LX Durchflusszytometer BECKMAN COULTERCYTExpert Software Version 2.5
CaCl2SIGMA ALDRICH  C34006
CD105-FITCBD BIOSCIENCE
CD106-APCBD BIOSCIENCE
CD14-FITCBD BIOSCIENCE
CD29-APCBD BIOSCIENCE
CD34-PEBD BIOSCIENCE
CD45-FITCBD BIOSCIENCE
CD49b-FITCMILTENYL BIOTEC  MACS 130/100337
CD49e-PEBD BIOSCIENCE
CD73-PEBD BIOSCIENCE
CD90-PEBD BIOSCIENCE561970
ZellzählerDE NOVIXCell Drop BF
ZellsiebHIMEDIATCP024
ZentrifugeBECKMAN COULTERAllegra X-30R
CO2 Inkubator THERMO SCIENTIFICMODEL-371
Kollagen Typ X (COL10A1), Runt-verwandter Transkriptionsfaktor (RUNX2), SRY-Box-Transkriptionsfaktor 9 (SOX-9), Aggrecan (ACAN) und Kollagen Typ II (COL2A1)EUROGENTEC, BELGIEN
Kollagenase Typ IIWORTHINGTONLS004176
DMEM F-12 (Dulbecco's Modified Eagle's Medium F-12)SIGMA ALDRICHD8900-1L
ELISA Plate ReaderMOLECULAR DEVICESSpectraMax i3x Reader
Fast GreenFISHER SIENTIFIC2353459
Fötales RinderserumGIBCO10270106
FGF2CLOUD CLONE CORPAPA551Hu01
Fibronektin (10 & Mikro; L/mL)SIGMA ALDRICHF1141
Erststrang-SynthesesystemTAKARA BIO6110A
GlutamaxGIBCO35050061
HämatoxylinQUALIGENSQ39411
MgCl2 SIGMA ALDRICHM8787
Öl Rot OSIGMA1320065
PBS (Phosphatgepufferte Kochsalzlösung)GIBCO10010023
PCR Thermocycler APPLIED BIOSYSTEMSQuantstudio 12K Flex Thermocycler 
Penicillin-Streptomycin (100 IE/ml)GIBCO15240062
Picrosirius RedALFA AESAR2610108
Primärantikörper (Maus Kollagen Typ II)DSHBDSHB II II6B3
PronaseROCHE10165913103
Quant-iT Picogreen dsDNA ReagenzTHERMO SCIENTIFICP7589
KühlschrankELANPRO
RNeasy MiniKitQIAGEN74104
Safranin OQUALIGENSQ39962
Sekundärantikörper (Ziegen-Anti-Maus-IgG-Antikörper, HRP-Konjugat)THERMO SCIENTIFIC31430
Schüttelwasserbad REMI
StemPro Differenzierungskits GIBCO1007201, A1007001 und A1007101
T-25 Kolben CORNING430639
TakyonTM Low Rox SYBR Master Mix dTTP Blau EUROGENTECUF-LSMT-B0701
TGFβABCAMab277760
Gewebekultur PetridishTARSONS960010
ToluidinblauQUALIGENS2040
Tryphan blauGIBCO15250061
Trypsin EDTAGIBCO25200072
561443 551147 555397 559883 348057 347463 555617 550257

Referenzen

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Schlagwörter

Chondrozyten IsolierungChondroprogenitorzellenKnorpel Explantatenzymatischer VerdauGelenkknorpelZellkulturmesenchymale EigenschaftenTrypsin EDTA

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