Methodenartikel

Visualisierung der DNA-Schadensantwort in Purkinje-Zellen mit Hilfe von zerebellären organotypischen Kulturen

DOI:

10.3791/67167

⸱

27. Dezember 2024

 ,  , 
1The David and Inez Myers Laboratory for Cancer Genetics, Department of Human Molecular Genetics and Biochemistry, Faculty of Health and Medical Sciences, School of Medicine, Tel Aviv University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Kleinhirn-Purkinje-Zellen (PCs) reagieren besonders empfindlich auf Defizite in der DNA-Schadensreaktion. Es wird ein Protokoll zur visuellen Bewertung der Dynamik der PC-Reaktion auf DNA-Schäden vorgestellt, das die Färbung proteingebundener Poly(ADP-Ribose)-Ketten in zerebellären organotypischen Kulturen beinhaltet.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kleinhirn-Purkinje-Zellen (PCs) weisen ein einzigartiges Zusammenspiel aus hohen Stoffwechselraten, spezifischer Chromatinarchitektur und umfangreicher Transkriptionsaktivität auf, was sie besonders anfällig für DNA-Schäden macht. Dies erfordert eine effiziente DNA-Schadensantwort (DDR), um eine Kleinhirndegeneration zu verhindern, die oft durch PC-Dysfunktion oder -Verlust ausgelöst wird. Ein bemerkenswertes Beispiel ist das Genominstabilitätssyndrom, Ataxie-Teleangiektasien (A-T), das durch fortschreitende PC-Depletion und Kleinhirnverschlechterung gekennzeichnet ist. Die Untersuchung der DDR-Mechanismen bei PCs ist von entscheidender Bedeutung, um die Wege aufzuklären, die zu ihrer Degeneration bei solchen Erkrankungen führen. Die Komplexität der Isolierung und Kultivierung von PCs in vitro hat die Forschungsbemühungen jedoch lange Zeit behindert. Murine zerebelläre organotypische (Schnitt-)Kulturen bieten eine praktikable Alternative, da sie die in vivo Gewebeumgebung genau nachahmen. Dieses Modell ist jedoch auf DDR-Indikatoren beschränkt, die für mikroskopische Bildgebung zugänglich sind. Wir haben das organotypische Kulturprotokoll verfeinert und gezeigt, dass die Fluoreszenzbildgebung von proteingebundenen Poly(ADP-Ribose) (PAR)-Ketten, einem schnellen und frühen DDR-Indikator, die DDR-Dynamik in PCs innerhalb dieser Kulturen als Reaktion auf genotoxischen Stress effektiv aufdeckt.

Einleitung

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Die Integrität der zellulären DNA ist ständig durch DNA-schädigende Wirkstoffe bedroht, vor allem durch metabolische Nebenprodukte wie reaktive Sauerstoffspezies, die täglich Zehntausende von DNA-Läsionen pro Zelle verursachen1. Die dauerhafte Aufrechterhaltung der Genomstabilität ist für die zelluläre Homöostase essentiell 2,3. Der Eckpfeiler dieser Aufrechterhaltung ist die DNA-Schadensantwort (DDR) - ein kompliziertes, geschichtetes Signalnetzwerk, das spezifische DNA-Reparaturwege initiiert und gleichzeitig viele andere zelluläre Prozesse sorgfältig anpasst 4,5. Defizite in der DDR manifestieren sich häufig als "Genominstabilitätssyndrome", die durch chromosomale Instabilität, fortschreitende Gewebeverschlechterung, beeinträchtigtes Wachstum oder Entwicklung, eine Veranlagung für Krebs und eine erhöhte Empfindlichkeit gegenüber bestimmten DNA-schädigenden Wirkstoffen gekennzeichnetsind 6,7,8,9. Insbesondere die Neurodegeneration, die häufig eine Kleinhirnatrophie einschließt, ist ein charakteristisches Merkmal vieler Genominstabilitätssyndrome 7,10,11,12.

Die autosomal-rezessive Störung, die Ataxie-Teleangiektasie (A-T), ist ein gut dokumentiertes Beispiel für eine Genominstabilitätsstörung 13,14,15. Dieser Zustand entsteht durch Nullmutationen im ATM-GEN (A-T, mutiert), das für die Kodierung der zentralen Proteinkinase ATM verantwortlich ist, die in erster Linie als DDR-Mobilisierer als Reaktion auf DNA-Doppelstrangbrüche (DSBs) bekannt ist16,17. A-T manifestiert sich als Multisystemstörung, die überwiegend durch eine fortschreitende Kleinhirndegeneration gekennzeichnet ist, die zu akuten motorischen Beeinträchtigungen, Immunschwäche, Gonadenatrophie, Krebsprädisposition und extremer Empfindlichkeit gegenüber ionisierender Strahlung führt. Kultivierte Zellen von Individuen mit A-T zeigen eine chromosomale Instabilität und eine erhöhte Empfindlichkeit gegenüber genotoxischen Wirkstoffen, insbesondere solchen, die DSBs verursachen 15,18,19. Wichtig ist, dass ATM auch eine Rolle bei der Reparatur anderer DNA-Läsionen spielt, was seine breite Bedeutung für die Aufrechterhaltung der Genomstabilität unterstreicht 20,21,22.

Trotz gründlicher Forschung über die zahlreichen Rollen von ATM bleibt der spezifische Mechanismus, der zur Kleinhirndegeneration bei A-T führt, ein Thema aktiver Debatten, wobei verschiedene Modelle vorgeschlagen werden, um diesen Prozess aufzuklären 23,24,25,26,27,28,29,30. Unser Modell28 deutet darauf hin, dass die Kleinhirndegeneration bei AT-Patienten mit der Dysfunktion und dem letztendlichen Verlust von Purkinje-Zellen (PCs) beginnt. In Anbetracht der entscheidenden Rolle von ATM bei der Erhaltung der Genomstabilität angesichts anhaltender DNA-Schäden sind PCs besonders anfällig für das Fehlen von ATM. Wir führen diese Anfälligkeit auf die Kombination aus hoher metabolischer Aktivität, ausgeprägter Chromatinstruktur und umfangreicher transkriptioneller Aktivität zurück. Letztendlich wird vermutet, dass der Verlust der PC-Funktion und damit ihre Degeneration auf die stochastische, funktionelle Inaktivierung von Genen zurückzuführen ist, eine Folge der Produktion defekter Transkripte28.

Die Erforschung der PC-Biologie im Labor wird durch Herausforderungen bei der Kultivierung isolierter PCs behindert, da diese Zellen für ihr Überleben und ihre Funktion stark auf ihr natürliches Milieu und benachbarte Zellen angewiesen sind, was sie mit dem dissoziierten Kulturwachstum inkompatibel macht. Nichtsdestotrotz können PCs in Gewebeschnittkulturen über längere Zeiträume lebensfähig bleiben. Zerebelläre organotypische Kulturen, bei denen es sich um Gewebeschnitte handelt, die typischerweise aus Nagetier-Cerebella gewonnen werden, erhalten die strukturelle Organisation des Gewebes aufrecht und unterstützen verschiedene experimentelle Manipulationen, die denen entsprechen, die mit kultivierten Zellen möglich sind. Daher ermöglichen diese Kulturen Kleinhirnuntersuchungen in einer kontrollierten Umgebung 31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43. Insbesondere im Zusammenhang mit A-T haben sich murine zerebelläre organotypische Kulturen als maßgeblich für die Erforschung der DDR bei Atm-defizienten PCserwiesen 40,41,42,43. Während Atm-defiziente Mäuse nur einen subtilen Kleinhirn-Phänotypaufweisen 44,45,46,47, vermutlich aufgrund von Unterschieden zwischen der Kleinhirnphysiologie von Mensch und Maus, wird davon ausgegangen, dass die Rolle von ATM bei diesen Spezies weitgehend konserviert ist. Diese Annahme wird durch unsere Beobachtungen gestützt, dass die defiziente Reaktion auf DNA-DSBs in Atm-/- murinen PCs mit der übereinstimmt, die in anderen murinen und humanen ATM/Atm-defizienten Zelltypen beobachtet wurde 40,41,42,43.

Eine Einschränkung bei der Analyse von PC-Reaktionen auf verschiedene Reize oder Stressfaktoren in organotypischen Kulturen ist die Notwendigkeit, sich bei der Auslesung auf mikroskopische Bildgebung zu verlassen. Die DDR wird in der Regel mit biochemischen Massenauslesungen untersucht, obwohl auch gängige Immunfluoreszenzmarker verwendet werden, wie z. B. die Verfolgung der Dynamik der Bildung und Auflösung von Kernherden des phosphorylierten Histons H2AX (γH2AX) und des 53BP1-Proteins, die als Indikatoren für DSBs gelten48,49. Ein breiteres Maß ist die Fluoreszenzbildgebung der Poly(ADP-Ribose) (PAR)-Kettenbildung auf Proteinen, eine schnelle und robuste frühe DNA-Schadensreaktion, insbesondere auf Strangbrüche 7,50. Wir modifizierten das Protokoll von Komulainen et al.51 für die PAR-Färbung in zerebellären organotypischen Kulturen. Wir beobachteten eine ausgeprägte PAR-Antwort in den großen Zellkernen von PCs. Hier vorgestellt wird unser verfeinertes Protokoll zur Etablierung von zerebellären organotypischen Kulturen von Mäusen und zur Visualisierung der PAR-Antwort unter genotoxischem Stress.

Protokoll

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In der Materialtabelle finden Sie Einzelheiten zu Materialien, Geräten und Antikörpern. Tierversuche wurden nach der Genehmigung nach den ethischen Richtlinien der Ethikkommission der Universität Tel Aviv angewendet. Das Verfahren wird an 10 Tage alten Mäusewelpen durchgeführt, unabhängig von ihrem Geschlecht. Bei Bedarf wird die Genotypisierung am Vortag mit einer Schwanzbiopsie und Standardmethoden durchgeführt. Lösungen sind steril und werden bei 4 °C gelagert, sofern nicht anders angegeben; siehe Tabelle 1.

1. Vorbereitung der Kulturen

HINWEIS: Führen Sie den Eingriff in einer sterilen Umgebung durch und desinfizieren Sie die Arbeitsfläche im Voraus mit 70%igem Ethanol.

  1. Geben Sie 1 ml BME in jede Vertiefung der 6-Well-Platten. Setzen Sie mit einer sterilen Pinzette einen einzelnen Zellkultureinsatz in jede Vertiefung ein und inkubieren Sie die Platten in einem 37 °C/5 %CO 2 -Inkubator für mindestens 2 Stunden vor dem Dissektionsverfahren.
  2. Richten Sie einen Präparierbereich in einer biologischen Haube ein, der den Gewebe-Chopper, 30-mm-Kulturplatten, ein binokulares Mikroskop und eine Lichtquelle enthält.
  3. Tauchen Sie die chirurgischen Instrumente während des gesamten Prozesses in 70%iges Ethanol. Verwenden Sie einen mit 70 % Ethanol gefüllten Urinbecher zum Eintauchen und einen separaten Urinbecher mit 1x PBS, um das Ethanol vor dem Gebrauch abzuwaschen.
  4. Bereiten Sie für jede Dissektion (d.h. für jedes Kleinhirn) zwei mit Kaltdissektionsmedium gefüllte 30-mm-Kulturplatten vor und lassen Sie sie auf Eis liegen.
  5. Besprühen Sie das Tier mit 70% Ethanol.
  6. Enthaupte das Tier mit einer scharfen Schere schnell. Um das Gehirn freizulegen, machen Sie einen kleinen Schnitt mit einer Schere weg vom Kleinhirn. Ziehe mit einer Pinzette mit abgerundeten Enden den Schädel vorsichtig ab. Entferne den Schädel in kleinen Stücken, um das Kleinhirngewebe nicht zu beschädigen.
  7. Übertragen Sie das Gehirn sofort in ein kaltes Seziermedium oder entfernen Sie das Kleinhirn direkt aus dem Schädel. Legen Sie dazu das Kleinhirn frei und trennen Sie die Kleinhirnrinde vom Hirnstamm, indem Sie die drei Stielpaare mit einem fein gebogenen Irisspatel trennen. Zur Identifizierung der Stiele Blick von rostral nach kaudal: Die paarigen oberen Kleinhirnstiele verbinden das Mittelhirn mit jeder Seite des Kleinhirns; Die paarigen mittleren Kleinhirnstiele verbinden die Pons mit jeder Seite des Kleinhirns; und die paarigen unteren Kleinhirnstiele verbinden sich mit der Medulla zu beiden Seiten des Kleinhirns. Sobald das Kleinhirn sichtbar ist, trennen Sie es mit demselben Spatel vom Großhirn: Schieben Sie den Spatel zwischen das Kleinhirn, den Colliculus superior und den Hirnstamm.
    HINWEIS: Machen Sie keine besonderen Anstrengungen, um die Hirnhäute zu entfernen, da sie sich nach dem Schneiden des Kleinhirns leicht lösen.
  8. Stellen Sie den Gewebehacker auf eine Scheibendicke von 350 μm ein.
  9. Bevor Sie das Kleinhirn auf der Basis des Zerkleinerers positionieren, entfernen Sie überschüssigen Präparierpuffer aus dem Gewebe. Dadurch wird die Haftung des Gewebes an der Basis des Häckslers verbessert.
  10. Positionieren Sie das Kleinhirn vertikal auf der Schneidplattform und führen Sie das parasagittale Schneiden bei einer Schichtdicke von 350 μm durch. Trennen Sie die Scheiben vorsichtig mit einem feinen Irisspatel und legen Sie sie in kaltes Seziermedium.
  11. Übertragen Sie das geschnittene Gewebe zurück in einen frischen Kaltdissektionspuffer. Verwenden Sie eine 1.000-μl-Spitze, um die Gewebescheiben vorsichtig in die Schale mit dem Kaltdissektionspuffer zu führen.
  12. Unter dem Fernglas verwenden Sie zwei gebogene Irisspatel, um die Gewebescheiben vorsichtig voneinander zu trennen. Verwenden Sie für Kulturen Schnitte, die aus dem Kleinhirnvermis stammen, der sich in der medialen kortikonukleären Zone des Organs befindet.
  13. Übertragen Sie jede Gewebescheibe mit einem breiten Spatel auf einen Kultureinsatz und bewegen Sie jeden Einsatz mit einer Gewebescheibe in eine Vertiefung in den 6-Well-Platten, die das vorgewärmte Medium enthalten. Lassen Sie die Platten im Inkubator.
  14. Tauschen Sie das Medium alle zwei Tage aus: Aspirieren Sie das gebrauchte Medium mit einer sterilen Glaspipette und fügen Sie mit einer serologischen 5-ml-Pipette 1 ml frisches MBE hinzu, wobei die Pipettenspitze an der Wand des Brunnens lehnt. Achten Sie darauf, den Medienfluss nicht auf das Gewebe zu richten.
    HINWEIS: Die Gewebescheibe zeigt in den ersten 5-7 Tagen in Kultur ein entzündungsähnliches Aussehen und ist bereit für Experimente, sobald dieses Phänomen verschwindet und bis zu 2 Wochen nach der Kulturetablierung.

2. Behandlung mit DNA-schädigenden Mitteln, Fixierung, Färbung und mikroskopische Bildgebung

  1. Geben Sie DNA-schädigende Chemikalien in geeigneten Endkonzentrationen für eine vorgegebene Dauer direkt in das Kulturmedium. Entfernen Sie die Chemikalien nach der Expositionszeit, indem Sie das Medium durch frisches Kulturmedium ersetzen.
  2. Wenn die DDR-Messung eine PAR-Färbung umfasst, fügen Sie dem Kulturmedium 30 Minuten vor der Fixierung einen Inhibitor der Poly(ADP-Ribose)-Glykohydrolase (PARG) in einer Endkonzentration von 10 μM hinzu.
    HINWEIS: Diese Behandlung ist von entscheidender Bedeutung, da die PAR-Modifikation nur von kurzer Dauer ist und durch PARG kontinuierlich abgebaut wird.
  3. Unmittelbar vor der Fixierung das Medium aspirieren und durch 1 ml 0,1 M Phosphatpuffer bei Raumtemperatur ersetzen.
    HINWEIS: Kältepuffer kann dazu führen, dass sich die Gewebescheiben von der Einlage lösen.
  4. Fixieren Sie die Scheiben sofort, indem Sie den Puffer durch ein vorgekühltes (-20 °C) Aceton-Methanol-Gemisch (1:1) ersetzen, so dass die Gewebescheibe in diese Mischung eingetaucht wird, und lassen Sie es 20 Minuten lang bei -20 °C stehen.
    HINWEIS: Es ist möglich, in diesem Stadium aufzuhören und später mit der Immunfärbung fortzufahren. Waschen Sie dazu das Gewebe 3x mit 0,1 M Phosphatpuffer, der auf 4 °C vorgekühlt ist, und achten Sie darauf, dass das Gewebe in den Puffer eingetaucht ist. Gewebe können jetzt bis zu 2 Wochen bei 4 °C in 0,1 M Phosphatpuffer gelagert werden.
  5. Übertragen Sie die Gewebescheibe in eine Vertiefung in einer 48-Well-Platte.
  6. Entferne mit einem Skalpell und einem Schneidebrett die Ränder des Einsatzes und schneide um die Gewebescheibe herum. Legen Sie jede Scheibe in eine Vertiefung einer 48-Well-Platte. 100 μl 0,1 M Phosphatpuffer zugeben.
  7. Für die Permeabilisierung aspirieren Sie den Puffer, geben Sie 100 μl 0,1 M Phosphatpuffer mit 1 % Triton X-100 in die Vertiefung und lassen Sie ihn 5 Minuten bei Raumtemperatur ruhen.
  8. Aspirieren Sie die Lösung und fügen Sie 100 μl Blockierungslösung (siehe Tabelle 1) pro Vertiefung hinzu. 2 h bei Raumtemperatur leicht schütteln.
  9. Während des Blockierungsschritts verdünnen Sie den Primärantikörper oder das Anti-PAR-Reagenz (1:800) in der Blockierungslösung.
  10. Entfernen Sie die Blockierungslösung (kein Waschen erforderlich) und geben Sie 100 μl Primärantikörpermischung in jede Vertiefung. 2 h bei Raumtemperatur leicht schütteln.
  11. Verdünnen Sie die Sekundärantikörper in 0,1 M Phosphatpuffer, der 0,2 % Triton X-100 (1:500) enthält, und minimieren Sie gleichzeitig ihre Lichteinwirkung.
  12. Die Primärantikörperlösung aspirieren und die Scheiben 3 x 5 min mit 0,1 M Phosphatpuffer mit 0,2 % Triton X-100 bei Raumtemperatur unter leichtem Schütteln waschen.
  13. Ersetzen Sie die Waschlösung durch 100 μl Sekundärantikörperlösung (1:500 Verdünnung). Schütteln Sie das Schütteln 2 h lang bei Raumtemperatur im Dunkeln fort (decken Sie die Platten mit Alufolie ab).
  14. Um eine DAPI-Lösung herzustellen, verdünnen Sie die Stammlösung (2 mg/ml) auf 1 μg/ml in 1x PBS.
  15. Zwanzig Minuten vor dem Ende der 2-stündigen Inkubation mit dem Sekundärantikörper geben Sie 20 μl der endgültigen DAPI-Lösung in jede Vertiefung und schütteln Sie 20 Minuten lang. Die Flüssigkeit absaugen und mit der Waschlösung 3 x 5 min unter leichtem Schütteln waschen.
  16. Legen Sie das Gewebe zum Einstecken mit dem Gewebe nach oben auf einen Objektträger aus Mikroskopglas, fügen Sie Einbettmedium hinzu und bedecken Sie es mit einem Deckglas. Legen Sie die Dias auf eine ebene Fläche und lassen Sie sie über Nacht im Dunkeln bei Raumtemperatur trocknen (vermeiden Sie die Verwendung von DAPI-haltigem Eindeckmedium, um Unschärfen zu vermeiden).
  17. Lagern Sie die Objektträger bei 4 °C in einer lichtdichten Box.
  18. Nehmen Sie mikroskopische Bilder mit einem konfokalen Mikroskop und entsprechenden Filtern auf.

Ergebnisse

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Abbildung 1 veranschaulicht das allgemeine Erscheinungsbild der kleinhirnorganischen Kulturen. Die obere Reihe in Abbildung 1A zeigt die Kleinhirnfoliation, die in Kultur erhalten bleibt, während die untere Reihe die für Calbindin D-28k gefärbten PCs (grün) und die für NeuN gefärbten neuronalen Kerne (rot) zeigt. In Abbildung 1B sind die Astrozyten in den PCs (rot) mit GFAP (grün) gefärbt, einem intermediären Filament-Typ-III-Protein. Abbildung 2 und Abbildung 3 zeigen die PAR-Färbung, die nach der Behandlung dieser Kulturen mit zwei DNA-schädigenden Wirkstoffen beobachtet wurde, die beide starke Oxidationsmittel sind: Kaliumbromat (eine Endkonzentration von 10 mM für 12 h) und Paraquat. Die PAR-Antwort war bei den behandelten PCs im Kleinhirnfolium im Vergleich zur Kontrolle ausgeprägt.

figure-results-1
Abbildung 1: Überblick über die zerebellären organotypischen Kulturen der Maus. (A) Die obere Reihe zeigt die Kleinhirnfoliation, die in Kultur erhalten bleibt. Die untere Reihe konzentriert sich auf die PC-Ebene. PCs sind durch Calbindin D-28k (grün) gekennzeichnet. Die NeuN-Färbung (rot) identifiziert neuronale Kerne über die Schichten hinweg. (B) Ein genauerer Blick auf PCs (rot). GFAP (grün), ein intermediäres Filament-Typ-III-Protein, das Astrozyten hervorhebt. Maßstabsbalken = 968,8 μm (A, obere Reihe), 42,1 μm (A, zweite Reihe), 72,7 μm (B, obere Reihe), 18,2 μm (B, zweite Reihe). Abkürzungen: PC = Purkinje-Zellen; GFAP = saures Protein der Gliafaser; DAPI = 4',6-diamidino-2-phenylindol. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

figure-results-2
Abbildung 2: PAR-Färbung in einer Kleinhirnscheibe, die mit Kaliumbromat behandelt wurde. Die Kleinhirnscheibe wurde mit Kaliumbromat (KBrO3), einem starken Oxidationsmittel, in einer Endkonzentration von 10 mM für 12 h behandelt. Maßstabsleisten = 775 μm. Abkürzungen: PAR = poly(ADP-ribose); DAPI = 4',6-diamidino-2-phenylindol. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 3: PAR-Reaktion in Kleinhirnschnitten, die Paraquat ausgesetzt waren, einem starken Produzenten von Superoxid-Anionen. (A) Eine allgemeine Ansicht eines Kleinhirnblattes. Beachten Sie die robuste PAR-Reaktion, insbesondere bei PCs, im Vergleich zur Steuerung. (B) Eine genauere Untersuchung zeigt die PAR-Reaktion bei PCs und anderen Zelltypen. Maßstabsleisten = 193,8 μm (A), 18,2 μm (B). Abkürzungen: PAR = poly(ADP-ribose); DAPI = 4',6-diamidino-2-phenylindol. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Lösungen und Puffer
Lösung  Zutaten
Medium zum SezierenHank's ausgewogene Salzlösung (HBSS) mit 0,5 % D-Glukose. Fügen Sie 0,5 ml 50%ige D-Glukoselösung zu 50 ml HBSS ohne Mg2+ und Ca2+ hinzu.
BME-NährmediumMischen Sie 100 ml Basal Medium Eagle (BME), das Phenolrot, aber kein L-Glutamin oder HEPES enthält, mit 50 ml HBSS mit Phenolrot, 50 ml hitzeinaktiviertem Pferdeserum, 2 ml 50% D-Glucose und 1 ml 200 mM L-Glutamin. Mischen und filtrieren Sie durch einen 0,22-μm-Filter in einer sterilen Umgebung. Bei 4 °C lagern
Blockierungslösung für die Immunfärbungin 0,1 M Phosphatpuffer: 0,5% Triton X-100, 10% Ziegenserum hinzufügen
Puffer zur Verdünnung von Sekundärantikörpern0,1 M Phosphatpuffer, 0,2 %Triton X-100
Puffer waschen0,1 M Phosphatpuffer, 0,2 %Triton X-100
Fixative LösungActenoe:Methanol (1:1 v:v)
Lösung für die Permeabilisierung0,1 M Phosphatpuffer, 1%Triton X-100
DAPI-LösungStammlösung (2 mg/ml) verdünnt auf 1 μg/mL in 1x PBS
Phosphat-PufferBereiten Sie zwei Lösungen A und B vor (siehe unten). Mischen Sie die Lösungen gemäß den unten angegebenen Verhältnissen, um 0,2 M Phosphatpuffer herzustellen. Verdünnen Sie dann die 0,2-M-Lösung mit DDW (1:1), um 0,1 M-Phosphatpuffer (Arbeitslösung) herzustellen.
Lösung A (für 0,2 M)12 g Natriumphosphat, einbasisch, wasserfrei (Na2HPO4 FW 141.96)
500 mL DDW
Lösung B (für 0,2 m)14,2 g Natriumphosphat diabasisch wasserfrei (Na2HPO4 FW 141,96)
500 mL DDW
Gemischte Lösungen zur Herstellung von 0,2 MBereiten Sie 1 l vor: 230 mL Lösung A und 770 mL Lösung B
0,1 M PhosphatpufferVerdünnen Sie die gemischte Lösung mit DDW (1:1)

Tabelle 1: Lösungen und ihre Zusammensetzung.

Diskussion

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Allgemeine Bemerkungen
Der große Vorteil des organotypischen Kultursystems besteht darin, dass es Studien mit dem Kleinhirnrindengewebe ermöglicht und seine strukturelle Organisation für mehrere Wochen in der Kulturschale bewahrt. Dieses System ist nützlich für die Durchführung eingehender morphologischer Analysen von Purkinje-Zellen (PCs), einschließlich detaillierter Untersuchungen von dendritischen Dornen und ultrastrukturellen Merkmalen 52,53,54,55,56,57,58,59. Unsere Beobachtungen deuten darauf hin, dass die DNA-Schadensantwort (DDR) in diesen Kulturen besonders aktiv ist. Zu den größten Einschränkungen dieses Systems gehören jedoch die begrenzte Nutzungsdauer und die Abhängigkeit von mikroskopischer Bildgebung zur Überwachung zellulärer Prozesse, was die anhaltende Notwendigkeit unterstreicht, geeignete Bildgebungsverfahren zu entwickeln oder anzupassen.

Ein weiteres Wort der Vorsicht betrifft den Kleinhirnanteil, der für die Vorbereitung der Gewebeschnitte präpariert wird. Wir haben beobachtet, dass verschiedene Kleinhirnlappen Kulturen mit deutlich unterschiedlicher innerer Organisation und Gesamtqualität hervorbringen können. Daher bevorzugen wir es, Kulturen aus Schnitten zu etablieren, die über mittelsagittale Schnitte des Kleinhirnvermis gewonnen wurden. In diesen Schnitten sind die Fola der Kleinhirnrinde gut sichtbar.

Es empfiehlt sich, Gewebeschnitte aus dem Kleinhirnvermis zu verwenden, die die charakteristische Foliation der Kleinhirnrinde aufweisen. Diese Slices behalten ihre Organisationsstruktur in der Kultur für mehrere Wochen bei. Darüber hinaus wird empfohlen, die experimentellen Verfahren mit den Kulturen etwa 7-12 Tage nach der Etablierung zu beginnen. Ein typisches Experiment zur Bewertung der DNA-Schadensreaktion in diesen Kulturen beinhaltet die Initiierung von Schäden durch Bestrahlung oder durch Zugabe von DNA-schädigenden Chemikalien zum Kulturmedium. Anschließend erfolgt die Gewebefixierung und -färbung in verschiedenen Zeitabständen. Um die Genesung von chemisch induzierten Schäden zu beurteilen, wird eine Inkubationszeit in frischem Medium einbezogen. Es empfiehlt sich, so früh wie möglich, idealerweise etwa 7 Tage nach der Kulturetablierung, Langzeitexperimente zu starten.

Die zerebellären organotypischen Kulturen werden in einem Medium ohne Antibiotika gehalten; Daher ist es unerlässlich, während ihrer Einrichtung eine sterile Umgebung aufrechtzuerhalten. Das Alter der Jungen, von denen die Kleinhirn geerntet werden, ist entscheidend, mit einer empfohlenen Spanne von 9-12 Tagen. Diese Altersspanne ist optimal, da die Kleinhirnrinde für die Schnitte ausreichend entwickelt ist. Bemerkenswert ist, dass bei älteren Tieren das Gewebe dazu neigt, an der Klinge zu haften. Es ist wichtig, das Kleinhirn bis zum Präparieren in eine kalte Dissektionslösung getaucht zu halten.

Während der ersten 5-7 Tage in Kultur können die Gewebescheiben Anzeichen aufweisen, die an eine Entzündung erinnern, die durch Schwellungen und milchige Verfärbungen gekennzeichnet sind. Diese Eigenschaften können sich möglicherweise auf die Messung physiologischer Parameter und die Wirksamkeit von Immunfärbetechniken auswirken.

Es wird dringend empfohlen, das Kleinhirn nicht dünner als 350 μm zu schneiden, um eine Inkonsistenz in der Dicke während des Schneidens zu vermeiden. Beachten Sie, dass ein Gewebe mit einer Größe von 350 μm nach 7 Tagen in Kultur viel dünner auf etwa 90 μm wird (basierend auf der Z-Stapel-Messung).

Hier führen wir die PAR-Färbung 7,50 in das Toolkit ein, das zur Untersuchung der DDR in PCs verwendet wird. Diese Auslesung ist schnell, empfindlich und erfasst die dynamische Natur des DDR, was sich bei unserer Analyse des DDR in Wildtyp- und Atm-defizienten PCs als besonders nützlich erweist. Die hier skizzierten Protokolle sollten besonders für Forscher von Vorteil sein, die genomische Instabilitätssyndrome untersuchen, die das Kleinhirn betreffen.

Offenlegungen

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Die Autoren erklären, dass es keine Interessenkonflikte im Zusammenhang mit dieser Studie gibt.

Danksagungen

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Die Arbeit in unserem Labor wird von der Dr. Miriam and Sheldon G. Adelson Medical Research Foundation und der Israeli Association for Fighting the A-T Disease unterstützt.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Reagenz und Ausrüstung
150 x 30 cm PetrischaleCorning Inc.3261
35 x 10 mm PetrischaleCorning Inc.3294
AcetonInvitrogen25030081
AcetonSigma-Aldrich270725-1L
Selbstklebende ObjektträgerMarienfeld4818776 x 26 x 1 mm
Klingen für ChopperTED PELLAModell TC752-1  Style Rasierklingen
BMEGIBCO41010-026 500ml. Keine L-Schwemme
Zellkultur-InsertsMilliporePICM0RG50
D-GlucoseBiological Indo.02-015-1A
HBSS ohne PhenolrotSigma-AldrichH-1138-500LKein Ca+,Kein Mg+
HBSS mit PhenolrotSartorius02-015-1A
PferdeserumGIBCO26050088hitzeinaktivierte
IriszangeCellPathGZX-0100-00A130mm stumpf gezackter Irisspatel
F.S.T10092-12
L-Glutamin (200 mM)Gibco41010026
MethanolSigma-Aldrich322412-1L
MethanolSigma-AldrichG5767
MikroskopOlympus
Eindeckmedium ohneGRIGENE. Ltd, IsraelK239320A
ParaquatSigma-Aldrich856177-250MGParaquat-Dichlorid (Methylviologen)
PARG-Poly(ADP-Ribose)-Glykohydrolase-InhibitorTocris Bioscience, Vereinigtes KönigreichPDD 00017273lichtempfindlich 
PhosphatpufferBiologisch Indo.02-018-1A
Schere, Haut-Gewebe
Sechs-Well-PlattenCorning integriertCLS3516
Ersatz-Hackscheiben TED PELLAModell 10180-01
GewebehackerMcIlwainModell TC75210180-220
Pinzette, spitze
Harnbecher<
stark>Antikörper
Fluor 488 Esel Anti Kaninchen IgG 
Invitrogen		A212061:500; sekundär ab; Sekundärer Verdünnungspuffer;   Inkubation für 2 h bei Raumtemperatur
Antigliafibrilläres saures ProtienMilliphoreMAB34021:1500; primär ab; blockierend; Host:Maus
Anti-calbindin-D-28KSwant CB3001:2000; primärer ab; blockierend; Wirt: Kaninchen 
Anti-Calbindin-D-28KSwantCB-38a1:2000; primär ab; blockierend 
Anti-Pan-ADP-Ribose-ReagenzMilliphoreMABE10161:800; primär ab; Blockierung; Inkubation für 2 h bei Raumtemperatur
DAPI (4',6-Diamidin-2'-phenylindoldihydrochlorid)Zellsignalisierung40841:1000; sekundärer Verdünnungspuffer; Inkubation für 20 min bei Raumtemperatur
Alexa

Referenzen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Tubbs, A., Nussenzweig, A. Endogenous DNA damage as a source of genomic instability in cancer. Cell. 168 (4), 644-656 (2017).
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