Methodenartikel

Kontrollierte reversible viszerale arterielle Ischämie, venöse Stauung und kombinierte Malperfusion mittels Midline-Laparotomie bei Ratten

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DOI:

10.3791/67171

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5. Juli 2024

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1Department of General, Visceral and Transplantation Surgery, Heidelberg University Hospital, 2Department of Urology and Urosurgery, University Medical Center Mannheim, Medical Faculty of the University of Heidelberg, 3Division of Intelligent Systems and Robotics in Urology (ISRU), German Cancer Research Center (DKFZ) Heidelberg, 4DKFZ Hector Cancer Institute at the University Medical Center Mannheim, 5Department of Urology, University Hospital Leipzig

In diesem Artikel

Zusammenfassung

In diesem Artikel wird ein standardisiertes Verfahren zur kontrollierten, reversiblen Malperfusion viszeraler Organe in Rattenmodellen vorgestellt. Ziel ist es, diese Malperfusionszustände mit einem hohen Maß an methodischer Sicherheit und Kontrolle zu induzieren und gleichzeitig die technische Einfachheit und Fehlerresilienz zu wahren.

Zusammenfassung

Neben Sepsis und Malignität ist die Malperfusion die dritthäufigste Ursache für den Gewebeabbau und ein wichtiger Pathomechanismus für verschiedene medizinische und chirurgische Erkrankungen. Trotz bedeutender Entwicklungen wie Bypass-Operationen, endovaskuläre Verfahren, extrakorporale Membranoxygenierung und künstliche Blutersatzstoffe bleibt die Malperfusion des Gewebes, insbesondere der viszeralen Organe, ein drängendes Problem in der Patientenversorgung. Der Bedarf an weiterer Forschung zu biomedizinischen Prozessen und möglichen Eingriffen ist hoch. Valide biologische Modelle sind von größter Bedeutung, um diese Art von Forschung zu ermöglichen. Aufgrund der multifaktoriellen Aspekte der Gewebeperfusionsforschung, die nicht nur die Zellbiologie, sondern auch die vaskuläre Mikroanatomie und Rheologie umfassen, erfordert ein geeignetes Modell einen Grad an biologischer Komplexität, den nur ein Tiermodell bieten kann, so dass Nagetiere das offensichtliche Modell der Wahl sind. Die Gewebemalperfusion kann in drei verschiedene Zustände unterschieden werden: (1) isolierte arterielle Ischämie, (2) isolierte venöse Stauung und (3) kombinierte Malperfusion. In diesem Artikel wird ein detailliertes Schritt-für-Schritt-Protokoll für die kontrollierte und reversible Induktion dieser drei Arten von viszeraler Malperfusion mittels Mittellinien-Laparotomie und Abklemmen der Bauchaorta und der Kavalvene bei Ratten vorgestellt und die Bedeutung einer präzisen Operationsmethodik unterstrichen, um einheitliche und zuverlässige Ergebnisse zu gewährleisten. Paradebeispiele für mögliche Anwendungen dieses Modells sind die Entwicklung und Validierung innovativer intraoperativer Bildgebungsmodalitäten wie Hyperspectral Imaging (HSI) zur objektiven Visualisierung und Differenzierung von Malperfusionen von gastrointestinalen, gynäkologischen und urologischen Organen.

Einleitung

Während die Auswirkungen von Gewebeperfusionsentzug in Form von lokalen oder systemischen Gewebemalperfusionszuständen seit langem anerkannt sind, sind sie nach wie vor eine der Hauptursachen für Morbidität und Mortalität sowohl in den Vereinigten Staaten als auch in Europa1. Diese Malperfusionszustände sind nach Malignität und septischen Entzündungen die dritthäufigste Ursache für den Gewebeabbau, haben aber im Vergleich zu den beiden letztgenannten ein weitaus breiteres Ursprungsspektrum2.

Dieses Spektrum reicht von lokalen Mechanismen wie Vorhofflimmern mit thromboembolischem Verschluss, Vasokonstriktion und iatrogener oder traumatischer Dissektion bis hin zu systemischen Mechanismen wie Herzinsuffizienz oder -schock, Sepsis, Hypovolämie und Steal-Phänomenen. Diese vielfältigen Mechanismen liegen einer Vielzahl von medizinischen und chirurgischen Erkrankungen zugrunde. Die signifikante Morbidität und Mortalität, die mit diesen Erkrankungen verbunden ist, hat die medizinische Aufmerksamkeit im Laufe der Jahrzehnte auf Verfahren zur Wiederherstellung des Blutflusses in malperfundiertem Gewebe gelenkt, um Nekrosen vorzubeugen und die Organfunktion wiederherzustellen3.

Diese Forschungsanstrengungen haben zu einer Vielzahl von pharmazeutischen, medizinischen und chirurgischen Lösungen zur Wiederherstellung der physiologischen Organperfusion geführt, darunter Fortschritte in der Bypass-Chirurgie4, endovaskulären Verfahren5, der extrakorporalen Membranoxygenierung 6,7, der Perfusion von Organmaschinen während der Transplantation8 und künstlichen Blutersatzstoffen9.

Trotz dieser bedeutenden Entwicklungen bleibt die Malperfusion, insbesondere der viszeralen Organe, ein drängendes Problem in der Patientenversorgung, und der Bedarf an weiterer Forschung zu biomedizinischen Prozessen und Rettungsstrategien ist hoch. Valide biologische Modelle sind von größter Bedeutung, um diese Art von Forschung zu ermöglichen. Aufgrund der multifaktoriellen Aspekte der Gewebeperfusionsforschung, die nicht nur die Zellbiologie, sondern auch die vaskuläre Mikroanatomie und Rheologie umfassen, erfordert ein geeignetes Modell einen Grad an biologischer Komplexität, den nur ein vollständiger Modellorganismus bieten kann, so dass Nagetiere das offensichtliche Modell der Wahl sind.

Die Gewebemalperfusion kann in drei verschiedene Zustände unterschieden werden: isolierte arterielle Ischämie, isolierte venöse Stauung und kombinierte Malperfusion10. Klinisch relevante Szenarien für diese Erkrankungen sind (1) Arterielle Ischämie: Vorhofflimmern mit thromboembolischem Verschluss, septische Embolien, Vasokonstriktion, iatrogene oder traumatische Gefäßdissektion oder -klemmung, Herzinsuffizienz oder -schock, Aortendissektion, Sepsis und Hypovolämie, extreme arterielle Obstruktion aufgrund einer äußeren Verengung, Lungenarterienembolie, chronische arterielle Gefäßverschlusserkrankungen oder Steal-Phänomene; (2) Venöse Stauung: iatrogene oder traumatische Gefäßdissektion oder -klemmung, Herzinsuffizienz, Leberfibrose oder Leberzirrhose, Venenobstruktion aufgrund äußerer Verengung, Venenthrombose, Veneninsuffizienz und Budd-Chiari-Syndrom; (3) Kombinierte Malperfusion: Kombinationen der oben genannten Zustände und fortgeschrittene Stadien der oben genannten Erkrankungen, wie z. B. sekundäre venöse Stauung aufgrund einer ischämieinduzierten Fibrose oder sekundäre arterielle Ischämie aufgrund einer stauungsinduzierten Retention, sowie spezifische Organerkrankungen wie ischämische Entzündungen (z. B. ischämische Kolitis)11,12.

Dieser Artikel zielt daher darauf ab, ein Schritt-für-Schritt-Modell zur Induktion einer kontrollierten, reversiblen viszeralen arteriellen Ischämie, einer venösen Stauung und einer kombinierten Malperfusion über Mittellinien-Laparotomie bei Ratten sowohl für Überlebens- als auch für Nicht-Überlebensanwendungen bereitzustellen, wie in Abbildung 1 dargestellt. Das experimentelle Modell bietet eine kontrollierte Umgebung für die Untersuchung der vielschichtigen Dynamik von arterieller Ischämie, venöser Stauung und ihren kombinierten Folgeerscheinungen und emuliert klinisch relevante Szenarien, die unter verschiedenen Bedingungen auftreten.

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Abbildung 1: Überblick über das Protokoll. Schematische Darstellung der vaskulären Anatomie der Ratte und Darstellung der Klemmstelle (grauer Pfeil). (A) Physiologische Durchblutung. (B) Arterielle Ischämie. (C) venöse Stauung. (D) Kombinierte Malperfusion. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Protokoll

Alle hier beschriebenen Tieraktivitäten wurden in akkreditierten Einrichtungen durchgeführt und vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) des Regierungspräsidiums Baden-Württemberg in Karlsruhe (35-9185.81/G-62/23) genehmigt. Die Versuchstiere wurden nach institutionellen Standards, den deutschen Gesetzen zur Verwendung und Pflege von Tieren, den Richtlinien des Rates der Europäischen Gemeinschaft (2010/63/EU) und den ANARRIVE-Richtlinien gehalten. Männliche Sprague Dawley-Ratten mit einem Bestellgewicht von 400 Gramm wurden nach einer einwöchigen Akklimatisierung verwendet. Die Einzelheiten zu den Reagenzien und der Ausrüstung, die in dieser Studie verwendet wurden, sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Anästhesie und Analgesie

  1. Betäuben Sie die Ratte mit dem Medikament gemäß den institutionellen Protokollen. Isofluran wird zur Einleitung einer Sedierung empfohlen, gefolgt von einer i.p. Injektion von 100 mg/kg Ketamin mit Körpergewicht und 4 mg/kg Xylazin mit Körpergewicht. Eine zusätzliche Analgesie kann mit einer s.c.-Injektion von 5 mg/kg Carprofen Körpergewicht erreicht werden. Für Details verweisen wir auf Studier-Fischer et al.13.
  2. Tragen Sie eine Augensalbe auf die Augen auf, um Trockenheit zu verhindern.
  3. Gewährleisten Sie die richtige analgetische Tiefe mit dem Zehenquetschtest mit chirurgischer Pinzette.
  4. Bewerten Sie die Narkosetiefe während der Operation regelmäßig und passen Sie sie an.

2. Vorbereitung des Eingriffs

  1. Bereiten Sie den Scheuertisch mit allen erforderlichen Materialien und Instrumenten vor, einschließlich lösbarer mikrovaskulärer Klemmen und des Applikators (Abbildung 2A-C), einer stumpfen Überholtklemme, einer Feinpräparationsschere und einer Pinzette.
    1. Bereiten Sie die chirurgischen Präparationshaken vor, indem Sie die Kanülen in einem Winkel von 135° in einem Abstand von 1 cm zur Spitze falten und über einen Luer-Lock mit Kunststoff-Perfusionsschläuchen verbinden, um mit einer chirurgischen Moskitoklemme Spannung aufzubringen (Abbildung 2D,E).
  2. Bereiten Sie eine chirurgische Expositionsvorrichtung für Nagetiere vor, einschließlich Y-förmiger Fixierungsstäbe und eines Heizkissens, wie in Studier-Fischer et al.13 beschrieben.
  3. Stellen Sie sicher, dass eine ordnungsgemäße Sauerstoffversorgung durch Inhalation von 100 % Sauerstoff mit einer Gesichtsmaske für Neugeborene erreicht wird (Abbildung 2F).

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Abbildung 2: Versuchs- und Tieraufbau. (A) Erforderliche chirurgische Instrumente und Materialien. (B,C) Lösbare mikrovaskuläre Klemme und Applikator. (D,E) Eine gefaltete Kanüle, die mit einem Perfusionsschlauch verbunden ist, wird als chirurgischer Vorbereitungshaken verwendet. (F,G) Das Rattenmodell wurde mit einer Gesichtsmaske mit Sauerstoff versorgt und rasiert. (H) Hautschnitt über die gesamte Bauchlänge. (I-M) Resektion des Xiphoids und Hämostase. (N-Q) Lebermobilisation und Dissektion des falciformen Bandes (Pfeil 1). (R) Anwendung von Präparationshaken und Metallständern für die Freilegung von Organen nach Laparotomie. (S) Vollständige viszerale Freilegung der großen abdominalen Gefäße mit stumpfen Haken (Pfeil 2), Silikongefäßschlaufen (Pfeil 3) und chirurgischer Kompresse (Pfeil 4). (T,U) Bauchaorta und Kavalvene. (V) Atraumatische Präparationsinstrumente. (W) Befeuchteter Wattestäbchen (Pfeil 5). (X) Befeuchtete Kompresse in der Pinzette (Pfeil 6) und stumpfe Überholtklemmen (Pfeil 7). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

3. Chirurgische Vorbereitung

  1. Rasieren Sie die chirurgische Zugangsstelle für eine Mittellinien-Laparotomie (Abbildung 2G). Führen Sie einen Hautschnitt über die gewünschte Bauchlänge von ca. 7 cm durch (Abbildung 2H), fahren Sie mit der Laparotomie fort, indem Sie die Faszie präparieren, und nähen Sie die chirurgischen Vorbereitungshaken mit angebrachten Kunststoffschläuchen und chirurgischen Mückenklemmen durch die Haut. Legen Sie den chirurgischen Situs mit den chirurgischen Vorbereitungshaken frei und üben Sie Spannung auf das Gewebe aus.
  2. Achten Sie darauf, dass das Bauchfell nur bis zu einigen Millimetern unterhalb des Brustbeinbeginns kranial präpariert wird und ein Teil des Bauchfells intakt bleibt. Legen Sie einen Teil einer chirurgischen Kompresse unterhalb des Brustbeins (Abbildung 2I) und resezieren Sie das Xiphoid mit einer starken Materialschere. Üben Sie mit der chirurgischen Kompresse Druck auf den Resektionsbereich aus, um eine ausreichende Blutstillung dieser gut durchbluteten Region zu erreichen (Abbildung 2I-M).
  3. Mobilisieren Sie die Leber dorso-kaudal, um das falciforme Band freizulegen (Abbildung 2N) und das Band zu präparieren (Abbildung 2O-Q).
  4. Zur hämostatischen Kontrolle führen Sie, je nachdem, wo die Klemmung der großen Gefäße durchgeführt werden soll, eine vollständige viszerale Freilegung der abdominalen großen Gefäße (Abbildung 2R) und der mit Silikongefäßschlaufen befestigten Gefäße durch (Abbildung 2S-U). Es sollten nur atraumatische Präparationsinstrumente verwendet werden (Abbildung 2V), wie z. B. befeuchtete Wattestäbchen (Abbildung 2W), befeuchtete Kompressen in einer Pinzette und stumpfe Überholklemmen (Abbildung 2X).

4. Vorbereitung und Abklemmen der Bauchschlagader bei arterieller Ischämie

  1. Führen Sie eine linke Medialisierung der oberen Bauchorgane mit atraumatischen Präparationsinstrumenten durch, um Zugang zur linken Nebennierenarterie zu erhalten (Abbildung 3A-D).
  2. Identifizieren Sie die pulsierende Stelle, die typischerweise medial zur kranialen Verlängerung der linken Nebennierenarterie liegt und den Verlauf der Aorta anzeigt (Abbildung 3E). Schieben Sie sich mit Overholt-Klemmen für eine stumpfe Dissektion durch das Weichgewebe vor, um Zugang zur Bauchaorta zu erhalten (Abbildung 3F,G).
  3. Tunneln Sie die Bauchschlagader am schädelreichsten Ende mit stumpfen Überholklemmen (Abbildung 3H-L) und schlingen Sie die Aorta mit einer Silikongefäßschlaufe (Abbildung 3M-T).
  4. Bringen Sie eine geeignete mikrovaskuläre Aneurysmaklemme an, indem Sie die Silikonschlaufe verwenden, um die Aorta ventral leicht zu luxieren, und führen Sie die mikrovaskuläre Aneurysmaklemme entlang der Silikonschlaufe, um eine isolierte Aortenklemmung zu gewährleisten (Abbildung 3U). Je nach Fragestellung kann die mikrovaskuläre Klemme wieder gelöst werden.

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Abbildung 3: Präparation und Klemmung der Bauchschlagader (A) Freilegung viszeraler Organe. (B-E) Linke Medialisierung der oberen Bauchorgane mit atraumatischen Präparationsinstrumenten, um Zugang zur linken Nebennierenarterie zu erhalten. (F,G) Stumpfe Dissektion medial der linken Nebennierenarterie an der pulsierenden Stelle (grauer Pfeil), um Zugang zur Bauchschlagader zu erhalten. (H-L) Tunnelung der Bauchschlagader mit stumpfen Overholt-Klemmen. (M-T) Schleudern der Aorta mit einer Silikongefäßschlaufe. (U) Anlegen einer lösbaren Aneurysma-Mikrovaskulärklemme unter Verwendung der Silikonschlaufe als Anleitung. (V-Z) Visualisierung der Arteria coeliacus (orange) in Bezug auf die Aorta (rot) und die Silikongefäßschlinge. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

5. Präparation und Klemmung der suprahepatischen Bauchvene bei venöser Stauung

  1. Mobilisieren Sie die Leber mit atraumatischen Präparationsinstrumenten nach rechts, präparieren Sie die Leberbänder scharf und lateralisieren Sie die Leber weiter (Abbildung 4A-C).
  2. Öffnen Sie den retrohepatischen Raum an den linken Crus des Zwerchfells mit stumpfen Overholt-Klemmen (Abbildung 4D-G).
  3. Tunneln Sie die Kavalvene mit stumpfen Überholtklammern (Abbildung 4H-K) und schlingen Sie die Kavalvene mit Silikongefäßschlaufen (Abbildung 4L-O).
  4. Bringen Sie eine geeignete mikrovaskuläre Aneurysmaklemme an, indem Sie die Kavalvene ventral leicht luxieren, und führen Sie die mikrovaskuläre Aneurysmaklemme entlang der Silikonschlaufe, um eine isolierte Klemmung der Kavalvene zu gewährleisten (Abbildung 4R).

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Abbildung 4: Präparation und Klemmung der suprahepatischen Vena cavale abdominal. (A) Freilegung der kranialen viszeralen Organe. (B) Gewebeschonende Mobilisation der Leber und scharfe Dissektion der Leberbänder mit atraumatischen Präparationsinstrumenten. (C) Lateralisierung der Leber. (D-G) Die Öffnung des retrohepatischen Raumes und die Präparation an den linken Crus des Zwerchfells. (H-K) Tunnelung der Vena cavale (blau) mit stumpfen Overholt-Klemmen. (v.l.n.r.) Schleudern der Vena cavale mit Hilfe von Gefäßschlaufen aus Silikon. (P,Q) Anstrengung von Spannung, um den Blutfluss der Kavale zaghaft einzuschränken. (R) Anlegen einer lösbaren mikrovaskulären Aneurysmaklemme unter Verwendung der Silikonschlaufe als Anleitung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

6. Abklemmen der Bauchschlagader und der suprahepatischen Bauchhöhle bei kombinierter Malperfusion

  1. Führen Sie die obigen Schritte aus, bis sowohl die Aorta als auch die Kavalvene mit Silikongefäßschlaufen versehen sind. Fahren Sie mit der Anwendung der Aneurysma-Mikrovaskulärklemme für beide Gefäße fort, wieder mit der Silikonschlaufe zur Führung. Es empfiehlt sich, zuerst die Aorta zu klemmen und die Zeit bis zur anschließenden Kavalklemmung auf wenige Sekunden zu minimieren.
    HINWEIS: Abhängig vom gewünschten Szenario und Forschungszweck kann die Malperfusion über eine definierte Zeitspanne fortgesetzt oder nach einer bestimmten Zeitspanne freigegeben werden, und die Tiere können entweder durch eine scharfe Kardiektomie (nach institutionell anerkannten Protokollen) für Nicht-Überlebensanwendungen euthanasiert werden oder im Falle geplanter Nachuntersuchungen und Überlebensexperimente einen schrittweisen Bauchverschluss mit chirurgischen Nähten erhalten. Für die vorliegende Studie wurden die Tiere eingeschläfert.

Ergebnisse

Dieses Protokoll wurde an 10 männlichen Ratten (Durchschnittsgewicht 403 g ± 26 g) in einer Nicht-Überlebensumgebung durchgeführt. Die Erfolgsrate wurde durch das Überleben über 20 Minuten nach arterieller Klemmung, venösem Klemmen und kombiniertem Klemmen für 5 Minuten mit 10 Minuten Reperfusion definiert, von denen jedes 100% betrug. Die mittlere Dauer der Präparation von der Hautinzision bis zur Bestückung beider Gefäße mit Silikonschlingen betrug 11 min 45 s ± 3 min 23 s.

Zur Validierung der 4 verschiedenen Malperfusionszustände wurden die Indexparameter für die Oxygenierung (StO2) und die Perfusion (NIR) mittels hyperspektraler Bildgebung (HSI) an 5 viszeralen Organen gemessen (Abbildung 5).

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Abbildung 5: Validierung des Malperfusionsmodells. (A,B) Quantifizierung der HSI-Oxygenierungs- und Perfusionswerte über vier verschiedene Perfusionszustände und fünf verschiedene viszerale Organe mit n = 10 Tieren. (C-F) RGB- und farbcodierte Indexbilder von HSI-Aufnahmen, die viszerale Organe über 4 verschiedene Perfusionszustände enthalten. Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung an. Der Maßstabsbalken zeigt 5 cm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur anzuzeigen.

Die Werte wurden in beliebigen Einheiten angegeben und zeigten eine signifikante Abnahme der Malperfusionszustände im Vergleich zum physiologischen Organzustand (Tabelle 1). Die hyperspektralen Ergebnisse stimmten mit neueren Veröffentlichungen überein, die darauf hindeuteten, dass die Lebensfähigkeit und Perfusion von Gewebe anhand von organspezifischen HSI StO 2-Cut-off-Werten bewertet werden kann, die mit den in dieser Studie beobachteten Werten übereinstimmten 14,15. Exemplarisch für den Magen waren dies 64,1 % (±9,4 %) für die physiologische Durchblutung, 43,1 % (±7,4 %) für die arterielle Ischämie, 40,5 % (±5,4 %) für die venöse Stauung und 39,3 % (±4,5 %) für die kombinierte Malperfusion.

Da es sich um Nicht-Überlebensexperimente handelte, gibt es keine experimentellen Daten über die Langzeitergebnisse der Tiere. Andere Studien berichten jedoch über ein Überleben von 100 % und 57 % über 24 Stunden für Ratten, die sich 30 Minuten und 60 Minuten einer oberen Mesenterialarterienklemmung unterzogen haben16,17 und dies erfolgreich mit den Serumspiegeln des Hitzeschockproteins 70 korreliert haben. Folglich könnte dies eine mögliche Methode sein, um die Ergebnisse in zukünftigen Überlebensstudien anhand unterschiedlicher Klemmzeiten zu bewerten.

ParameterOrgelGrundlinieArterielle IschämieVenöse StauungKombinierte Malperfusion
StO2Magen64,1 % (±9,4 %)43,1 % (±7,4 %)40,5 % (±5,4 %)39,3 % (±4,5 %)
Dünndarm78,4 % (±5,1 %)44,8 % (±5,5 %)38,0 % (±7,9 %)41,9 % (±6,9 %)
Doppelpunkt74,6 % (±5,0 %)56,0 % (±6,3 %)51,3 % (±4,1 %)51,8 % (±2,9 %)
Leber39,5 % (±9,7 %)16,9 % (±2,6 %)9,5 % (±0,8 %)9,3 % (±1,1 %)
Niere71,0 % (±3,8 %)26,3 % (±3,0 %)18,6 % (±2,5 %)21,2 % (±2,6 %)
NIRMagen20,0 % (±9,3 %)8,3 % (±6,7 %)6,8 % (±5,1 %)7,5 % (±8,1 %)
Dünndarm38,6 % (±17,4 %)12,9 % (±11,0 %)6,3 % (±6,5 %)5,7 % (±5,9 %)
Doppelpunkt12,6 % (±13,7 %)5,3 % (±8,7 %)3,8 % (±7,5 %)2,6 % (±4,7 %)
Leber40,4 % (±13,1 %)0,3 % (±0,7 %)0,0 % (±0,1 %)0,0 % (±0,0 %)
Niere10,4 % (±5,2 %)0,0 % (±0,0 %)0,0 % (±0,1 %)0,0 % (±0,0 %)

Tabelle 1: Gewebeparameter. HIS, StO,2 , Oxygenierungs- und NIR-Perfusionswerte in beliebigen Einheiten über 5 viszerale Organe und 4 verschiedene Perfusionszustände.

Diskussion

Während die periphere arterielle Verschlusskrankheit (pAVK) allein als prominentester Vertreter von Gewebemalperfusionserkrankungen bereits eine Prävalenz von etwa 7 % aufweist und allein in den Vereinigten Staaten schätzungsweise 8,5 Millionen Erwachsene betrifft18, ist die Gewebemalperfusion im Allgemeinen ein relevanter Pathomechanismus bei den meisten chirurgischen und medizinischen Erkrankungen. Folglich sind geeignete und reproduzierbare Tiermodelle zwingend erforderlich, um neuartige Forschungsfragen in diesem Bereich zu adressieren.

Die drei vaskulären dynamischen Situationen, die einer differenzierten Untersuchung bedürfen, sind die arterielle Ischämie, die venöse Stauung und die kombinierte Malperfusion. Durch die Induktion einer isolierten arteriellen Ischämie können die Wissenschaftler das zeitliche und räumliche Fortschreiten der Gewebehypoxie genau beschreiben und die molekularen Kaskaden untersuchen, die an Ischämie-Reperfusionsschäden, zellulärer Apoptose und Entzündungsreaktionen beteiligt sind. Durch die Kompromittierung der venösen Drainage, einer oft übersehenen Facette der Gefäßpathologie, können Wissenschaftler das Zusammenspiel zwischen arteriellen Zuflüssen und venösen Abflussdiskrepanzen untersuchen und Licht auf die Pathophysiologie von Venenthrombosen, stauungsbedingten Gewebeödemen und mikrozirkulatorischen Dysfunktionen werfen. Wenn man diese beiden pathologischen Situationen kombiniert, kann man das dyssynergistische Milieu der kombinierten Malperfusion untersuchen, was die komplexe Pathophysiologie widerspiegelt, die bei klinischen Syndromen wie der akuten mesenterialen Ischämie und der ischämischen Kolitis auftritt.

Neben der Aufklärung grundlegender pathophysiologischer Mechanismen dient die Fähigkeit, viszerale arterielle Ischämie, venöse Stauung und kombinierte Malperfusion bei Ratten zu induzieren, als unverzichtbare Plattform für die Bewertung der Wirksamkeit pharmakologischer Interventionen, chirurgischer Techniken, neuer therapeutischer Strategien und innovativer Bildgebungsverfahren, insbesondere wie HSI 14,19,20,21,22. Dieses Modell ist daher eine Schlüsselkomponente bei der Bereitstellung der erforderlichen biologischen Ground Truth, die erforderlich ist, um das volle Potenzial von HSI bei der Gewebebewertung und Identifizierung von Perfusionszuständen auszuschöpfen. Durch die Nutzung dieses Versuchsaufbaus können Forscher die Umsetzung präklinischer Befunde in klinisch tragfähige Strategien beschleunigen und letztendlich die Morbidität und Mortalität im Zusammenhang mit verschiedenen Gefäß- und Perfusionserkrankungen reduzieren.

Zur Veranschaulichung können Forscher dieses Modell verwenden, um die Wirksamkeit pharmakologischer Wirkstoffe zu untersuchen, die auf Ischämie-Reperfusions-Verletzungswege abzielen, wie z. B. Antioxidantien, entzündungshemmende Wirkstoffe und Vasodilatatoren, und so ihren potenziellen Nutzen in der klinischen Praxis abzugrenzen23,24. Darüber hinaus erleichtert dieses Modell die Bewertung neuartiger chirurgischer Ansätze, wie z. B. mesenteriale Revaskularisationstechniken und venöse dekompressive Verfahren, und bietet unschätzbare Einblicke in deren Machbarkeit, Sicherheit und langfristige Wirksamkeit25,26.

Darüber hinaus ermöglicht dieser experimentelle Rahmen den Forschern, das komplizierte Zusammenspiel zwischen vaskulärer Dysfunktion und systemischen Komorbiditäten wie Diabetes, Bluthochdruck und Atherosklerose zu untersuchen und so das komplizierte Geflecht miteinander verbundener pathophysiologischer Signalwege zu veranschaulichen, die das Fortschreiten der Gefäßerkrankung orchestrieren27,28.

Während es mehrere Veröffentlichungen zur selektiven Malperfusion einzelner Organe, wie z.B. der Leber 29,30,31 oder der Niere, gibt, gibt es bei Ratten 32,33 einen Mangel an wissenschaftlicher Literatur, die sich mit der Malperfusion der gesamten Eingeweide bei Ratten befasst, und es gibt explizit kein methodisches Protokoll. Dies ist also die Behauptung dieses Manuskripts. Zu den Einschränkungen der vorgestellten Technik gehören vor allem die Invasivität des Verfahrens und, abhängig von der Dauer der Malperfusion, konsekutive Organthrombosen und Funktionsstörungen, die möglicherweise zu postoperativem Leiden durch Multiorganversagen oder abdominales Kompartmentsyndrom führen 34,35,36. Eine sorgfältige Planung und Konzeption, je nach Fragestellung, kann helfen, die erforderliche Dauer der Malperfusion und ihre pathophysiologischen Folgen auszugleichen.

Bei der Fehlerbehebung bei häufigen Herausforderungen, die während des Eingriffs auftreten, sollte auf die folgenden Punkte und Empfehlungen geachtet werden: (1) Stellen Sie sicher, dass die Ausrüstung und die Medikamente im Voraus gründlich vorbereitet sind, um Unterbrechungen während des Eingriffs zu minimieren. (2) Führen Sie die hämostatische Kontrolle sorgfältig durch, indem Sie die avaskulären Ebenen sorgfältig vorbereiten und dissektionieren. Erwägen Sie die Verwendung einer bipolaren hämostatischen Pinzette für die elektrische Blutstillung, falls verfügbar. (3) Minimieren Sie das Trauma des Gewebes durch die Verwendung von nicht-traumatischen Instrumenten wie befeuchteten Wattestäbchen oder befeuchteten chirurgischen Kompressen mit Pinzette, wenn Sie mit dem Leberparenchym in Kontakt kommen; (4) Bei etwa 20 % der Tiere kam es aufgrund empfindlicher Gewebebedingungen zu diffusen oberflächlichen Leberparenchymblutungen. Die Blutung stoppte jedoch in allen Fällen mit leichter Kompression und Geduld. Diese Empfehlungen zielen darauf ab, die Verfahrenseffizienz zu verbessern und Komplikationen bei der Induktion von Malperfusion in Rattenmodellen zu minimieren.

Bei der Resektion des Xiphoids für einen besseren Zugang zur Vena cavalis ist darauf zu achten, dass das Peritoneum dorsal zum Übergang zwischen Xiphoid und Brustbein über einige Millimeter intakt bleibt. Die Resektionsstelle des Xiphoids ist hart und scharf, was möglicherweise zu einem Trauma des oberflächlichen Leberparenchyms führt. Daher wird empfohlen, das retrosternale Peritoneum kaudal mit einer Pinzette zu mobilisieren und effektiv um den Knochenstumpf zu wickeln, ihn zu bedecken und die Blutstillung zu unterstützen. Die chirurgischen Präparationshaken sollten mit kranialer Spannung durch die kraniale ventrale Bauchdecke genäht werden, so dass die peritoneale Abdeckung des Xiphoidstumpfes an Ort und Stelle bleibt.

Bei der Präparation des Bandes falciformis sollte darauf geachtet werden, dass es nicht versehentlich zu iatrogenen Verletzungen der Lebervene kommt, da dies für das Tier tödlich sein kann. Aufgrund des hohen Blutungsrisikos während der Gefäßpräparation wird empfohlen, den Großteil der chirurgischen Präparation durch Spreizen mit stumpfen Überholtklammern und nicht durch Verwendung scharfer Dissektionsinstrumente durchzuführen. Darüber hinaus sollten Silikongefäßschlaufen vor der Verwendung angefeuchtet werden, um die Oberflächenreibung zu verringern und das Risiko eines Gewebetraumas zu minimieren.

Bei der Anwendung der Aneurysma-Mikrovaskulärklemme ist es entscheidend, die genaue Gefäßanatomie zu visualisieren. So entspringt die Arteria coeliacus sehr kranial aus der Bauchschlagader. Wenn ein Zöliakie-Verschluss gewünscht ist, z. B. zur Untersuchung einer hepatischen Malperfusion, sollte die Zöliakie-Arterie in Bezug auf die Aorta und die Silikongefäßschlinge sichtbar gemacht werden. Dadurch wird sichergestellt, dass die Arteria coeliacus in das eingeklemmte Gefäßgewebe einbezogen wird (Abbildung 2V-Z). Es gab einen Fall, in dem die Klemme versehentlich zunächst kaudal zur Zöliakiearterie platziert wurde. Dies wurde jedoch aufgrund des fehlenden Abfalls der StO2-Leberwerte sofort erkannt, und es wurde erfolgreich eine ordnungsgemäße Reclamp durchgeführt.

Der gefährlichste Präparationsschritt ist das Tunneln der Vena cavale. Dieser Schritt erfordert sanfte Bewegungen und Geduld, und Overholt-Klemmen sollten nur dann gespreizt werden, wenn sicher ist, dass kein Kontakt mit der Kavalvene besteht. Es kann schwierig sein, dies zu beurteilen, da die Vena cavale bei leichter Kompression als dünnes avaskuläres Bindegewebe erscheint, wodurch das eingeschlossene Blut in beide Richtungen verschwindet. Es besteht auch die Gefahr einer versehentlichen Pleuraöffnung und der Entstehung eines Pneumothorax, wenn die Kavalvene zu kranial tunnelt wird. Dies kann eine schwerwiegende und lebensbedrohliche Komplikation sein, zumal das Tier spontan atmet und keine invasiven Beatmungsmaßnahmen ergriffen werden können. Es hat sich als hilfreich erwiesen, die Präparationsinstrumente leicht zurückzuziehen und kaudaler fortzufahren, um diese Komplikation zu vermeiden. Bei hämodynamisch relevanten und sichtbaren Pneumothorax mit Vorwölbung des Leberzwerchfells kann als Rettungsstrategie eine transdiaphragmatische Einmalpunktion und Aspiration der eingeschlossenen Luft mit einer 30 G Nadel und einer kleinen Spritze empfohlen werden. Diese Technik wurde erfolgreich bei einem Tier eingesetzt, um es intraoperativ zu retten.

Schließlich ist beim Anlegen der mikrovaskulären Klemmen besonders darauf zu achten, dass umliegendes Bindegewebe nicht einbezogen wird, was zu einem unzureichenden Verschluss des gewünschten Gefäßes führen könnte.

Während dieses Protokoll als Schritt-für-Schritt-Anleitung für die globale viszerale Malperfusion gedacht ist, kann die Klemmstelle aufgrund der in Abbildung 1T-V dargestellten umfangreichen Gefäßvorbereitung und Mobilisierung entsprechend der spezifischen Forschungsfrage angepasst werden. Daher bietet sich auch bei der Wahl der Klemmstelle weiter distal entlang des Gefäßbaums eine gezielte Malperfusion von Organgruppen oder einzelnen Organen an, wie z.B. das selektive Einklemmen des Truncus coeliacus bei hepatischer Ischämie. Durch das Angebot einer detaillierten und reproduzierbaren Methodik ermöglicht dieses Protokoll einen standardisierten Ansatz für kontrollierte reversible arterielle Ischämie, venöse Stauung und kombinierte Malperfusion in Rattenmodellen, was zu einer verbesserten Datenzuverlässigkeit, Robustheit, Unabhängigkeit der Forscher und Vergleichbarkeit in zukünftigen Tierversuchen führt. Damit stellt es ein unverzichtbares Werkzeug im Arsenal der biomedizinischen Forschung dar und bietet Einblicke in das komplexe Zusammenspiel von Gefäßkompromittierung, Gewebeverletzung und therapeutischen Eingriffen. Durch die Nutzung der Vielseitigkeit dieses Versuchsaufbaus können Forscher die Geheimnisse rund um die vaskuläre Pathophysiologie erforschen, neue Grenzen in der translationalen Medizin erschließen und letztendlich die Patientenergebnisse im Bereich der Gefäßgesundheit verbessern.

Danksagungen

Die Autorinnen und Autoren danken dem Datenspeicherungsdienst, der vom Ministerium für Wissenschaft, Forschung und Kunst Baden-Württemberg (MWK) und der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG) durch die Zuwendungen INST 35/1314-1 FUGG und INST 35/1503-1 FUGG unterstützt SDS@hd. Darüber hinaus bedanken sich die Autoren für die Unterstützung durch das NCT (Nationales Centrum für Tumorerkrankungen in Heidelberg, Deutschland) durch sein strukturiertes Postdoc-Programm und das Programm Chirurgische Onkologie. Wir würdigen auch die vom Landtag Baden-Württemberg bewilligte Unterstützung aus Landesmitteln für den Innovationscampus Health + Life Science Allianz Heidelberg Mannheim aus dem strukturierten Postdoc-Programm für Alexander Studier-Fischer: Artificial Intelligence in Health (AIH) - Eine Kooperation von DKFZ, EMBL, Universität Heidelberg, Universitätsklinikum Heidelberg, Universitätsklinikum Mannheim, Zentralinstitut für Seelische Gesundheit, und das Max-Planck-Institut für medizinische Forschung. Des Weiteren bedanken wir uns für die Unterstützung durch das DKFZ Hector Krebsinstitut am Universitätsklinikum Mannheim. Für die Publikationsgebühr danken wir der Deutschen Forschungsgemeinschaft im Rahmen des Förderprogramms "Open Access Publikationskosten" sowie der Universität Heidelberg für eine finanzielle Unterstützung.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Atraumatische PräparationszangeAesculapFB395RDE BAKEY ATRAUMATA atraumatische Zange, gerade
stumpfe ÜberholklemmeAesculapBJ012RBABY-MIXTER Präparations- und Ligaturklemme, gebogen, 180 mm
KanüleBD (Beckton, Dickinson)301300BD Mikrolanze 3 Kanüle 20 G
Fixierstäbelegefest500343896Stimmgabeln als Y-förmige Befestigungsstäbe aus Metall
HeizkissenRoyal GardineerIP67Royal Gardineer Heizkissen Größe S, 20 Watt
Kunststoff-PerfusorrohrM. Schilling GmbHS702NC150Verbindungsrohr COEX 150 cm
Silikongefäß SchlaufenbinderSERAG WIESSNERSL26Silikongefäß Schlaufenbinder 2,5 mm rot
Spraque Dawley ratJanvier LabsRN-SD-MSpraque Dawley rat
StahlblechMaschinenbau Feld GmbHC010206Verzinktes Blech, 40 x 50 cm, Dicke 4,0 mm
Yasargil ClipAesculapFE795KYASARGIL Aneurysma Clip System
Phynox Temporary (Standard)
Clip Yasargil Clip ApplikatorAesculapFE558KYASARGIL Aneurysma Clip Applikator
Phynox (Standard)

Referenzen

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Viszerale MalperfusionRattenmodellhyperspektrale BildgebungAortenabklemmungHohlvenenabklemmungOrganreperfusionGewebeoxygenierung
Kontrollierte reversible viszerale arterielle Ischämie, venöse Stauung und kombinierte Malperfusion mittels Midline-Laparotomie bei Ratten
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