Effiziente Verarbeitung von follikulären Helferzellen und Funktionsanalyse durch hochdimensionale Durchflusszytometrie

Summary

Hier stellen wir ein Protokoll für die Entnahme und Verarbeitung von Mandelproben, die Phänotypisierung mittels hochdimensionaler spektraler Durchflusszytometrie und die Durchführung unüberwachter Analysen vor.

Abstract

Follikuläre T-Helferzellen (Tfh) sind eine Untergruppe der CD4⁺ T-Helferzellen, die beim Wechsel des B-Zell-Isotyps, der Bildung des Keimzentrums (GC), der somatischen Hypermutation und der Affinitätsreifung helfen und so dazu beitragen, adaptive humorale Immunantworten in sekundären lymphatischen Geweben während der Infektion, Autoimmunität und Impfung zu orchestrieren. Das Verständnis der Entwicklung und Funktion von Tfh-Zellen ist entscheidend für die Entwicklung wirksamer Impfstoffe und die Entwicklung gezielter Behandlungsstrategien für Krankheiten, an denen diese Population beteiligt ist. Menschliche Mandelzellen sind zugängliche lymphatische Organe der Schleimhaut. Sie bieten eine einzigartige Möglichkeit, verschiedene Immunpopulationen wie Tfh- und GC-Zellen zu profilieren, Zell-zu-Zell-Interaktionen zu untersuchen, dynamische zelluläre Funktionen zu bewerten und ihre Regulationsmechanismen auf Organebene aufzudecken. Darüber hinaus sind in vitro Kulturen von Mandelzellen einfach zu verarbeiten und ermöglichen die Beurteilung der Tfh-Zellbiologie unter verschiedenen Bedingungen. Hier stellen wir ein Protokoll für die Entnahme, Isolierung, Konservierung und Kultivierung menschlicher Mandelzellen vor. Wir beschreiben auch zwei optimierte spektrale Durchflusszytometrie-Panels, die für eine detaillierte Charakterisierung von Tfh-Zellen entwickelt wurden. Zuletzt demonstrieren wir am Beispiel einer Behandlung mit Phosphataseprotein-2A (PP2A)-Inhibitoren die Effizienz und Leistungsfähigkeit unüberwachter Analysen von hochdimensionalen Durchflusszytometrie-Daten, wodurch behandlungsinduzierte Unterschiede auf einer hochdimensionalen Skala effektiv aufgedeckt werden.

Introduction

Follikuläre T-Helferzellen (Tfh) sind eine eigenständige Untergruppe der CD4⁺-T-Helferzellen, die für die Bildung und Funktion von Keimzentren (GCs) und die Produktion von B-Zell-Antikörpern unerlässlich sind. Tfh-Zellen stammen von naiven CD4⁺ T-Zellen durch Wechselwirkungen mit antigenpräsentierenden Zellen und die Integration von intrinsischen und extrinsischen Faktoren, einschließlich der Signalgebung von T-Zell-Rezeptoren, kostimulatorischen Wechselwirkungen mit B-Zellen, Zytokinen und Chemokinen¹. Tfh-Zellen exprimieren CXCR5 und PD-1, die ihre Position innerhalb oder in der Nähe des GC bestimmen. BCL-6 ist der Master-Transkriptionsfaktor, der für die Entwicklung, Aufrechterhaltung und Funktion von Tfh entscheidend ist ^1,2. Tfh-Zellen sind entscheidend für die Zunahme humoraler Immunantworten, insbesondere bei Impfreaktionen und bei der Abwehr bakterieller und viraler Krankheitserreger. Abnorme Tfh-Zellreaktionen sind an verschiedenen Erkrankungen beteiligt, darunter Autoimmunerkrankungen, Immunschwäche und möglicherweise einige Formen von Krebs 3,4,5,6. Das Verständnis ihrer Funktion und Regulation ist daher wichtig für die Entwicklung wirksamer Impfstoff- und Therapiestrategien⁷.

Im Gegensatz zu anderen CD4⁺ T-Helferzellen wie Th1, Treg und Th17, für die in vitro Differenzierungssysteme gut etabliert sind⁸, sind Tfh-Zellen komplexer zu untersuchen, da ihre Entwicklung dynamische Zell-zu-Zell-Interaktionen und spezialisierte anatomische Strukturen beinhaltet⁷. Daher stützten sich Studien an Tfh-Zellen weitgehend auf die ex vivo-Phänotypisierung von humanen peripheren zirkulierenden Tfh-Zellen (cTfh) und In-vivo-Mausmodellen . Die Untersuchung der Regulation spezifischer Moleküle auf Tfh-Zellen ist daher eine Herausforderung, insbesondere für menschliche Tfh-Zellen⁹. Daher ist eine eingehende Ex-vivo-Studie von Tfh-Zellen, die aus lymphatischem Gewebe gewonnen werden, unerlässlich, um unser Verständnis von menschlichen Tfh-Zellen zu verbessern.

Mandeln beherbergen als sekundäre lymphatische Organe einzigartige Zellpopulationen, die im peripheren Blut nicht vorhanden sind, wie z. B. Prä-Tfh- (CXCR5^intPD-1^int CD4⁺) und GC-Tfh (CXCR5^hiPD-1^hi CD4⁺) Zellen, die beide maßgeblich an der Bildung von GCs beteiligt sind. Darüber hinaus gehören die Gaumenmandeln zu den am häufigsten entnommenen Geweben in Kinderoperationen und sind leicht zugänglich, was sie zu einer unschätzbaren menschlichen Gewebequelle für die Erforschung komplexer Immunmechanismen macht, an denen Tfh-Zellen beteiligt sind. Da sie sich in den oberen Atemwegen befinden, einem primären Ort für respiratorische Virusinfektionen, bieten die Mandeln ein vorteilhaftes Gewebe für die Untersuchung von Immunantworten auf solche Virusinfektionen. Zum Beispiel charakterisierte unser Labor zuvor Tfh-Zellen in Mandeln und Polypen von Kindern, die sich von COVID-19 erholt hatten, und verglich diese Gewebe mit denen von nicht infizierten Kontrollen¹⁰. Hier stellen wir Ihnen unser Protokoll für die Verarbeitung und Lagerung von Mandelzellen vor. Am Beispiel von mit PP2A-Inhibitoren behandelten Mandeln beschreiben wir, wie diese Zellen durch hochdimensionale spektrale Durchflusszytometrie charakterisiert und die Daten mit unüberwachter Analyse analysiert werden können.

Protocol

Der Ethikkodex des Weltärztebundes (Deklaration von Helsinki) wurde in dieser Studie in allen Humanforschungen befolgt. Menschliche Mandelproben wurden von Patienten mit adenotonsilärer Hypertrophie gewonnen, die schlafgestörte Atmungsstörungen oder obstruktive Schlafapnoe verursacht, die von der Abteilung für pädiatrische Hals-Nasen-Ohrenheilkunde des Children's National Hospital, Washington, DC, USA, stammen. Diese Studie erhielt die Genehmigung des Institutional Review Board (IRB) am Children's National Hospital (IRB-Protokollnummer 00009806). Die Einverständniserklärung wurde von den Eltern oder Erziehungsberechtigten aller eingeschriebenen Teilnehmer unterschrieben, und die Zustimmung der minderjährigen Teilnehmer ab 7 Jahren wurde eingeholt.

1. Entnahme von Mandeln beim Menschen sowie Isolierung und Lagerung von Einzelzellen

1. Isolierung von tonsillären Einzelzellen
   1. Entnahme von chirurgischen Proben
      1. Entnehmen Sie Mandeln von Patienten, die sich einer Tonsillektomie unterziehen, und sammeln Sie die frischen Gewebestücke im Operationssaal in einem 50-ml-Zentrifugenröhrchen, das mit 25-35 ml eiskaltem, sterilem Mandelmedium gefüllt ist: RPMI, ergänzt mit 5 % hitzeinaktiviertem fötalem Rinderserum (FBS), 0,05 mg/ml Gentamicin, 10 mM Glutamin und einer Antibiotika-Antimykotika-Mischung (100 Einheiten/ml Streptomycin, 100 Einheiten/ml Penicillin, und 0,25 μg/ml Amphotericin B).
         HINWEIS: Mandeln im oben genannten Medium können über Nacht bei 4 °C gelagert und am nächsten Tag verarbeitet werden. Ein minimaler Verlust der Zellviabilität wurde bei Lagerung über Nacht im Vergleich zur Verarbeitung am selben Tag festgestellt (Abbildung 1A). Mandeln können auch über Nacht auf Eis verschickt werden.
   2. Verarbeitung von Mandeln
      HINWEIS: Alle Medien, Puffer und chirurgischen Instrumente müssen steril sein, und die Mandelzellisolierung sollte auf Eis in einer Biosicherheitshaube durchgeführt werden.
      1. Legen Sie die Mandeln auf eine 60-mm-Zellkulturschale aus Kunststoff mit 5 ml gekühltem Mandelmedium. Arbeiten Sie auf Eis. Entfernen Sie mit einer sterilen Pinzette und Schere oder einem Skalpell vorsichtig sichtbare Blutgerinnsel, Fett und Bindegewebe (Abbildung 1B,C).
      2. Bringen Sie die Mandeln in eine neue 60-mm-Zellkulturschale mit 5 ml eiskaltem Mandelmedium. Die Mandelstücke in 3-5 mm große Stücke schneiden.
      3. Bereiten Sie eine neue 60-mm-Zellkulturschale mit 10 mL kaltem Mandelmedium vor und legen Sie ein 70-μm-Zellsieb in die Schale.
      4. Bewegen Sie die Mandelfragmente in das Sieb und zerschlagen Sie die Mandelfragmente mit dem Kolbenende einer sterilen 3-ml-Spritze durch das Sieb.
      5. Sammeln Sie das Medium, das Zellen enthält, außerhalb des Siebs in der Schale und geben Sie es in ein konisches 50-ml-Röhrchen.
      6. Geben Sie weitere 10 ml Mandelmedium in die Schale mit dem Sieb, zerdrücken Sie die Mandelfragmente mit dem Kolben und sammeln Sie das Medium in dem konischen Röhrchen. Bei großen Mandeln wiederholen Sie diesen Schritt noch 2-3x, bis nur noch Bindegewebsfragmente im Sieb übrig sind. Legen Sie das restliche Taschentuch und die benutzten Platten in einen Biohazard-Beutel und in den medizinischen Abfall.
      7. Füllen Sie das konische 50-ml-Röhrchen bis zum Rand mit Mandelmedium.
      8. Bei 400 × g 5 min bei 4 °C zentrifugieren.
         HINWEIS: Eine Verlängerung der Zentrifugation auf 20 min kann die Ausbeute erhöhen.
      9. Entfernen Sie den Überstand durch vorsichtiges Absaugen oder Pipettieren und resuspendieren Sie das Pellet in 5 ml Ammoniumchlorid-Kalium (ACK)-Lysingpuffer bei Raumtemperatur (RT), um rote Blutkörperchen zu lysieren. 5 Minuten bei RT inkubieren und dann 35 ml gekühltes PBS hinzufügen, um eine weitere Lyse zu verhindern. Bei 400 × g 5 min bei 4 °C zentrifugieren.
      10. Einmal mit 50 ml gekühltem PBS waschen und zentrifugieren. Resuspendieren Sie mit 10 mL PBS und Stammzellen durch ein 70 μm Kunststoffsieb. Zellen zählen.
2. Kryokonservierung von Tonsillenzellen
   1. Bereiten Sie Gefriermedium vor (90 % hitzeinaktiviertes FBS und 10 % Dimethylsulfoxid (DMSO)).
      HINWEIS: Dies kann bis zu 1 Monat bei 4 °C gelagert werden.
   2. Die Zellsuspension (Schritt 1.1.2.10) wird bei 400 × g 5 min lang bei 4 °C zentrifugiert. Den Überstand verwerfen und das Zellpellet mit Gefriermedium resuspendieren.
      HINWEIS: Wir empfehlen, die Zellen bei einer Dichte von 10 × 10⁶ bis 50 × 10⁶ Zellen/ml Gefriermedium¹¹ einzufrieren.
   3. Aliquot 0,5-1 ml der Zellsuspension in sterile Kryoröhrchen. Frieren Sie die Fläschchen in geschwindigkeitsgesteuerten Gefrierbehältern in einem -80 °C Gefrierschrank ein. Füllen Sie die Fläschchen innerhalb einer Woche in einen Lagertank mit flüssigem Stickstoff um, um sie langfristig zu konservieren.
3. Auftauen von gefrorenen Zellen
   HINWEIS: Im Folgenden wird ein Ansatz des Auftauens mit sequenzieller Verdünnung beschrieben, auf der in einem Probenvorbereitungsprotokoll für die Einzelzell-RNA-Sequenzierung verwiesen wird¹². Andere Auftaumethoden können ebenfalls funktionieren, aber wir fanden bei diesem Ansatz eine höhere Zellviabilität im Vergleich zum sofortigen Einsetzen der Zellen in einen warmen Auftaupuffer (Abbildung 1D). Der Waschpuffer kann im Voraus vorbereitet werden. Der Auftaupuffer besteht aus Waschpuffer plus 0,1 mg/ml DNase I (DNase I sollte kurz vor Beginn des Auftauens hinzugefügt werden). Eine Erhöhung der Zentrifugationszeit auf 1 min/ml (für 15-ml-Röhrchen) ist optional, um die Zellausbeute zu erhöhen.
   1. Ein Wasserbad auf 37 °C erwärmen. Den Auftau- und Waschpuffer im 37 °C warmen Wasserbad vorwärmen.
      HINWEIS: Alle Zellwäschen werden bei RT durchgeführt.
   2. Tauen Sie die Kryofläschchen sofort nach der Entnahme aus der Lagerung 2-3 min im 37 °C warmen Wasserbad auf. Vermeiden Sie es, die Durchstechflasche vollständig in das Wasserbad einzutauchen. Nehmen Sie das Fläschchen aus dem Wasserbad, während ein kleiner Eiskristall sichtbar bleibt.
   3. Übertragen Sie aufgetaute Zellen vorsichtig in ein konisches 15-ml-Röhrchen mit einer Pipettenspitze mit breiter Öffnung in einer Biosicherheitshaube. Spülen Sie das Kryoröhrchen mit 0,5 ml vorgewärmtem Auftaupuffer und geben Sie das Spülgefäß Tropfen für Tropfen (1 Tropfen alle 5 s) in das konische 15-ml-Röhrchen, indem Sie das Röhrchen zum Mischen vorsichtig schütteln.
   4. Verdünnen Sie die Zellen nacheinander im konischen 15-ml-Röhrchen, indem Sie schrittweise 2 ml und dann 4 ml Medium mit einer Wartezeit von ~1 Minute zwischen den Zugaben hinzufügen. Geben Sie alle 3-5 s Medium in einer Menge von 1 ml in das Röhrchen und schwenken Sie es vorsichtig, um es zu mischen.
   5. Zentrifugieren Sie bei 400 × g für 5 min bei RT.
   6. Entfernen Sie den Überstand; das Zellpellet in 300 μl Auftaupuffer resuspendieren; und 5 Minuten bei RT inkubieren.
   7. Fügen Sie 10 mL Waschpuffer (keine DNase I) hinzu. Erneut bei 400 × g für 5 min bei RT zentrifugieren.
   8. Noch einmal waschen: Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet in 10 mL Waschpuffer. Bei 400 × g 5 min bei RT zentrifugieren.
   9. Filtern Sie die Zellen durch ein 70 μm Sieb. Nochmals 5 min bei 400 × g bei RT zentrifugieren und die Zellen zählen. Resuspendieren Sie es in einem Nährmedium.

2. Messung der Expression von intrazellulären Zytokinen und Transkriptionsfaktoren nach ex vivo Behandlung

HINWEIS: Hier beschreiben wir unsere Methode zur phänotypischen Charakterisierung von tonsillären Tfh-Zellen unter Verwendung von zwei hochdimensionalen Durchflusszytometrie-Panels. Angesichts der Tatsache, dass die PP2A-Aktivität für eine optimale BCL-6-Proteinexpression und die Tfh-Differenzierung essentiell ist⁴, veranschaulichen wir unsere Bewertung der Erhaltung und Funktionalität von Tfh-Zellen durch die Untersuchung von Mandelzellen, die mit dem PP2A-Inhibitor Cantharidin (CAN) behandelt wurden.

1. Durchflusszytometrische Färbung
   1. Intrazelluläre Zytokin-Färbung
      HINWEIS: Die Inkubationen werden im Dunkeln durchgeführt. Reagenzien, Antikörper und ihre jeweiligen Mengen pro Well, die in beiden Panels verwendet werden, sind in der Materialtabelle aufgeführt. Um die T-Zell-Degranulation zu beurteilen, wird der Anti-CD107a-Antikörper während des Behandlungsschritts zugegeben, um falsch-negative Ergebnisse, die durch seine Internalisierung verursacht werden, zu minimieren¹³.
      1. Platte 2 × 10 6-Tonsillen-Zellen mit 200 μl Kulturmedium (1 × 10⁷ Zellen/ml) in einer 96-Well-U-Bodenplattenvertiefung mit den folgenden Mengen an PP2A-Inhibitor-CAN für 16 h: Vehikelkontrolle, 3 μM und 6 μM.
         HINWEIS: CAN wurde bei 0,1 M mit 1 % DMSO rekonstituiert.
      2. Monensin (0,7 μl/ml), Brefeldin (1:1.000), Phorbolmyristatacetat (50 ng/ml, PMA), Ionomycin (1.000 ng/ml) und 2 μl Anti-CD107a für 2,5 Stunden in einen 5 % CO_{2 -} Inkubator bei 37 ^°C in jede Vertiefung geben. Das Gesamtkulturvolumen beträgt 200 μl pro Vertiefung.
      3. Zentrifugieren Sie färbende Antikörper bei ~16.000 × g für 3-5 min bei 4 °C, um Antikörperaggregate zu entfernen. Bereiten Sie die Oberflächenantikörpermischung für Schritt 2.1.1.8 vor, die alle Oberflächenantikörper mit Ausnahme der Chemokinrezeptoren, Brilliant Stain Buffer Plus und FACS-Puffer enthält (Volumen von jedem in der Materialtabelle angegeben, insgesamt 112 μl Mischung pro Reaktion).
      4. Nach 2,5 h in Kultur waschen Sie die Zellen 2x mit 200 μl eiskaltem PBS, indem Sie bei 400 × g für 2 min bei 4 °C zentrifugieren. Entsorgen Sie den Überstand zwischen den Wäschen, indem Sie die Platte schnell umdrehen. Führen Sie die Färbung in derselben Platte durch.
      5. Inkubieren Sie die Zellen in 100 μl/Vertiefung mit 1:800 verdünntem LIVE/DEAD Blue-Farbstoff in PBS für 15 min bei RT. 2x mit 200 μl FACS-Puffer waschen.
      6. Resuspendieren Sie die Zellen mit dem True Stain Monocyte Blocker (5 μl Monozytenblocker + 45 μl FACS-Puffer pro Well) für 5 Minuten bei RT.
      7. Fügen Sie nacheinander Chemokinrezeptor-Antikörper direkt zur Färbereaktion hinzu (zuerst Anti-CXCR3 und Anti-CCR7 für jeweils 10 Minuten, gefolgt von einer Mischung aus Anti-CXCR5 und Anti-CCR6 zusammen mit 10 μl Brilliant Stain Buffer Plus für 5 Minuten bei RT). Nach jeder Zugabe gut mischen, indem Sie mehrmals auf und ab pipettieren. In der Materialtabelle finden Sie die Antikörpervolumen.
      8. Geben Sie die in Schritt 2.1.1.3 hergestellte Oberflächenantikörpermischung direkt zur Färbereaktion und inkubieren Sie sie 30 Minuten lang bei RT. Das Gesamtfärbevolumen pro Reaktion beträgt 180 μl: 50 μl Monozytenblocker in Puffer (siehe Schritt 2.1.1.6) + 18 μl Anti-Chemokinrezeptor-Antikörper (siehe Schritt 2.1.1.7) + 112 μl Oberflächen-Antikörpermix (siehe Schritt 2.1.1.3).
      9. 2x mit 200 μl kaltem FACS-Puffer waschen.
      10. Resuspendieren Sie die Zellen und inkubieren Sie sie mit 80 μl/Vertiefung Fixierungspuffer auf Paraformaldehyd-Basis bei RT für 20 Minuten.
      11. Geben Sie 160 μl 1x Permeabilisierungspuffer in jede Vertiefung, die bereits Fixierungspuffer enthält. Die Platte bei 400 × g für 2 min bei RT zentrifugieren und 1x mit 200 μl Permeabilisierungspuffer waschen.
      12. Bereiten Sie eine intrazelluläre Zytokin-Antikörpermischung (ICS) vor, die Anti-Zytokin-Antikörper, Brilliant Stain Buffer Plus und Permeabilisierungspuffer (Gesamtvolumen 50 μl/Well, Materialtabelle) enthält. Inkubieren Sie die Zellen mit diesem intrazellulären Zytokin-Antikörper-Mix bei RT für 30 min.
      13. 2x mit 200 μl/Well Permeabilisierungspuffer waschen. Resuspendieren Sie mit 200 μl/Vertiefung FACS-Puffer.
      14. Lagern Sie die gefärbten Zellen bei 4 °C im Dunkeln und erfassen Sie die Daten innerhalb von 24 Stunden auf einem spektralen Durchflusszytometer, um den Verlust der Färbeintensität zu minimieren¹⁴.
   2. Färbung von nukleären Transkriptionsfaktoren
      1. Kultivieren Sie die Zellen mit CAN wie in Schritt 2.1.1.1 (ohne Stimulation der Zellen).
      2. Geben Sie einen Anti-Human-CD40-Antikörper (0,5 μg/ml) in das Kulturmedium und kultivieren Sie es 15 Minuten lang mit den Zellen, bevor Sie mit der Färbung beginnen. Wenn Zellen stimuliert werden, fügen Sie diesen Antikörper 15 Minuten vor Beginn der Stimulation hinzu, um die Internalisierung von CD40L nach der Aktivierung zu verhindern^15,16.
      3. Zentrifugieren Sie die Färbeantikörper und bereiten Sie die Oberflächenantikörpermischung ähnlich wie in Schritt 2.1.1.3 vor: Oberflächenantikörper in der Materialtabelle, 10 μl/Vertiefung Brilliant Stain Buffer Plus und 54,1 μl/Vertiefung FACS-Puffer.
         HINWEIS: Das Gesamtfärbevolumen pro Vertiefung beträgt 180 μl: 50 μl Monozytenblocker in Puffer + 13 μl Chemokinrezeptor-Antikörper + 117 μl Oberflächen-Antikörper-Mix.
      4. Waschen Sie die Zellen und führen Sie die LIVE/DEAD Blue-Färbung und Oberflächenfärbung und -waschung wie in den Schritten 2.1.1.5-2.1.1.8 durch.
         HINWEIS: Der Anti-CXCR3-Antikörper ist nicht in diesem Panel enthalten.
      5. Fixieren Sie die Zellen mit 80 μl nukleärem Transkriptionsfaktor-Fixierungspuffer aus dem FoxP3/Transkriptionsfaktor-Färbepuffer-Set. 30 Minuten bei RT inkubieren.
      6. Waschen Sie die Zellen mit Permeabilisierungspuffer wie in Schritt 2.1.1.11.
      7. Bereiten Sie die Antikörpermischung für den intrazellulären Transkriptionsfaktor (TF) vor, die die in der Materialtabelle aufgeführten Antikörper gegen den Transkriptionsfaktor, 10 μl Brilliant Stain Buffer Plus und 16 μl Permeabilisierungspuffer (Gesamtvolumen 40 μl/Well) enthält. Inkubieren Sie die Zellen mit dieser Mischung für 1 h bei 4 °C.
      8. Waschen und Erfassen auf einem Spektralzytometer wie in den Schritten 2.1.1.13-2.1.1.14.

3. Unüberwachte Analyse von hochdimensionalen Durchflusszytometrie-Daten

HINWEIS: Software, Pakete und deren Versionen, die für die Analyse verwendet werden, sind in der Materialtabelle aufgeführt. Screenshots aus den Schritten 3.2 bis 3.4 befinden sich in der Zusatzdatei 1. Beispielskripte aus den Schritten 3.5 bis 3.7 befinden sich inder Ergänzungsdatei 2 und der Zusatzdatei 3, die Schritte 3.8 bis 3.9 in der Zusatzdatei 4 und der Zusatzdatei 5. ICS-Rohdateien und TF-Rohdateien für die Skripts werden in der Zusatzdatei 6 bzw. der Zusatzdatei 7 bereitgestellt.

1. Öffnen Sie den Arbeitsbereich der Durchflusszytometrie-Analysesoftware, in dem die ".fcs"-Dateien gespeichert sind, und schließen Sie das Gating ab, wie in Abbildung 1E gezeigt.
2. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf den Zielknoten (in diesem Fall CD4⁺ T-Zellen). Wählen Sie Select Equivalent Nodes (Äquivalente Knoten auswählen) aus.
3. Klicken Sie erneut mit der rechten Maustaste auf den Zielknoten. Wählen Sie Populationen exportieren/verketten aus.
4. Warten Sie, bis das Fenster Populationen: Exportieren oder Verketten geöffnet wird, wählen Sie CSV-Kanalwerte und dann das Ziel für die exportierten Dateien aus. Schließen Sie alle Zellen in das Feld "Ereignisse einschließen" ein, und wählen Sie im Feld "Parameter" die Option "Alle kompensierten Parameter" aus. Erweitern Sie die erweiterten Optionen, geben Sie ein Präfix ein, um die Dateien umzubenennen, und klicken Sie auf Exportieren, um die Dateien in den Zielordner zu exportieren (exportieren Sie eine .csv Datei für jedes Beispiel).
5. Lesen Sie die exportierten "*.csv"-Dateien mit R (eine für jedes Sample). Weisen Sie jeder Zelle eine Beispiel-ID zu und kombinieren Sie Zellen aus allen Stichproben in einem einzigen Datenrahmen.
6. Fügen Sie Metadaten (zusätzliche Informationen zu Beispielen) zum Datenrahmen hinzu oder führen Sie sie zusammen.
7. Führen Sie für die folgende Analyse ein zufälliges Downsampling von gleich vielen Zellen pro Probe durch. Dieser Schritt ist optional.
   HINWEIS: In diesem Beispiel wurden 8.000 CD4⁺ T-Zellen aus der Gesamtzahl der CD4⁺ T-Zellen jeder Bedingung heruntergerechnet, was mindestens 1/7 der Gesamtzahl der CD4⁺ T-Zellen entspricht.
8. Seurat-Objekt erstellen: Interpretieren Sie die Kanalwerte für Antikörpermarker als Genexpressionsniveaus beim Erstellen eines Seurat-Objekts.
   1. Erstellen Sie ein Seurat-Objekt mit dem Datenrahmen, der aus Schritt 3.6 generiert wurde. Überspringen Sie den Schritt NormalizeData und speichern Sie sie direkt als "Daten"-Assay.
   2. Wählen Sie die Oberflächenmarkierungen aus der Gruppe Fluss aus, die als VariableFeatures in der nicht überwachten Cluster-Bildung verwendet werden sollen.
   3. Führen Sie ScaleData, RunPCA, FindNeighbors, FindClusters, RunUMAP als Standardpipeline aus, die von Seurat eingeführt wurde, mit Ausnahme des NormalizeData-Schritts ¹⁷.
   4. Passen Sie den Auflösungsparameter im Schritt "FindClusters" an, um die Anzahl der Cluster zu ändern und sicherzustellen, dass sie den zugrunde liegenden biologischen Kontext genauer widerspiegeln.
9. Verwenden Sie Visualisierungstools wie DimPlot und FeaturePlot , die mit dem Seurat-Paket kompatibel sind. Berechnen Sie zum Vergleichen von Gruppen, die mehrere Stichproben pro Gruppe enthalten, den Prozentsatz jedes Clusters pro Proband, und führen Sie statistische Vergleiche durch. Verwenden Sie anschließend mathematische Modelle für anspruchsvollere statistische Analysen¹⁰.

Results

Um die allgemeine Lebensfähigkeit der Zellen zu vergleichen, haben wir die Mandeln in drei ähnliche Stücke geschnitten und sie mit unserem Protokoll unter drei Bedingungen verarbeitet: (1) Verarbeitung am selben Tag, (2) Lagerung über Nacht bei 4 °C und (3) Lagerung über Nacht auf Eis. Die Lebensfähigkeit dieser drei Erkrankungen war ziemlich ähnlich, ohne dass es einen signifikanten Unterschied gab (Abbildung 1A). Wir untersuchten auch die Auswirkungen des Auftauprozesses auf die Lebensfähi...

Discussion

Im Gegensatz zu früheren Berichten, dass frische Mandeln innerhalb von 3 Stunden nach der Operation verarbeitet werden sollten¹⁹, stellten wir fest, dass frische Mandelproben ihre Lebensfähigkeit behalten konnten, wenn sie bei 4 °C gelagert und innerhalb von 24 Stunden verarbeitet wurden. Um die Zellviabilität von Mandelgewebe nach dem Auftauen aus der Lagerung von flüssigem Stickstoff zu optimieren, haben wir die tropfenweise Auftaumethode übernommen, die in der ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Maschinen und Instrumente
3 mL Kunststoffspritze	BD	309657
96 Well U Bodenplatte	Thermo Scientific	163320
1,2 mL Kryogene Fläschchen	Corning	430487
Zellsieb 70 & micro; m Nylon	Falcon	352350
Zellkulturschale (60 mm)	VWR	10062-890
Zentrifuge	Thermo Scientific	Sorvall Legend XTR
Benchmark B2000-2 MyBath 2L Digital Water Bath	Benchmark	B2000-2
Feine Schere - Scharf	F.S.T	14060-11
Instrumentenkoffer aus Kunststoff	F.S.T	20830-05
Spektrales Durchflusszytometer, Aurora	Cytek		5L 16UV-16V-14B-10YG-8R
Zange mit Standardmuster	F.S.T	11000-13
Pinzette mit Standardmuster	F.S.T	11000-20
Vi-cell Blu Zellviabilitätsanalysator	Beckman Coulter	C19201
Reagenzien
0,5 M EDTA pH 8,0	Qualität Biologie	351-027-101
2-Mercaptoethanol	Gibco	21985-023
ACK Lysingpuffer	Gibco	A10492-01
Antibiotisch-Antimykotisches Gemisch (Penicillin-Streptomycin-Amphotericin B Suspension, 100x)	Gibco	15240-062
Brilliant Stain Buffer Plus (RUO)	BD	566385
Cantharidin	Sigma	C7632-25MG
Cytofix Fixationspuffer	BD	554655
Dimethylsulphoxid (DMSO)	Sigma	D8418-250ml
DNAase I	Roche	10104159001
Fetal Rinderserum (FBS)	VWR	97068-085
FoxP3/Transkriptionsfaktor-Färbepuffer-Set	eBioscience	00-5523-00
Gentamicin (50 mg/ml)	Gibco	15750-060
Golgiplug	BD	555029
GolgiSTOP	BD	554724
HEPES (1 M)	Gibco	15630-080
Ionomycin	Sigma	I0634-1mg
L-Glutamin (200 mM)	Gibco	25030-081
MEM NEAA (100x)	Gibco	11140-050
Paraformaldehyd 16%ige Lösung, EM-Qualität (PFA)	Elektronenmikroskopie   Science	15710	Verdünnung mit PBS
PBS, pH 7,4	Gibco	10010072
Penicillin-Streptomycin (10.000 U/ml)	Gibco	15140-122
Phorbol 12-Myristat 13-Acetat (PMA)	Sigma	P8139-1mg
Gefrierbehälter	Millipore	Corning CoolCell FTS30
RPMI (+L-Glutamin)	Gibco	11875-085
Natriumpyruvat (100 mM)	Gibco	11360-070
Monozytenblocker	BioLegend	426103
Buffers
Kulturmedium			10 % hitzeinaktiviertes FBS (VWR), 2 nM Glutamin, 0,055 mM 2-Mercaptoethanol, 1 % Penicillin/ Streptomycin, 1 mM Natriumpyruvat, 10 mM HEPES, 1 % nicht-essentielle Aminosäuren in RPMI (+L-Glutamin)
FACS-Puffer			2 mM EDTA und 2 % hitzeinaktiviertes FBS in PBS
Gefriermedium			90 % hitzeinaktiviertes FBS und 10 % DMSO-Auftaupuffer
			Waschpuffer + 0,1 mg/ml, DNaseI
Tonsillenmedium			RPMI ergänzt mit 5 % hitzeinaktiviertem FBS, 10 mM Glutamin, 0,05 mg/ml Gentamicin, 1 % Antibiotikum-Antimykotika-Mix   (Penicillin, Streptomycin und Amphotericin B).
Waschpuffer			RPMI (+L-Glutamin) ergänzt mit 10%  hitzeinaktiviertem FBS und 10 mM HEPES
Antikörpern & anderen Regenten für das Zytokin-Panel&
Biotin Anti-Human-CD107a (LAMP-1) Antikörper	BioLegend	328604	2 μ L in 200 μ L vollständiges Kulturmedium pro Well. Dieser Antikörper wurde während der PMA/Ionomycin-Stimulation mit Zellen zugesetzt.
Lebende Tot-Flecken	100 μ L-Mix pro Vertiefung
LIVE DEAD Blue	Thermo	L23105	1 : 800, 0,125 μ L in 100 μ L PBS pro Bohrung.
Monozytenblock	50 μ L Mix pro Well
Monozytenblocker Puffer	BioLegend	426103	5 μ L True Stain Monozytenblocker und 45 μ; L FACS-Puffer pro Well
Oberflächen-Antikörper für Zytokin-PanelChemokin-Rezeptoren
mix			μ L/gut
Anti-Mensch CCR6-BV711	BioLegend		353436 1
Anti-Mensch CCR7-BV421	BioLegend	353208	1
Anti-Mensch CXCR3-PE-Cy5	BD	551128	5
Anti-Mensch CXCR5-BV750	BD	747111	1
Brilliant Stain Buffer Plus (RUO)	BD	566385	10
nbsp;	18 μ L-Mix pro Vertiefung für Chemokinrezeptoren; Den Zellen mit dem Monozyten-Blockpuffer
Anderer Oberflächen-Antikörpermix			μ L/gut
Anti-Mensch CD103-BUV661	BD	749993	2.5
Anti-Mensch CD14-Spark Blue 550	BioLegend	367148	2.5
Anti-Mensch CD19-Spark NIR 685	BioLegend	302270	2.5
Anti-Mensch CD25-BB515	BD	564467	10
Anti-Mensch CD27- Super Bright 436	Thermo	62-0279-42	5
Anti-Mensch CD3-BV510	BioLegend	344828	2.5
Anti-Mensch CD38 APC-Fire810	BioLegend	303550	1
Anti-Mensch CD4 CF YG584	Cytek	R7-20041	2.5
Anti-Mensch CD45RA-BUV395	BD	740315	0.6
Anti-Mensch CD56-BUV737	BD	612766	3.5
Anti-Mensch CD57-FITC	BioLegend	359604	1.2
Anti-Mensch CD69-BUV563	BD	748764	1
Anti-Mensch CD8-BUV805	BD	612889	1.2
Anti-Mensch FAS-BB700	BD	566542	0.6
Anti-Mensch HLA-DR APC-Fire 750	BioLegend	307658	2
Anti-Human-PD1-BV785	BioLegend	329929	1.2
Anti-Human-CD45-PerCP	Thermo	MHCD4531	1.2
Brilliant Stain Buffer Plus (RUO)	BD	566385	10
FACS Puffer			61
			112 μ L-Mischung pro Vertiefung für andere Oberflächenantikörper; Direkt zum Monozytenblockpuffer (50 μ L) und Chemokinrezeptor-Mix (18 μ L, 50+18+112 = 180 μ L insgesamt pro Well)
Intrazelluäre Zytokin-Antikörper für Zytokin-Panel			μ L/gut
Anti-Mensch Granzyme B-PE	BD		1
Anti-Mensch IL10-PE-Dazzle 594	BioLegend	506812	1
Anti-Mensch IL17A-BV605	BioLegend	512326	1
Anti-Mensch IL2-BV650	BioLegend	500334	3
Anti-Mensch IL21-Alexa Fluor 647	BD	560493	10
Anti-Mensch IL4-PerCP Cy5.5	BD	561234	1
Anti-Human-Perforin-APC	BioLegend	353312	2.5
Anti-Human-TNFa-PE-Cy7	BioLegend	502930	0.1
Anti-IFNγ-Pacific	Blue BioLegend	502522	1
SAv-BUV615	BD	613013	0.25
Brilliant Stain Buffer Plus (RUO)	BD	566385	10
1x Permeabilisierungs-Puffer	eBioscience	00-5523-00	19.15
	(50 μ L-Mix pro Vertiefung)
Antikörper & andere Regenten für Transkriptionsfaktor-Panel
CD40 Antikörper, anti-human	Miltenyi Biotec	130-094-133	0,5 μ g/ml Nährmedium für die Arbeitskonzentration
Lebendtotfärbung	100 μ L-Mix pro Vertiefung
LIVE DEAD Blue	Thermo	L23105	1 : 800, 0,125 μ L in 100 μ L PBS pro Bohrung.
Monozytenblocker-Puffer	BioLegend	426103	5 μ L True Stain Monozytenblocker und 45 μ; L FACS-Puffer pro Well
Oberflächen-Antikörper für Transkriptionsfaktor-Panel
Chemokin-Rezeptoren-Mix			μ L/gut
Anti-Human-Produkt CCR6-BV711	BioLegend	353436	1
Anti-Human-Produkt CCR7-BV421	BioLegend	353208	1
Anti-Human-Produkt CXCR5-BV750	BD	747111	1
Brilliant Stain Buffer Plus (RUO)	BD	566385	10
nbsp;	13 μ L-Mix pro Well
Anderer Oberflächen-Antikörper-Mix			μ L/gut
Anti-Mensch 4-1BB-PE-CY7	BioLegend	309818	2.5
Anti-Mensch CD14-Spark Blue 550	BioLegend	367148	2.5
Anti-Mensch CD19-Spark NIR 685	BioLegend	302270	2.5
Anti-Mensch CD200-PerCP-eFluor 710	ThermoFisher	46-9200-42	2.5
Anti-Mensch CD25-PE-CY5	BioLegend	302608	5
Anti-Mensch CD3-BV510	BioLegend	344828	2.5
Anti-Mensch CD38-APC-Fire810	BioLegend	303550	1
Anti-Mensch CD4-Pacific Blue	BioLegend	317423	1
Anti-Mensch CD40L-PE	BD		15
Anti-Mensch CD45RA-BUV395	BD	740315	0,6
Anti-Mensch CD56-BUV737	BD	612766	3.5
Anti-Mensch CD69-BUV650	BioLegend	310934	2.5
Anti-Mensch CD8-BUV805	BD	612889	1.2
Anti-Mensch HLA-DR APC-Fire 750	BioLegend	307658	2
Anti-Mensch ICOS-BUV563	BD		741421 1.2
Anti-Mensch OX40-APC	BioLegend	350008	5
Anti-Human-PD1-BV785	BioLegend	329929	1.2
Anti-Human-CD45-PerCP	Thermo	MHCD4531	1.2
Brilliant Stain Buffer Plus (RUO)	BD	566385	10
FACS Buffer			54.1
			117  μ L-Mischung pro Vertiefung für andere Oberflächenantikörper; Direkt zum Monozytenblock hinzufügen  Puffer (50 μ L) und Chemokinrezeptor-Mix (13 μ L, 50+13+117 = 180 μ L insgesamt pro Well)
Transkriptionsfaktor-Antikörper für Transkriptionsfaktor-Panel	μ L/gut
Anti-Mensch T-bet-BV605	BioLegend	644817	4
Anti-Mensch Bcl6-PE-CF594	BD	562401	4
Anti-Mensch FoxP3-Alexa Fluor 488	BD	560887	1.6
Anti-Mensch GATA3-BB700	BD	566642	2
Anti-Mensch Ki67-Alexa Fluor 700	BD	561277	0.4
Anti-Mensch Rorgt-Alexa Fluor 647	BD	563620	2
Brilliant Stain Buffer Plus (RUO)	BD	566385	10
1 x Permeabilisierungspuffer	eBioscience	00-5523-00	16
			40 μ L Mix pro well
Software und Pakete für unüberwachte Analysen
	Software/package<	strong>Version	Source
>1	data.table	1.16.2	Das umfassende R-Archiv-Netzwerk
2	FlowJO	10.9.0	Becton, Dickinson and Company
3	pheatmap	1.0.12	Das Comprehensive R Archive Network
4	R	4.3.2	Das Comprehensive R Archive Network
5	readxl	1.4.3	Das Comprehensive R Archive Network
6	Rstudio	2023.12.1+402	Posit PBC
7	Seurat	5.1.0	Das Comprehensive R Archive Network
8	SeuratData	0.2.2.9001	Das Comprehensive R Archive Network
9	SpectroFlo	3.0	Cytek
10	tidyverse	2.0.0	Das Comprehensive R Archive Network
11	viridis	0.6.5	Das Comprehensive R Archive Network