Effiziente Verarbeitung von follikulären Helferzellen und Funktionsanalyse durch hochdimensionale Durchflusszytometrie

Summary

Hier stellen wir ein Protokoll für die Entnahme und Verarbeitung von Mandelproben, die Phänotypisierung mittels hochdimensionaler spektraler Durchflusszytometrie und die Durchführung unüberwachter Analysen vor.

Abstract

Follikuläre T-Helferzellen (Tfh) sind eine Untergruppe der CD4⁺ T-Helferzellen, die beim Wechsel des B-Zell-Isotyps, der Bildung des Keimzentrums (GC), der somatischen Hypermutation und der Affinitätsreifung helfen und so dazu beitragen, adaptive humorale Immunantworten in sekundären lymphatischen Geweben während der Infektion, Autoimmunität und Impfung zu orchestrieren. Das Verständnis der Entwicklung und Funktion von Tfh-Zellen ist entscheidend für die Entwicklung wirksamer Impfstoffe und die Entwicklung gezielter Behandlungsstrategien für Krankheiten, an denen diese Population beteiligt ist. Menschliche Mandelzellen sind zugängliche lymphatische Organe der Schleimhaut. Sie bieten eine einzigartige Möglichkeit, verschiedene Immunpopulationen wie Tfh- und GC-Zellen zu profilieren, Zell-zu-Zell-Interaktionen zu untersuchen, dynamische zelluläre Funktionen zu bewerten und ihre Regulationsmechanismen auf Organebene aufzudecken. Darüber hinaus sind in vitro Kulturen von Mandelzellen einfach zu verarbeiten und ermöglichen die Beurteilung der Tfh-Zellbiologie unter verschiedenen Bedingungen. Hier stellen wir ein Protokoll für die Entnahme, Isolierung, Konservierung und Kultivierung menschlicher Mandelzellen vor. Wir beschreiben auch zwei optimierte spektrale Durchflusszytometrie-Panels, die für eine detaillierte Charakterisierung von Tfh-Zellen entwickelt wurden. Zuletzt demonstrieren wir am Beispiel einer Behandlung mit Phosphataseprotein-2A (PP2A)-Inhibitoren die Effizienz und Leistungsfähigkeit unüberwachter Analysen von hochdimensionalen Durchflusszytometrie-Daten, wodurch behandlungsinduzierte Unterschiede auf einer hochdimensionalen Skala effektiv aufgedeckt werden.

Introduction

Follikuläre T-Helferzellen (Tfh) sind eine eigenständige Untergruppe der CD4⁺-T-Helferzellen, die für die Bildung und Funktion von Keimzentren (GCs) und die Produktion von B-Zell-Antikörpern unerlässlich sind. Tfh-Zellen stammen von naiven CD4⁺ T-Zellen durch Wechselwirkungen mit antigenpräsentierenden Zellen und die Integration von intrinsischen und extrinsischen Faktoren, einschließlich der Signalgebung von T-Zell-Rezeptoren, kostimulatorischen Wechselwirkungen mit B-Zellen, Zytokinen und Chemokinen¹. Tfh-Zellen exprimieren CXCR5 und PD-1, die ihre Position innerhalb oder in der Nähe des....

Protocol

Der Ethikkodex des Weltärztebundes (Deklaration von Helsinki) wurde in dieser Studie in allen Humanforschungen befolgt. Menschliche Mandelproben wurden von Patienten mit adenotonsilärer Hypertrophie gewonnen, die schlafgestörte Atmungsstörungen oder obstruktive Schlafapnoe verursacht, die von der Abteilung für pädiatrische Hals-Nasen-Ohrenheilkunde des Children's National Hospital, Washington, DC, USA, stammen. Diese Studie erhielt die Genehmigung des Institutional Review Board (IRB) am Children's National Hospital (IRB-Protokollnummer 00009806). Die Einverständniserklärung wurde von den Eltern oder Erziehungsberechtigten aller einges....

Results

Um die allgemeine Lebensfähigkeit der Zellen zu vergleichen, haben wir die Mandeln in drei ähnliche Stücke geschnitten und sie mit unserem Protokoll unter drei Bedingungen verarbeitet: (1) Verarbeitung am selben Tag, (2) Lagerung über Nacht bei 4 °C und (3) Lagerung über Nacht auf Eis. Die Lebensfähigkeit dieser drei Erkrankungen war ziemlich ähnlich, ohne dass es einen signifikanten Unterschied gab (Abbildung 1A). Wir untersuchten auch die Auswirkungen des Auftauprozesses auf die Lebensfähi.......

Discussion

Im Gegensatz zu früheren Berichten, dass frische Mandeln innerhalb von 3 Stunden nach der Operation verarbeitet werden sollten¹⁹, stellten wir fest, dass frische Mandelproben ihre Lebensfähigkeit behalten konnten, wenn sie bei 4 °C gelagert und innerhalb von 24 Stunden verarbeitet wurden. Um die Zellviabilität von Mandelgewebe nach dem Auftauen aus der Lagerung von flüssigem Stickstoff zu optimieren, haben wir die tropfenweise Auftaumethode übernommen, die in der .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Maschinen und Instrumente
3 mL Kunststoffspritze	BD	309657
96 Well U Bodenplatte	Thermo Scientific	163320
1,2 mL Kryogene Fläschchen	Corning	430487
Zellsieb 70 & micro; m Nylon	Falcon	352350
Zellkulturschale (60 mm)	VWR	10062-890
Zentrifuge	Thermo Scientific	Sorvall Legend XTR
Benchmark B2000-2 MyBath 2L Digital Water Bath	Benchmark	B2000-2
Feine Schere - Scharf	F.S.T	14060-11
Instrumentenkoffer aus Kunststoff	F.S.T	20830-05
Spektrales Durchflusszytometer, Aurora	Cytek		5L 16UV-16V-14B-10YG-8R
Zange mit Standardmuster	F.S.T	11000-13
Pinzette mit Standardmuster	F.S.T	11000-20
Vi-cell Blu Zellviabilitätsanalysator	Beckman Coulter	C19201
Reagenzien
0,5 M EDTA pH 8,0	Qualität Biologie	351-027-101
2-Mercaptoethanol	Gibco	21985-023
ACK Lysingpuffer	Gibco	A10492-01
Antibiotisch-Antimykotisches Gemisch (Penicillin-Streptomycin-Amphotericin B Suspension, 100x)	Gibco	15240-062
Brilliant Stain Buffer Plus (RUO)	BD	566385
Cantharidin	Sigma	C7632-25MG
Cytofix Fixationspuffer	BD	554655
Dimethylsulphoxid (DMSO)	Sigma	D8418-250ml
DNAase I	Roche	10104159001
Fetal Rinderserum (FBS)	VWR	97068-085
FoxP3/Transkriptionsfaktor-Färbepuffer-Set	eBioscience	00-5523-00
Gentamicin (50 mg/ml)	Gibco	15750-060
Golgiplug	BD	555029
GolgiSTOP	BD	554724
HEPES (1 M)	Gibco	15630-080
Ionomycin	Sigma	I0634-1mg
L-Glutamin (200 mM)	Gibco	25030-081
MEM NEAA (100x)	Gibco	11140-050
Paraformaldehyd 16%ige Lösung, EM-Qualität (PFA)	Elektronenmikroskopie   Science	15710	Verdünnung mit PBS
PBS, pH 7,4	Gibco	10010072
Penicillin-Streptomycin (10.000 U/ml)	Gibco	15140-122
Phorbol 12-Myristat 13-Acetat (PMA)	Sigma	P8139-1mg
Gefrierbehälter	Millipore	Corning CoolCell FTS30
RPMI (+L-Glutamin)	Gibco	11875-085
Natriumpyruvat (100 mM)	Gibco	11360-070
Monozytenblocker	BioLegend	426103
Buffers
Kulturmedium			10 % hitzeinaktiviertes FBS (VWR), 2 nM Glutamin, 0,055 mM 2-Mercaptoethanol, 1 % Penicillin/ Streptomycin, 1 mM Natriumpyruvat, 10 mM HEPES, 1 % nicht-essentielle Aminosäuren in RPMI (+L-Glutamin)
FACS-Puffer			2 mM EDTA und 2 % hitzeinaktiviertes FBS in PBS
Gefriermedium			90 % hitzeinaktiviertes FBS und 10 % DMSO-Auftaupuffer
			Waschpuffer + 0,1 mg/ml, DNaseI
Tonsillenmedium			RPMI ergänzt mit 5 % hitzeinaktiviertem FBS, 10 mM Glutamin, 0,05 mg/ml Gentamicin, 1 % Antibiotikum-Antimykotika-Mix   (Penicillin, Streptomycin und Amphotericin B).
Waschpuffer			RPMI (+L-Glutamin) ergänzt mit 10%  hitzeinaktiviertem FBS und 10 mM HEPES
Antikörpern & anderen Regenten für das Zytokin-Panel&
Biotin Anti-Human-CD107a (LAMP-1) Antikörper	BioLegend	328604	2 μ L in 200 μ L vollständiges Kulturmedium pro Well. Dieser Antikörper wurde während der PMA/Ionomycin-Stimulation mit Zellen zugesetzt.
Lebende Tot-Flecken	100 μ L-Mix pro Vertiefung
LIVE DEAD Blue	Thermo	L23105	1 : 800, 0,125 μ L in 100 μ L PBS pro Bohrung.
Monozytenblock	50 μ L Mix pro Well
Monozytenblocker Puffer	BioLegend	426103	5 μ L True Stain Monozytenblocker und 45 μ; L FACS-Puffer pro Well
Oberflächen-Antikörper für Zytokin-PanelChemokin-Rezeptoren
mix			μ L/gut
Anti-Mensch CCR6-BV711	BioLegend		353436 1
Anti-Mensch CCR7-BV421	BioLegend	353208	1
Anti-Mensch CXCR3-PE-Cy5	BD	551128	5
Anti-Mensch CXCR5-BV750	BD	747111	1
Brilliant Stain Buffer Plus (RUO)	BD	566385	10
nbsp;	18 μ L-Mix pro Vertiefung für Chemokinrezeptoren; Den Zellen mit dem Monozyten-Blockpuffer
Anderer Oberflächen-Antikörpermix			μ L/gut
Anti-Mensch CD103-BUV661	BD	749993	2.5
Anti-Mensch CD14-Spark Blue 550	BioLegend	367148	2.5
Anti-Mensch CD19-Spark NIR 685	BioLegend	302270	2.5
Anti-Mensch CD25-BB515	BD	564467	10
Anti-Mensch CD27- Super Bright 436	Thermo	62-0279-42	5
Anti-Mensch CD3-BV510	BioLegend	344828	2.5
Anti-Mensch CD38 APC-Fire810	BioLegend	303550	1
Anti-Mensch CD4 CF YG584	Cytek	R7-20041	2.5
Anti-Mensch CD45RA-BUV395	BD	740315	0.6
Anti-Mensch CD56-BUV737	BD	612766	3.5
Anti-Mensch CD57-FITC	BioLegend	359604	1.2
Anti-Mensch CD69-BUV563	BD	748764	1
Anti-Mensch CD8-BUV805	BD	612889	1.2
Anti-Mensch FAS-BB700	BD	566542	0.6
Anti-Mensch HLA-DR APC-Fire 750	BioLegend	307658	2
Anti-Human-PD1-BV785	BioLegend	329929	1.2
Anti-Human-CD45-PerCP	Thermo	MHCD4531	1.2
Brilliant Stain Buffer Plus (RUO)	BD	566385	10
FACS Puffer			61
			112 μ L-Mischung pro Vertiefung für andere Oberflächenantikörper; Direkt zum Monozytenblockpuffer (50 μ L) und Chemokinrezeptor-Mix (18 μ L, 50+18+112 = 180 μ L insgesamt pro Well)
Intrazelluäre Zytokin-Antikörper für Zytokin-Panel			μ L/gut
Anti-Mensch Granzyme B-PE	BD		1
Anti-Mensch IL10-PE-Dazzle 594	BioLegend	506812	1
Anti-Mensch IL17A-BV605	BioLegend	512326	1
Anti-Mensch IL2-BV650	BioLegend	500334	3
Anti-Mensch IL21-Alexa Fluor 647	BD	560493	10
Anti-Mensch IL4-PerCP Cy5.5	BD	561234	1
Anti-Human-Perforin-APC	BioLegend	353312	2.5
Anti-Human-TNFa-PE-Cy7	BioLegend	502930	0.1
Anti-IFNγ-Pacific	Blue BioLegend	502522	1
SAv-BUV615	BD	613013	0.25
Brilliant Stain Buffer Plus (RUO)	BD	566385	10
1x Permeabilisierungs-Puffer	eBioscience	00-5523-00	19.15
	(50 μ L-Mix pro Vertiefung)
Antikörper & andere Regenten für Transkriptionsfaktor-Panel
CD40 Antikörper, anti-human	Miltenyi Biotec	130-094-133	0,5 μ g/ml Nährmedium für die Arbeitskonzentration
Lebendtotfärbung	100 μ L-Mix pro Vertiefung
LIVE DEAD Blue	Thermo	L23105	1 : 800, 0,125 μ L in 100 μ L PBS pro Bohrung.
Monozytenblocker-Puffer	BioLegend	426103	5 μ L True Stain Monozytenblocker und 45 μ; L FACS-Puffer pro Well
Oberflächen-Antikörper für Transkriptionsfaktor-Panel
Chemokin-Rezeptoren-Mix			μ L/gut
Anti-Human-Produkt CCR6-BV711	BioLegend	353436	1
Anti-Human-Produkt CCR7-BV421	BioLegend	353208	1
Anti-Human-Produkt CXCR5-BV750	BD	747111	1
Brilliant Stain Buffer Plus (RUO)	BD	566385	10
nbsp;	13 μ L-Mix pro Well
Anderer Oberflächen-Antikörper-Mix			μ L/gut
Anti-Mensch 4-1BB-PE-CY7	BioLegend	309818	2.5
Anti-Mensch CD14-Spark Blue 550	BioLegend	367148	2.5
Anti-Mensch CD19-Spark NIR 685	BioLegend	302270	2.5
Anti-Mensch CD200-PerCP-eFluor 710	ThermoFisher	46-9200-42	2.5
Anti-Mensch CD25-PE-CY5	BioLegend	302608	5
Anti-Mensch CD3-BV510	BioLegend	344828	2.5
Anti-Mensch CD38-APC-Fire810	BioLegend	303550	1
Anti-Mensch CD4-Pacific Blue	BioLegend	317423	1
Anti-Mensch CD40L-PE	BD		15
Anti-Mensch CD45RA-BUV395	BD	740315	0,6
Anti-Mensch CD56-BUV737	BD	612766	3.5
Anti-Mensch CD69-BUV650	BioLegend	310934	2.5
Anti-Mensch CD8-BUV805	BD	612889	1.2
Anti-Mensch HLA-DR APC-Fire 750	BioLegend	307658	2
Anti-Mensch ICOS-BUV563	BD		741421 1.2
Anti-Mensch OX40-APC	BioLegend	350008	5
Anti-Human-PD1-BV785	BioLegend	329929	1.2
Anti-Human-CD45-PerCP	Thermo	MHCD4531	1.2
Brilliant Stain Buffer Plus (RUO)	BD	566385	10
FACS Buffer			54.1
			117  μ L-Mischung pro Vertiefung für andere Oberflächenantikörper; Direkt zum Monozytenblock hinzufügen  Puffer (50 μ L) und Chemokinrezeptor-Mix (13 μ L, 50+13+117 = 180 μ L insgesamt pro Well)
Transkriptionsfaktor-Antikörper für Transkriptionsfaktor-Panel	μ L/gut
Anti-Mensch T-bet-BV605	BioLegend	644817	4
Anti-Mensch Bcl6-PE-CF594	BD	562401	4
Anti-Mensch FoxP3-Alexa Fluor 488	BD	560887	1.6
Anti-Mensch GATA3-BB700	BD	566642	2
Anti-Mensch Ki67-Alexa Fluor 700	BD	561277	0.4
Anti-Mensch Rorgt-Alexa Fluor 647	BD	563620	2
Brilliant Stain Buffer Plus (RUO)	BD	566385	10
1 x Permeabilisierungspuffer	eBioscience	00-5523-00	16
			40 μ L Mix pro well
Software und Pakete für unüberwachte Analysen
	Software/package<	strong>Version	Source
>1	data.table	1.16.2	Das umfassende R-Archiv-Netzwerk
2	FlowJO	10.9.0	Becton, Dickinson and Company
3	pheatmap	1.0.12	Das Comprehensive R Archive Network
4	R	4.3.2	Das Comprehensive R Archive Network
5	readxl	1.4.3	Das Comprehensive R Archive Network
6	Rstudio	2023.12.1+402	Posit PBC
7	Seurat	5.1.0	Das Comprehensive R Archive Network
8	SeuratData	0.2.2.9001	Das Comprehensive R Archive Network
9	SpectroFlo	3.0	Cytek
10	tidyverse	2.0.0	Das Comprehensive R Archive Network
11	viridis	0.6.5	Das Comprehensive R Archive Network