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Methodenartikel

Effiziente Verarbeitung von follikulären Helferzellen und Funktionsanalyse durch hochdimensionale Durchflusszytometrie

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DOI:

10.3791/67188

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11. Juli 2025

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1Cell Signaling and Immunity Section, Laboratory of Immune System Biology, National Institute of Allergy and Infectious Diseases, National Institutes of Health, 2Laboratory of Immunogenetics, National Institute of Allergy and Infectious Diseases, National Institutes of Health, 3Rheumatology Fellowship Training Program, National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases, National Institutes of Health, 4Division of Pediatric Otolaryngology, Children's National Hospital, 5Division of Otolaryngology, Department of Surgery, George Washington University School of Medicine and Health Sciences

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Hier stellen wir ein Protokoll für die Entnahme und Verarbeitung von Mandelproben, die Phänotypisierung mittels hochdimensionaler spektraler Durchflusszytometrie und die Durchführung unüberwachter Analysen vor.

Zusammenfassung

Follikuläre T-Helferzellen (Tfh) sind eine Untergruppe der CD4+ T-Helferzellen, die beim Wechsel des B-Zell-Isotyps, der Bildung des Keimzentrums (GC), der somatischen Hypermutation und der Affinitätsreifung helfen und so dazu beitragen, adaptive humorale Immunantworten in sekundären lymphatischen Geweben während der Infektion, Autoimmunität und Impfung zu orchestrieren. Das Verständnis der Entwicklung und Funktion von Tfh-Zellen ist entscheidend für die Entwicklung wirksamer Impfstoffe und die Entwicklung gezielter Behandlungsstrategien für Krankheiten, an denen diese Population beteiligt ist. Menschliche Mandelzellen sind zugängliche lymphatische Organe der Schleimhaut. Sie bieten eine einzigartige Möglichkeit, verschiedene Immunpopulationen wie Tfh- und GC-Zellen zu profilieren, Zell-zu-Zell-Interaktionen zu untersuchen, dynamische zelluläre Funktionen zu bewerten und ihre Regulationsmechanismen auf Organebene aufzudecken. Darüber hinaus sind in vitro Kulturen von Mandelzellen einfach zu verarbeiten und ermöglichen die Beurteilung der Tfh-Zellbiologie unter verschiedenen Bedingungen. Hier stellen wir ein Protokoll für die Entnahme, Isolierung, Konservierung und Kultivierung menschlicher Mandelzellen vor. Wir beschreiben auch zwei optimierte spektrale Durchflusszytometrie-Panels, die für eine detaillierte Charakterisierung von Tfh-Zellen entwickelt wurden. Zuletzt demonstrieren wir am Beispiel einer Behandlung mit Phosphataseprotein-2A (PP2A)-Inhibitoren die Effizienz und Leistungsfähigkeit unüberwachter Analysen von hochdimensionalen Durchflusszytometrie-Daten, wodurch behandlungsinduzierte Unterschiede auf einer hochdimensionalen Skala effektiv aufgedeckt werden.

Einleitung

Follikuläre T-Helferzellen (Tfh) sind eine eigenständige Untergruppe der CD4+-T-Helferzellen, die für die Bildung und Funktion von Keimzentren (GCs) und die Produktion von B-Zell-Antikörpern unerlässlich sind. Tfh-Zellen stammen von naiven CD4+ T-Zellen durch Wechselwirkungen mit antigenpräsentierenden Zellen und die Integration von intrinsischen und extrinsischen Faktoren, einschließlich der Signalgebung von T-Zell-Rezeptoren, kostimulatorischen Wechselwirkungen mit B-Zellen, Zytokinen und Chemokinen1. Tfh-Zellen exprimieren CXCR5 und PD-1, die ihre Position innerhalb oder in der Nähe des GC bestimmen. BCL-6 ist der Master-Transkriptionsfaktor, der für die Entwicklung, Aufrechterhaltung und Funktion von Tfh entscheidend ist 1,2. Tfh-Zellen sind entscheidend für die Zunahme humoraler Immunantworten, insbesondere bei Impfreaktionen und bei der Abwehr bakterieller und viraler Krankheitserreger. Abnorme Tfh-Zellreaktionen sind an verschiedenen Erkrankungen beteiligt, darunter Autoimmunerkrankungen, Immunschwäche und möglicherweise einige Formen von Krebs 3,4,5,6. Das Verständnis ihrer Funktion und Regulation ist daher wichtig für die Entwicklung wirksamer Impfstoff- und Therapiestrategien7.

Im Gegensatz zu anderen CD4+ T-Helferzellen wie Th1, Treg und Th17, für die in vitro Differenzierungssysteme gut etabliert sind8, sind Tfh-Zellen komplexer zu untersuchen, da ihre Entwicklung dynamische Zell-zu-Zell-Interaktionen und spezialisierte anatomische Strukturen beinhaltet7. Daher stützten sich Studien an Tfh-Zellen weitgehend auf die ex vivo-Phänotypisierung von humanen peripheren zirkulierenden Tfh-Zellen (cTfh) und In-vivo-Mausmodellen . Die Untersuchung der Regulation spezifischer Moleküle auf Tfh-Zellen ist daher eine Herausforderung, insbesondere für menschliche Tfh-Zellen9. Daher ist eine eingehende Ex-vivo-Studie von Tfh-Zellen, die aus lymphatischem Gewebe gewonnen werden, unerlässlich, um unser Verständnis von menschlichen Tfh-Zellen zu verbessern.

Mandeln beherbergen als sekundäre lymphatische Organe einzigartige Zellpopulationen, die im peripheren Blut nicht vorhanden sind, wie z. B. Prä-Tfh- (CXCR5intPD-1int CD4+) und GC-Tfh (CXCR5hiPD-1hi CD4+) Zellen, die beide maßgeblich an der Bildung von GCs beteiligt sind. Darüber hinaus gehören die Gaumenmandeln zu den am häufigsten entnommenen Geweben in Kinderoperationen und sind leicht zugänglich, was sie zu einer unschätzbaren menschlichen Gewebequelle für die Erforschung komplexer Immunmechanismen macht, an denen Tfh-Zellen beteiligt sind. Da sie sich in den oberen Atemwegen befinden, einem primären Ort für respiratorische Virusinfektionen, bieten die Mandeln ein vorteilhaftes Gewebe für die Untersuchung von Immunantworten auf solche Virusinfektionen. Zum Beispiel charakterisierte unser Labor zuvor Tfh-Zellen in Mandeln und Polypen von Kindern, die sich von COVID-19 erholt hatten, und verglich diese Gewebe mit denen von nicht infizierten Kontrollen10. Hier stellen wir Ihnen unser Protokoll für die Verarbeitung und Lagerung von Mandelzellen vor. Am Beispiel von mit PP2A-Inhibitoren behandelten Mandeln beschreiben wir, wie diese Zellen durch hochdimensionale spektrale Durchflusszytometrie charakterisiert und die Daten mit unüberwachter Analyse analysiert werden können.

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Protokoll

Der Ethikkodex des Weltärztebundes (Deklaration von Helsinki) wurde in dieser Studie in allen Humanforschungen befolgt. Menschliche Mandelproben wurden von Patienten mit adenotonsilärer Hypertrophie gewonnen, die schlafgestörte Atmungsstörungen oder obstruktive Schlafapnoe verursacht, die von der Abteilung für pädiatrische Hals-Nasen-Ohrenheilkunde des Children's National Hospital, Washington, DC, USA, stammen. Diese Studie erhielt die Genehmigung des Institutional Review Board (IRB) am Children's National Hospital (IRB-Protokollnummer 00009806). Die Einverständniserklärung wurde von den Eltern oder Erziehungsberechtigten aller eingeschriebenen Teilnehmer unterschrieben, und die Zustimmung der minderjährigen Teilnehmer ab 7 Jahren wurde eingeholt.

1. Entnahme von Mandeln beim Menschen sowie Isolierung und Lagerung von Einzelzellen

  1. Isolierung von tonsillären Einzelzellen
    1. Entnahme von chirurgischen Proben
      1. Entnehmen Sie Mandeln von Patienten, die sich einer Tonsillektomie unterziehen, und sammeln Sie die frischen Gewebestücke im Operationssaal in einem 50-ml-Zentrifugenröhrchen, das mit 25-35 ml eiskaltem, sterilem Mandelmedium gefüllt ist: RPMI, ergänzt mit 5 % hitzeinaktiviertem fötalem Rinderserum (FBS), 0,05 mg/ml Gentamicin, 10 mM Glutamin und einer Antibiotika-Antimykotika-Mischung (100 Einheiten/ml Streptomycin, 100 Einheiten/ml Penicillin, und 0,25 μg/ml Amphotericin B).
        HINWEIS: Mandeln im oben genannten Medium können über Nacht bei 4 °C gelagert und am nächsten Tag verarbeitet werden. Ein minimaler Verlust der Zellviabilität wurde bei Lagerung über Nacht im Vergleich zur Verarbeitung am selben Tag festgestellt (Abbildung 1A). Mandeln können auch über Nacht auf Eis verschickt werden.
    2. Verarbeitung von Mandeln
      HINWEIS: Alle Medien, Puffer und chirurgischen Instrumente müssen steril sein, und die Mandelzellisolierung sollte auf Eis in einer Biosicherheitshaube durchgeführt werden.
      1. Legen Sie die Mandeln auf eine 60-mm-Zellkulturschale aus Kunststoff mit 5 ml gekühltem Mandelmedium. Arbeiten Sie auf Eis. Entfernen Sie mit einer sterilen Pinzette und Schere oder einem Skalpell vorsichtig sichtbare Blutgerinnsel, Fett und Bindegewebe (Abbildung 1B,C).
      2. Bringen Sie die Mandeln in eine neue 60-mm-Zellkulturschale mit 5 ml eiskaltem Mandelmedium. Die Mandelstücke in 3-5 mm große Stücke schneiden.
      3. Bereiten Sie eine neue 60-mm-Zellkulturschale mit 10 mL kaltem Mandelmedium vor und legen Sie ein 70-μm-Zellsieb in die Schale.
      4. Bewegen Sie die Mandelfragmente in das Sieb und zerschlagen Sie die Mandelfragmente mit dem Kolbenende einer sterilen 3-ml-Spritze durch das Sieb.
      5. Sammeln Sie das Medium, das Zellen enthält, außerhalb des Siebs in der Schale und geben Sie es in ein konisches 50-ml-Röhrchen.
      6. Geben Sie weitere 10 ml Mandelmedium in die Schale mit dem Sieb, zerdrücken Sie die Mandelfragmente mit dem Kolben und sammeln Sie das Medium in dem konischen Röhrchen. Bei großen Mandeln wiederholen Sie diesen Schritt noch 2-3x, bis nur noch Bindegewebsfragmente im Sieb übrig sind. Legen Sie das restliche Taschentuch und die benutzten Platten in einen Biohazard-Beutel und in den medizinischen Abfall.
      7. Füllen Sie das konische 50-ml-Röhrchen bis zum Rand mit Mandelmedium.
      8. Bei 400 × g 5 min bei 4 °C zentrifugieren.
        HINWEIS: Eine Verlängerung der Zentrifugation auf 20 min kann die Ausbeute erhöhen.
      9. Entfernen Sie den Überstand durch vorsichtiges Absaugen oder Pipettieren und resuspendieren Sie das Pellet in 5 ml Ammoniumchlorid-Kalium (ACK)-Lysingpuffer bei Raumtemperatur (RT), um rote Blutkörperchen zu lysieren. 5 Minuten bei RT inkubieren und dann 35 ml gekühltes PBS hinzufügen, um eine weitere Lyse zu verhindern. Bei 400 × g 5 min bei 4 °C zentrifugieren.
      10. Einmal mit 50 ml gekühltem PBS waschen und zentrifugieren. Resuspendieren Sie mit 10 mL PBS und Stammzellen durch ein 70 μm Kunststoffsieb. Zellen zählen.
  2. Kryokonservierung von Tonsillenzellen
    1. Bereiten Sie Gefriermedium vor (90 % hitzeinaktiviertes FBS und 10 % Dimethylsulfoxid (DMSO)).
      HINWEIS: Dies kann bis zu 1 Monat bei 4 °C gelagert werden.
    2. Die Zellsuspension (Schritt 1.1.2.10) wird bei 400 × g 5 min lang bei 4 °C zentrifugiert. Den Überstand verwerfen und das Zellpellet mit Gefriermedium resuspendieren.
      HINWEIS: Wir empfehlen, die Zellen bei einer Dichte von 10 × 106 bis 50 × 106 Zellen/ml Gefriermedium11 einzufrieren.
    3. Aliquot 0,5-1 ml der Zellsuspension in sterile Kryoröhrchen. Frieren Sie die Fläschchen in geschwindigkeitsgesteuerten Gefrierbehältern in einem -80 °C Gefrierschrank ein. Füllen Sie die Fläschchen innerhalb einer Woche in einen Lagertank mit flüssigem Stickstoff um, um sie langfristig zu konservieren.
  3. Auftauen von gefrorenen Zellen
    HINWEIS: Im Folgenden wird ein Ansatz des Auftauens mit sequenzieller Verdünnung beschrieben, auf der in einem Probenvorbereitungsprotokoll für die Einzelzell-RNA-Sequenzierung verwiesen wird12. Andere Auftaumethoden können ebenfalls funktionieren, aber wir fanden bei diesem Ansatz eine höhere Zellviabilität im Vergleich zum sofortigen Einsetzen der Zellen in einen warmen Auftaupuffer (Abbildung 1D). Der Waschpuffer kann im Voraus vorbereitet werden. Der Auftaupuffer besteht aus Waschpuffer plus 0,1 mg/ml DNase I (DNase I sollte kurz vor Beginn des Auftauens hinzugefügt werden). Eine Erhöhung der Zentrifugationszeit auf 1 min/ml (für 15-ml-Röhrchen) ist optional, um die Zellausbeute zu erhöhen.
    1. Ein Wasserbad auf 37 °C erwärmen. Den Auftau- und Waschpuffer im 37 °C warmen Wasserbad vorwärmen.
      HINWEIS: Alle Zellwäschen werden bei RT durchgeführt.
    2. Tauen Sie die Kryofläschchen sofort nach der Entnahme aus der Lagerung 2-3 min im 37 °C warmen Wasserbad auf. Vermeiden Sie es, die Durchstechflasche vollständig in das Wasserbad einzutauchen. Nehmen Sie das Fläschchen aus dem Wasserbad, während ein kleiner Eiskristall sichtbar bleibt.
    3. Übertragen Sie aufgetaute Zellen vorsichtig in ein konisches 15-ml-Röhrchen mit einer Pipettenspitze mit breiter Öffnung in einer Biosicherheitshaube. Spülen Sie das Kryoröhrchen mit 0,5 ml vorgewärmtem Auftaupuffer und geben Sie das Spülgefäß Tropfen für Tropfen (1 Tropfen alle 5 s) in das konische 15-ml-Röhrchen, indem Sie das Röhrchen zum Mischen vorsichtig schütteln.
    4. Verdünnen Sie die Zellen nacheinander im konischen 15-ml-Röhrchen, indem Sie schrittweise 2 ml und dann 4 ml Medium mit einer Wartezeit von ~1 Minute zwischen den Zugaben hinzufügen. Geben Sie alle 3-5 s Medium in einer Menge von 1 ml in das Röhrchen und schwenken Sie es vorsichtig, um es zu mischen.
    5. Zentrifugieren Sie bei 400 × g für 5 min bei RT.
    6. Entfernen Sie den Überstand; das Zellpellet in 300 μl Auftaupuffer resuspendieren; und 5 Minuten bei RT inkubieren.
    7. Fügen Sie 10 mL Waschpuffer (keine DNase I) hinzu. Erneut bei 400 × g für 5 min bei RT zentrifugieren.
    8. Noch einmal waschen: Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet in 10 mL Waschpuffer. Bei 400 × g 5 min bei RT zentrifugieren.
    9. Filtern Sie die Zellen durch ein 70 μm Sieb. Nochmals 5 min bei 400 × g bei RT zentrifugieren und die Zellen zählen. Resuspendieren Sie es in einem Nährmedium.

2. Messung der Expression von intrazellulären Zytokinen und Transkriptionsfaktoren nach ex vivo Behandlung

HINWEIS: Hier beschreiben wir unsere Methode zur phänotypischen Charakterisierung von tonsillären Tfh-Zellen unter Verwendung von zwei hochdimensionalen Durchflusszytometrie-Panels. Angesichts der Tatsache, dass die PP2A-Aktivität für eine optimale BCL-6-Proteinexpression und die Tfh-Differenzierung essentiell ist4, veranschaulichen wir unsere Bewertung der Erhaltung und Funktionalität von Tfh-Zellen durch die Untersuchung von Mandelzellen, die mit dem PP2A-Inhibitor Cantharidin (CAN) behandelt wurden.

  1. Durchflusszytometrische Färbung
    1. Intrazelluläre Zytokin-Färbung
      HINWEIS: Die Inkubationen werden im Dunkeln durchgeführt. Reagenzien, Antikörper und ihre jeweiligen Mengen pro Well, die in beiden Panels verwendet werden, sind in der Materialtabelle aufgeführt. Um die T-Zell-Degranulation zu beurteilen, wird der Anti-CD107a-Antikörper während des Behandlungsschritts zugegeben, um falsch-negative Ergebnisse, die durch seine Internalisierung verursacht werden, zu minimieren13.
      1. Platte 2 × 10 6-Tonsillen-Zellen mit 200 μl Kulturmedium (1 × 107 Zellen/ml) in einer 96-Well-U-Bodenplattenvertiefung mit den folgenden Mengen an PP2A-Inhibitor-CAN für 16 h: Vehikelkontrolle, 3 μM und 6 μM.
        HINWEIS: CAN wurde bei 0,1 M mit 1 % DMSO rekonstituiert.
      2. Monensin (0,7 μl/ml), Brefeldin (1:1.000), Phorbolmyristatacetat (50 ng/ml, PMA), Ionomycin (1.000 ng/ml) und 2 μl Anti-CD107a für 2,5 Stunden in einen 5 % CO2 - Inkubator bei 37 °C in jede Vertiefung geben. Das Gesamtkulturvolumen beträgt 200 μl pro Vertiefung.
      3. Zentrifugieren Sie färbende Antikörper bei ~16.000 × g für 3-5 min bei 4 °C, um Antikörperaggregate zu entfernen. Bereiten Sie die Oberflächenantikörpermischung für Schritt 2.1.1.8 vor, die alle Oberflächenantikörper mit Ausnahme der Chemokinrezeptoren, Brilliant Stain Buffer Plus und FACS-Puffer enthält (Volumen von jedem in der Materialtabelle angegeben, insgesamt 112 μl Mischung pro Reaktion).
      4. Nach 2,5 h in Kultur waschen Sie die Zellen 2x mit 200 μl eiskaltem PBS, indem Sie bei 400 × g für 2 min bei 4 °C zentrifugieren. Entsorgen Sie den Überstand zwischen den Wäschen, indem Sie die Platte schnell umdrehen. Führen Sie die Färbung in derselben Platte durch.
      5. Inkubieren Sie die Zellen in 100 μl/Vertiefung mit 1:800 verdünntem LIVE/DEAD Blue-Farbstoff in PBS für 15 min bei RT. 2x mit 200 μl FACS-Puffer waschen.
      6. Resuspendieren Sie die Zellen mit dem True Stain Monocyte Blocker (5 μl Monozytenblocker + 45 μl FACS-Puffer pro Well) für 5 Minuten bei RT.
      7. Fügen Sie nacheinander Chemokinrezeptor-Antikörper direkt zur Färbereaktion hinzu (zuerst Anti-CXCR3 und Anti-CCR7 für jeweils 10 Minuten, gefolgt von einer Mischung aus Anti-CXCR5 und Anti-CCR6 zusammen mit 10 μl Brilliant Stain Buffer Plus für 5 Minuten bei RT). Nach jeder Zugabe gut mischen, indem Sie mehrmals auf und ab pipettieren. In der Materialtabelle finden Sie die Antikörpervolumen.
      8. Geben Sie die in Schritt 2.1.1.3 hergestellte Oberflächenantikörpermischung direkt zur Färbereaktion und inkubieren Sie sie 30 Minuten lang bei RT. Das Gesamtfärbevolumen pro Reaktion beträgt 180 μl: 50 μl Monozytenblocker in Puffer (siehe Schritt 2.1.1.6) + 18 μl Anti-Chemokinrezeptor-Antikörper (siehe Schritt 2.1.1.7) + 112 μl Oberflächen-Antikörpermix (siehe Schritt 2.1.1.3).
      9. 2x mit 200 μl kaltem FACS-Puffer waschen.
      10. Resuspendieren Sie die Zellen und inkubieren Sie sie mit 80 μl/Vertiefung Fixierungspuffer auf Paraformaldehyd-Basis bei RT für 20 Minuten.
      11. Geben Sie 160 μl 1x Permeabilisierungspuffer in jede Vertiefung, die bereits Fixierungspuffer enthält. Die Platte bei 400 × g für 2 min bei RT zentrifugieren und 1x mit 200 μl Permeabilisierungspuffer waschen.
      12. Bereiten Sie eine intrazelluläre Zytokin-Antikörpermischung (ICS) vor, die Anti-Zytokin-Antikörper, Brilliant Stain Buffer Plus und Permeabilisierungspuffer (Gesamtvolumen 50 μl/Well, Materialtabelle) enthält. Inkubieren Sie die Zellen mit diesem intrazellulären Zytokin-Antikörper-Mix bei RT für 30 min.
      13. 2x mit 200 μl/Well Permeabilisierungspuffer waschen. Resuspendieren Sie mit 200 μl/Vertiefung FACS-Puffer.
      14. Lagern Sie die gefärbten Zellen bei 4 °C im Dunkeln und erfassen Sie die Daten innerhalb von 24 Stunden auf einem spektralen Durchflusszytometer, um den Verlust der Färbeintensität zu minimieren14.
    2. Färbung von nukleären Transkriptionsfaktoren
      1. Kultivieren Sie die Zellen mit CAN wie in Schritt 2.1.1.1 (ohne Stimulation der Zellen).
      2. Geben Sie einen Anti-Human-CD40-Antikörper (0,5 μg/ml) in das Kulturmedium und kultivieren Sie es 15 Minuten lang mit den Zellen, bevor Sie mit der Färbung beginnen. Wenn Zellen stimuliert werden, fügen Sie diesen Antikörper 15 Minuten vor Beginn der Stimulation hinzu, um die Internalisierung von CD40L nach der Aktivierung zu verhindern15,16.
      3. Zentrifugieren Sie die Färbeantikörper und bereiten Sie die Oberflächenantikörpermischung ähnlich wie in Schritt 2.1.1.3 vor: Oberflächenantikörper in der Materialtabelle, 10 μl/Vertiefung Brilliant Stain Buffer Plus und 54,1 μl/Vertiefung FACS-Puffer.
        HINWEIS: Das Gesamtfärbevolumen pro Vertiefung beträgt 180 μl: 50 μl Monozytenblocker in Puffer + 13 μl Chemokinrezeptor-Antikörper + 117 μl Oberflächen-Antikörper-Mix.
      4. Waschen Sie die Zellen und führen Sie die LIVE/DEAD Blue-Färbung und Oberflächenfärbung und -waschung wie in den Schritten 2.1.1.5-2.1.1.8 durch.
        HINWEIS: Der Anti-CXCR3-Antikörper ist nicht in diesem Panel enthalten.
      5. Fixieren Sie die Zellen mit 80 μl nukleärem Transkriptionsfaktor-Fixierungspuffer aus dem FoxP3/Transkriptionsfaktor-Färbepuffer-Set. 30 Minuten bei RT inkubieren.
      6. Waschen Sie die Zellen mit Permeabilisierungspuffer wie in Schritt 2.1.1.11.
      7. Bereiten Sie die Antikörpermischung für den intrazellulären Transkriptionsfaktor (TF) vor, die die in der Materialtabelle aufgeführten Antikörper gegen den Transkriptionsfaktor, 10 μl Brilliant Stain Buffer Plus und 16 μl Permeabilisierungspuffer (Gesamtvolumen 40 μl/Well) enthält. Inkubieren Sie die Zellen mit dieser Mischung für 1 h bei 4 °C.
      8. Waschen und Erfassen auf einem Spektralzytometer wie in den Schritten 2.1.1.13-2.1.1.14.

3. Unüberwachte Analyse von hochdimensionalen Durchflusszytometrie-Daten

HINWEIS: Software, Pakete und deren Versionen, die für die Analyse verwendet werden, sind in der Materialtabelle aufgeführt. Screenshots aus den Schritten 3.2 bis 3.4 befinden sich in der Zusatzdatei 1. Beispielskripte aus den Schritten 3.5 bis 3.7 befinden sich inder Ergänzungsdatei 2 und der Zusatzdatei 3, die Schritte 3.8 bis 3.9 in der Zusatzdatei 4 und der Zusatzdatei 5. ICS-Rohdateien und TF-Rohdateien für die Skripts werden in der Zusatzdatei 6 bzw. der Zusatzdatei 7 bereitgestellt.

  1. Öffnen Sie den Arbeitsbereich der Durchflusszytometrie-Analysesoftware, in dem die ".fcs"-Dateien gespeichert sind, und schließen Sie das Gating ab, wie in Abbildung 1E gezeigt.
  2. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf den Zielknoten (in diesem Fall CD4+ T-Zellen). Wählen Sie Select Equivalent Nodes (Äquivalente Knoten auswählen) aus.
  3. Klicken Sie erneut mit der rechten Maustaste auf den Zielknoten. Wählen Sie Populationen exportieren/verketten aus.
  4. Warten Sie, bis das Fenster Populationen: Exportieren oder Verketten geöffnet wird, wählen Sie CSV-Kanalwerte und dann das Ziel für die exportierten Dateien aus. Schließen Sie alle Zellen in das Feld "Ereignisse einschließen" ein, und wählen Sie im Feld "Parameter" die Option "Alle kompensierten Parameter" aus. Erweitern Sie die erweiterten Optionen, geben Sie ein Präfix ein, um die Dateien umzubenennen, und klicken Sie auf Exportieren, um die Dateien in den Zielordner zu exportieren (exportieren Sie eine .csv Datei für jedes Beispiel).
  5. Lesen Sie die exportierten "*.csv"-Dateien mit R (eine für jedes Sample). Weisen Sie jeder Zelle eine Beispiel-ID zu und kombinieren Sie Zellen aus allen Stichproben in einem einzigen Datenrahmen.
  6. Fügen Sie Metadaten (zusätzliche Informationen zu Beispielen) zum Datenrahmen hinzu oder führen Sie sie zusammen.
  7. Führen Sie für die folgende Analyse ein zufälliges Downsampling von gleich vielen Zellen pro Probe durch. Dieser Schritt ist optional.
    HINWEIS: In diesem Beispiel wurden 8.000 CD4+ T-Zellen aus der Gesamtzahl der CD4+ T-Zellen jeder Bedingung heruntergerechnet, was mindestens 1/7 der Gesamtzahl der CD4+ T-Zellen entspricht.
  8. Seurat-Objekt erstellen: Interpretieren Sie die Kanalwerte für Antikörpermarker als Genexpressionsniveaus beim Erstellen eines Seurat-Objekts.
    1. Erstellen Sie ein Seurat-Objekt mit dem Datenrahmen, der aus Schritt 3.6 generiert wurde. Überspringen Sie den Schritt NormalizeData und speichern Sie sie direkt als "Daten"-Assay.
    2. Wählen Sie die Oberflächenmarkierungen aus der Gruppe Fluss aus, die als VariableFeatures in der nicht überwachten Cluster-Bildung verwendet werden sollen.
    3. Führen Sie ScaleData, RunPCA, FindNeighbors, FindClusters, RunUMAP als Standardpipeline aus, die von Seurat eingeführt wurde, mit Ausnahme des NormalizeData-Schritts 17.
    4. Passen Sie den Auflösungsparameter im Schritt "FindClusters" an, um die Anzahl der Cluster zu ändern und sicherzustellen, dass sie den zugrunde liegenden biologischen Kontext genauer widerspiegeln.
  9. Verwenden Sie Visualisierungstools wie DimPlot und FeaturePlot , die mit dem Seurat-Paket kompatibel sind. Berechnen Sie zum Vergleichen von Gruppen, die mehrere Stichproben pro Gruppe enthalten, den Prozentsatz jedes Clusters pro Proband, und führen Sie statistische Vergleiche durch. Verwenden Sie anschließend mathematische Modelle für anspruchsvollere statistische Analysen10.

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Ergebnisse

Um die allgemeine Lebensfähigkeit der Zellen zu vergleichen, haben wir die Mandeln in drei ähnliche Stücke geschnitten und sie mit unserem Protokoll unter drei Bedingungen verarbeitet: (1) Verarbeitung am selben Tag, (2) Lagerung über Nacht bei 4 °C und (3) Lagerung über Nacht auf Eis. Die Lebensfähigkeit dieser drei Erkrankungen war ziemlich ähnlich, ohne dass es einen signifikanten Unterschied gab (Abbildung 1A). Wir untersuchten auch die Auswirkungen des Auftauprozesses auf die Lebensfähi...

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Diskussion

Im Gegensatz zu früheren Berichten, dass frische Mandeln innerhalb von 3 Stunden nach der Operation verarbeitet werden sollten19, stellten wir fest, dass frische Mandelproben ihre Lebensfähigkeit behalten konnten, wenn sie bei 4 °C gelagert und innerhalb von 24 Stunden verarbeitet wurden. Um die Zellviabilität von Mandelgewebe nach dem Auftauen aus der Lagerung von flüssigem Stickstoff zu optimieren, haben wir die tropfenweise Auftaumethode übernommen, die in der ...

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Offenlegungen

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Danksagungen

Diese Forschung wurde von der Abteilung für intramurale Forschung des NIAID, NIH, unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Maschinen und Instrumente
3 mL KunststoffspritzeBD309657
96 Well U BodenplatteThermo Scientific163320
1,2 mL Kryogene FläschchenCorning430487
Zellsieb 70 & micro; m NylonFalcon352350
Zellkulturschale (60 mm)VWR10062-890
ZentrifugeThermo ScientificSorvall Legend XTR
Benchmark B2000-2 MyBath 2L Digital Water BathBenchmarkB2000-2
Feine Schere - ScharfF.S.T14060-11
Instrumentenkoffer aus KunststoffF.S.T20830-05
Spektrales Durchflusszytometer, AuroraCytek5L 16UV-16V-14B-10YG-8R
Zange mit StandardmusterF.S.T11000-13
Pinzette mit StandardmusterF.S.T11000-20
Vi-cell Blu Zellviabilitätsanalysator Beckman CoulterC19201
Reagenzien
0,5 M EDTA pH 8,0Qualität Biologie351-027-101
2-MercaptoethanolGibco21985-023
ACK LysingpufferGibcoA10492-01
Antibiotisch-Antimykotisches Gemisch (Penicillin-Streptomycin-Amphotericin B Suspension, 100x)Gibco15240-062
Brilliant Stain Buffer Plus (RUO)BD566385
CantharidinSigmaC7632-25MG
Cytofix FixationspufferBD554655
Dimethylsulphoxid (DMSO)SigmaD8418-250ml
DNAase IRoche10104159001
Fetal Rinderserum (FBS)VWR97068-085
FoxP3/Transkriptionsfaktor-Färbepuffer-SeteBioscience00-5523-00
Gentamicin (50 mg/ml)Gibco15750-060
GolgiplugBD555029
GolgiSTOPBD554724
HEPES (1 M)Gibco15630-080
IonomycinSigma  I0634-1mg
L-Glutamin (200 mM)Gibco25030-081
MEM NEAA (100x)Gibco11140-050
Paraformaldehyd 16%ige Lösung, EM-Qualität (PFA)Elektronenmikroskopie
  Science		15710Verdünnung mit PBS
PBS, pH 7,4Gibco10010072
Penicillin-Streptomycin (10.000 U/ml)Gibco15140-122
Phorbol 12-Myristat 13-Acetat (PMA)SigmaP8139-1mg
GefrierbehälterMilliporeCorning CoolCell FTS30
RPMI (+L-Glutamin)Gibco11875-085
Natriumpyruvat (100 mM)Gibco11360-070
MonozytenblockerBioLegend426103
Buffers
Kulturmedium10 % hitzeinaktiviertes FBS (VWR),
2 nM Glutamin,
0,055 mM 2-Mercaptoethanol,
1 % Penicillin/ Streptomycin,
1 mM Natriumpyruvat,
10 mM HEPES,
1 % nicht-essentielle Aminosäuren
in RPMI (+L-Glutamin)
FACS-Puffer2 mM EDTA und 2 % hitzeinaktiviertes FBS in PBS
Gefriermedium90 % hitzeinaktiviertes FBS und 10 % DMSO-Auftaupuffer
Waschpuffer + 0,1 mg/ml, DNaseI
TonsillenmediumRPMI ergänzt mit 5 % hitzeinaktiviertem FBS,
10 mM Glutamin,
0,05 mg/ml Gentamicin,
1 % Antibiotikum-Antimykotika-Mix
  (Penicillin, Streptomycin und Amphotericin B).
WaschpufferRPMI (+L-Glutamin) ergänzt mit 10%  hitzeinaktiviertem FBS und 10 mM HEPES
Antikörpern & anderen Regenten für das Zytokin-Panel&
Biotin Anti-Human-CD107a (LAMP-1) AntikörperBioLegend3286042 μ L in 200 μ L vollständiges Kulturmedium pro Well.
Dieser Antikörper wurde während der PMA/Ionomycin-Stimulation mit Zellen zugesetzt.
Lebende Tot-Flecken100 μ L-Mix pro Vertiefung
LIVE DEAD BlueThermoL23105  1 : 800, 0,125 μ L in 100 μ L PBS pro Bohrung. 
Monozytenblock50 μ L Mix pro Well
Monozytenblocker PufferBioLegend4261035 μ L True Stain Monozytenblocker und 45 μ; L FACS-Puffer pro Well
Oberflächen-Antikörper für Zytokin-PanelChemokin-Rezeptoren
mixμ L/gut 
Anti-Mensch CCR6-BV711BioLegend353436 1
Anti-Mensch CCR7-BV421BioLegend3532081
Anti-Mensch CXCR3-PE-Cy5BD5511285
Anti-Mensch CXCR5-BV750BD7471111
Brilliant Stain Buffer Plus (RUO)BD56638510
nbsp;        18 μ L-Mix pro Vertiefung für Chemokinrezeptoren;
Den Zellen mit dem Monozyten-Blockpuffer
Anderer Oberflächen-Antikörpermixμ L/gut 
Anti-Mensch CD103-BUV661BD7499932.5
Anti-Mensch CD14-Spark Blue 550BioLegend3671482.5
Anti-Mensch CD19-Spark NIR 685BioLegend3022702.5
Anti-Mensch CD25-BB515 BD56446710
Anti-Mensch CD27- Super Bright 436Thermo62-0279-425
Anti-Mensch CD3-BV510BioLegend3448282.5
Anti-Mensch CD38 APC-Fire810BioLegend3035501
Anti-Mensch CD4 CF YG584CytekR7-200412.5
Anti-Mensch CD45RA-BUV395BD7403150.6
Anti-Mensch CD56-BUV737BD6127663.5
Anti-Mensch CD57-FITCBioLegend3596041.2
Anti-Mensch CD69-BUV563BD7487641
Anti-Mensch CD8-BUV805BD6128891.2
Anti-Mensch FAS-BB700BD5665420.6
Anti-Mensch HLA-DR APC-Fire 750BioLegend3076582
Anti-Human-PD1-BV785BioLegend3299291.2
Anti-Human-CD45-PerCPThermoMHCD45311.2
Brilliant Stain Buffer Plus (RUO)BD56638510
FACS Puffer61
                                       112 μ L-Mischung pro Vertiefung für andere Oberflächenantikörper;
Direkt zum Monozytenblockpuffer (50 μ L) und Chemokinrezeptor-Mix (18 μ L, 50+18+112 = 180 μ L insgesamt pro Well)
Intrazelluäre Zytokin-Antikörper für Zytokin-Panelμ L/gut 
Anti-Mensch Granzyme B-PEBD1
Anti-Mensch IL10-PE-Dazzle 594BioLegend5068121
Anti-Mensch IL17A-BV605BioLegend5123261
Anti-Mensch IL2-BV650BioLegend5003343
Anti-Mensch IL21-Alexa Fluor 647BD56049310
Anti-Mensch IL4-PerCP Cy5.5BD5612341
Anti-Human-Perforin-APCBioLegend3533122.5
Anti-Human-TNFa-PE-Cy7BioLegend5029300.1
Anti-IFNγ-PacificBlue BioLegend5025221
SAv-BUV615BD6130130.25
Brilliant Stain Buffer Plus (RUO)BD56638510
1x Permeabilisierungs-Puffer eBioscience00-5523-0019.15
       (50 μ L-Mix pro Vertiefung)
Antikörper & andere Regenten für Transkriptionsfaktor-Panel
CD40 Antikörper, anti-humanMiltenyi Biotec130-094-1330,5 μ g/ml Nährmedium für die Arbeitskonzentration
Lebendtotfärbung100 μ L-Mix pro Vertiefung
LIVE DEAD BlueThermoL23105  1 : 800, 0,125 μ L in 100 μ L PBS pro Bohrung. 
Monozytenblocker-PufferBioLegend4261035 μ L True Stain Monozytenblocker und 45 μ; L FACS-Puffer pro Well
Oberflächen-Antikörper für Transkriptionsfaktor-Panel
Chemokin-Rezeptoren-Mixμ L/gut 
Anti-Human-Produkt CCR6-BV711BioLegend3534361
Anti-Human-Produkt CCR7-BV421BioLegend3532081
Anti-Human-Produkt CXCR5-BV750BD7471111
Brilliant Stain Buffer Plus (RUO)BD56638510
nbsp;        13 μ L-Mix pro Well
Anderer Oberflächen-Antikörper-Mixμ L/gut 
Anti-Mensch 4-1BB-PE-CY7BioLegend3098182.5
Anti-Mensch CD14-Spark Blue 550BioLegend3671482.5
Anti-Mensch CD19-Spark NIR 685BioLegend3022702.5
Anti-Mensch CD200-PerCP-eFluor 710ThermoFisher46-9200-422.5
Anti-Mensch CD25-PE-CY5BioLegend3026085
Anti-Mensch CD3-BV510BioLegend3448282.5
Anti-Mensch CD38-APC-Fire810BioLegend3035501
Anti-Mensch CD4-Pacific BlueBioLegend3174231
Anti-Mensch CD40L-PEBD15
Anti-Mensch CD45RA-BUV395BD7403150,6
Anti-Mensch CD56-BUV737BD6127663.5
Anti-Mensch CD69-BUV650BioLegend3109342.5
Anti-Mensch CD8-BUV805BD6128891.2
Anti-Mensch HLA-DR APC-Fire 750BioLegend3076582
Anti-Mensch ICOS-BUV563BD741421 1.2
Anti-Mensch OX40-APCBioLegend3500085
Anti-Human-PD1-BV785BioLegend3299291.2
Anti-Human-CD45-PerCPThermoMHCD45311.2
Brilliant Stain Buffer Plus (RUO)BD56638510
FACS Buffer54.1
               117  μ L-Mischung pro Vertiefung für andere Oberflächenantikörper;
Direkt zum Monozytenblock hinzufügen  Puffer (50 μ L) und Chemokinrezeptor-Mix (13 μ L, 50+13+117 = 180 μ L insgesamt pro Well)
Transkriptionsfaktor-Antikörper für Transkriptionsfaktor-Panelμ L/gut 
Anti-Mensch T-bet-BV605BioLegend6448174
Anti-Mensch Bcl6-PE-CF594BD5624014
Anti-Mensch FoxP3-Alexa Fluor 488BD5608871.6
Anti-Mensch GATA3-BB700BD5666422
Anti-Mensch Ki67-Alexa Fluor 700BD5612770.4
Anti-Mensch Rorgt-Alexa Fluor 647BD5636202
Brilliant Stain Buffer Plus (RUO)BD56638510
1 x Permeabilisierungspuffer eBioscience00-5523-0016
                           40 μ L Mix pro well
Software und Pakete für unüberwachte Analysen
Software/package<strong>VersionSource
>1data.table1.16.2Das umfassende R-Archiv-Netzwerk
2FlowJO10.9.0Becton, Dickinson and Company
3pheatmap1.0.12Das Comprehensive R Archive Network
4R4.3.2Das Comprehensive R Archive Network
5readxl1.4.3Das Comprehensive R Archive Network
6Rstudio2023.12.1+402Posit PBC
7Seurat5.1.0Das Comprehensive R Archive Network
8SeuratData0.2.2.9001Das Comprehensive R Archive Network
9SpectroFlo3.0Cytek
10tidyverse2.0.0Das Comprehensive R Archive Network
11viridis0.6.5Das Comprehensive R Archive Network
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