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Methodenartikel

Optimierung von Verfahren zur Entnahme von Brustbiopsien und Mastektomieproben für Biobanking, personalisierte Medizin und Forschungsanwendungen

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DOI:

10.3791/67193

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2. September 2025

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1Department of Biology, University of the Philippines Baguio, 2Philippine Genome Center, University of the Philippines, 3Department of Surgery, Philippine General Hospital, University of the Philippines, 4Institute of Biology, College of Science, University of the Philippines Diliman, 5Department of Pathology, College of Medicine, University of the Philippines Manila, 6Institute of Human Genetics, National Institutes of Health, University of the Philippines Manila

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

In diesem Artikel wird ein detailliertes Protokoll für die Entnahme von Brustkrebsproben vorgestellt, das entwickelt wurde, um ihren Nutzen für Biobanking, personalisierte Medizin und andere Forschungsanwendungen zu optimieren. Der Arbeitsablauf für die Probenentnahme, einschließlich Brustbiopsie und Mastektomie, wird detailliert beschrieben, wobei der Schwerpunkt auf der Minimierung von Gewebeschäden und der Maximierung der Probenqualität liegt.

Zusammenfassung

Brustkrebs ist die häufigste Krebserkrankung bei Frauen, insbesondere in Asien, mit der höchsten Inzidenz auf den Philippinen. Trotz laufender Bemühungen ist das Verständnis der Biologie von Brustkrebs nach wie vor unzureichend, was durch den Mangel an effektiven Screening-Programmen und rechtzeitigen Behandlungen noch verstärkt wird. Um diese Probleme anzugehen, haben Biobanken und andere Repositorien für biologische Proben weltweit an Dynamik gewonnen. Das University of the Philippines-Philippine General Hospital (UP-PGH) hat eine Krebs-Biobank eingerichtet und damit die Tragfähigkeit einer von der Regierung unterstützten Initiative zur Krebsforschung auf den Philippinen unter Beweis gestellt. Die Studie umfasst eine prospektive Beobachtung von 100 philippinischen Brustkrebspatientinnen in verschiedenen Krankheitsstadien, wobei die Expertise der UP-PGH, des Philippine Genome Center (PGC) und der University of the Philippines Diliman - Institute of Biology (UPD-IB) genutzt wird. Es integriert die Entnahme, Verarbeitung und Lagerung von Bioproben neben umfassenden Patientendaten. Zu den Verfahren gehören RNA-Extraktion, Bibliothekserstellung und Sequenzierung. Darüber hinaus nimmt eine Untergruppe von Patienten an einem dreidimensionalen (3D) In-vitro-Zellkulturexperiment für das Chemotherapie-Pre-Screening teil. Die aggregierten Daten zielen darauf ab, therapeutische Strategien aufzudecken, die zu personalisierten Behandlungen führen können, bei denen klinische Standardansätze unzureichend sind. Zu den wichtigsten Techniken gehören die ultraschallgesteuerte Biopsie der Kernnadel, die sorgfältige Entnahme von normalem Brustgewebe und die präzise Bestimmung des Tumorprozentsatzes, um eine qualitativ hochwertige RNA-Extraktion, Sequenzierung und 3D-Zellkultur zu gewährleisten. Die Studie befasst sich auch mit Herausforderungen, die bei früheren Biobanking-Projekten aufgetreten sind. Letztendlich zielt diese Forschung darauf ab, einen wesentlichen Beitrag zur Brustkrebsforschung zu leisten und sich als Modell für die gemeinsame Forschung, den Aufbau von Biobanken und die Förderung der Präzisionsmedizin in Entwicklungsländern wie den Philippinen zu positionieren.

Einleitung

Brustkrebs ist die häufigste Krebsform bei philippinischen Frauen. In Asien weisen die Philippinen eine der höchsten Brustkrebs-Sterblichkeitsraten und das niedrigste Verhältnis von Sterblichkeit zu Inzidenzauf 1. Die Raten könnten durch das Fehlen von Screening-Programmen und einer rechtzeitigen und wirksamen Behandlung von Brustkrebs stark beeinflusst worden sein. Im Land wird Brustkrebs in der Regel in späteren Stadien diagnostiziert, da die meisten Krebspatientinnen erst in fortgeschrittenen Krebsstadien konsultiert werden. Auf den Philippinen, wo eine hohe Inzidenzrate von Brustkrebs beobachtet wird, wurden 53 % der Brustkrebsfälle in den Stadien III und IV und nur 2-3 % in den Stadien Idiagnostiziert 1,2,3. Neben der Förderung der Inanspruchnahme von Vorsorgeuntersuchungen und der Patientenaufklärung über Brustkrebs sollte die Forschung und Entwicklung im Zusammenhang mit Brustkrebs weiter ausgebaut werden, um die Brustkrebsinzidenz im Land zu senken.

Die Einrichtung von Biobanken auf der ganzen Welt ermöglichte die Beschleunigung des medizinischen Fortschritts. Biobanken dienen der Lagerung und Konservierung wissenschaftlich wertvoller biologischer Proben für zukünftige Forschung und Entwicklung4. Seitdem werden Biobanken für die translationale Forschung5 und die Verbesserung personalisierter medizinischer Ansätze6 genutzt. In Asien konzentrieren sich Biobanken vor allem auf Ostasien, insbesondere auf China, Japan und Korea4. In asiatischen Ländern mit niedrigem bis mittlerem Einkommen, wie z. B. den Philippinen, steckt das Konzept des Biobankings noch in den Kinderschuhen. Biobanken auf den Philippinen befinden sich meist im Besitz privater Gesundheitseinrichtungen, in denen der Gesundheits- und Expositionsstatus der breiteren philippinischen Bevölkerung möglicherweise nicht gut repräsentiert ist.

Die Einrichtung der Krebs-Biobank am Philippine General Hospital (PGH) der University of the Philippines Manila (UPM) hat die Machbarkeit der Einrichtung einer staatlich unterstützten Krebs-Biobank bewiesen, die krebsbezogene Studien auf den Philippinen vorantreiben kann7. Aufbauend auf dieser Grundlage durch eine gemeinsame Anstrengung, die medizinische Expertise, Forschungsinnovation und Gesundheitspolitik verbindet, bemühen wir uns, eine positive Veränderung in der Landschaft der Brustkrebsversorgung und -forschung auf den Philippinen zu bewirken. Daher ist ein dringender Bedarf an einem Biobanking-Workflow für Krebsphänomene und einem erweiterten Ansatz erforderlich, der die Erfassung umfangreicher und geschichteter patientenspezifischer Daten auf nationaler Ebene rationalisiert. Diese Studie beschreibt das Protokoll für die Entnahme von Brustbiopsien und Mastektomien und konzentriert sich dabei auf deren Integration in den Biobanking-Rahmen. Wir gehen davon aus, dass wir nicht nur unser Verständnis der Pathogenese von Brustkrebs im Kontext der philippinischen Bevölkerung verbessern, sondern auch die Entwicklung von Präzisionsbehandlungen erleichtern können, die auf die einzigartigen genetischen, umweltbedingten und klinischen Eigenschaften der betroffenen Personen abgestimmt sind.

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Protokoll

Dabei handelt es sich um eine prospektive Beobachtungsstudie mit einer Sammlung von anonymisierten Bioproben (Tumor und normales Brustgewebe) und klinisch-pathologischen, Behandlungs- und Ergebnisdaten von 100 philippinischen Brustkrebspatientinnen verschiedener Stadien. Dabei handelt es sich um eine Zusammenarbeit zwischen dem Philippine General Hospital (PGH), dem Philippine Genome Center (PGC) und dem Institute of Biology (IB) der University of the Philippines Diliman, die jeweils mit bestimmten Aufgaben betraut sind. Das Protokoll wurde im Research Grants Administration Office (RGAO-2020-0933) registriert und vom University of the Philippines Manila Research Ethics Board (UPMREB) für die Umsetzung unter der Ethik-Freigabenummer UPMREB 2020-822-01 geprüft und genehmigt. Alle eingesetzten Labore halten sich an die Biosicherheitsrichtlinien der jeweiligen Institution. Die Rekrutierung von Patienten aus PGH stellte die Varianz und Repräsentation in Bezug auf klinisch-pathologische Faktoren, ethnische Zugehörigkeit und Umwelteinflüsse sicher. Eine in früheren Projekten entwickelte und validierte Standardarbeitsanweisung (SOP) diente als Rahmen für die Beschaffung, Entnahme, den Transport und andere logistische Vorkehrungen im Zusammenhang mit den Proben.

HINWEIS: In Abbildung 1 - Diagrammatischer Arbeitsablauf des Protokolls finden Sie eine Zusammenfassung des Protokollablaufs und der Rollen der einzelnen an der Studie beteiligten Institutionen.

1. Verfahren zur Entnahme von Brustproben

  1. Identifizieren und screenen Sie die Patienten, die für die Aufnahme in die Studie in Frage kommen, während einer klinischen Beratung oder einer präoperativen Konferenz.
    1. Einschlusskriterien für Krebspatienten
      1. Dazu gehören philippinische, weibliche Frauen im Alter von 19 bis 75 Jahren, bei denen Brustkrebs im Stadium 1, 2 und 3 diagnostiziert wurde, und philippinische Frauen im Alter von 19 bis 70 Jahren, bei denen Brustkrebs im Stadium 3B und 4 diagnostiziert wurde.
      2. Dazu gehören klinisch vermutete oder pathologisch diagnostizierte Fälle von invasivem Brustkrebs in jedem Stadium.
      3. Eingeschlossen sind Patienten, die sich einer chirurgischen Behandlung (modifizierte radikale Mastektomie oder radikale Mastektomie) entweder im Vorfeld (klinisches Stadium I oder II) oder nach einer neoadjuvanten Chemotherapie (Stadium IIIB, IIIC) unterziehen. Patienten im Stadium IIIA können sich gemäß den Empfehlungen des Arztes entweder einer Operation im Vorfeld oder einer neoadjuvanten Therapie unterziehen. Für Patientinnen im Stadium IV, diejenigen, die bereit sind, sich einer Kernnadelbiopsie des Brusttumors und des angrenzenden normalen Gewebes zu unterziehen. Brustkrebspatientinnen im Stadium IV werden nicht operativ behandelt.
      4. Schließt man Brustkrebspatientinnen im Stadium III ein, die sich vor der Rekrutierung einer neoadjuvanten Therapie unterzogen haben, liegt ein vollständiges medizinisches und klinisches Ansprechen auf die Behandlung vor.
      5. Schließen Sie Patienten ein, die die Einverständniserklärung verstehen und unterschreiben können.
    2. Ausschlusskriterien für Krebspatienten
      1. Ausschluss von Patientinnen mit früherer oder gleichzeitiger Malignität, einschließlich der Vordiagnose von Brustkrebs.
      2. Patientinnen mit beidseitigem Brustkrebs ausschließen.
      3. Patienten ausschließen, die sich zuvor einer neoadjuvanten Strahlen- oder Hormontherapie unterzogen haben.
      4. Ausschluss von Patienten, die sich zuvor einer Stanz- oder Inzisionsbiopsie unterzogen haben, bei denen keine Zustimmung zur Wiederholung des Biopsieverfahrens für Patienten besteht, die sich einer neoadjuvanten Chemotherapie unterziehen (da keine frischen Tumorproben vor der Chemotherapie entnommen werden können)
      5. Patienten ausschließen, die sich zuvor einer Exzisionsbiopsie ohne Resttumor unterzogen haben.
      6. Patienten mit Komorbiditäten, die eine chirurgische Behandlung oder neoadjuvante Chemotherapie ausschließen, sind auszuschließen.
    3. Entnahmekriterien
      1. Informieren Sie die Teilnehmer, dass sie sich aus Sicherheitsgründen oder anderen Gründen jederzeit zurückziehen können, ohne ihre medizinische Versorgung zu beeinträchtigen. Diese nicht-interventionelle Studie hat keinen Einfluss auf die Wahl der Behandlung für die Teilnehmer.
  2. Holen Sie sich die Einwilligung des Patienten ein und füllen Sie das Datenerfassungsformular aus.
    HINWEIS: Der zugewiesene Fellow-in-Charge (FIC) oder der Berater holt zusammen mit dem University Research Associate (URA) die Zustimmung ein.
  3. Holen Sie den Zeitplan des Patienten für das Kernnadelbiopsieverfahren ein und überprüfen Sie ihn, nachdem Sie seine Teilnahme an der Studie bestätigt haben.
  4. Durchführung von Verfahren in Übereinstimmung mit den Richtlinien, die vom Ethikausschuss und dem Biosicherheitsausschuss der Institution festgelegt und genehmigt wurden.

2. Verfahren zur Entnahme von Brustbiopsieproben

HINWEIS: In Abbildung 2 finden Sie den detaillierten Arbeitsablauf des Nadelbrustbiopsieverfahrens für Patientinnen im Stadium III und IV, der die Verteilung der Proben für jedes Verfahren zeigt.

  1. Beschriften Sie die Röhrchen vor der Probenentnahme als GB, d. h. Genomics - Breast (die Studie, in der sich die Probe befindet), xxx, was die Teilnehmernummer ist und zwischen 001 und 100 oder mehr liegen kann, und die Buchstaben A, C und D. Im Folgenden sind die Buchstabencodes aufgeführt, die für die Beschriftung der Tuben verwendet werden sollen:
    A - bedeutet Kernnadelbiopsie, Tumorgewebe, für den Versand an das PGC
    C - bedeutet Kernnadelbiopsie, Tumorgewebe, für Biobanking
    D - bedeutet Kernnadelbiopsie, normales Gewebe
    1. Weisen Sie den zur Sequenzierung eingesandten Proben das Etikett des Labors zu: "BC" und zwei zweistellige Probennummern (z. B. BC01, BC21). Jede Probe hat einen entsprechenden "GB"-Code, der mit dem Code korreliert, der bei der Probenentnahme zugewiesen wurde.
  2. Entnahme von bis zu neun Gewebekernen mit einer 14-G-Kernnadel-Biopsiepistole unter Ultraschallkontrolle, in einer Ambulanz, einem Operationssaal oder einer anderen aseptischen Umgebung.
    1. Entnehmen Sie für jeden Kern eine Brustprobe von etwa 2 cm Länge in der Mitte des Tumors und 1 cm vom Tumor entfernt für angrenzendes normales Gewebe. Sammeln Sie von jedem Teilnehmer zwei Arten von Proben: Tumorgewebe und normales Gewebe.
    2. Übergeben Sie jede Probe an das URA, um sie in eine Petrischale zu geben, die phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) enthält.
      HINWEIS: In dieser Studie wurden Kernnadelbiopsien nur bei Patientinnen mit Brustkrebs im Stadium III und IV durchgeführt. Bei Patienten im Stadium III lieferten Kernnadelbiopsien Chemotherapie-naive Tumorproben. Bei Patienten im Stadium IV dienten Stanzbiopsien als Primärtumorprobe, da keine Mastektomie durchgeführt wurde. Bei Patientinnen mit Brustkrebs im Stadium I und II wurden keine Kernnadelbiopsien durchgeführt. Stattdessen wurden Tumor und angrenzendes normales Gewebe aus Mastektomieproben gewonnen.
  3. Schneiden Sie die Biopsieproben in zwei Hälften, um sie gleichmäßig zwischen der Studie und der histopathologischen Analyse zu verteilen.
    1. Für Tumorgewebe erhalten Sie bis zu 9 Kerne pro Studienpatient mit einer 14-G-Nadel.
    2. Trennen Sie die gewonnenen Tumorkerne in der Petrischale in 2 Gruppen: Proben für die RNA-Analyse (6 Kerne) und Proben für das Biobanking (3 Kerne).
    3. Schneiden Sie jeden Kern der Länge nach in 2 Teile, aber in Fällen, in denen dies schwierig ist, schneiden Sie die Kerne quer in 2. Verwende eine sterile Klinge, um die Kerne zu schneiden. Senden Sie die Hälfte des Gewebekerns zur RNA-Analyse oder lagern Sie ihn für das Biobanking. Senden Sie die andere Hälfte des Gewebekerns zur routinemäßigen histopathologischen Analyse an die Pathologie.
    4. Für normales Gewebe erhalten Sie bis zu 3 Kerne pro Studienpatient mit einer 14-G-Nadel. Verwenden Sie eine andere Nadel als die, die zur Gewinnung von Tumorgewebe verwendet wird, um eine Kontamination zu vermeiden. In Fällen, in denen dies nicht möglich ist, entnehmen Sie zuerst normales Brustgewebe, bevor Sie Tumorgewebe erhalten.
    5. Legen Sie jedes gewonnene normale Gewebe in eine Petrischale, ähnlich wie es mit dem Tumorgewebe gemacht wurde, und schneiden Sie die Kerne in zwei Hälften. Verteilen Sie die Proben für die Studie und an die Pathologie für die histopathologische Analyse.
  4. Nach der Probenentnahme verteilen Sie die Proben auf die Röhrchen in einer Art und Reihenfolge ihrer Priorität.
    1. Die Hälfte der Kerne wird in das dafür vorgesehene 2-ml-Kryofläschchen gegeben, das mit 1,25 ml RNA-Stabilisierungslösung vorgefüllt ist (alle Kerne für die RNA-Analyse werden zusammen in 1 Fläschchen und alle Kerne für die Biobank in einem separaten Fläschchen aufbewahrt, die Proben werden immer bei kalter Temperatur gehalten) und die entsprechenden Hälften dieser Kerne werden in ein gewöhnliches Probenfläschchen/-röhrchen gegeben und mit 10 % neutral gepuffertem Formalin (10 % NBF) fixiert. für histopathologische Analysen. Stellen Sie sicher, dass die beiden entsprechenden Halbgruppen, diejenige, die an das angegebene Zentrum geht (z. B. Proben, die zur RNA-Analyse geschickt werden), und die entsprechende Pathologie-Probe denselben Probencode haben.
  5. Füllen Sie die Formulare für die chirurgische Pathologie aus. Senden Sie zusammen mit den Formularen die mit Formalin fixierten Pathologieproben an die Pathologie für die routinemäßige Histopathologie.
  6. Versiegeln Sie die in Röhrchen mit RNA-Stabilisierungslösung getränkten Kernnadel-Biopsieproben mit Parafilm (idealerweise 5:1 Verhältnis von Lösung zu Gewebe, also bei 0,25 cm Gewebe 1,25 ml RNA-Stabilisierungslösung).
  7. Lagern Sie die Proben 24 Stunden lang bei 4 °C und geben Sie sie dann in den Ultratiefkühlschrank mit einer Temperatur von -80 °C.
    HINWEIS: Eine Anleitung zur Lagerung wird in Abschnitt 4 (Lagerung, Verpackung und Transport von Proben) behandelt.

3. Verfahren zur Probenentnahme bei Brustmastektomie

  1. Befolgen Sie das Verfahren zur Entnahme von Brustproben in Abschnitt 1.
    HINWEIS: Patienten der Stadien I, II und III, die in die Studie aufgenommen wurden, werden im Operationssaal (OP) einer Mastektomie unterzogen. Bei Patienten der Stadien I und II wird die Mastektomie im Voraus durchgeführt, während bei Patienten im Stadium III die Mastektomie erst nach Abschluss von 8 Zyklen der neoadjuvanten Therapie durchgeführt wird. Für Stufe 4 werden keine Mastektomieproben entnommen. In Abbildung 3 finden Sie das detaillierte Protokoll zur Probenentnahme bei Brustmastektomie, das die Verteilung der Proben pro Eingriff zeigt.
  2. Koordinieren Sie den Zeitplan mit den Mitarbeitern und der Pathologieabteilung. Tun Sie dies mindestens 2 Tage vor dem Zieldatum des Eingriffs. Im Falle von Änderungen des festgelegten Zeitplans informieren Sie sofort das betroffene Personal, um Konflikte im Zeitplan zu vermeiden.
  3. Beschriften Sie die Röhrchen vor der Probenentnahme als GB, d.h. Genomics Breast (die Studie, in der sich die Probe befindet), xxx, was die Teilnehmernummer ist und zwischen 001 und 100 oder mehr liegen kann, und die Buchstaben E und F. Im Folgenden sind die Buchstabencodes aufgeführt, die für die Beschriftung der Tuben verwendet werden sollen:
    E - bedeutet Mastektomie, Tumorgewebe, für den Versand an PGC, IB und für Biobanken
    F - bedeutet Mastektomie, normales Gewebe
    1. Weisen Sie den zur Sequenzierung eingesandten Proben das Etikett des Labors zu: "BC" und eine zweistellige Probennummer (z. B. BC01, BC21). Jede Probe hat einen entsprechenden "GB"-Code, der mit dem Code korreliert, der bei der Probenentnahme zugewiesen wurde.
  4. Füllen Sie die chirurgischen Pathologieformulare während der Operation aus, während Sie auf die Probe warten. Senden Sie Updates an den zuständigen Pathologen, damit dieser alle notwendigen Vorbereitungen für die Probenentnahme treffen kann.
  5. Legen Sie die Probe sofort nach der Entnahme und Dokumentation der Brustprobe in einen sauberen Plastik-/Probenbeutel. Stellen Sie sicher, dass die Mastektomieprobe sofort zur Untersuchung in die Pathologie gebracht wird, um die kalte ischämische Zeit zu minimieren. Legen Sie die Probe bei der Einreichung nicht in Formalin.
    HINWEIS: Beispielfotos von Aktionen während der Mastektomie sind in Abbildung 4 dargestellt (Repräsentative Bilder der Probenentnahme während des Mastektomie-Eingriffs).
  6. Von jeder Probe werden beim Groben zwei Arten von Proben entnommen: Tumorgewebe und normales Gewebe.
    1. Tumorgewebe
      1. Entnehmen Sie mindestens einen Block (vorzugsweise mehr) mit den Maßen 1 cm × 1 cm × 1 cm Tumorgewebe pro Probe.
      2. Schneiden Sie den erhaltenen Gewebeblock weiter in zwei Teile, wobei jeder halbe Block 1 cm × 0,5 cm × 0,5 cm misst. Übergeben Sie die Hälfte des Gewebeblocks an das URA für das Biobanking und die Analyse und fixieren Sie die andere Hälfte in Formalin für die routinemäßige Histopathologie.
      3. Trisektionieren Sie den halben Block aus frischem Gewebe gleichmäßig. Dies ist für die RNA-Sequenzierung, das Biobanking und die Organoidkultur vorgesehen.
      4. Für die RNA-Sequenzierung: Sofort in vorgekühlte, vormarkierte 5-ml-Kryoröhrchen geben, die mit 2,5 mL RNA-Stabilisierungslösung vorgefüllt sind (nicht länger als 30 Minuten, muss immer kalt gehalten werden).
      5. Für Biobanking: Sofort in vorgekühlte, vormarkierte und vorgefüllte 5-ml-Kryoröhrchen mit 2,5 mL RNA-Stabilisierungslösung geben (nicht länger als 30 Minuten, muss immer kalt gehalten werden).
      6. Für die Organoidkultur: Sofort in vorgekühlte, vormarkierte und vorgefüllte konische 15-ml-Fläschchen mit 5 mL Gewebeaufbewahrungslösung und 0,01 mL Primocin geben (nicht länger als 30 Minuten, muss immer kalt gehalten werden). Sammeln Sie in einem konischen Röhrchen ein Drittel aller Tumorblöcke, die aus verschiedenen Schnitten der Probe gewonnen wurden.
    2. Normales Gewebe
      1. Besorgen Sie sich pro Probe mindestens einen Block (vorzugsweise mehr) mit den Maßen 1 cm × 1 cm × 1 cm normales Brustgewebe.
      2. Schneiden Sie den erhaltenen Gewebeblock weiter in zwei Teile, wobei jeder halbe Block 1 cm × 1 cm × 0,5 cm misst. Übergeben Sie die Hälfte des Gewebeblocks an das URA für das Biobanking und die Analyse und fixieren Sie die andere Hälfte in Formalin für die routinemäßige Histopathologie.
      3. Schneiden Sie den Gewebeblock für die Studie gleichmäßig in zwei Teile. Diese sind für die RNA-Sequenzierung und das Biobanking vorgesehen.
      4. Für die RNA-Sequenzierung: Sofort in vorgekühlte, vormarkierte 5-ml-Kryoröhrchen geben, die mit 2,5-ml-Kryoröhrchen mit RNA-Stabilisierungslösung vorgefüllt sind (nicht länger als 30 Minuten, immer bei kalter Temperatur aufbewahren).
      5. Für das Biobanking sofort in vorgekühlte, vormarkierte und vorgefüllte 2,5-ml-Kryoröhrchen mit RNA-Stabilisierungslösung geben (nicht länger als 30 Minuten, immer bei kalter Temperatur aufbewahren).
        HINWEIS: Tumorproben mit der Bezeichnung "E" werden in der Regel aus drei oder mehr verschiedenen Abschnitten der Probe gewonnen. Um Verwechslungen zu vermeiden, sollten Tumorproben, die für die RNA-Analyse und das Biobanking bestimmt sind, in separate Röhrchen mit den Bezeichnungen E1, E2, E3 usw. gegeben werden, während gepoolte Tumorproben, die für die Zellkultur bestimmt sind, in Röhrchen mit der einfachen Beschriftung E gegeben werden sollten. Bei Proben, die mit E1, E2 und E3 gekennzeichnet sind, sollte die relative Position/Lokalisation jeder Gewebeprobe in Bezug auf den Tumor (z. B. Mitte, 10-Uhr-Position) aufgezeichnet werden.
  7. Verschließen Sie die Kryoröhrchen mit den Proben aus der Mastektomie mit Parafilm.
  8. Lagern Sie die Kryofläschchen 24 Stunden lang bei 4 °C und stellen Sie sie dann für die Langzeitlagerung in den Ultratiefkühlschrank mit einer Temperatur von -80 °C.
  9. Verpacken Sie das konische Röhrchen mit den gepoolten Tumorblöcken und bereiten Sie es für den Transport vor. Diese Tumorblöcke werden für die Zellkultur in Organoiden verwendet.

4. Lagerung, Verpackung und Transport von Proben

  1. Alle Kryoröhrchen, die den Tumor und normales Gewebe enthalten, sofort mit Parafilm verschließen und bei 4 °C für 24 h lagern. Nach 24 h werden die Röhrchen für ca. 2-4 h auf -20 °C und schließlich auf unbestimmte Zeit auf -80 °C umgestellt, um sie bis zum Transport langfristig zu lagern.
  2. Aktualisieren Sie den Probentracker und die Datenbank vor dem Transport von Proben für die RNA-Analyse, einschließlich der Ergebnisse der routinemäßigen Histopathologie und der Tumorprozentsätze, um die Identität der Probe sicherzustellen.
  3. Erstellen Sie vor dem Transport ein Transportmanifest für jede Probe. Stellen Sie sicher, dass der Verpackungsprozess schnell abläuft und die Röhrchen mit den Proben nicht über einen längeren Zeitraum bei Raumtemperatur (RT) belassen werden.
    1. Verschließen Sie alle Kryofläschchenkappen mit Parafilm, um ein Auslaufen zu verhindern.
    2. Lege alle Röhrchen in ein Reagenzglasgestell.
    3. Stellen Sie den Temperaturlogger ein und platzieren Sie ihn für den Transport neben den Röhrchen über dem Gestell.
    4. Wickeln Sie die Tuben mit saugfähigem Material und dann mit Luftpolsterfolie ein und legen Sie die Gegenstände in den wiederverschließbaren Beutel. Stellen Sie sicher, dass der Temperaturlogger die Temperatur aufzeichnet und dass die Röhrchen intakt und aufrecht positioniert sind, bevor Sie die Gegenstände im Beutel verschließen.
    5. Legen Sie die Gelpacks auf den Boden des Styropor-Versandkartons und legen Sie dann den wiederverschließbaren Beutel mit den Tuben auf die Gelpacks. Legen Sie eine weitere Schicht Gelpacks auf den Beutel. Stellen Sie sicher, dass die Röhrchen zwischen den Gelpacks eingeklemmt sind, um sicherzustellen, dass die Proben während des Transports kalt bleiben.
    6. Verschließen Sie die Styroporschachtel und legen Sie sie in einen Versandkarton aus Karton. Wenn kein großer Karton zur Verfügung steht, verwenden Sie einen größeren Styroporkarton. Legen Sie das ausgefüllte Transportmanifest in einen Druckverschlussbeutel und legen Sie es in den Karton. Die Platzierung der Elemente in der Box ist in Abbildung 5 dargestellt.
    7. Verschließen Sie den Karton und bringen Sie das entsprechende Versandetikett außerhalb des Kartons an.
  4. Informieren Sie den Empfänger über den Zeitplan für die Probenentnahme und wann die geplante Zusendung der Proben erfolgen wird.
    1. Für die Organoidkultur werden nur Tumorgewebe aus Mastektomien geschickt und verwendet. Stellen Sie sicher, dass diese frisch, auf nassem Eis und innerhalb von 24 Stunden nach der Probenentnahme geliefert werden. Sobald die Proben verpackt und die Box versiegelt ist, buchen Sie schnell einen Kurier, um sie zu transportieren. Stellen Sie sicher, dass die Boxen nicht über längere Zeit in Bereichen mit hohen Temperaturen belassen werden, da ein starker Temperaturabfall oder -anstieg die Lebensfähigkeit der Proben beeinträchtigen kann.
    2. Notieren Sie sich vor der Übergabe an den Kurier die Anzahl der versandten Fläschchen/Röhrchen und den Zeitpunkt, zu dem der Kurier die Biobank verlassen hat. Stellen Sie bei der Ankunft des Pakets sicher, dass der Empfänger Folgendes zur Kenntnis nimmt: Ankunfts- und Empfangszeit im angegebenen Zentrum, Temperatur bei der Ankunft, Anzahl der erhaltenen Fläschchen/Röhrchen und alle kompromittierten Proben
    3. Prüfen Sie bei der RNA-Analyse, ob die zu liefernden Proben ein entsprechendes histopathologisches Ergebnis und Tumoranteile von der Abteilung Chirurgische Pathologie aufweisen, bevor Sie Proben zur RNA-Analyse einsenden. Identifizieren und wählen Sie für jeden Patienten, der zur RNA-Extraktion eingereicht werden soll, den Gewebeblock mit dem höchsten Tumorgehalt aus. Transportieren Sie nur Proben mit Tumoranteilen.
    4. Senden Sie die Proben in Gruppen von nicht mehr als 40 Personen, um die Stapelverarbeitung zu erleichtern. Wählen Sie eine beliebige Kombination aus Tumorgewebe aus einer Kernnadelbiopsie oder Mastektomie und normalem Gewebe aus der Mastektomie. Überprüfen Sie die folgenden Bedingungen, wenn normales Gewebe aus der Kernnadelbiopsie transportiert werden soll:
      -Als Stadium 3 aufgenommen, aber das histopathologische Ergebnis zeigt Stadium 4 an
      -Aufnahme in das Stadium 3, aber histopathologisches Ergebnis zeigt ein lokoregionales Fortschreiten der Erkrankung.
    5. Stellen Sie sicher, dass alle Proben auf nassem Eis transportiert werden. Ähnlich wie beim Versand von Proben für 3D-Zellkulturen sollte nach dem Verpacken der Proben und dem Verschließen der Box umgehend ein Kurier für den Transport gebucht werden. Vermeiden Sie es, die Boxen über einen längeren Zeitraum in Bereichen mit hohen Temperaturen zu lassen, da erhebliche Temperaturschwankungen die Lebensfähigkeit der Proben beeinträchtigen können.
    6. Notieren Sie sich vor der Übergabe an den Kurier die Anzahl der versandten Fläschchen/Röhrchen und den Zeitpunkt, zu dem der Kurier die Biobank verlassen hat. Beachten Sie bei der Ankunft des Pakets Folgendes: Ankunfts- und Empfangszeit im angegebenen Zentrum, Temperatur bei der Ankunft, Anzahl der erhaltenen Fläschchen/Röhrchen und alle kompromittierten Proben (falls vorhanden).
  5. Aktualisieren Sie die Datenbank der gesendeten Proben und geben Sie alle notwendigen Informationen ein, die vor der weiteren Verarbeitung der Proben erforderlich sind. Überwachen und bewerten Sie die Datenbank einmal pro Woche.

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Ergebnisse

Bei der Entnahme von Proben während der Kernnadelbiopsie hatte die Durchführung des Verfahrens unter Ultraschallkontrolle einen großen Einfluss auf den Patientenkomfort und die Effizienz des Arbeitsablaufs sowie auf die RNA-Integrität der Proben. Geschieht dies nicht, werden möglicherweise nicht die erwarteten Ergebnisse erzielt, und die Patienten müssen in die Kliniken zurückkehren, um den Eingriff zu wiederholen, wodurch sich die Probenentnahme und -verarbeitung verlängert.

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Diskussion

Die erfolgreiche Implementierung dieses Protokolls hängt nicht nur von der technischen Präzision ab, sondern auch von der Koordination von klinischen und Forschungsteams, um eine gleichbleibende Probenqualität und Datenintegrität zu gewährleisten. Dieses Protokoll umfasst mehrere wichtige Verfahren, die darauf ausgelegt sind, die diagnostische Genauigkeit zu maximieren und qualitativ hochwertige Bioproben zu generieren, die für nachgelagerte molekulare Analysen geeignet sind. Zu den wich...

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Offenlegungen

Die Autoren haben keinen Interessenkonflikt, weder finanziell, persönlich noch institutionell, offenzulegen.

Danksagungen

Diese Forschung wird vom Department of Science and Technology des Philippine Council for Health Research and Development (DOST-PCHRD) finanziert und in Zusammenarbeit mit dem Philippine Genome Center (PGC) und der University of the Philippines Diliman - Institute of Biology (UPD-IB) durchgeführt. Die Autoren danken auch Herrn Lech Havel Tizon, Herrn Conrad Chong und Frau Susan Valibia für ihre Unterstützung bei der Optimierung dieses Protokolls sowie den Assistenzärzten der Pathologie, die an den Dreharbeiten zu diesem Protokoll mitgewirkt haben, Dr. Clarisse Veronica Mirhan und Dr. Patricia Franco.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
37%-FormalinlösungPHILUSA CorporationN/AVerwendet als Konservierungsmittel von Geweben für histopathologische Analysen
70 % IsopropylalkoholGreen Cross Inc.N/AAls Desinfektionsmittel verwendet
BarcodedruckerZebraGC420tFür das Drucken von Barcode-Etiketten, die in Etikettierröhrchen verwendet werden, die die Proben enthalten
BleichmittelGreen Cross Inc.N/AAls Desinfektionsmittel verwendet; zur Dekontamination chirurgischer Instrumente
Blaue EispacksRubbermaid1002Zum Aufbewahren von Proben bei niedrigen Temperaturen während des Transports
Kernnadelbiopsie 14-G-NadelBardeMN1410Ein invasives röhrenförmiges chirurgisches Instrument, das mit einem Biopsiepistolen-Handstück verbunden werden kann, um eine kleine Gewebeprobe aus einer anatomischen Struktur (eine Biopsie) automatisch zu entnehmen, während dabei minimale Gewebeschäden entstehen, für die gewebspathologische Untersuchung/Untersuchung.
Kernnadel-BrustbiopsiepistoleBardeMG1522Wiederverwendbares Kernbiopsieinstrument, das bei der Entnahme von Gewebeproben während der Nadelkernbiopsie verwendet wird
Einweg-Petrischale 90 mm x 15 mmPhoenix Biomedizinische ProdukteLOS: 20220206Verwendet bei der Kernnadelbiopsie beim Eintauchen von Geweben in PBS
Dulbeccos phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)Thermo Fisher Scientific21600010Eine ausgewogene Salzlösung, die für verschiedene Zellkulturanwendungen verwendet wird, wie zum Beispiel das Waschen von Zellen vor der Dissoziation, den Transport von Zellen oder Gewebe, das Verdünnen von Zellen zum Zählen und die Herstellung von Reagenzien. 
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Kimtech Science KimWipes empfindliche AufgabenwischerKimberly Clark ProfiKC341204,3 x 8,4 Zoll. (11,0 cm x 21,3 cm); 1-lagige 280 Count; Für die Reinigung von Oberflächen, Teilen, Instrumenten und Arztpraxen reinigen diese Tücher leicht Flüssigkeiten, Staub und kleine Partikel.
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MikropipetteShanghai Lichen Instrument Technology Co., Ltd.STEM-GC-3197-YFür das Pipetieren/Übertragen von Flüssigkeiten in kleinen Mengen
MikropipettenspitzenTarsons521100Für das Pipetieren/Übertragen von Flüssigkeiten in kleinen Mengen
ParafilmParafilm M5259-04LC PM996Für luftdichte und feuchtigkeitsdichte Abdichtung der Schläuche, um Undichtigkeiten zu verhindern
Primocin 250 mg (5 x 1 ml)InvivoGenANT-PM-05Verwendet zum Schutz von Geweben vor mikrobieller Kontamination
Kühlschrank (4 & Grad; C)LGModell: GR-Y331SLZBZur Aufbewahrung von Gewebeproben und Reagenzien
RNAlater-LösungThermo Fisher ScientificAM7021RNA-Stabilisierungslösung, die zur Speicherung und zum Biobanking von Geweben verwendet wird
Sterile 15 mL konische Röhre Thermowissenschaftlich339650Verwendet zur Herstellung von Aliquoten von Reagenzien/Medien, die in der Gewebelagerung verwendet werden
Sterile 5-mL-KryovialeThermowissenschaftlich5000-1020Verwendet zur Herstellung von Aliquoten von Reagenzien/Medien, die in der Gewebelagerung verwendet werden
Sterile Skalpellklinge (#11)SurgitechN/AZum Zerschneiden von Tumor- und normalen Brustgeweben
Chirurgische Schere (18,5 cm 7 & Frac14; " str)Olten-InstrumenteBO-0125Zum Zerschneiden von Tumor- und normalen Brustgeweben
TemperaturloggerExtech Instruments42280Zur Aufzeichnung von Temperatur und Luftfeuchtigkeit während des Transports von Proben
GewebetinteEpredia3120123Zum Färben der Ränder entfernter chirurgischer Proben für histopathologische Analysen
Ultra-niedriger GefrierkühlerHaier BiomedicalDW-86L579Für unbegrenzte Lagerung von Tumor- und normalen Brustgeweben
Urinprobenbehälter 60 mlSichere Wache0016UCS06PCZur Speicherung von Geweben für histopathologische Analysen
Ziplock-BeutelReynolds Consumer Products LLCVerwendet beim Verpacken der Proben für den Transport

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