Method Article

Akute Einzel-Multi-Elektroden-Ableitungen aus dem Hirnstamm von Mäusen mit fixiertem Kopf

DOI:

10.3791/67205

⸱

October 11th, 2024

 ,  ,  , 
1Department of Anesthesiology, University of Virginia, 2Neuroscience Graduate Program, University of Virginia, 3Department of Pharmacology, University of Virginia

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode, um in vivo Einzelneuronen-Aufzeichnungen mit hoher Dichte aus dem Hirnstamm von kopffixierten Mäusen zu erhalten. Dieser Ansatz wird eingesetzt, um das Aktionspotentialfeuer von Neuronen im ventrolateralen periaquäduktalen Grau - einer Hirnstammregion, die während des REM-Schlafs (Rapid Eye Movement) inaktiv ist - vor und während der Vollnarkose zu messen.

Abstract

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Silizium-Multielektroden-basierte Aufzeichnungen werden immer beliebter, um die neuronale Aktivität bei der zeitlichen Auflösung von Aktionspotentialen in vielen Hirnregionen zu untersuchen. Die Aufzeichnung der neuronalen Aktivität von tiefen kaudalen Strukturen wie dem Hirnstamm mit Mehrkanalsonden bleibt jedoch eine Herausforderung. Ein wesentliches Anliegen ist es, einen Pfad für das Einführen der Sonde zu finden, der große Blutgefäße wie den oberen sagittalen Venensinus und den transversalen Venensinus vermeidet. Eine Verletzung dieser großen Venen kann zu starken Blutungen, Schäden am darunter liegenden Hirngewebe und möglicherweise zum Tod führen. Dieser Ansatz beschreibt das Targeting von Hirnstammstrukturen, indem anteriore Koordinaten mit einem abgewinkelten Ansatz gekoppelt werden, wodurch die Aufzeichnungssonde das Gehirn unterhalb von Gefäßstrukturen mit hohem Risiko durchdringen kann. Im Vergleich zu einem streng vertikalen Ansatz maximiert der abgewinkelte Ansatz die Anzahl der Gehirnregionen, die anvisiert werden können. Mit dieser Strategie kann reproduzierbar und zuverlässig auf das ventrolaterale periaquäduktale Grau (vlPAG), eine Hirnstammregion, die mit dem REM-Schlaf assoziiert ist, zugegriffen werden, um Einzel-, Mehrelektroden-Aufzeichnungen bei Mäusen mit fixiertem Kopf vor und während der Sevofluran-Anästhesie zu erhalten. Die Möglichkeit, die neuronale Aktivität im vlPAG und den umgebenden Kernen mit hoher zeitlicher Auflösung aufzuzeichnen, ist ein Schritt nach vorne, um das Verständnis der Beziehung zwischen REM-Schlaf und Anästhesie zu verbessern.

Introduction

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Silizium-Multielektroden-basierte Aufzeichnungen werden immer beliebter, um die neuronale Aktivität in vielen Gehirnregionen mit einer Auflösung von Einzelaktionspotentialenzu messen 1,2,3,4. In den letzten zehn Jahren hat die High-Density-Recording-Technologie erheblich zugenommen. Aktuelle Aufzeichnungselektroden auf Silizium können hohe Kanalzahlen, optische Fasern und Elektrokortikographie-Aufzeichnungsgeräte (ECoG) aufnehmen 5,6. Darüber hinaus ermöglicht die chronische Implantation dieser Elektroden Langzeitaufzeichnungen 7,8.

Trotz der jüngsten technologischen Fortschritte bleibt es eine Herausforderung, tiefe kaudale Strukturen wie den Hirnstamm mit Mehrkanalsonden zu erreichen. Bei der Ausrichtung auf Hirnstammstrukturen wie das ventrolaterale periakquäduktale Grau (vlPAG) besteht ein wesentliches Hindernis darin, eine Sondentrajektorie zu identifizieren, die wichtige Blutgefäße vermeidet, z. B. den Sinus sagittalis superior und den venösen Sinus transversal. Eine Verletzung dieser großen Venen kann zu starken Blutungen, Schäden am darunter liegenden Hirngewebe und sogar zum Tod führen 9,10. Wir schlagen vor, Hirnstammstrukturen von anterioren Koordinaten aus in einem Winkel anzuvisieren, so dass die Aufzeichnungssonde das Gehirn unterhalb solcher hochriskanten Gefäßstrukturen durchdringen kann (siehe Abbildung 1). Dieser abgewinkelte Ansatz maximiert im Vergleich zu einem vertikalen Ansatz die Anzahl der Gehirnregionen, die für die Aufzeichnung zugänglich sind. Darüber hinaus bietet der abgewinkelte anteriore Zugang unter experimentellen Bedingungen, in denen ECoG-Aufzeichnungen gewünscht sind, mehr Schädeloberfläche für die Implantation des ECoG-Headsets, da das Kraniotomiefenster für das Einführen der Sonde weiter nach vorne positioniert ist10,11.

Die Identifizierung der spezifischen Zellgruppen und Schaltkreise, die für anästhesieinduzierte REM-Schlafveränderungen verantwortlich sind, bleibt ein wichtiges Ziel der Anästhesieforschung. Daher bestand das Ziel darin, reproduzierbar und zuverlässig auf das vlPAG - eine Hirnstammregion, die mit dem REM-Schlaf assoziiert ist - zuzugreifen, um Einzel-Mehrelektroden-Aufzeichnungen in Maus mit fixiertem Kopf vor und während der Sevofluran-Anästhesie zu erhalten12,13. Frühere Studien haben elektrophysiologische LFP-Messungen (Local Field Potential) des vlPAG bei wachen Mäusen verwendet, um Veränderungen des neuronalen Zustands im Zusammenhang mit der Anästhesie zu identifizieren14,15. LFP-Messungen sind jedoch in erster Linie empfindlich gegenüber synaptischer Aktivität, nicht auf Aktionspotentialen, innerhalb des aufgezeichneten Bereichs16. Folglich gibt es nach wie vor ein begrenztes Verständnis darüber, wie Anästhetika die von vlPAG-Neuronen produzierten neuronalen Aktivitätsmuster direkt beeinflussen. Hier wird ein Verfahren beschrieben, um High-Density-Einzelneuronen-Ableitungen aus dem Hirnstamm von kopffixierten Mäusen zu erhalten. Diese Methode kann auch angepasst werden, um die Aktivität einzelner Neuronen aus verschiedenen anderen tiefen und hinteren Hirnstammstrukturen aufzuzeichnen.

Protocol

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Alle Studien wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee der University of Virginia (Charlottesville, Virginia) genehmigt. Es wurden fünf männliche C57BL/6J-Mäuse im Alter von 3-7 Monaten mit einem Gewicht von 25-30 g verwendet. Die Details zu den hier verwendeten Reagenzien und Geräten sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Implantation der Kopfplatte und des Headsets

  1. Stellen Sie ein ECoG-Headset her, indem Sie einen mit Perfluoralkoxy (PFA) beschichteten Edelstahldraht an eine 3-polige Steckerleiste löten (Abbildung 2A).
  2. Identifizieren Sie die Einfügekoordinaten anhand eines stereotaktischen Atlas17 der Maus. Die Verwendung des Satzes des Pythagoras zur Berechnung des Winkels und der Tiefe der Sondeneinführung - insbesondere wenn es nur wenige Informationen in der Literatur gibt - ist ein vernünftiger Ausgangspunkt (Abbildung 1)18.
    HINWEIS: Letztendlich werden die Koordinaten durch Versuch und Irrtum angepasst. Um den vlPAG zu bestimmen, wurden bei adulten Mäusen die folgenden Koordinaten verwendet: anteroposterior (AP) -3,6 mm, mediolateral (ML) +0,5 mm, dorsoventral (DV) -4 mm. Die Sonde wurde in einem Winkel von 20° (AP) eingeführt.
  3. Induzieren Sie eine Vollnarkose, indem Sie die Maus in die Induktionskammer legen (1,5%-3% Isofluran in Sauerstoff). Nach der Betäubung positionieren Sie die Maus im stereotaktischen Rahmen, platzieren Sie die Nase des Tieres im Nasenkegel und stabilisieren Sie den Kopf mit Kopfstangen.
  4. Tragen Sie eine Augensalbe auf die Augen auf, um Hornhautschäden zu vermeiden. Verwenden Sie ein Temperaturkontrollsystem, um die Körpertemperatur auf 37 °C zu halten.
  5. Tragen Sie Haarentfernungscreme oder Rasierfell auf die Kopfhaut auf und desinfizieren Sie sie mit Povidon, Jod und 70% Alkohol. Verwenden Sie die aseptische Technik "Nur Spitzen", um ein steriles Operationsfeld zu erhalten.
  6. Führen Sie einen Zehenquetschtest durch, um die Tiefe der Anästhesie zu überprüfen.
  7. Analgesie verabreichen: Carprofen 2,5 mg/kg, subkutan in den Rücken verabreicht.
  8. Machen Sie einen 5 mm großen Schnitt an der Kopfhaut, um einen kreisförmigen Hautfleck über dem Scheitel- und Hinterhauptbein zu entfernen. Entfernen Sie vorsichtig die Hirnhäute, indem Sie sie mit der Skalpellklinge abkratzen.
  9. Mit der Skalpellklinge Muskelansätze durchtrennen und die Scheitel- und Hinterhauptknochen freilegen19. Tragen Sie bei Bedarf Wasserstoffperoxid auf, um Blutungen zu kontrollieren und die Schädeloberfläche zu trocknen. Es ist wichtig, Zahnzement und Harz auf den trockenen Schädel aufzutragen, um eine starke Verbindung zu erreichen.
  10. Identifizieren Sie zunächst die Bregma- und Lambda-Landmarken auf dem Schädel20. Passen Sie dann die Position des Nasenkonus an, um die anterior-hintere Position des Schädels zu nivellieren, wobei Sie sicherstellen, dass zwischen den beiden Landmarken kein Höhenunterschied von mehr als 100 μm besteht.
  11. Um die medial-laterale Position des Schädels zu nivellieren, wählen Sie zwei gegenüberliegende Punkte zwischen Bregma und Lambda, die jeweils 1 mm von der sagittalen Naht entfernt sind, und überprüfen Sie deren Höhe. Wenn zwischen ihnen ein Höhenunterschied von mehr als 100 μm besteht, passen Sie die medial-laterale Position des Schädels an, indem Sie die Kopfstangen manipulieren.
  12. Messen Sie den Abstand zwischen Bregma und Lambda und vergleichen Sie ihn mit dem im stereotaktischen Atlas von Franklin-Paxinos angegebenen Abstand (normalerweise 4,2 mm)17. Verwenden Sie die Differenz zwischen den gemessenen und den gemeldeten Entfernungen, um Ihre AP-Koordinate proportional zu skalieren. Markieren Sie die Kraniotomie-Koordinaten mit einem sterilisierten Bleistift auf dem Schädel.
    HINWEIS: Wenn der gemessene Bregma-Lambda-Abstand von 4,2 mm abweicht, müssen die Koordinaten proportional skaliert werden. Alle AP-Koordinaten, die in einem stereotaktischen Atlas angegeben sind, entsprechen einer standardisierten Bregma-Lambda-Entfernung. Da die Größe eines Mäuseschädels variabel ist, ist es wichtig, dass Sie Ihre Koordinaten entsprechend anpassen.
  13. Positionieren Sie die Kopfplatte mit einem stereotaktischen Mikromanipulator direkt auf der Lambda-Naht und befestigen Sie sie am Schädel, indem Sie Zahnzement auf die Kopfplatte und um sie herum auftragen (Abbildung 3A, B). Lassen Sie den Zement mindestens 10 Minuten trocknen.
  14. Bohren Sie Bohrlöcher (0,5 mm Durchmesser) für zwei kortikale Elektroden (frontaler und parietaler Kortex) und für eine, die als Referenzelektrode dient (Kleinhirn). Legen Sie die abisolierten Enden (0,5 mm) der beschichteten Silberdrahtelektroden in die Gratlöcher und befestigen Sie sie mit UV-Licht-aktiviertem Harz.
  15. Decken Sie die beschichteten Edelstahldrähte vollständig mit Zahnzement ab, so dass kein Draht freiliegt. Decken Sie die Unterseite und die Seiten des Steuersatzes mit Zahnzement ab, damit er fest sitzt. Stellen Sie sicher, dass die Bregma- und Lambda-Nähte sichtbar bleiben, sobald das Headset befestigt ist (Abbildung 2B).
  16. Lassen Sie die Maus mindestens 7 Tage lang genesen, untersuchen Sie das Tier und die Operationsstelle täglich auf Unregelmäßigkeiten. Verabreichen Sie bei Bedarf Analgetika (Carprofen 2,5 mg/kg, SC).

2. Platzierung und Aufzeichnung der Silikonsonde

  1. Gewöhnen Sie die Maus an das Aufnahme-Rig und die Kopffixierung (mindestens 1,5 Stunden an zwei verschiedenen Tagen) (Abbildung 2D).
  2. Legen Sie die Maus am Tag der Aufzeichnung in die Anästhesiekammer (Isofluran 1,5%-3% in Sauerstoff).
  3. Positionieren Sie die Maus in einem stereotaktischen Rahmen, passen Sie den Nasenkonus und die Kopfstangen wie in 1.3 beschrieben an. Halten Sie die Anästhesie (Isofluran 1,5 % -3 % Sauerstoff) während der gesamten stereotaktischen Operation aufrecht. Führen Sie einen Zehenquetschtest durch, um die Tiefe der Anästhesie zu überprüfen.
  4. Tragen Sie eine Augensalbe auf die Augen auf und halten Sie eine angemessene Körpertemperatur aufrecht.
  5. Identifizieren Sie Bregma und Lambda und stellen Sie sicher, dass zwischen den beiden anatomischen Orientierungspunkten kein Höhenunterschied von mehr als 100 μm besteht.
  6. Suchen und markieren Sie die berechneten Koordinaten mit einem sterilen Bleistift auf dem Schädel und erstellen Sie dann einen Umriss des 2 mm x 2 mm großen Kraniotomiefensters um die Koordinaten.
  7. Führen Sie einen Zehenquetschtest durch, um die Narkosetiefe zu überprüfen.
  8. Verwenden Sie einen Hochgeschwindigkeitsbohrer, um ein 2 mm x 2 mm großes Kraniotomiefenster zu erstellen. Tragen Sie 0,5-1 ml normale Kochsalzlösung auf, um ein Austrocknen der Gehirnoberfläche zu verhindern. Entfernen Sie die Dura mit einer Spritzennadel und einer feinen Pinzette.
    HINWEIS: Achten Sie auf große Gefäße (Sinus sagittalis superior, Sinus transversax), um übermäßige Blutungen zu vermeiden (Abbildung 3).
  9. Verwenden Sie einen Hochgeschwindigkeitsbohrer, um ein separates Bohrloch für die Referenzelektrode der Siliziumsonde zu erstellen, in der Regel ~1-2 mm vom Schädelfenster entfernt.
  10. Tragen Sie 0,2 ml Silikonkleber mit geringer Toxizität auf den Schädel auf, um die Kraniotomie mit dem beigefügten Applikator vollständig zu versiegeln.
  11. Lassen Sie die Maus ca. 1 Stunde lang erholen.
  12. Befestigen Sie den Kopf der Maus mit der Kopfplatte und den Schrauben an der elektrophysiologischen Aufzeichnungsanlage (Abbildung 2D).
  13. Beschichten Sie den Sondenschaft aus Silikon mit dem Fluoreszenzfarbstoff DiI (1:4 DiI:Ethanol), damit die Sondenbahn nach dem Experiment rekonstruiert werden kann.
  14. Montieren Sie die Sonde am Manipulator und stellen Sie den gewünschten Winkel ein. Um den vlPAG anzuvisieren, wurde ein AP-Winkel von 15-20° angewendet.
  15. Senken Sie die Aufnahmesonde auf die Gehirnoberfläche in der Mitte des Schädelfensters ab. Führen Sie zunächst die Sonde manuell bis zu einer Tiefe von ~300 μm ein. Nach dem Einführen in diese Tiefe senken Sie die Sonde langsam automatisch (z. B. 200 μm/min) auf die Zieltiefe ab, um Gewebeschäden zu minimieren21 (Abbildung 2C).
    HINWEIS: Es wird zunächst empfohlen, die Sonde manuell einzuführen. Das manuelle Einführen der Sonde stellt sicher, dass die Sonde gestoppt und zurückgezogen werden kann, falls sie sich beim ersten Einführen verbiegt. Sobald die Sonde vollständig in das Gewebe eingedrungen ist, ist es im Allgemeinen sicher, die Sonde im automatischen Modus weiter abzusenken.
  16. Tragen Sie Mineralöl auf die Gehirnoberfläche innerhalb des Kraniotomiefensters auf, um ein Austrocknen zu verhindern.
  17. Lassen Sie die Aufzeichnungssonde nach dem Einsetzen 10 Minuten einwirken.
  18. Zeichnen Sie Daten von der Siliziumsonde und ECoG mit 30 kHz mit einem Intan Recording Controller auf.
  19. 1-2 h nach der Aufnahme verwenden Sie die transkardiale Perfusionstechnik, um das Gehirn mit 4% Paraformaldehyd22 zu fixieren.
    HINWEIS: Aufgrund des Zements kann es schwierig sein, den rostralen Teil des Schädels zu entfernen. Deshalb ist es vorzuziehen, das Gehirn zu entfernen, indem die dorsalen Teile des Schädels entfernt werden.
  20. Enthaupten Sie die Maus, schneiden Sie die Haut entlang der Mittellinie auf der Rückenseite vom Hals bis zum Unterkiefer auf. Entfernen Sie Muskeln und Gewebe, die am Schädel befestigt sind, schneiden Sie den Unterkiefer ab, um den Zugang zum Gehirn zu erleichtern.
  21. Wenn die Perfusion korrekt durchgeführt wird, sollte das Gehirn etwas schrumpfen, so dass genügend Platz bleibt, um eine feine Schere in den dorsalen Teil des Foramen magnum einzuführen. Machen Sie einen medialen Schnitt, einen lateralen und einen kontralateralen Schnitt von etwa 1 mm Größe im Hinterhauptbein.
  22. Entfernen Sie vorsichtig den dorsalen Teil des Schädels mit einer Augenzange. Beginnen Sie am Hinterhauptbein, entfernen Sie alle Schädelfragmente, bis der gesamte dorsale Teil des Gehirns freigelegt ist.
  23. Schieben Sie einen Mikrospatel unter das Gehirn, beginnend bei den Riechkolben, um das Gehirn herauszuschöpfen.
  24. Nach der Perfusion und Entfernung kann das Gehirn in 4% Paraformaldehyd bei 4 °C für 24-48 h gelagert werden.

3. Histologie für die Rekonstruktion der Sondentrajektorie

  1. Schneiden Sie das Gehirn mit einem Vibratom in 70 μm große koronale Schnitte.
  2. Montieren Sie die Schnitte auf Objektträger mit einem DAPI-Einbettmedium, das Zellkerne färbt. Decken Sie die Objektträger ab und versiegeln Sie sie mit klarem Nagellack.
  3. Bilden Sie die Objektträger auf einem Fluoreszenzmikroskop ab. Stellen Sie den Kontrast/die Helligkeit so ein, dass die Sondenspuren deutlich sichtbar sind. Stellen Sie sicher, dass die resultierende TIFF-Bilddateigröße weniger als 10 MB beträgt, damit MATLAB-Codes reibungslos ausgeführt werden. Rekonstruieren Sie die Sondenspuren mit einem MATLAB-Code23.

4. Elektrophysiologische Datenanalyse

  1. Analysieren Sie aufgezeichnete neuronale Signale von der Siliziumsonde mit einer Offline-Erkennungs- und automatischen Sortiersoftware (Kilosort)24.
  2. Klassifiziert erkannte Cluster mit Phy manuell als Multi- oder Einzeleinheiten25. Klassifizieren Sie Cluster als einzelne Einheiten, wenn sie eine physiologische Spike-Wellenformform aufweisen, eine Refraktärperiode im Kreuzkorrelogramm und eine Normalverteilung der Amplitudenansicht aufweisen.
  3. Importieren Sie Daten einzelner Einheiten in MATLAB und analysierenSie 23.

Results

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Fünf männlichen C57BL/6J wurden ein ECoG-Headset und eine Kopfplatte implantiert (Abbildung 4A). Nach der Genesung wurden die Mäuse während zweier 1,5-stündiger Sitzungen an verschiedenen Tagen an die Kopffixation und das elektrophysiologische Aufzeichnungssystem gewöhnt (Abbildung 4B). Als nächstes wurde ein 2 mm x 2 mm großes Kraniotomiefenster erstellt (Abbildung 4C) und eine Silikonsonde eingeführt, während die Maus wach und mit festem Kopf befestigt war (Abbildung 4D). Es wurden zwei Arten von Silizium-UCLA-Sonden verwendet: (1) 64 M: eine Sonde mit einem Schaft und 64 Elektroden; und (2) 256 ANS: eine Sonde mit vier Schäften und 256 Elektroden. Sevofluran und Sauerstoff wurden mit einem Nasenkonus verabreicht, der an der Elektrophysiologie-Anlage befestigt war. Der Sauerstoff- und Sevoflurangehalt wurde alle 5 Minuten mit einem Inline-Gasanalysator überwacht. Nach der transkardialen Perfusion wurde das Gehirn entnommen (Abbildung 4E) und auf die Sondentrajektorie untersucht (Abbildung 4F). Die aufgezeichneten Aktionspotentiale wurden dann in Daten in einer einzigen Einheit kuratiert (Abbildung 4G).

Es wurden fünf Aufnahmen durchgeführt, bei denen die Sondenplatzierung mit verfügbaren Sondenrekonstruktionsalgorithmen validiert wurde, die in MATLAB23 entwickelt wurden. Mit Hilfe dieser Algorithmen wurde jede Elektrode der Siliziumsonde an einer spezifischen Gehirnstruktur lokalisiert, so dass eine dreidimensionale Perspektive der Sondenplatzierung im Gehirn gewonnen wurde (Abbildung 5). Diese Rekonstruktionsalgorithmen wurden mit immunhistochemischen Markern gekoppelt, um die Sondentrajektorien weiter zu validieren (Abbildung 6). Die Daten wurden dann mit kuratierten Einzeleinheiten abgeglichen (Abbildung 7).

Insgesamt wurden 64 einzelne Neuronen eingefangen, von denen 13 im vlPAG lokalisiert waren. Die restlichen 51 Neuronen befanden sich in benachbarten Kernen: Mittelhirn, Nucleus reticularis (Mittelhirn), Nucleus paratrochlea, Nucleus cuneiformis, Nucleus tegmentalis laterodorsdal, Nucleus parabrachialis (Nucleus parabrachialis) und Stiele superior cerebellär. Die Feueraktivität der Neuronen in jeder Maus wird als Heatmap dargestellt (Abbildung 7). Maus 3 wurde aufgrund der schlechten Qualität der Einzelaufzeichnung von der Analyse ausgeschlossen. Die meisten aufgezeichneten Neuronen verringerten ihr Feuern während der Sevofluran-Anästhesie.

Das mittlere Feuern von vlPAG-Neuronen wurde für jede Maus nach 5 Minuten zu Studienbeginn (d. h. 10-15 Minuten nach Beginn der Aufzeichnung) und 5 Minuten während der Sevofluran (d. h. 40-45 Minuten nach Beginn der Aufzeichnung) verglichen. Das vlPAG-Feuern war signifikant verringert (Abbildung 8A) und darüber hinaus war dieser Anstieg über alle vlPAG-Neuronen hinweg konsistent (Abbildung 8B).

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Abbildung 1: Berechnung der stereotaktischen Koordinaten für das Einführen der Sonde. Linker Bereich: Verwenden der Geometrie zum Berechnen des abgewinkelten Ansatzes für das Einführen der Sonde. Die folgenden Komponenten eines rechtwinkligen Dreiecks wurden identifiziert: (a) DV-Tiefe der Zielstruktur von der Gehirnoberfläche (erfasst mit dem stereotaktischen Atlas), (b) Abstand zwischen der AP-Koordinate unter der Annahme eines streng vertikalen Abstiegs und der AP-Koordinate der Zielstruktur. Rechtes Bild: Mit (a) und (b) kann man den Satz des Pythagoras verwenden, um den AP-Winkel (β) und die Länge (c) des Sondeneinstichs zu berechnen. Die folgenden Koordinaten wurden verwendet, um den vlPAG anzuvisieren: (AP) -3,6 mm, (ML) +0,5 mm, (DV) -4 mm. Es wurde ein AP-Winkel (β) von 20° verwendet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 2: Implantation der Kopfplatte und Aufzeichnung einer einzelnen Einheit. (A) Platzierung des ECoG-Headset-Kabels während der Implantation. (B) Draufsicht auf den Schädel der Maus nach der Implantation des ECoG-Headsets und der Kopfplatte. (C) Silikonsondenschäfte, die in das Gehirn eingeführt werden. (D) Maus mit festem Kopf während der Aufnahme einer Silikonsonde. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 3: Platzierung des Schädelfensters relativ zu den großen Blutgefäßen. Schematische Darstellung des Gefäßsystems auf der Oberfläche des Mausgehirns mit markiertem Sinus sagittalis superior und Sinus transversamals. Das weiße Quadrat zeigt die Position des Schädelfensters an und der rote Punkt stellt den Einführpunkt der Sonde dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 4: Versuchsaufbau. Fünf männliche C57BL/6J-Mäuse wurden mit ECoG-Headset und Kopfplatte (A) implantiert. Nach der Genesung waren sie an die Kopffixation und das Aufnahmegerät gewöhnt (B). Als nächstes wurde eine Kraniotomie durchgeführt (C) und eine Silikonsonde eingeführt, während die Maus wach und in einer kopffesten Position war. Flüchtige Anästhetika und Sauerstoff wurden über einen Nasenkonus (D) verabreicht. Nach der Aufzeichnung wurde das Gehirn entnommen (E) und mit immunhistochemischen Techniken analysiert, um die Flugbahn der Sonde (F) zu rekonstruieren. Die aufgezeichneten Aktionspotentiale wurden dann in Einzeleinheitsdaten (G) kuratiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 5: 3D-Modell des Gehirns mit rekonstruierten Sondenspuren. Jede gerade farbige Linie stellt eine Sondenbahn dar. Jeder Punkt markiert die Position des DiI-Farbstoffs, der auf koronalen Hirnschnitten sichtbar ist. Die Sondenbahn wird für jeden Schaft der Siliziumsonde rekonstruiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 6: Post-hoc-Rekonstruktion der Sondenplatzierung innerhalb des vlPAG. Repräsentativer koronaler Hirnschnitt für jede aufgezeichnete Maus (1-5), gefärbt mit DAPI (blau), zeigt Sondenspuren ((DiI, rot, markiert durch grüne Pfeile) mit einem Umriss der Hirnregionen. Maßstab: 500 μm. Maus 1-3 wurde mit Einschaft-Siliziumsonden (d.h. 64 Kanälen) aufgezeichnet, während Maus 4 und 5 mit Vierschenkel-Siliziumsonden (d.h. 256 Kanäle) aufgezeichnet wurden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 7: Binned firing-Aktivität vor und während der Sevofluran-Anästhesie. Heatmaps stellen die Anzahl der abgefeuerten Aktionspotentiale von 64 einzelnen Neuronen in Ein-Minuten-Intervallen dar. Einzelnen Neuronen wurde eine Ursprungsstruktur zugewiesen, die auf der Rekonstruktion der Sondenbahn basierte. Die weiße gestrichelte Linie zeigt den Beginn der Verabreichung von Sevofluran an, n = 4 Mäuse. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 8: Abschaffung des Feuerns von vlPAG-Neuronen während der Sevofluran-Anästhesie. (A) Mittlere Anzahl der Aktionspotentiale, die vor und während der Anästhesie für jede Maus ausgelöst werden. (B) Anzahl der Aktionspotentiale, die von jedem vlPAG-Neuron abgefeuert werden (B). Gepaarter t-Student-Test, **P = 0,0036, P = 0,0053. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 9: Beispiel dafür, wie sich eine ungleichmäßige Platzierung der Kopfplatte auf die Flugbahn der Sonde auswirken kann. (A) Ungleichmäßige Platzierung der Kopfplatte auf dem Mauskopf. (B,C) 3D-Rekonstruktion des Mausgehirns mit gerenderter Sondenbahn, bei der ein unbeabsichtigter mediolateraler Winkel auftritt, der durch eine ungleichmäßige Platzierung der Kopfplatten auf dem Mauskopf verursacht wird. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Discussion

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Hirnstammkerne vermitteln grundlegende Funktionen wie Atmung, Bewusstsein und Schlaf 26,27,28. Die Lage des Hirnstamms (tief und posterior) stellt eine Herausforderung dar, wenn es darum geht, seine neuronale Aktivität in vivo mit Standardtechniken zu untersuchen. Hier wird ein abgewinkelter anteriorer Zugang vorgestellt, um eine reproduzierbare Einzelaufzeichnung bei kopffixierten Mäusen zu ermöglichen.

Das vorsichtige Einführen der Multi-Elektroden-Siliziumsonde ist entscheidend, um eine konsistente Ausrichtung auf die Hirnstammstrukturen im Zusammenhang mit dem REM-Schlaf zu gewährleisten und gleichzeitig eine Schädigung der wichtigsten Blutgefäße zu vermeiden. Ein beträchtliches Maß an Fingerspitzengefühl, Konzentration und Geduld sind erforderlich, um die besten Koordinaten und die beste Flugbahn von Eintrag13 zu klären.

Aufgrund der abgewinkelten Sondenbahn und der Entfernung, die erforderlich ist, um tiefe Strukturen anzuvisieren, führen selbst geringfügige Inkonsistenzen in den Koordinaten und der Positionierung der Kopfplatte wahrscheinlich dazu, dass die Zielstruktur verfehlt wird. Es ist zwingend erforderlich, dass sich Bregma und Lambda bei der Implantation der Kopfplatte auf gleicher Höhe befinden und der Abstand zwischen ihnen genau gemessen wird. Da die Operationen an einem stereotaktischen Rahmen und die Aufzeichnungen an einem separaten Elektrophysiologie-Rig durchgeführt werden, ist es wichtig, dass die Kopfplatten an einem nivellierten Schädel befestigt werden. Die Einführung zusätzlicher Winkel (z. B. geneigter Kopf) erhöht das Fehlerrisiko, das besonders bei kleinen, tiefen Hirnstrukturen hoch ist (Abbildung 9).

Da Silikonsonden zerbrechlich sind, ist es wichtig, die Dura von der Oberfläche des Gehirns zu entfernen und sicherzustellen, dass keine Knochenfragmente das Schädelfenster verstopfen. Nach der Duraentfernung kann es zu leichten Blutungen kommen, daher ist es wichtig, die Kraniotomieoberfläche von geronnenem Blut zu befreien, das zu einer Biegung der Sonde führen könnte. Wenn sich das Einführen der Silikonsonde in das Gehirn als schwierig erweist (z. B. weil sich die Sonde verbiegt), ist es wichtig, zu prüfen, ob noch Dura vorhanden ist oder ob die Oberfläche des Gehirns getrocknet ist, da sich eine dünne Membran bilden kann, wenn wenig bis gar keine Flüssigkeit vorhanden ist. Beim Menschen27 haben Bereiche in der Nähe von Blutgefäßen eine dickere Dura, und ein ähnliches Problem findet sich bei Mäusen, bei denen die Entfernung der Dura ohne Riss der Gefäße eine Herausforderung sein kann. Obwohl eine sorgfältige Entfernung der Dura in der Regel zu einem reibungslosen Einführen der Sonde führt, können größere Einführwinkel zusätzliche Schwierigkeiten bereiten.

Die Ausbeute der Aufzeichnungen kann von Tier zu Tier sehr unterschiedlich sein und hängt von zahlreichen Variablen ab. Ein wesentlicher Faktor ist die Dichte der Neuronen in der Zielstruktur; Bereiche mit geringer Neuronendichte (z. B. Kortex) weisen tendenziell eine geringere Ausbeute an aufgezeichneten Einzelneuronen auf. Darüber hinaus können Gewebeschäden, wie z. B. das Aufreißen eines Gefäßes unter der Gehirnoberfläche, zum Tod oder zur Verletzung von Neuronen führen, was die Ausbeute weiter verringert21,29. Auch die Qualität der Aufnahmen ist entscheidend, da durch die höhere Qualität der Aufnahmen die Unterscheidung einzelner Neuronen erleichtert wird. Eine Off-Target-Sondenbahn kann auch zu geringeren Erträgen führen. Obwohl dieses Protokoll für Aufzeichnungen im vlPAG entwickelt wurde, kann es verwendet werden, um von nahe gelegenen Strukturen im Hirnstamm aufzunehmen.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren haben keine konkurrierenden finanziellen Interessen oder andere Interessenkonflikte im Zusammenhang mit dieser Arbeit.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Abbildung 1, Abbildung 3, Abbildung 4, Abbildung 8 und Abbildung 9 wurden mit BioRender.com erstellt. Wir bedanken uns bei Scott Kilianski für die Hilfe mit dem MATLAB-Code und das Teilen seiner Skripte. Wir danken Anna Grace Carns für die Hilfe bei der Rekonstruktion der Sondenbahn.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1024 Kanal RHD Recording ControllerIntan Technologies, Los Angeles, California, USAC3008Siliziumsonde Aufzeichnung; Aufzeichnungshardware und -software
24 mm x 50 mm Nr. 1,5 VWR DeckglasVWR, Radnor, Pennsylvania, USA48393-081Histologie
4% PFA in PBSThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USAJ61899. AKHistologie; Perfusionslösung
C& B MetabondPatterson Dental, Richmond, Virginia, USAPulver: 5533559, schnelle Basis: 5533492, Katalysator: 55335007Kopfplatte & Headset Implantation
C57/6J Mäuse 4-6 Wochen, MännchenThe Jackson Laboratory, Bar Harbor, Maine, USA000664
Capnomac UltimaDatex, Helsinki, Finnland ULT-SVi-27-07Gasanalysator; abgekündigt; alternativer Gasanalysator kann bei Bionet America erworben werden 
CM-DiIThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USAV22888Roter Fluoreszenzfarbstoff zur Beschichtung der Silikonsonde
Connector HeaderDigiKey, Thief River Falls, Minnesota, USA1212-1788-NDECoG Headset
DAPI Fluoromount-GSouthernBiotech, Birmingham, Alabama, USA0100-20Histologie
iBOND UniversalPatterson Dental, Richmond, Virginia, USA044-1113Kopfplatte & Headset-Implantation; für  Befestigung von Edelstahldrähten am Schädel
Silikonklebstoff mit geringer ToxizitätWorld Precision Instruments, Sarasota, Florida, USAKWIK-SIL
New Scale Technologies, Victor, New York, USAMulti-Probe-Manipulator: XYZ-Tischmontage: 06464-0000, MPM-Systemkit: 06267-3-0001, MPM-Plattform-360, MPM-Ring für MPM-Handarme, MPM_Ring-72 DEG: 06262-3-0000Aufzeichnung von Silikonsonden; Einführen der Sonde in das Gehirn
MikrosondenUCLA, Los Angeles, Kalifornien, USA256 ANS, 64MNicht mehr erhältlich; alternative Silikonsonden können bei Neuropixels Mineral
MineralölSigma Aldrich, Saint Luis, Missouri, USAM8410-100MLAufzeichnung von Silikonsonden; Verhinderung des Austrocknens des Gewebes während der
Aufzeichnung Normale KochsalzlösungThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USAZ1376Kopfplatte & Headset-Implantation; Verhinderung des Austrocknens des Gehirns während der
Operation PFA-beschichteter Edelstahldraht mit einem Durchmesser von 0,008 Zoll beschichtet mit gestreiften EndenA-M Systems, Sequim, Washington, USA791400ECoG Headset & Referenzelektrode für ECoG
Platindraht 24AWG World Precision Instruments, Sarasota, Florida, USAPTP201Referenzelektrode für die Aufzeichnung von Siliziumsonden
Shandon Colorfrost Plus ObjektträgerThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA99-910-01Histologie
Edelstahl KopfplatteStar Rapid, ChinaSonderanfertigungKopfplatte & Headset-Implantation; Design auf Anfrage erhältlich
Stereotaktisches GerätKOPF, Tujunga, Kalifornien, USAModell 940 Stereotaktisches Kleintierinstrument mit DigitalanzeigekonsoleKopfplatte & Headset-Implantation
Kopfplatten-MikromanipulatorsystemOil erworben werden

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