Bewertung der Wirkung von Wachstumsfaktoren auf die Produktion von Chlorophyllen a und b aus Mikroalgen

Zusammenfassung

Die vorliegende Studie unterstreicht die Vorteile des Einsatzes der von Jeffrey und Humphrey entwickelten Methode zur Extraktion und Quantifizierung fettlöslicher Pigmente aus Mikroalgen. Diese Methode dient als wertvolles Instrument, um den Einfluss von Wachstumsfaktoren auf die Chlorophyllproduktion und den zellulären Gehalt in diesen Organismen zu beurteilen.

Zusammenfassung

Mikroalgen enthalten zwei Hauptgruppen von Pigmenten: Chlorophylle und Carotinoide. Chlorophyll ist ein grünes Pigment, das Lichtenergie absorbiert und in chemische Energie umwandelt, um die Synthese organischer Verbindungen zu erleichtern. Dieses Pigment dient aufgrund seiner hohen antioxidativen Eigenschaften und Färbeeigenschaften als wertvolle Primärquelle für biotechnologische Einsatzstoffe in der Lebensmittel-, Pharma- und Kosmetikindustrie. Das Ziel dieser Forschung war es, die Wirkung von Wachstumsfaktoren (CO₂ -Konzentration, Lichtfarbe und Lichtintensität) durch ein Taguchi L 4-Versuchsdesign auf das Zellwachstum und den zellulären Gehalt an Chlorophyll a und b in Chlorella sorokiniana zu bewerten, gefolgt von der Validierung der Methode mit Haematococcus pluvialis Mikroalgen als zusätzliches Studienmodell. Das Zellwachstum wurde mit Hilfe der optischen Dichtespektrophotometrie bei einer Wellenlänge von 550 nm quantifiziert. Für die Quantifizierung der Chlorophylle wurde ein Zellextrakt unter Verwendung einer 90%igen reinen Acetonlösung gewonnen, und anschließend wurden die Konzentrationen der Chlorophylle a und b mit spektrophotometrischen Techniken bei Wellenlängen von 647 nm und 664 nm gemäß der von Jeffrey und Humphrey beschriebenen Methode quantifiziert. Die experimentellen Ergebnisse zeigten, dass die Kontrolle der Bedingungen mit geringer CO₂ -Addition, violettem Licht und geringer Lichtintensität sowohl das Zellwachstum als auch die Konzentration der Chlorophylle a und b in den Zellen erhöht. Die Implementierung dieser Chlorophyll-Quantifizierungsmethode ermöglicht eine schnelle, einfache und präzise Bestimmung des Chlorophyllgehalts, da die verwendeten Wellenlängen an den Absorptionsspitzen beider Arten von Chlorophyllen liegen, wodurch diese Technik für alle untersuchten Mikroalgen leicht reproduzierbar ist.

Einleitung

In den letzten Jahren haben die zunehmenden Umweltprobleme, die durch anthropogene Aktivitäten verursacht werden, und ihre negativen Auswirkungen auf die Gesundheit und das Gleichgewicht der Ökosysteme die Suche nach effizienteren und umweltfreundlicheren Produktionssystemen vorangetrieben. Dies hat die Prozesse in der Industrie beschleunigt und die Umsetzung von Bioremediationsbehandlungen und die Entwicklung von Bioverbindungen zur Abschwächung dieser schädlichen Auswirkungen gefördert¹.

Dieser Kontext hat zu einem deutlichen Wachstum der Erforschung von Mikroalgen geführt, angetrieben von der Notwendigkeit, innovative Lösungen für aktuelle ökologische und wirtschaftliche Herausforderungen zu finden. Mikroalgen gedeihen in aquatischen Umgebungen und nutzen Sonnenlicht und Kohlendioxid als Energie- bzw. Kohlenstoffquellen. Diese Eigenschaft macht sie zu einer nachhaltigen und vielversprechenden Alternative für die Herstellung verschiedener wertvoller Produkte. Die Forschung auf diesem Gebiet konzentrierte sich auf das Verständnis der Physiologie und des Stoffwechsels dieser Zellen sowie auf die Entwicklung effizienter Technologien für ihre Kultivierung und Verarbeitung².

Es besteht ein klarer Bedarf, zugängliche und zuverlässige Werkzeuge für die Erforschung von Mikroalgen zu entwickeln, um Forschungsprozesse zu beschleunigen und das Verständnis ihrer Physiologie, ihres Stoffwechsels und ihrer potenziellen Anwendungen zu vertiefen. Diese Instrumente sollen eine schnelle Analyse der Auswirkungen von Umwelt- und Produktionsfaktoren auf Schlüsselparameter wie die Chlorophyllkonzentration ermöglichen, die ein grundlegender Indikator für die Gesundheit und Entwicklung dieser Organismen ist. Eine Abnahme des Chlorophyllgehalts kann auf Umweltstress, Ernährungsmängel oder Krankheiten hinweisen.

Diese grünen Pigmente spielen eine entscheidende Rolle bei der Photosynthese, indem sie Sonnenenergie einfangen, um Kohlendioxid und Wasser in Glukose und Sauerstoff umzuwandeln, und machen zwischen 0,5 % und 5 % der Biomasse von Mikroalgen^{aus 3}. Neben ihrer wesentlichen Rolle bei der Aufrechterhaltung von Lebensprozessen haben Chlorophylle in verschiedenen Industrien Anwendung gefunden. Chlorophyllextrakte werden in der Lebensmittel- und Getränkeverarbeitung als natürliche Farbstoffe verwendet, die den Produkten leuchtende grüne Farbtöne verleihen und gleichzeitig antioxidative Eigenschaften bieten. Darüber hinaus werden Nahrungsergänzungsmittel auf Chlorophyllbasis im Gesundheits- und Wellnessbereich aufgrund ihrer angeblich entgiftenden und entzündungshemmenden Wirkung immer beliebter. Durch die Nutzung der vielfältigen Eigenschaften von Chlorophyll kann die Industrie innovative Produkte entwickeln, die sowohl zur optischen Attraktivität als auch zum Wohlbefinden der Verbraucher beitragen¹.

Eine Mikroalge von großer biotechnologischer Relevanz ist in diesem Zusammenhang C. sorokiniana. Dieser Mikroorganismus zeichnet sich durch eine schnelle Wachstumsrate aus, die ihn bei der Biomasseproduktion hocheffizient macht. Darüber hinaus weist C. sorokiniana einen vielfältigen Gehalt an hochnährstoffreichen Verbindungen auf, darunter Proteine, Lipide und Vitamine, was es für verschiedene Anwendungen in der Lebensmittel-, Futtermittel- und Biokraftstoffproduktion wertvoll macht². Darüber hinaus wurde festgestellt, dass diese Mikroalgenart extrazelluläre Enzyme mit vielfältigen Funktionen produziert, was Möglichkeiten für biotechnologische Anwendungen wie Abwasserbehandlung, Bioremediation und Pharmazie eröffnet⁴. Neben seinem schnellen Wachstum und seinen vielseitigen Einsatzmöglichkeiten weist C. sorokiniana auch ein erhebliches Potenzial für die Chlorophyllproduktion auf. Als photosynthetischer Mikroorganismus verfügt C. sorokiniana über die für die Synthese von Chlorophyll notwendigen Mechanismen, die zwischen 0,5 % und 5 % der Biomasse von Mikroalgen ausmachen³. Diese Fähigkeit macht C. sorokiniana zu einem attraktiven Kandidaten für die Chlorophyllproduktion im kommerziellen Maßstab und verspricht eine nachhaltige Lösung für dringende Umwelt- und Ernährungsprobleme^{zu sein 5}.

Auf der anderen Seite ist H. pluvialis eine weitere Mikroalgenart von großem Interesse. Diese Mikroalge ist bekannt für ihre Produktion von Astaxanthin, einem starken antioxidativen Pigment mit zahlreichen industriellen Anwendungen. Astaxanthin dient als Schutzmechanismus für das Photosystem von H. pluvialis und schützt es vor oxidativem Stress, der durch Umwelteinflüsse induziert wird. Dieses Pigment ist aufgrund seiner antioxidativen Eigenschaften und potenziellen gesundheitlichen Vorteile in der Kosmetik-, Nutrazeutika- und Aquakulturindustrie sehr gefragt. Mit seiner reichlich vorhandenen Fähigkeit, Astaxanthin zu produzieren, stellt H. pluvialis einen vielversprechenden Weg für die Entwicklung innovativer Produkte dar, die auf verschiedene Industrie- und Verbraucherbedürfnisse zugeschnitten^{sind 6}.

Jüngste Studien haben auch das Potenzial von H. pluvialis¹ für die Chlorophyllproduktion hervorgehoben, was seine industrielle Bedeutung weiter erhöht. So untersuchte eine Studie den Chlorophyllgehalt von H. pluvialis unter unterschiedlichen Wachstumsbedingungen und fand heraus, dass H. pluvialis unter optimalen Kultivierungsparametern bemerkenswerte Chlorophyllproduktionsraten aufwies, die die anderer Mikroalgenarten übertrafen⁷. Diese Erkenntnis unterstreicht das Potenzial von H. pluvialis als nachhaltige Quelle für Chlorophyll und bietet neue Möglichkeiten für seine Nutzung in verschiedenen Industriesektoren.

Protokoll

1. Vorbereitung von Nährmedien und Inokulum

1. Bereiten Sie 1 l 3N-BBM+ V(CCAP)-Wachstumsmedium vor (Makronährstoffe: NaNO₃ [0,75 g ^L-1], CaCl₂ [0,019 g ^L-1], MgSO₄ [0,019 g ^L-1], K₂HPO₄ [0,057 g ^L-1], NaCl [0,025 g ^L-1], KH₂PO₄ [0,175 g ^L-1]; Mikronährstoffe: Na₂ EDTA [0,0186 g ^L-1], FeCl₃ [0,0024 g ^L-1], MnCl₂ [0,001 g ^L-1], ZnCl₂ [1,25 x ^10-4 g ^L-1], CoCl₂ [5 x ^10-5 g ^L-1], Na₂MoO₄ [9,98 x ^10-5 g ^L-1])⁸ und sterilisieren Sie es für 15 min bei 121 °C und 1,5 psi.
2. Einen Kolben mit 1 l Wachstumsmedium in einer Konzentration von ca. 3 x 10⁶ Zellen ^mL-1 für die Mikroalge C. sorokiniana beimpfen; Oder geben Sie 5% bis 10% (v/v) Inokulum in das Wachstumsmedium.
   HINWEIS: Um sterile Bedingungen aufrechtzuerhalten, wird empfohlen, eine Laminar-Flow-Haube, Handschuhe, einen Laborkittel und eine Gesichtsmaske zu verwenden.
3. Der inokulierte Kolben wird unter roten Lichtquellen mit einer Intensität von etwa 3.600 bis 4.200 Lux bei einer Temperatur zwischen 22 und 26 °C inkubiert, mit einer Photoperiode von 12 h Licht und 12 h Dunkelheit für C. sorokiniana und einer Photoperiode von 16 h Licht und 8 h Dunkelheit für H. pluvialis und alle 24 h manuell gerührt. Ungefähr 7 Tage lang für beide Stämme.
   HINWEIS: Unter Wachstumsbedingungen mindestens 7-10 Tage (bis eine intensive grüne Farbe erreicht ist) für C. sorokiniana und 10-12 Tage für H. pluvialis aufbewahren. Um das Mikroalgenkonzentrat zu erhalten, das als Inokulum in der Kinetik dienen wird, ist es notwendig, das überstehende Medium von den produzierten Algen zu entfernen.
4. In einer sterilen Umgebung sterile konische 15-ml-Zentrifugationsröhrchen mit ca. 10 mL inokuliertem Medium füllen und bei 3.000 x g für 20 min unter 25-30 °C zentrifugieren.
5. Unter sterilen Bedingungen wird der Überstand mit einer Mikropipette oder durch Gießen und Konzentrieren der Biomasse in ein steriles konisches 50-ml-Zentrifugationsröhrchen entfernt.
6. Dieser Vorgang wird bei Bedarf wiederholt, bis das erforderliche Inokulumvolumen für die Kinetik erreicht ist.
7. Messen Sie die optische Dichte (OD₅₅₀ nm) des Inokulums, um die Zellkonzentration der Mikroalgen zu bestimmen und lagern Sie es bei einer Temperatur von 3-4 °C bis zur Verwendung.
   HINWEIS: Die direkte zelluläre Zählung wurde ursprünglich durchgeführt, um die Zellkonzentration mit der Absorption zu korrelieren. Nach dem Zählen kann das Inokulum nicht länger als 4 Tage im Kühlschrank gelagert werden.

2. Untersuchung der Wachstumskinetik

1. Bereiten Sie das für jedes Experiment geeignete erforderliche Volumen an 3N-BBM+ V (CCAP) gemäß den Standardlaborverfahren vor (8 l für Photobioreaktor-Tests auf C. sorokiniana und 0,5 l für die Kolben-Level-Tests auf H. pluvialis), um eine ordnungsgemäße Sterilisation zu gewährleisten.
2. Sowohl für Photobioreaktoren als auch für Kolben ist die Lichtquelle auf das gewünschte Farbspektrum einzustellen (Blau bei 460 nm, Violett, Mischung aus 460 nm und 630 nm für C. sorokiniana und Rot bei 630 nm für H. pluvialis); Decken Sie beide Systeme ab, um Störungen durch externes Licht zu vermeiden.
   HINWEIS: Aufgrund der Variation der Wellenlänge, die von jeder Leuchtdiode emittiert wird, wurde die Spektroradiometrie mit einem Spektralradiometer an den Lichtquellen durchgeführt, um die Wellenlänge und die Emissionsleistung jeder Diode⁹ zu bestimmen. Violettes Licht wurde durch die Kombination von roten und blauen LEDs erreicht, was zu Wellenlängen von 460 nm mit einer Emissionsleistung von 1,65 W ^nm-1 für die blauen LEDs und 630 nm mit einer Emissionsleistung von 0,6 W ^nm-1 für die roten LEDs führte. Diese Messungen wurden für die Tests verwendet, die ausschließlich unter blauem und rotem Licht durchgeführt wurden.
3. Programmieren Sie den Timer so, dass er zwischen 12 h hellen und 12 h dunklen Zyklen für C. sorokiniana und 16 h hellen und 8 h dunklen Zyklen für H. pluvialis wechselt.
4. Schließen Sie das CO_{2 -} Belüftungssystem an das Photobioreaktor-Kulturgefäß an, um C. sorokiniana in Abständen von 12 Stunden Kohlendioxid zuzuführen.
5. Beimpfen Sie das Kulturgefäß mit einem ausreichenden Volumen an Präinokulum, um eine Ausgangszelldichte von 3 x 10⁵ Zellen ^mL-1 oder einem entsprechenden Äquivalent in optischer Dichte (OD₅₅₀ nm) = 0,180 zu erreichen.
   HINWEIS: Achten Sie während der Inokulation auf eine aseptische Technik, um eine Kontamination zu vermeiden.
6. Die Kultur wird in regelmäßigen Abständen von 12 Stunden für C. sorokiniana und 8 Stunden für H. pluvialis beprobt, um das Zellwachstum und die physiologischen Parameter zu überwachen. Sammeln Sie Proben mit sterilen Techniken, um die Integrität der Kultur zu erhalten.

3. Quantifizierung von Chlorophyllen

HINWEIS: Die Daten für die zelluläre Quantifizierung sind in der Zusatzdatei 1 enthalten.

1. 40 ml der Probe werden in konische Zentrifugationsröhrchen aus Kunststoff gegeben.
2. Bei 3.000 x g für 20 min bei 15 °C zentrifugieren und den Überstand durch Dekantieren oder mit einer Pasteurpipette verwerfen.
3. Übertragen Sie das Zellpellet in ein Glasröhrchen, das mit Aluminiumfolie und einem Schraubverschluss bedeckt ist, um eine Oxidation zu verhindern.
4. Resuspendieren Sie das Zellpellet mit 3 mL 90%iger reiner Acetonlösung unter Verwendung eines Vortexs.
5. Die suspendierte Probe wird in einem Eisbad für zwei Zyklen von je 5 Minuten beschallt und 16 h¹⁰ bei 4 °C ruhen gelassen.
6. Nach 16 Stunden wird erneut unter den gleichen Bedingungen wie im vorherigen Schritt (Schritt 3.5) beschallt und unter den zuvor beschriebenen Bedingungen (Schritt 3.2) erneut zentrifugiert.
7. Trennen Sie den Pigmentextrakt mit einer Pasteur-Pipette und geben Sie ihn in ein anderes, sauberes, lichtgeschütztes Röhrchen.
8. Geben Sie den Pigmentextrakt in eine Quarzzelle, um ihn in einem Spektralphotometer bei Wellenlängen von 630 nm, 647 nm und 664 nm abzulesen.
   HINWEIS: Kalibrieren Sie das Spektralphotometer vorher mit 90% Aceton.
9. Um die Chlorophyllkonzentrationen zu berechnen, verwenden Sie die folgenden Gleichungen¹¹:
   Chlorophyll a = 11,93 A₆₆₄ - 1,93 A₆₄₇
   Chlorophyll b = 20,36 A₆₄₇ - 5,50 A₆₆₄
   HINWEIS: Die Ergebnisse werden in μg ^mL-1 des Extrakts ausgedrückt, die mit dem Extraktvolumen multipliziert und durch die Anzahl der ml der Probe dividiert werden, um die Chlorophyllkonzentrationen in μg ^mL-1 der Kultur zu erhalten.
10. Um Werte in μg chl ^Zelle-1 zu erhalten, verwenden Sie die folgende Formel:
    μg chl ^Zelle-1 = μg chl in 1 ml Kultur / [Zellen ^mL-1] Zellkonzentration in der Kultur.

Ergebnisse

Um die Wirksamkeit der Technik zur Erkennung von Schwankungen der Chlorophyllzellkonzentration zu beobachten und die Wirkung von Wachstumsfaktoren in C. sorokiniana zu bewerten, wurde ein Taguchi L 4-Versuchsdesign erstellt, in dem die CO₂ -Volumenzugabe, die Lichtfarbe und die Lichtintensität bewertet wurden. Jeder Faktor wurde auf niedrigem und hohem Niveau bewertet, wie in Tabelle 1 gezeigt, unter den Bedingungen, die im Versuchsplan in Tabelle 2 definie...

Diskussion

Die vergleichende Studie zwischen H. pluvialis und C. sorokiniana zeigte signifikante Unterschiede in der Dynamik der Chlorophyllproduktion. Während H. pluvialis während des gesamten Experiments eine Abnahme der Chlorophyllkonzentration zeigte, zeigte C. sorokiniana einen stetigen Anstieg. Zusätzlich gab es anfänglich einen geringeren Anteil an Chlorophyll a in beiden Spezies, aber dieses Verhältnis kehrte sich unter bestimmten Wachstumsbeding...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
C3H6O	Meyer	67-64-1	Aceton 90%
15 mL Röhrchen	Biologix	10-9502	Reagenzglas
2510-DTH	Branson	D-73595	Sonicator
5 mL Reagenzglas mit Schraubverschluss	Kimax	45066-13100	Reagenzglas
50 mL Zentrifugenröhrchen	Biologix	10-9151	Reagenzglas
Aluminiumfolie	Reynolds	611 Standard, 12" x 1000 Fuß	Reagenzglasabdeckung
CaCl2	Meyer	0925-250
	Dynamica	14 R	Zentrifuge
CoCl2	Merck	1057-100	Kobaltdichlorid
FeCl3	Merck	157740	Eisen(III)-chlorid
K2HPO4	Meyer	2051-250	Dikaliumphosphat
KH2PO4	Meyer	2055-250	Monokaliumphosphat
MgSO4	Meyer	1605-250
	LabNet	Model Beta-Pette	Mikropipette
MnCl2	Merck	429449	Mangan(II)-chlorid
Na2 EDTA	Merck	200-449-4	Edatamil, Edetato Dinatriumsalz Dihydrat
Na2MoO4	Merck	243655	Natriummolybdat
NaCl	Meyer	2365-500	Natriumchlorid
NaNO3	Meyer	2465-250	Natriumnitrat
RGB LED Streifen	Steren	GAD-LED2	Licht Quelle
Spektralphotometer	PerkinElmer	Modell Lambda35	Spektralphotometer
Spektralradiometer	Gigahertz-Optik	Modell BTS256
Vortex	Scientific Industries	Vortex-Genie® 2	Vortex
ZnCl2	Merck	208086	Zinkchlorid

Calciumchlorid-Zentrifuge gekühlt Magnesiumsulfat-Mikropipette