Optimierung der Probenvorbereitung für die kryogene Elektronenmikroskopie

Summary

Dieses Protokoll stellt eine praktische Methode am Beispiel von Methanocaldococcus jannaschii (MjsHSP16.5) vor, um eine ungleichmäßige Partikelverteilung durch Optimierung der Probenvorbereitung zu beheben, und bietet Forschern eine Referenz zur effizienten Aufklärung makromolekularer Strukturen mittels kryogener Elektronenmikroskopie (Kryo-EM).

Abstract

Die kryogene Elektronenmikroskopie (Kryo-EM) hat die Strukturbiologie revolutioniert, indem sie die Untersuchung makromolekularer Strukturen unter nahezu nativen Bedingungen ermöglicht, die in Glaseis suspendiert sind. Diese Technik ermöglicht die hochauflösende Visualisierung von Proteinen und anderen Biomolekülen, ohne dass eine Kristallisation erforderlich ist, und bietet wichtige Einblicke in deren Funktion und Mechanismus. Jüngste Fortschritte in der Einzelpartikelanalyse, gepaart mit einer verbesserten rechnerischen Datenverarbeitung, haben die Kryo-EM zu einem unverzichtbaren Werkzeug in der modernen Strukturbiologie gemacht. Trotz ihrer zunehmenden Akzeptanz steht Kryo-EM vor anhaltenden Herausforderungen, die ihre Wirksamkeit einschränken können, insbesondere bei ungleichmäßiger Partikelverteilung. Dieses Problem führt oft zu einer schlechten Auflösung und verminderter Genauigkeit bei rekonstruierten Proteinstrukturen. Dieser Artikel skizziert einen einfachen, praktischen Ansatz, um diese Herausforderung anzugehen, am Beispiel des kleinen Hitzeschockproteins von Methanocaldococcus jannaschii (MjsHSP16.5). Die Methode optimiert die Probenvorbereitung, um die bevorzugte Adsorption zu minimieren und eine homogenere Partikelverteilung und hochwertigere Protein-Kryo-EM-Strukturen zu gewährleisten. Diese Technik bietet eine wertvolle Orientierungshilfe für Forscher, die ähnliche Herausforderungen in Strukturstudien bewältigen wollen.

Introduction

Mit den jüngsten Fortschritten sowohl bei der Instrumentenhardware ^1,2 als auch bei der Bildverarbeitungssoftware ^3,4,5 hat sich die kryogene Elektronenmikroskopie (Kryo-EM) zu einem beliebten und leistungsfähigen Werkzeug in der modernen Strukturbiologie entwickelt. Trotz dieser Durchbrüche gibt es nach wie vor Engpässe bei der Erzielung hochauflösender makromolekularer Strukturen mittels Kryo-EM. Eine dieser großen Herausforderungen ist die ungleichmäßige Partikelverteilung, einschl....

Protocol

Die Einzelheiten zu den Reagenzien und der Ausrüstung, die in dieser Studie verwendet wurden, sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Reinigung von Proteinen

1. Induzieren Sie die Expression von rekombinantem MjsHSP16.5 in E. coli BL21(DE3) und reinigen Sie das Protein mit einer Nickelchelat-Chromatographiesäule, wie zuvor beschrieben²⁶. Nach der Aufreinigung auf einer Größenausschlusschromatographie-Säule (SEC)²⁶ ist die Proteinreinheit zu untersuchen, indem 5 μl Peakfraktionen auf ein 12,5 % SDS-PAGE-Gel....

Results

Um optimale Gitterbedingungen für MjsHSP16.5 zu identifizieren, wurde ein erstes Kryo-EM-Screening durchgeführt, das sich hauptsächlich auf die Untersuchung verschiedener Proteinpufferbedingungen konzentrierte: (1) den abschließenden Reinigungspuffer, der die Stabilität und Homogenität von MjsHSP16.5 gewährleistet und für seine Kristallisation wichtig ist³⁰; (2) Puffer, angepasst an Bedingungen, die für das Wachstum von MjsHSP16.5-Kristallen mit hoher Beugungsqualität^{erforderlich.......}

Discussion

Alle Proteinstrukturstudien beginnen mit der Proteinreinigung, einem iterativen Prozess, um ein Gleichgewicht zwischen der Isolierung von Proteinzielen mit hoher Reinheit und Homogenität bei gleichzeitiger Beibehaltung ihrer nativen Funktionalität zu erreichen. Obwohl die Pufferzusammensetzungen zur Aufreinigung und Konservierung von Proteinproben während des Aufreinigungsprozesses sorgfältig ausgewählt werden, stellen diese Puffer bei der anschließenden Kryo-EM-Probenvorbereitung und Bi.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
14-ml-Röhrchen mit rundem Boden	SPL Life Sciences	40114
250 µ L Gasdichte Spritze Modell 1725 LTN	Hamilton	81100	Zementierte Nadel, 22s Gauge, 2 Zoll, Spitze Ausführung 2
50 & Mikro; L Dialyseknopf	Hampton Research	HR3-326
50-ml-Glasbecher	DIAMOND	HA.1010D.50
Ä KTA pure 25 L	Cytiva	29018224	FPLC
Amicon Ultra-15 Zentrifugalfiltereinheit	Millipore	UFC905024	50-KDa NMWL
Bradford Reagenz	Supelco	B6916
Dumoxel Style N5	Dumont	0103-N5-PO
Glacios 2 Cryo-TEM	ThermoFisher Scientific	GLACIOSTEM
HiLoad 16/600 Superdex 200 pg	Cytiva	28989335
Mikrozentrifugenröhrchen 1,5 mL	HD Micro	H23015
PCR-Röhrchen 0,2 mL, flache Kappe	Axygen	PCR-02-C
PELCO easiGlow Glow Entladeeinheit	Ted Pella	91000
PELCO TEM Gitterhalterblock	Ted Pella	16820-25
Quantifoil R 1,2/1,3 200 Mesh, Cu	Elektronenmikroskopie Sciences	Q2100CR1.3
Spectra/Por 3 RC Dialyse-Membranschläuche	Fisher Scientific	086705B	3500 Dalton MWCO
Superose 6 Increase 10/300 GL	Cytiva	29091596
Uranylacetat	Merck	8473
Vitrobot Mark IV	ThermoFisher Scientific	VITROBOT
VitroEase Puffer Screening Kit und Reinigungsmittel	ThermoFisher Scientific	A49856