Methodenartikel

Enterische Gliakultur bei Pferden und Anwendung zur Untersuchung eines neuronalen Entzündungsmechanismus bei Pferdekoliken

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DOI:

10.3791/67244

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4. Oktober 2024

 ,  ,  ,  , 
1Department of Clinical Sciences, College of Veterinary Medicine, NC State University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Enterische Gliazellen werden zunehmend für ihre Rolle bei der Darmhomöostase und bei Krankheitsprozessen, einschließlich postoperativer Komplikationen, anerkannt. Equidenpatienten, die sich von einer explorativen Notfall-Laparotomie erholen, leiden unter einem hohen Risiko für entzündliche postoperative Erkrankungen, was die Bedeutung der Etablierung einer wiederholbaren enterischen Glia-Primärzellkultur für die Studie unterstreicht.

Zusammenfassung

Entzündliche postoperative Erkrankungen der Pferdekoliken (akutes Abdomen) tragen nicht nur zu erhöhten Kundenkosten, Patientenbeschwerden und Krankenhausaufenthalten bei, sondern erweisen sich in vielen Fällen als lebensbedrohlich. Eine einzigartige Population von Darmzellen, enterische Gliazellen, wird zunehmend für ihre Rolle bei der Wahrnehmung des gastrointestinalen Milieus und der Kommunikation mit den umgebenden Zelltypen anerkannt. Wechselwirkungen zwischen enterischen Gliazellen und Darmepithelien können sich als entscheidend erweisen, um festzustellen, wie enterische Gliazellen bei Pferden die Schleimhautbarriere verändern können, um Entzündungen bei Gesundheit und Koliken zu modulieren.

Um diese Interaktion zu untersuchen, stellen wir eine Methode vor, bei der primäre enterische Gliakulturen von Pferden aus equinem Jejunum etabliert und die Kulturen entzündlichen Zuständen ausgesetzt werden, von denen bekannt ist, dass sie bei Koliken vorhanden sind. Primäre enterische Gliakulturen wurden von erwachsenen Pferden gewonnen, die aus Gründen, die nichts mit Koliken zu tun hatten, euthanasiert wurden. Darmzotten und Lamina propria wurden mikropräpariert, um die Submukosa freizulegen. Die isolierte Submukosa wurde 2-3 Stunden lang enzymatisch mit Kollagenase, Protease und Rinderserumalbumin verdaut. Als nächstes ergab der mechanische Aufschluss mit Zentrifugation, Pipettieren und Zellsieben (40-100 μm) ein Pellet, das für die Beschichtung auf 0,05 mg/ml-Poly-L-Lysin-beschichteten Wells bei einer Konzentration von ~400.000 Zellen/300 μl Medium verwendet wurde.

Nach der Konfluenz und der ersten Passage wurden die enterischen Gliazellen dann 24 Stunden lang rekombinantem IL-1β (0, 10, 25 ng) ausgesetzt. Um epithelial-gliale Wechselwirkungen zum Zeitpunkt der Koliken zu modellieren, wurde Medium, das entweder durch Kontrollglia oder behandelte enterische Gliazellen kontaminiert wurde, direkt zu konfluenten jejunalen Monoschichten von Pferden hinzugefügt, während der transepitheliale elektrische Widerstand (TEER) mit einer EndOhm-Kammer mit zwei Elektroden gemessen wurde. Diese Daten zeigen nur eine von vielen potenziell wirkungsvollen Anwendungen der enterischen Gliakultur von Pferden.

Einleitung

Pferdekoliken sind die häufigste medizinische Beschwerde, die bei der Notfallkonsultationauftreten 1. Da bis zu 17 % der Pferde eine chirurgische Korrektur benötigen, sollten die Bemühungen zur Verbesserung der postoperativen Ergebnisse im Vordergrund der pferdemedizinischen Forschung stehen2. Derzeit haben postoperative Kolikpatienten ein hohes Risiko für mehrere lebensbedrohliche Erkrankungen, darunter Sepsis/endotoxämischer Schock (12,3 % der Patienten) und postoperativer Ileus (13,7 % der Patienten)3. Trotz Fortschritten bei der Behandlung postoperativer Komplikationen besteht nach wie vor ein Bedarf an fortschrittlichen Behandlungen zur Vorbeugung oder Behandlung dieser Erkrankungen.

Neuere Forschungen haben den lokalen und systemischen Entzündungsstatus von Kolikpatienten hervorgehoben4. Zum Beispiel wurde gezeigt, dass proinflammatorische Proteine wie der Tumornekrosefaktor (TNF) alpha, Interleukin 1β (IL-1β), Interleukin 6 (IL-6) und das Monozyten-Chemoattractant-Protein-1 in der Kolik-Darmschleimhaut im Vergleich zu normalem Darmgewebe signifikant erhöht sind4. Aus systemischer Sicht konnte gezeigt werden, dass ein erhöhter TNF-alpha-Spiegel im Darmgewebe mit einem erhöhten Risiko für einen postoperativen nasogastrischen Reflux von mehr als 2 l korreliert, ein allgemeines Maß für die postoperative Motilitätsdystilität4. Es ist auch bekannt, dass die Verabreichung von Interleukin, IL-1β und TNF alpha in der Lage ist, klinische Anzeichen eines septischen Schocks zu induzieren5.

Eine mögliche Erklärung für den entzündlichen Status von Kolik-Darmgewebe und dessen Zusammenhang mit postoperativen Komplikationen ist die Darmepithelbarriere. Im Gesundheitswesen stellen die Tight-Junction-Komplexe, die die einzelne Schicht des Säulenepithels verbinden, die den Darmtrakt auskleidet, eine funktionelle Barriere dar, um zu verhindern, dass der Luminalgehalt und seine bakteriellen Bestandteile den submukkösen Raum und den Blutkreislauf erreichen. Die Dehnung und Schädigung durch kolikassoziierte Darmverschlüsse und Darmmanipulationen während der Operation können jedoch diese Darmbarrierefunktion stören.

In Bezug auf die funktionellen Komponenten der Darmwand als Ganzes hat sich gezeigt, dass das submuköse enterische Glianetzwerk innerhalb des enterischen Nervensystems entscheidend für die pathophysiologische Entwicklung postoperativer Komplikationen im Zusammenhang mit Entzündungswegen ist und ein spezifisches therapeutisches Ziel darstellen kann 6,7,8,9 . Enterische Gliazellen sind nicht nur im gesamten Magen-Darm-Trakt vorhanden, sondern fungieren auch als Sensoren der Darmumgebung, beeinflussen die Signalübertragung mit zahlreichen Zelltypen der Darmwand und regulieren direkt die Darmbarriere6. Es ist daher vertretbar anzunehmen, dass diese potenten Sensoren des Darms durch Verletzungen und Entzündungen aktiviert werden und eine akute Reaktion wie Veränderungen der Barrierepermeabilität hervorrufen könnten.

Diese Studie ist die erste, die die Kultur der enterischen Gliazellen von Pferden und insbesondere die Rolle entzündlicher enterischer Gliazellen bei Pferden für die Funktion der Darmbarriere beschreibt. In diesem Artikel stellen wir Methoden zur Primärkultur von submukösen enterischen Gliazellen bei Pferden und ihre Reaktion auf die Exposition gegenüber inflammatorischem IL-1β vor, die Bewertung der Wirkung von enterischen Gliaprodukten nach IL-1β-Exposition auf die Permeabilität von equinen Enterozyten-Monoschichten und eine mögliche Blockade durch die Anwendung von equinem Serum.

Protokoll

Enterale Glia-Primärkulturen von Pferden wurden von drei Pferden gewonnen, die aus Gründen, die nichts mit dieser Studie zu tun hatten, human euthanasiert und mit einer Überdosis eines Barbiturats eingeschläfert worden waren. Bei den für die Kulturstudien ausgewählten Pferden handelte es sich um erwachsene Pferde ohne Vorgeschichte von Magen-Darm-Erkrankungen.

1. Submuköse enterische Glia-Primärkultur bei Pferden

  1. Züchten Sie epitheliale Monoschichten von Pferden aus Jejunalkrypten, die von drei verschiedenen erwachsenen Pferden stammen.
    1. 24-Well-Platten 2 h bei 37 °C oder über Nacht bei Raumtemperatur mit Beschichtungslösung beschichten, 2x mit sterilem Wasser waschen und bei Raumtemperatur lagern, bis die Zellen bereit für die Beschichtung sind.
    2. Nach der humanen Euthanasie wird innerhalb von 60 Minuten ein Teil des Jejunums entfernt und in kalte Ringer-Lösung auf Eis gelegt.
    3. Entnehmen Sie ein 10 cm langes Stück aus dem Jejunum und öffnen Sie es an der antimesenterialen Grenze, um nicht-lymphoide Regionen im Zentrum des Gewebes zu halten. Schneiden Sie die Portion auf einen ca. 7 cm x 7 cm großen Abschnitt. Spülen Sie das Taschentuch vor der Dissektion gut mit frischer Ringer-Lösung ab.
    4. Stecken Sie das Gewebe in kalter Ringer-Lösung oder PBS-Schleimhaut nach oben auf eine mit Silikonelastomer beschichtete Petrischale und dehnen Sie das Gewebe so weit wie möglich (Abbildung 1A).
    5. Entfernen Sie die Darmzotten mit einer gekrümmten Pinzette (Abbildung 1B), gefolgt von der Schicht der Lamina propria aus der etwa 5 cm x 5 cm großen nicht-lymphoiden Region (Abbildung 1C).
      HINWEIS: Diese Schichten lösen sich leicht von der Submukosa (Abbildung 1B).
    6. Entfernen Sie die Submukosa in einem Blatt, indem Sie sie mit einer Mikrodissektionsschere an einer Ecke befreien und beobachten Sie die natürliche Trennung beim Abschälen der Submukosa von der inneren zirkulären Muskelschicht des Jejunums (Abbildung 1D).
    7. Zerkleinern Sie die gesammelte submuköse Schicht in 2-5 mm große Stücke und geben Sie sie in ein konisches 50-ml-Röhrchen, das 5 ml "Organo-FBS" (Tabelle 1), 0,825 mg Kollagenase, 5 mg Protease und 20 mg Rinderserumalbumin enthält. Inkubieren Sie das Gewebe für 2-3 h bei 37 °C für die enzymatische Verdauung.
    8. Nach der Inkubation 10 ml "Organo + FBS" bei Raumtemperatur hinzufügen, um die Enzymwirkung zu stoppen. Pipettieren Sie das Gewebegemisch ca. 15x mit einer serologischen 10-ml-Pipette auf und ab, um die Zellen vom Gewebe zu dissoziieren, und zentrifugieren Sie dann bei 3.000 × g für 3 min bei Raumtemperatur.
    9. Entsorgen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet mit 10 ml PBS bei Raumtemperatur, indem Sie mit einer serologischen 10-ml-Pipette etwa 15x auf und ab pipettieren, um die Zellen vom Gewebe zu dissoziieren.
    10. Das konische Röhrchen bei 3.000 × g 3 min bei Raumtemperatur zentrifugieren. Entsorgen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet mit 10 mL Raumtemperatur "Organo + FBS", indem Sie mit einer serologischen 10-ml-Pipette etwa 15x auf und ab pipettieren, um die Zellen vom Gewebe zu dissoziieren.
    11. Filtern Sie die Zellen nacheinander durch ein 100 μm, ein 70 μm und dann ein 40 μm porengroßes Zellsieb.
    12. Zentrifugieren Sie die filtrierten Zellen und Medien bei 3.000 × g für 3 min bei Raumtemperatur. Entsorgen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in 1 ml "Organo + FBS".
    13. Mit Trypanblau färben, um lebende Zellen zu identifizieren und mit einem Hämozytometer zu zählen.
    14. Säen Sie etwa 400.000 Zellen in 300 μl "Organo + FBS" in jeder Vertiefung einer 24-Well-Platte aus und fügen Sie jeder Vertiefung Wachstumsfaktoren hinzu: N2 5 μl/Vertiefung, G5 5 μl/Vertiefung und B27 10 μl/Vertiefung. Stellen Sie die 24-Well-Platte in einen 37 °C heißen Inkubator mit 5 % CO2 , damit die Zellen haften können. Vierundzwanzig Stunden später wechseln Sie das Medium auf "glia media" (Tabelle 1) mit den oben genannten Wachstumsfaktoren und wechseln Sie alle 48 Stunden (Abbildung 2).

2. Immunfluoreszenz-Zytologie

  1. Züchten Sie die enterischen Gliazellen aus der Primärkultur (P0) (Schritt 2.1.14) auf 70-80% Konfluenz und passieren Sie sie einmal (P1).
  2. Fixieren Sie die Primärkulturzellen (P0) in den Vertiefungen mit 4 % Paraformaldehyd für 5 Minuten, bevor Sie 0,1 % PBS-Azid auftragen.
  3. Bereiten Sie eine Sättigungslösung vor, die aus PBS-Azid, 4 % Eselserum und 0,5 % Triton-X besteht. Geben Sie 300 μl Sättigungslösung in die Vertiefungen, um die Zellen 2 h lang bei Raumtemperatur zu permeabilisieren.
  4. Der Primärantikörper für den Gliamarker, das saure Gliafibrillärprotein (GFAP), und der Primärantikörper für den Fibroblastenmarker, Alpha-Aktin der glatten Muskulatur, werden in Verdünnungen von 1:1.000 in Sättigungslösung für die Inkubation über Nacht bei 4 °C zugegeben.
  5. Waschen Sie 3x mit PBS, bevor Sie den Sekundärantikörper für das Esel-Anti-Kaninchen-IgG Alexa Fluor 594 und das Anti-Maus-IgG Alexa Flour 488 für 2-3 h in einer Verdünnung von 1:500 in Sättigungslösung hinzufügen.
  6. Färben Sie die Zellkerne mit 4',6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) in einer Verdünnung von 1:1.000 in PBS für 5 min.
  7. Lagern Sie die Zellen nach drei Wäschen mit PBS in 0,1 % PBS-Azid.

3. Exposition der submukösen equinen enterischen Glia-Primärkultur IL-1β

  1. Wenn die Zellen aus der ersten Passage (P1) eine Konfluenz von 70-80 % erreichen, führen Sie das IL-1β-Expositionsexperiment durch. Setzen Sie die Vertiefungen 24 Stunden lang 0 ng, 10 ng und 25 ng IL-1β aus. Nach 24 Stunden werden die Medien aus jeder Vertiefung bei -80 °C gelagert und gelagert.

4. Organoidkultur bei Pferden zur Herstellung von Enterozyten-Monoschichten

HINWEIS: In Anlehnung an das 2018 veröffentlichte Protokoll von Stewart et al. wurden die Darmkrypten und Knospen von Pferden, die einer Kryobank unterzogen worden waren, für 2D-enteroide Studien erweitert10.

  1. Verwenden Sie ca. 700-1.000 Knospen/Kryptenfragmente (40.000-50.000 Zellen, wenn sie in einzelne Zellen dissoziiert werden) pro Transwell-Einsatz. Die Transwell-Einsätze vor der Zugabe der Enterozyten mit 42 μl 0,05 % Matrigel bestreichen. Lassen Sie das Matrigel 1 h bei 37 °C auf dem Einsatz fixieren. Saugen Sie das zusätzliche Medium an und lassen Sie die Transwells 30 Minuten lang unbedeckt trocknen. Geben Sie 200 μl DMEM-F12-Medium in jeden Transwell-Einsatz und lagern Sie die Platte bis zur Verwendung bei 37 °C.
  2. Waschen Sie die Matrigel-Patties mit den Organoiden mit PBS und setzen Sie sie dann auf Eis 500 μl Cell Recovery aus. Pipettieren Sie sie wiederholt, um eine vollständige Sammlung der Zellen in einem 15-ml-Röhrchen zu gewährleisten.
  3. Das Röhrchen wird 5 Minuten lang bei 4 °C bei 300 × g zentrifugiert, der Überstand entfernt und das Zellpellet im Zielvolumen des Mediums für intestinale epitheliale Stammzellen (IESC) suspendiert. Berechnen Sie das Zielvolumen, indem Sie die gewünschte Anzahl an Monolagen mit 200 μl Medium multiplizieren. (Tabelle 1).
  4. Eine 1-ml-Spritze in IESC-Medien vorcoaten und die Zellsuspension durch eine 16-G-Nadel aspirieren. Ersetzen Sie die 16-G-Nadel durch eine 28-G-Nadel und stoßen Sie die Zellsuspension durch diese Nadel aus, um die Trennung der Organoide zu fördern.
  5. Es werden 200 μL der resultierenden Zellsuspension in die apikale Seite der beschichteten Transwells und 500 μL IESC sowie zuvor beschriebene Wachstumsfaktoren auf die basale Seite des Transwell-Einsatzes10 gegeben. Wechseln Sie die Medien und Wachstumsfaktoren alle 24-48 Stunden, bis die Konfluenz erreicht ist. Definieren Sie Konfluenz als die Zelldichte, die einem TEER von 1.000 Ohmsxcm 2,11 entspricht. Zur Messung siehe Schritt 5.1.

5. Permeabilität der Monoschicht von Enterozyten bei Pferden nach Exposition gegenüber entzündlichen Zytokinen und enterischen Gliaprodukten bei Pferden

  1. Verwenden Sie eine TEER-Messkammer mit zwei Elektroden, um den TEER über die Monoschichten zu quantifizieren und einen Basiswert für jede transwellpermeable Membran zu ermitteln. Stellen Sie sicher, dass das IESC-Medium und der Transwell 15 Minuten Zeit haben, um Raumtemperatur zu erreichen, bevor Sie Messungen durchführen. Füllen Sie den Kulturbecher mit 1,5 mL IESC-Medien und stellen Sie sicher, dass genau 200 μl Medium im Transwell-Einsatz vorhanden sind, damit die Flüssigkeitsleitungen zum Zeitpunkt der Messung übereinstimmen.
  2. Der basolaterale Aspekt der Transwell-Inserts wird entweder entzündlichen Zytokinen von 25 ng IL-1β, 10 ng und 25 ng Interleukin 6 (IL-6) pro Vertiefung oder Gliaprodukten von Kulturen, die 10 ng oder 25 ng IL-1β ausgesetzt wurden, ausgesetzt. Der basolaterale Aspekt der Kontroll-Transwell-Insertionen wird dem Gliamedium und dem Gliamedium aus Kulturen, die nicht IL-1β ausgesetzt sind, ausgesetzt.
  3. Messen Sie den TEER 45 Minuten lang in Abständen von 10-15 Minuten, indem Sie jeden Transwell in den Kulturbecher geben.

6. Statistik

  1. Berechnen Sie die Faltenänderung des TEER jedes Transwells für die Zeitpunkte: 0, 10, 20, 30 und 45 min.
  2. Vergleichen Sie unter Verwendung der Software Ihrer Wahl (siehe Materialtabelle) die Korrelationen zwischen einer verringerten TEER und einer basolateralen Exposition gegenüber IL-1β (25 ng), IL-6 (10 ng, 25 ng und 100 ng) und Gliamedien (exponiert mit 0 ng IL-1β, 10 ng IL-1β und 25 ng IL-1β), um Medien mit einem ungepaarten einseitigen t-Test zu kontrollieren.

Ergebnisse

Die Mikrodissektion des equinen Jejunums in die submuköse Schicht (Abbildung 1) mit weiterem enzymatischem und mechanischem Verdau könnte lebensfähige Zellkulturen der enterischen Gliazellen des Pferdes erzeugen. Die Zellen zeigten einen Pleomorphismus mit einer Dominanz spindelförmiger Zellen, die mit den enterischen Gliazellen anderer Spezies übereinstimmt (Abbildung 2A). Die Kulturen waren positiv für den selektiven Gliamarker, das saure Gliafibrillenprotein (GFAP), mit geringer Fibroblastenkontamination (alpha SMA, Abbildung 2B). In einigen Fällen wurde die Mikrodissektion der submukösen Schichten nicht hoch genug kontrolliert, und die Kulturen waren mit hohen Prozentsätzen von Fibroblasten kontaminiert, die durch Immunfluoreszenz des Fibroblastenmarkers Aktin der glatten Muskulatur beobachtet wurden (Abbildung 3).

Als nächstes wurde als Beispiel für die Nützlichkeit der enterischen Gliakultur von Pferden der Einfluss von IL-1β-exponierten enterischen Gliazellen auf die Funktion der intestinalen Epithelbarriere bewertet. Die basolaterale Exposition gegenüber Medien aus submukösen enterischen Gliakulturen von Pferden, die 24 h lang mit 10 ng und 25 ng IL-1β kontaminiert wurden, erhöhte die Permeabilität signifikant (p = 0,05 bzw. 0,04, Mittelwert der Kontrollmedien = 0,9, Mittelwert der glialen 10 ng IL-1β-Gruppe = 0,8, 95%-Konfidenzintervall = -0,2 bis 0,02, Mittelwert der glialen 25 ng IL-1β-Gruppe = 0,8, 95 %-Konfidenzintervall = -0,1995 bis 0,01060, n = 3-4) (Abbildung 4A). Die Exposition von equinen epithelialen Monolayern gegenüber basolateralem 10-25 ng equinem IL-6, einem inflammatorischen Zytokin, das nachweislich sowohl von enterischen Gliazellen produziert wird, die IL-1β ausgesetzt sind, als auch eine erhöhte Enterozytenpermeabilität in Nagetiermodelleninduziert 12, erhöhte jedoch nicht signifikant die Permeabilität der equinen Enterozyten-Monolayer (Abbildung 4B)

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Abbildung 1: Isolierung der enterischen Gliazellen aus dem equinen Jejunum durch Mikrodissektion und enzymatischen und mechanischen Verdau. (A) Das Jejunum wurde entlang der antimesenterialen Grenze durchtrennt und mit der Schleimhautseite nach oben fixiert. (B) Die Darmzotten wurden mikroskopisch sichtbar gemacht und durch sanftes Schaben entfernt, bis die dünne Lamina propria sichtbar war. (C) Die Schicht der Lamina propria wurde dann entfernt, bis die glatten Muskelfasern gerade noch durch die durchscheinende Submukosa sichtbar waren. (D) Die Submukosa wurde gezeltet und von der Muskelschicht zurückgeschält, wobei bei Bedarf Schnitte an den fibrösen Markierungen vorgenommen wurden. Die Bilder wurden mit einem 10-fach-Dissektionsmikroskop (B,C) aufgenommen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 2: Bildgebung der submukösen enterischen Gliakulturen von Pferden. (A) Die sternförmige (Pfeile), fusiforme (offene Pfeilspitze) und ganglionäre (geschlossene Pfeilspitze) Morphologie der enterischen Gliazellen von Pferden wurde mittels Phasenkontrastmikroskopie untersucht. (B) Die Reinheit der Kulturen wurde durch Färbung auf GFAP und auf den Fibroblastenmarker Aktin der glatten Muskulatur bestimmt. Skalenbalken = 100 mm (A), 400 mm (B). Abkürzungen: GFAP = saures gliales fibrilläres Protein; DAPI = 4',6-diamidino-2-phenylindol. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 3: Bildgebung von erfolglosen submukösen enterischen Gliakulturen von Pferden. Die Reinheit der Kulturen wurde durch Färbung auf GFAP (rot) und auf den Fibroblastenmarker Aktin der glatten Muskulatur (grün) bewertet, was einen hohen Prozentsatz der Fibroblastenkontamination zeigt. Die gelbe Pfeilspitze steht für GFAP und die weiße Pfeilspitze für Aktin der glatten Muskulatur. Maßstabsstange = 400 mm. Abkürzung: GFAP = gliales fibrilläres saures Protein. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 4: TEER der epithelialen Monoschicht des Pferdes nach Exposition von inflammatorischen Zytokinen und entzündlichen Gliaprodukten. (A) Basolaterale Exposition gegenüber Medien aus der submukösen enterischen Gliakultur des Pferdes, die 24 h lang mit 10 ng und 25 ng IL-1β exponiert wurde, erhöhte die Permeabilität signifikant (*p = 0,05 bzw. 0,04, n = 3-4). (B) Die akute Exposition der Enterozyten-Monoschicht bei Pferden gegenüber basolateralen 25 ng IL-1β und 10-25 ng IL-6 bei Pferden erhöhte die Permeabilität der epithelialen Monoschicht bei Pferden nicht signifikant (n = 2-4). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Tabelle 1: Reagenzien für Isolierung und Kultur. Die folgenden Reagenzien wurden verwendet, um Medien für die Isolierung von enterischen Gliazellen bei Pferden, enterische Gliakulturen und intestinale epitheliale Stammzellkulturen bei Pferden zu formulieren. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Diskussion

Das Ziel dieser Studie war es, eine wiederholbare Methode zur Primärkultur von submukösen enterischen Gliazellen von Pferden zu entwickeln und ihre Anwendung zur Modellierung von Epithel-Glia-Interaktionen zum Zeitpunkt der Koliken zu demonstrieren. Die Isolierung und Kultur enterischer Gliazellen, die beim Pferd neu ist, hat sich als vorteilhaft für das Verständnis der Darmkrankheitswege in Schweine- und Nagetiermodellen sowie beim Menschen erwiesen 6,7,13,14. Die Untersuchung dieser Zellpopulation ist möglicherweise wichtig, da sie als subepitheliale Sensoren der Darmumgebung fungieren und mit den umgebenden Zellen in der Darmwand interagieren und kommunizieren können. Mit ihrer ausgeprägten Wahrnehmungsfähigkeit ist es nicht schwer, sich eine potenziell kritische Rolle der Gliazellen bei Pferdekoliken vorzustellen, bei denen das Darmgewebe durch Blähungen, Ischämie und möglicherweise chirurgische Manipulation belastet wird6.

Frühere Arbeiten von Lisowski et al. zeigten einen erhöhten Entzündungsstatus des Darmgewebes von Pferden zum Zeitpunkt der Kolikchirurgie. Wie wichtig es ist, dieses entzündliche Milieu zu mildern, wird durch enterische Gliakulturen von Nagetieren unterstrichen, die bewiesen haben, dass sie in der Lage sind, Produkte zu synthetisieren, die die Funktion der Darmbarriere stören können 7,12. Das Austreten von intestinalem luminalem Inhalt in die Darmwand würde nicht nur zu einer Entzündungsreaktion führen, sondern auch zu einer möglichen Infiltration in den Kreislauf, die dann einen endotoxämischen Schock/Sepsis auslösen könnte. Patienten mit postoperativen Koliken bei Pferden werden leider von zahlreichen entzündlichen postoperativen Komplikationen geplagt, darunter Sepsis und postoperativer Ileus, die nicht nur das Überleben und den Patientenkomfort verringern, sondern auch die Kosten und die emotionale Belastung der Kunden erhöhen3. Die Etablierung eines Modells von Epithel-Glia-Interaktionen zum Zeitpunkt der Koliken könnte einen möglichen Weg der Durchlässigkeit der Darmbarriere bei Koliken und eine mögliche Prävention aufklären.

Die Kultivierung der submukösen enterischen Gliazellen von Pferden ist aufgrund der Merkmale der Art mit Anpassungen und Einschränkungen verbunden. Am wichtigsten war, dass die Zeitspanne, die für einen effektiven enzymatischen Aufschluss erforderlich war, eine Titration erforderte. Die Autoren fanden heraus, dass eine Inkubation mit den Enzymen für 2-3 h bei 37 °C für die erfolgreiche Isolierung der enterischen Gliazellen des Pferdes notwendig war. Darüber hinaus scheint es für die Lebensfähigkeit der Kultur nachteilig zu sein, wenn enterische Kulturen von Pferden vor der Passage einen Konfluenzgrad von über 80 % erreichen. Die Haupteinschränkung dieser Methode ist derzeit der Stichprobenumfang. In dieser Studie wurden nur Gewebe/Zellen von Pferden untersucht, die sich aus nicht studienbezogenen Gründen einer Kolikoperation oder Euthanasie unterzogen hatten. Die fortgesetzte Kultivierung von enterischen Gliazellen von Pferden von weiteren Probanden sowie die Entwicklung eines Protokolls für das Einfrieren und Lagern von enterischen Gliazellen bei Pferden werden die Aussagekraft dieser Studie erheblich erhöhen.

In dieser Studie wird der neuartige Nutzen der submukösen enterischen Gliakultur und der Primärkultur von equinen Enterozyten als mögliche Methoden zum Verständnis von Koliken und Magen-Darm-Erkrankungen bei Pferden vorgestellt. Während epitheliale Monoschichten von Pferden, die aus isolierten Darmkrypten und Organoiden gezüchtet wurden, in der Vergangenheit gut etabliert waren, hat diese Studie nicht nur ihre Nützlichkeit als Modell unter Beweis gestellt, sondern ermutigt auch zu weiteren Studien, die die Interaktion mit den intestinalen Enterozyten von Pferden und anderen Zelltypen in der Darmwand untersuchen.

Die beobachteten Wechselwirkungen zwischen diesen Zelltypen beinhalten potenzielle Anwendungen sowohl für Koliken als auch für andere entzündliche Magen-Darm-Erkrankungen wie entzündliche Darmerkrankungen (CED) und Kolitis. Darüber hinaus wird die weitere Verfeinerung der Kulturmethoden für enterische Gliazellen und Enterozyten in Zukunft die Etablierung von Kokulturstudien ermöglichen. Während sich die aktuelle Studie aufgrund ihrer Nähe zur epithelialen Monoschicht und des Fokus auf die Darmbarrierefunktion auf die submuköse enterische Gliapopulation konzentriert, können zusätzliche Arbeiten durchgeführt werden, um die Funktion der enterischen Gliazellen von Pferden aus dem myenterischen Plexi der Darmwand zu kultivieren und zu bewerten, was bei der Bestimmung des Einflusses entzündlicher enterischer Gliazellen bei Pferden auf die Motilität hilfreich sein kann15.

Offenlegungen

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Danksagungen

Die Autoren danken der Morris Animal Foundation für die Finanzierung dieses Projekts.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
1 M HEPES PufferGibco15630-080
10 mM HEPESLife Technologies15630-106
2 mM GlutaMAXLife Technologies25050-061
4' 6-Diaminidino-2-phenylindolInvitrogenD3571
Advanced DMEM/F12Life Technologies12634-010
Alpha-Aktin-Antikörper für die glatte MuskulaturAbcam7817
Amphotericin BSigmaAA95294,4 g/ml, Stammaliquote, Endkonzentration 1,1 & Mikro; g/mL
Antimikotikum 1xGibco15240-096
B27Gibco12587010
RinderserumalbuminSigmaAA3311
BSA 50 mg/ml StammlösungSigmaA3311
CaCL2ACROS Organiics206791000Bestandteil von Equine Ringer ' s Brühe 1: Kombinieren Sie sie mit anderen Zutaten, geben Sie dann 100 ml dieser Brühe in einen Messzylinder und verdünnen Sie sie mit entionisiertem Wasser auf 1 l. Stellen Sie den pH-Wert auf 7,4 mit 5 % CO2,
Kombinieren Sie mit Equine Ringer" s Lager 2 zu vervollständigen " Klingelton" s Lösung".
CollagenaseSigma9891
DMEM-F12 MedienThermo Fisher11320033
Esel Anti-Kaninchen IgG Alexa Fluor 594Invitrogen21207
EVOM EndOhm Doppelelektrode TEER-MesskammerWorld Precision InstrumentsEVM-EL-03-01
EVOM Handbuch für TEER-MessungWorld Precision InstrumentsEVM-MT-03-01
G5Gibco17503012
Gentamicin LösungSigmaG1272Endkonzentration 20 & Mikro; g/mL
GFAP-AntikörperAbcam4674
Ziege Anti-Maus IgG Alexa Fluor 488Invitrogen28175
IL-1β ELISAThermo FisherESIL1B
KClThermo FisherP330-500Komponente des Pferderingers s Brühe 1: Kombinieren Sie sie mit anderen Zutaten, geben Sie dann 100 ml dieser Brühe in einen Messzylinder und verdünnen Sie sie mit entionisiertem Wasser auf 1 l. Stellen Sie den pH-Wert auf 7,4 mit 5 % CO2,
Kombinieren Sie mit Equine Ringer" s Lager 2 zu vervollständigen " Klingelton" s Lösung".
L-Glutamin-LösungCorning25-00-Cl
MatrigelBD Bioscience354277
MgCl2Thermo FisherM33-500Bestandteil von Equine Ringer' s Brühe 1: Kombinieren Sie sie mit anderen Zutaten, geben Sie dann 100 ml dieser Brühe in einen Messzylinder und verdünnen Sie sie mit entionisiertem Wasser auf 1 l. Stellen Sie den pH-Wert auf 7,4 mit 5 % CO2,
Kombinieren Sie mit Equine Ringer" s Lager 2 zu vervollständigen " Klingelton" s Lösung".
N2Gibco17502048
Na2HPO4Thermo FisherBP332-1Komponente des Pferderingers s Brühe 2: Kombinieren Sie sie mit anderen Zutaten, geben Sie dann 100 ml dieser Brühe in einen Messzylinder und verdünnen Sie sie auf 1 l mit entionisiertem Wasser. Stellen Sie den pH-Wert auf 7,4 mit 5 % CO2,
Kombinieren Sie mit Equine Ringer" s Bestand 1 zur Vervollständigung " Klingelton" s Lösung".
NaClThermo FisherS271-10Komponente des Pferderingers s Brühe 1: Kombinieren Sie sie mit anderen Zutaten, geben Sie dann 100 ml dieser Brühe in einen Messzylinder und verdünnen Sie sie mit entionisiertem Wasser auf 1 l. Stellen Sie den pH-Wert auf 7,4 mit 5 % CO2,
Kombinieren Sie mit Equine Ringer" s Lager 2 zu vervollständigen " Klingelton" s Lösung".
NaH2PO4Thermo FisherBP329-500Komponente des Pferderingers s Brühe 2: Kombinieren Sie sie mit anderen Zutaten, geben Sie dann 100 ml dieser Brühe in einen Messzylinder und verdünnen Sie sie auf 1 l mit entionisiertem Wasser. Stellen Sie den pH-Wert auf 7,4 mit 5 % CO2,
Kombinieren Sie mit Equine Ringer" s Bestand 1 zur Vervollständigung " Klingelton" s Lösung".
NaHCO3Thermo FisherS637-212Komponente von Equine Ringer' s Brühe 2: Kombinieren Sie sie mit anderen Zutaten, geben Sie dann 100 ml dieser Brühe in einen Messzylinder und verdünnen Sie sie auf 1 l mit entionisiertem Wasser. Stellen Sie den pH-Wert auf 7,4 mit 5 % CO2,
Kombinieren Sie mit Equine Ringer" s Bestand 1 zur Vervollständigung " Klingelton" s Lösung".
Pen/Streptokokken-LösungGemini400-109
Poly-L-LysinSigmaP26360,5 mg/ml in 1x Boratpuffer
Prismensoftware GraphPad
ProteaseSigmaP4630
NatriumbicarbonatlösungSigmaS87617,5%ige Stammlösung

Referenzen

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Equine enterische GliaDarmbarrierefunktionsubmukosale Zellisolationenzymatische Verdauungtransepithelialer elektrischer Widerstandepitheliale gliale InteraktionInterleukin 1 Betaintestinale epitheliale Monoschicht

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