Modellierung der endothelialen Glykokalyx nach der Pneumonektomie in einem 3D-Fluidik-Chip - Ein Ansatz zur Herstellung eines vaskulär basierten Organ-on-Chip-Systems

Zusammenfassung

Hier stellen wir ein Protokoll für die Konstruktion eines Organ-on-Chip (OOC)-Systems vor, das die Pneumonektomie nachahmen soll. Dieses System untersucht den möglichen Zusammenhang zwischen einer Beeinträchtigung der Glykokalyx und Komplikationen nach Pneumonektomie.

Zusammenfassung

Die endotheliale Glykokalyx (GCX), eine kohlenhydratreiche Schicht, die die luminale Oberfläche von Endothelzellen bedeckt, spielt eine entscheidende Rolle bei der Regulierung zellulärer Reaktionen auf Reize. Es besteht aus Transmembranproteinen, die als Mechanotransducer für zelluläre Reaktionen dienen. Während es unter homöostatischen Bedingungen auf natürliche Weise seine Struktur und Stabilität beibehält, kann die Einwirkung von hoher Scherbelastung zu Schäden mit zahlreichen Folgen führen. Die Auswirkungen von allgemeiner Scherbelastung auf Endothelzellen wurden untersucht, aber das Ausmaß und die Auswirkungen von Scherbelastung auf die Gefäßsysteme, insbesondere nach der Pneumonektomie, wurden nicht gut untersucht. Um dies zu untersuchen, wurde ein umfassender Ansatz verfolgt, der die Erstellung eines CAD-Modells der Lungengefäße vor und nach der Pneumonektomie beinhaltete. Mit Hilfe von Computational Fluid Simulation wurden Schlüsselbereiche mit erhöhter Scherspannung und erhöhtem Druck identifiziert und in einem Organ-on-Chip (OOC)-System repliziert. Humane mikrovaskuläre Endothelzellen (HLMVECs) der Lunge wurden auf eine Form in Form der ausgewählten Schnitte ausgesät, um die Auswirkungen erhöhter Scherspannung in vitro zu charakterisieren. Nach den Experimenten wurden HLMVECs immungefärbt, um die Gesundheit von GCX unter normalen und erhöhten Belastungen, die durch Pneumonektomie induziert wurden, qualitativ zu bewerten. Die Integration von Computermodellierung und experimenteller Analyse verbessert unser Verständnis dafür, wie sich Änderungen der Scherspannung auf GCX auswirken, und klärt ihre Auswirkungen auf die Gefäßfunktion und postoperative Komplikationen.

Einleitung

Eine Pneumonektomie ist ein invasiver und risikoreicher chirurgischer Eingriff, der zur Extraktion der rechten oder linken Lunge^{durchgeführt wird 1}. Dieses Verfahren wird in der Regel als Behandlungsoption für verschiedene schwere Erkrankungen wie Lungenkrebs, Lungentuberkulose und traumatische Lungenverletzungen eingesetzt². Das Verfahren ist zwar vielversprechend, birgt aber auch erhebliche Risiken, die durch erhöhte Raten postoperativer Komplikationen von Herzrhythmusstörungen bis hin zu Lungenödemen unterstrichen^{werden 1}.

Pneumonektomien haben einen tiefgreifenden Einfluss auf die kardiovaskuläre Dynamik, indem sie das gesamte Herzzeitvolumen des Herzens in die verbleibende Lunge leiten³. Es ist bekannt, dass diese Umlenkung des Blutflusses den Druck und die Scherspannungen innerhalb der verbleibenden Lungengefäße erhöht⁴. Bei diesen enormen Veränderungen der Blutflussmuster spielt die endotheliale Glykokalyx (GCX) eine entscheidende Rolle bei der Wahrnehmung dieser Veränderungen in den Blutflussmustern⁵.

Der GCX ist eine gelartige Schicht, die biochemische Aktivitäten als Reaktion auf Veränderungen in ihrer Umgebung reguliert ^6,7. Es hat sich gezeigt, dass ihre Expression mit längerer Exposition gegenüber gleichmäßiger Strömung zunimmt und mit Exposition gegenüber gestörter Strömung im Vergleich zu statischen Kulturen abnimmt ^8,9. Der GCX weist eine variable Dicke von 0,1 bis 1 μm über das gesamte Gefäßsystem auf und fungiert als essentielle Mechanotransduktionsschicht, die die Endothelzellen der Blutgefäße umhüllt¹⁰. Das Netzwerk besteht aus einer dichten Schicht aus Zuckern, Lipiden und Proteinen, wie in Abbildung 1 gezeigt. Diese Zucker binden an Glykane, die entweder frei im Blutkreislauf existieren oder an Proteine oder Lipide gebunden sein können, was zur Bildung von Proteoglykanen, Glykoproteinen oder Glykolipiden führt ^7,11. Proteoglykane bestehen aus Glykosaminoglykanketten (GAG), die über Plasmaproteine oder Rezeptoren an die Zellmembran binden. Zu diesen GAGs gehören Heparansulfat (HS), Hyaluronsäure (HA), Chondroitinsulfat (CS), Dermatansulfat und Keratansulfat¹². Heparansulfat ist der vorherrschende GAG und macht über 50 % der gesamten GAGs aus, die im GCX gefunden werden. Diese Seitenketten können an eingebettete Kernproteine binden, zu denen Glypicane (verankert durch Glycosylphosphatidylinositol) und Syndecane (mit einer membranübergreifenden Domäne) sowie CD44 (ein Oberflächenadhäsionsrezeptor) gehören. Die oben beschriebenen Komplexe spielen eine entscheidende Rolle bei der Regulierung von Wachstumsfaktoren, entzündungshemmenden Reaktionen, der Erleichterung der Gefäßerweiterung und der Kontrolle der Gefäßpermeabilität¹³.

Abbildung 1: Diagramm der GCX-Komponente. Schematische Darstellung der Bestandteile des endothelialen Glykokalyxes. Dieses Schema zeigt die apikale Glykokalyx, die sich auf dem Lumen des Gefäßes befindet, mit ihren membrangebundenen Proteoglykanen und Glykoproteinen. Erstellt mit BioRender.com Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Obwohl der genaue Zusammenhang zwischen Pneumonektomien und GCX-Schädigungen nicht gut untersucht ist, besteht eine plausible Korrelation zwischen den durch Pneumonektomien induzierten veränderten Blutflussmustern und der Integrität der GCX. Es ist bekannt, dass eine gestörte Durchblutung des Gefäßsystems dem GCX⁶ Schaden zufügt. Wir stellten die Hypothese auf, dass eine erhöhte Strömungsstörung und Veränderungen der Scherspannung im verbleibenden Gefäßsystem nach einer Pneumonektomie im Laufe der Zeit zu einer Schädigung des GCX führen können. Diese beschleunigte Verschlechterung kann postoperative Komplikationen und Morbiditäten katalysieren und dadurch die inhärenten Risiken für die allgemeine Gesundheit des Patienten erhöhen¹³.

Dieses Protokoll zielte darauf ab, das pulmonale Gefäßsystem nach der Pneumonektomie nach dem in Abbildung 2 beschriebenen allgemeinen Verfahren zu modellieren. Fluidsimulationen wurden an einem computergestützten Designmodell durchgeführt, das das menschliche Lungengefäßsystem mit und ohne Pneumonektomie nachbildete. Die Pneumonektomiemodelle wurden erstellt, indem 3D-Lungengefäße in einer 3D-Modellierungssoftware entworfen wurden, basierend auf Abmessungen, die aus CT-Scans und Literaturdaten abgeleitet wurden, und sie dann für Strömungssimulationen in CFD-Software (Computational Fluid Dynamics) weiter vereinfacht wurden. Die Simulationen identifizierten spezifische Interessengebiete, die nach Bereichen ausgewählt wurden, in denen die Scherspannung in den Pneumonektomiemodellen im Vergleich zur Kontrolle erhöht war. Diese Interessengebiete wurden ausgewählt, um sie für die Erstellung eines In-vitro-Modells zu replizieren. Das In-vitro-Modell verwendete ein fluidisches Kammerdesign, um mehrere Abschnitte des Gefäßsystems mit normaler Geometrie zu simulieren, und eine Pneumonektomiegeometrie, um den Unterschied in den Strömungsbedingungen zu simulieren.

Humane mikrovaskuläre Endothelzellen (HLMVECs) der Lunge wurden auf Fibronektin-beschichteten Polydimethylsiloxan (PDMS)-Substraten kultiviert, die so geformt waren, dass sie eine ausgewählte Bifurkationsregion nachahmen. Mikrovaskuläre Endothelzellkulturmedien wurden mit einer Peristaltikpumpe durch das System perfundiert. Schließlich wurden die Zellen und GCX fixiert, mit einem GCX-färbenden Antikörper immungefärbt und mit einem Fluoreszenzmikroskop visualisiert, um ihren Zustand nach der Exposition gegenüber dem Flüssigkeitsfluss zu bewerten. Eine allgemeine Zeitleiste des Protokolls ist in Tabelle 1 zu finden.

Abbildung 2: OOC-Entwicklungssequenz. Sequenz der Entwicklung eines neuartigen OOC-Systems zur Untersuchung der Auswirkungen der Lungenpneumonektomie (1) CT-Scan des menschlichen Lungengefäßsystems. (2) CT-Scan-Geometrie, die zur Identifizierung von Bereichen von Interesse für das 3D-CAD-Modell verwendet wird. (3) Strömungssimulationen zur Bestimmung von Geometrien, die für das In-vitro-Modell von Interesse sind. (4) PDMS-Form modelliert mit interessanten Bereichen aus den Simulationsergebnissen (5) Form wird in ein Acrylgehäuse eingesetzt, um die Form für die Perfusion zu fixieren (6) Abgeschlossene Einrichtung der Durchflusskammer (7) Vollständige Einrichtung der Durchflusskammer wird in den Inkubator übertragen (8) Hellfeld- und Fluoreszenzbilder, die nach Scherbelastung aufgenommen wurden. Erstellt mit BioRender.com Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Tabelle 1: Allgemeiner Zeitplan des Protokolls. Allgemein Abfolge der ausführenden Schritte innerhalb des Protokolls mit der durchschnittlichen Dauer (h) jedes Schritts. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Protokoll

In dieser Studie wurden Computertomographie (CT)-Bildgebungsdaten aus früherer Literatur¹⁴ verwendet, die in Übereinstimmung mit den ethischen Standards der Institutionen und des Bundes erhoben wurden. Alle Bilddaten, auf die verwiesen wurde, hatten eine informierte Einverständniserklärung der Teilnehmer, nachdem sie vom Institutional Review Board (IRB) genehmigt worden waren, um den Schutz der Rechte und der Privatsphäre der Teilnehmer zu gewährleisten.

1. Modellierung der Lungengefäße in CAD-Software

1. Erforschung der physiologischen Geometrien der zu modellierenden Primärgefäße.
2. Verwenden Sie CT-Bilder der zu modellierenden Gefäße des Patienten, um spezifische Geometrien für die Replikation auszuwählen (siehe Abbildung 2).
   HINWEIS: Für dieses Protokoll wurden CT-Scans des klinischen Zustands der Lunge aus der früheren Literatur verwendet¹⁴. Dieses Protokoll ermöglicht auch die Verwendung beliebiger CT-Scandaten zur Generierung von In-vitro-Modellen .
   1. Öffnen Sie einen DICOM-Viewer und importieren Sie die CT-Bilder. Navigieren Sie durch die Segmente, um die gewünschten Gefäße zu identifizieren. Speichern Sie die relevanten Bilder für die weitere Analyse.
      HINWEIS: Bei dem für dieses Protokoll replizierten Gefäß handelte es sich um Lungengefäße, da die Anwendung dieses Protokolls darin besteht, die endotheliale Glykokalyx bei gesunden und nach einer Pneumonektomie zu modellieren. Andere Standorte können für unterschiedliche Anwendungen verwendet werden.
3. Messen Sie mit ImageJ FIJI v1.54f¹⁵ Gefäßdurchmesser aus CT-Bildern oder Literaturwerten.
   1. Offen ImageJ FIJI und Importieren Sie die gespeicherten CT-Bilder: Wählen Sie Datei > Öffnen.
   2. Wählen Sie das Linienwerkzeug aus der Symbolleiste aus, um eine Linie zu zeichnen, die sich über die Länge der Maßstabsleiste auf dem CT-Bild erstreckt.
   3. Wählen Sie dann Analysieren > Skalierung festlegen aus. Geben Sie den bekannten Abstand ein (z. B. wenn der Maßstabsbalken im Bild 10 mm beträgt, geben Sie 10 als bekannten Abstand ein). Geben Sie die Längeneinheit ein (z. B. mm). Klicken Sie auf OK.
4. Verwenden Sie das Linienwerkzeug, um Durchmesser zu messen. Wählen Sie dazu das Linienwerkzeug aus der Symbolleiste aus und zeichnen Sie eine Linie, die den Behälterdurchmesser überspannt. Wählen Sie dann Analysieren > Messen aus, um den Durchmesserwert abzurufen.
5. Die Schritte 1.3 und 1.4 werden für alle betreffenden Schiffe wiederholt und die Messungen aufgezeichnet.
6. Kompilieren Sie Schiffsmessungen in Segmenttypen, um die Modellierung zu erleichtern.
   1. Erstellen Sie eine Tabelle, um die Gefäßmaße zu kategorisieren, und beschriften Sie jede Zeile mit dem Gefäßnamen, der Messung und dem Segmenttyp (z. B. Arterie, Vene).
7. Erstellen Sie eine Referenztabelle für Gefäßsegmentlängen und -durchmesser auf der Grundlage von Literatur- und Röntgenmessungen.
8. Generieren Sie ein 3D-Modell mit einer 3D-Modellierungssoftware, um die Geometrie und Abmessungen der CT-Bilder zu replizieren.
   1. Öffnen Sie die Software und erstellen Sie eine neue Bauteildatei: Wählen Sie Datei > Neu > Bauteil und wählen Sie Skizze > Skizze erstellen und zeichnen Sie das Profil mit den Bemaßungen aus ImageJ.
   2. Verwenden von Oberflächen-Sweeps und Lofting für 3D-Geometrie: Wählen Sie für Sweeps die Option Features > Sweeped Boss/Base aus. Wählen Sie für Erhebungen die Option Features > Erhobene Nase/Basis aus.
   3. Verfeinern Sie das Modell so, dass es den exakten Maßen entspricht.
9. Identifizieren Sie Modellvariationen, die entwickelt werden sollen, z. B. ein Kontrollmodell und ein Pneumonektomiemodell.
   1. Skizzieren Sie die verschiedenen Erkrankungen (z. B. normale vs. Pneumonektomie) und listen Sie die strukturellen Veränderungen auf, die für jede Variation erforderlich sind.
10. Duplizieren Sie das Originalmodell zur Änderung, um die experimentellen Modelle gemäß Ihren Parametern zu erstellen (z. B. rechte und linke Pneumonektomie).
    1. Speichern Sie das Originalmodell, und wählen Sie dann Datei > Als Kopie speichern , um Kopien für jede experimentelle Bedingung zu erstellen.
    2. Modifizieren Sie jede Kopie entsprechend den definierten Parametern (z. B. rechte und linke Pneumonektomie).
11. Konvertieren Sie das Modell von einer Teiledatei in eine Parasolid-Datei für CFD-Simulationen (Computational Fluid Dynamics).
    1. Wählen Sie Datei > Speichern unter. Wählen Sie Parasolid (*.x_t) aus der Dropdown-Liste "Dateityp" aus und speichern Sie die Datei im gewünschten Verzeichnis.

2. Simulation von Strömungen

HINWEIS: Dieser Schritt ist hilfreich bei der Lokalisierung von Regionen mit modifizierter Scherspannung nach der Pneumonektomie, um die Gefäßgeometrie auszuwählen, die für das In-vitro-System repliziert werden soll. Darüber hinaus muss die Softwarelizenz das Importmodul unterstützen.

1. Richten Sie eine neue Steady-State-Laminar-Flow-Studie ein.
   1. Wählen Sie Model Wizard > 3D (Raumdimension) > Fluidströmung > Einphasenströmung > Laminarströmung (SPF) aus, > wählen Sie Hinzufügen aus, um die Laminar-Flow-Physikschnittstelle hinzuzufügen, > wählen Sie Studie aus, wählen Sie Studie > unter Allgemeine Studie die Option Stationär aus, > wählen Sie Fertig.
2. Fügen Sie Geometrie aus dem CAD-Modell hinzu.
   1. Importieren Sie die Parasolid-Datei. Wählen Sie Kappenflächen aus, und wählen Sie im Grafikfenster den Umfang der Innenwand des Behälters an jedem offenen Ein- und Auslass aus. Dabei handelt es sich um die Begrenzungskanten der Abschlussflächen. Wählen Sie "Vereinigung bilden " und "Alle erstellen" aus.
   2. Wählen Sie Details entfernen aus, und stellen Sie sicher, dass alle Optionen unter Zu entfernende Details ausgewählt sind, und wählen Sie dann Alle erstellen aus, um unnötige Geometrie zu entfernen.
3. Erstellen von Netz 1 (vermaschte Behälterwand + vermaschte Fluiddomäne).
   1. Größe auf vordefiniert setzen: extra fein, für Fluiddynamik kalibrieren.
   2. Setzen Sie Größe 1 auf vordefiniert: extra fein, kalibrieren für Fluiddynamik, für geometrische Elementauswahl, geben Sie Begrenzung und Manuell an. Wählen Sie im Grafikfenster alle sichtbaren Außenflächen der Behälterwanddomäne aus, einschließlich der ringförmigen Fläche um die Kappenfläche. Wählen Sie keine Kappenflächen an den Ein- und Ausgängen.
      HINWEIS: Wählen Sie die Deckungsfläche am Ende des entfernten Abschnitts rechts und links von Pneumonektomiemodellen, da diese nach einer Pneumonektomie als geometrische Grenzen betrachtet werden.
   3. Wählen Sie unter Eckenverfeinerung die Option Domäne und Manuell aus. Wählen Sie im Grafikfenster [Domäne] 1 (Behälterwand) und [Domäne] 2 (Flüssigkeit) aus.
   4. Stellen Sie unter Begrenzungsauswahl sicher, dass die Begrenzungen mit denen übereinstimmen, die in der "Auswahl geometrischer Elemente" unter "Größe 1" angegeben sind.
   5. Wählen Sie unter Freies Tetraeder 1 die Option Verbleibend für Geometrische Elementebene unter Domänenauswahl aus.
   6. Geben Sie unter Grenzschichten 1 und Auswahl geometrischer Elemente die Option Domäne an, und wählen Sie im Grafikfenster [Domäne] 1 und [Domäne] 2 die Option Manuell aus. Für Grenzschichteigenschaften gilt die gleiche Auswahl, die in Größe 1 angegeben ist.
   7. Erstellen Sie das Netz, indem Sie unter Netz 1 die Option Alle erstellen auswählen.
4. Erstellen von Netz 2 (nur vernetzte Fluiddomäne).
   1. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf Netz 1, wählen Sie Importieren aus, um "Netz 2" zu erstellen, und löschen Sie Import 2.
   2. Wählen Sie unter Import 1 die Option Vernetzungssequenz aus, um automatisch Netz 1 auszuwählen. Stellen Sie sicher , dass Quellgitter automatisch erstellen, Domänenelemente importieren und Nicht vernetzte Domänen importieren aktiviert sind, und wählen Sie dann Importieren aus. Alle Einstellungen, die in Netz 1 definiert sind, werden in Netz 2 übernommen.
   3. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf Netz 2, und wählen Sie Entitäten löschen aus. Wählen Sie für Elemente 1 löschen unter Auswahl geometrischer Elemente die Option Domäne aus, wählen Sie Manuell, wählen Sie im Grafikfenster [Domäne] 1 (Behälterwand) aus, und wählen Sie dann Alle erstellen aus, um nur die Fluidgeometrie zu belassen, da sich die Oberfläche des Fluidbereichsnetzes an der Schnittstelle zwischen der Fluidströmung und der Innenwand der Behälter befindet.
5. Fließmaterial hinzufügen: Erstellen Sie ein neues Material mit Eigenschaften von Blut aus der Literatur. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf Materialien , und wählen Sie Leeres Material aus. Wählen Sie Domäne in der Auswahl auf geometrischer Elementebene aus, und wählen Sie Alle Domänen aus. Wählen Sie Nichtfest als Materialtyp aus, und fügen Sie die Materialeigenschaften des Blutes hinzu, einschließlich Viskosität und Dichte.
6. Richten Sie die Randbedingungen und Parameter für die Laminar-Flow-Studie ein.
   1. Wählen Sie Laminar Flow (spf) aus, und wählen Sie unter Domänenauswahl die Option Alle Domänen aus. Es wird nur [Domain] 1 aufgeführt. Domäne 1 ist in diesem Fall die Fluidgeometrie, nicht die Behälterwand. Fluideigenschaften 1 wird automatisch aus dem in Schritt 5 definierten Material gefüllt.
   2. Legen Sie die Anfangswerte 1 Druck auf den physiologischen Blutdruck fest. Legen Sie die Randbedingung für Wand 1 auf Rutschfest fest.
   3. Wählen Sie im Grafikfenster Einlass 1 aus, und legen Sie die Randbedingung auf Vollständig entwickelte Strömung fest. Stellen Sie sicher, dass Bedingung auf jede getrennte Auswahl separat anwenden aktiviert ist.
   4. Wählen Sie unter Vollständig entwickelter Durchfluss die Option Durchflussrate aus, und geben Sie die Geschwindigkeit ein.
   5. Wählen Sie für Ausgang 1 im Grafikfenster alle Ausgänge aus, und stellen Sie sicher, dass die Randbedingung auf Druck eingestellt ist.
   6. Wählen Sie unter Druckbedingungen die Option Gesamt aus, und geben Sie den Druck ein. Wählen Sie Durchschnitt und Rückfluss unterdrücken.
7. Richten Sie die Studie ein und führen Sie sie aus.
   1. Stellen Sie für Schritt 1: Stationär unter Studie sicher, dass der Abschnitt Physik und Variablen mit der beabsichtigten Studie übereinstimmt und Netzauswahlkomponente 1 auf Netz 2 festgelegt ist. Wählen Sie Compute aus.
8. Analysieren Sie die Ergebnisse der Schubspannung.
   1. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf Druck (Lichtschutzfaktor) und wählen Sie Duplizieren aus. Umbenennen in Schubspannung.
   2. Wählen Sie unter Schubspannung die Option Fläche aus, und ändern Sie das Dataset in Studie 1/Lösung 1 (sol1).
   3. Geben Sie unter Ausdruck den Text spf.sr*spf.mu set units to Pa ein.
      HINWEIS: Dies steht für "single-phase flow shear rate * single-phase flow viscosity".
   4. Wählen Sie anschließend Plotten und klicken Sie mit der rechten Maustaste auf Transparenz 1 und wählen Sie Deaktivieren.
   5. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf Schubspannung und wählen Sie Volumen , um den Datensatz in Studie 1/Lösung 1 (sol1) zu ändern.
   6. Geben Sie unter Ausdruck spf.sr*spf.mu ein, und legen Sie die Einheiten auf Pa fest.
   7. Wählen Sie Plotten, klicken Sie mit der rechten Maustaste auf Oberfläche und wählen Sie Deaktivieren , um "Volume 1" visuell zu analysieren und die für das OOC-Modell interessanten Schiffsbereiche zu bestimmen.

3. Vorbereitung der PDMS-Formen

1. Wählen Sie anhand der Ergebnisse der Fluidsimulation Geometrien für die Kontrolle und Pneumonektomie aus, indem Sie Bereiche auswählen, die signifikante Unterschiede in der Scherspannung zwischen Kontroll- und Pneumonektomiemodellen aufweisen, und replizieren Sie sie als negative Formen in CAD. Die Abmessungen von CAD-Modellen des Kontroll- und Pneumonektomiegefäßsystems sind in den Abbildungen 3 und 4 dargestellt.
2. Darüber hinaus können Sie Stopfen für den Einlass und Auslass der Form entwerfen, um ein Auslaufen während der Zellaussaat zu verhindern.
3. Drucken Sie mit einem 3D-Drucker die Formen und die Stecker mit PLA-Filament.
4. Besorgen Sie sich die Polymilchsäure (PLA)-Formen, die in 3D gedruckt wurden (Kontrolle + Pneumonektomie) (Abbildung 5A).
5. Wiegen Sie 10 Teile Silikonelastomerbasis und 1 Teil Silikonelastomer-Härter, um insgesamt 30 ml Mischung (Masse/Massenverhältnis 10:1) herzustellen, um die Formen auf eine Dicke von 3 mm zu füllen (Abbildung 5B).
   HINWEIS: Mischen Sie während des Wägevorgangs keine Stammlösungen. Verwenden Sie für jedes Reagenz separate Wägematerialien.
6. Elastomerbasis und Härter zusammengießen und gründlich vermischen
   HINWEIS: Dies kann in einem Wiegeboot erfolgen.
7. Gießen Sie die gut gemischte Lösung in die Formen (ca. 15 mL für die Formhälfte) (Abbildung 5C).
8. Entgasen Sie das PDMS, indem Sie es für 30 - 60 Minuten in eine Vakuumkammer legen oder bis keine Blasen mehr übrig sind (Abbildung 5D).
9. PDMS aus der Vakuumkammer nehmen und 48 h bei Raumtemperatur aushärten.
   HINWEIS: Aufgrund der thermischen Kapazität der PLA-Formen wurde kein Ofen zum Aushärten verwendet.
10. Extrahieren Sie das PDMS aus der PLA-Form.
11. Spülen Sie die PLA-Form großzügig mit DI-Wasser aus, um sicherzustellen, dass keine Verunreinigungen auf der Oberfläche verbleiben, damit sie wieder verwendet werden kann.

Abbildung 3: 3D-CAD-Zeichnung des Kontrollgefäßsystems. Abmessungen des Kontrollgefäßmodells in mm in einer Draufsicht und einer Seitenansicht. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4: 3D-CAD-Zeichnung des Pneumonektomie-Gefäßsystems. Abmessungen des Pneumonektomie-Gefäßmodells in mm in der Draufsicht und in der Seitenansicht. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 5: Erstellen von PDMS-Formen. Erstellen von PDMS-Formen. (A) 3D-gedruckte PLA-Formen für Kontroll- (orange) und Pneumonektomie-Experimente (grün). (B) Waage mit PDMS zur Herstellung von Materialien. (C) Gießen der PDMS-Mischung (10:1 Basis + Härter) in die 3D-gedruckten Formen. (D) Entgasung des PDMS in einer Vakuumkammer. Erstellt mit BioRender.com Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

4. Zellkultur und Aussaat

1. Verwenden Sie die richtige aseptische Technik gemäß den lokalen Laborprotokollen.
2. Sprühen Sie mit 70 % Ethanol und bringen Sie alle notwendigen Materialien und Komponenten in die Biosicherheitswerkbank (BSC) (Abbildung 6A), einschließlich PDMS-Stücke und vier Stücke doppelseitiges Klebeband.
3. Legen Sie zwei Stücke des doppelseitigen Klebebandes in jede Zellkulturplatte (Abbildung 6B).
4. Legen Sie jede PDMS-Gefäßhälfte in einer eigenen Zellkulturschale auf das doppelseitige Klebeband (Abbildung 6C).
5. Sterilisieren Sie alle Komponenten weiter, indem Sie 20 Minuten lang im BSC UV-Licht ausgesetzt werden.
6. Tauen Sie Trypsin, HLMVEC-Nährmedien und 20 μg/ml Fibronektin bei 37 °C auf, falls erforderlich.
7. Platzieren Sie mehrere 30 μl Tropfen mit 20 μg/ml Fibronektin mit einer Mikropipette entlang des PDMS-Gefäßsystems. Kippen Sie das PDMS Falls erforderlich, und verwenden Sie eine Pipettenspitze, um das PDMS gleichmäßig zu beschichten (Abbildung 7A).
8. Inkubieren Sie die PDMS-Teile 30 Minuten lang, während Sie sich im BSC befinden.
9. Nach der Inkubation aspirieren Sie die Fibronektinlösung und lassen Sie die PDMS-Stücke in der BSC trocknen (Abbildung 7B).
10. Bringen Sie einen konfluenten Kolben mit HLMVEC-Zellen aus dem Inkubator (37 °C, 5 % CO₂) in die BSC.
11. HLMVEC-Nährmedien werden aus dem Kulturkolben aspiriert. Kurz mit Trypsin oder sterilem PBS nachspülen.
12. Aspirieren Sie die Wäsche und geben Sie 3 ml Trypsin in den Kolben. Bei 37 °C, 5 % CO₂ 5 min inkubieren. Beobachten Sie die Zellen mit einem Mikroskop, um zu bestätigen, dass alle Zellen vom Kolben gelöst sind.
13. Fügen Sie 9 ml HLMVEC vollständiges Kulturmedium hinzu, um die Trypsinwirkung zu stoppen.
14. Die Zellsuspension wird in ein konisches 50-ml-Röhrchen überführt, dann wird der Kolben mit 10 ml HLMVEC-Kulturmedium gespült, um alle verbleibenden Zellen zu sammeln.
15. In das 50-ml-Röhrchen umfüllen. Zellen bei 220 x g für 5 min zentrifugieren.
16. Wenn Sie fertig sind, bestätigen Sie visuell das Zellpellet am Boden des Rohrs. Besprühen Sie die Tube mit 70% Ethanol und bringen Sie sie in die Biosicherheitswerkbank. Saugen Sie den Überstand an und lassen Sie das Pellet zurück.
17. Resuspendieren Sie die Zellen vorsichtig in 1 ml frischem HLMVEC-Kulturmedium und zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer. Berechnen Sie die Gesamtzahl der Zellen anhand der folgenden Gleichungen, wobei A-H die Anzahl der Zellen ist, die pro Hämozytometerquadrat gezählt werden. Halten Sie die Zellen auf Eis.
    
18. Bringen Sie die Konzentration der Zellen auf 2 x 10⁶ Zellen/ml mit HLMVEC-Kulturmedium.
19. Platzieren Sie die 3D-gedruckten Stopfen an den Enden jeder Gefäßhälfte, um Leckagen der Zellsuspension aus der PDMS-Form zu vermeiden, wie in Abbildung 5 gezeigt (insgesamt 4 Stopfen, 2 pro PDMS-Stück) (Abbildung 7C).
20. 300 μl HLMVEC-Zellsuspension (600 k Zellen) mit einer Mikropipette in jedes PDMS-Stück aussäen (Abbildung 7D).
21. Übertragen Sie die PDMS-Stücke mit HLMVEC-Zellen vorsichtig für 1-2 Stunden in den Inkubator (37 °C, 5 % CO₂), um sie zu befestigen (Abbildung 7E).
22. Prüfen Sie mit einem Mikroskop, um die erfolgreiche HLMVEC-Befestigung an den PDMS-Substraten visuell zu bestätigen.
23. Geben Sie die PDMS-Gefäßhälften an die BSC zurück.
24. Entfernen Sie die vier Stopfen, fügen Sie genügend HLMVEC-Kulturmedium hinzu, um die PDMS-Gefäßhälften einzutauchen, und stellen Sie die Kulturplatten mit den PDMS-Gefäßen wieder in den Inkubator ein (Abbildung 7F).
25. 6-10 Stunden nach der Aussaat pipettieren Sie das HLMVEC-Kulturmedium, das das PDMS umgibt, manuell in das Gefäßsystem, um das Medium aufzufrischen, das den Zellen am nächsten ist.

Abbildung 6: Anbringen von PDMS-Formen an Platten. Grundlegende Schritte zum Anbringen des PDMS-Gefäßsystems an Zellkulturplatten. (A) Materialien, die für das Platzieren von PDMS-Gefäßhälften in Kulturplatten erforderlich sind. (B) In jede sterile Kulturplatte werden zwei Stücke doppelseitiges Klebeband diagonal gelegt. (C) PDMS-Gefäßhälften, die auf dem doppelseitigen Klebstoff montiert sind. Erstellt mit BioRender.com Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 7: Säen von HLMVECs in PDMS-Formen. Schritte zum Seeding von HLMVECs in PDMS-Gefäßen. (A) Füllen Sie das Gefäßsystem 150-300 μl mit 20 μg/ml Fibronektin. (B) Überschüssiges Fibronektin mit der Kippklopftechnik aspirieren. (C) Verstopfen Sie die Enden der PDMS-Gefäßhälfte mit 3D-gedruckten Steckern. (D) 500-600 K Zellen in 300 μl Medium in jede Gefäßhälfte einpflanzen. (E) Legen Sie die PDMS-Hälften für 1-2 Stunden in den Inkubator, um die Zelladhäsion zu erleichtern. (F) Decken Sie die PDMS-Hälften mit Medien ab und entfernen Sie die Stecker. Erstellt mit BioRender.com Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

5. Montage und Betrieb des Flow-Systems

1. Führen Sie den Flow-Vorgang durch, sobald die Zellen in den PDMS-Gefäßhälften vollständig zusammenfließen, wie durch visuelle Inspektion unter einem Mikroskop festgestellt.
2. Kalibrieren Sie die Schlauchpumpe gemäß dem Protokoll des Herstellers, bevor Sie ein Experiment durchführen.
3. Autoklavieren Sie alle autoklavierbaren Komponenten, einschließlich des Durchflussschlauchs, der Schlauchanschlüsse, des Spritzenbehälters und des Gummistopfens.
4. Tauchen Sie die Acrylblöcke, Schrauben, Dübel, 1 Zoll langen Masterflex L/S 16-Schlauchstücke und den 15-mm-Deckel der Petrischale 15 Minuten lang in 70 % Ethanol und 20 Minuten lang in einer BSC in eine UV-Behandlung und wenden Sie sie nach der Hälfte der Zeit.
5. Sobald alle anderen Geräte und Materialien sterilisiert sind, bringen Sie die PDMS-Gefäßhälften in das BSC.
6. Aspirieren Sie das HLMVEC-Medium aus der Petrischale, die die Gefäßhälften enthält (Abbildung 8A,B).
7. Platzieren Sie die PDMS-Hälften in den beiden Polycarbonatblöcken und stellen Sie sicher, dass sie ausgerichtet sind (Abbildung 8C).
8. Tragen Sie Silikondichtmittel auf die Enden des Gefäßsystems auf, wo der Schlauch an den PDMS-Hälften befestigt wird, und platzieren Sie den zentimeterlangen Schlauch an den beiden Enden des unteren Gefäßsystems (Abbildung 8D).
9. Drehen Sie den oberen Acrylblock (der die obere Hälfte des PDMS-Gefäßsystems enthält) auf den unteren Acrylblock (mit der unteren Hälfte des PDMS-Gefäßsystems) (Abbildung 8E).
10. Verschrauben Sie die Acrylblöcke mit dem Gewindeblock an der Unterseite und verstopfen Sie die freien Enden der zentimeterlangen Schläuche mit den 3D-gedruckten Stopfen (Abbildung 8F).
11. Entfernen Sie einen Stopfen und injizieren Sie vorsichtig 500 μl HLMVEC-Kulturmedium in das Gefäßsystem, kippen Sie es, um Luftblasen zu vermeiden, und setzen Sie dann den Stopfen wieder ein.
12. Legen Sie den gesamten zusammengebauten Chip in den Inkubator, damit das Silikon 1-2 h lang aushärten kann.
13. Bringen Sie den montierten Chip und alle anderen sterilen Materialien in die BSC und schließen Sie alles an, um das Flow-System gemäß Abbildung 9 einzurichten. Stellen Sie sicher, dass der Schlauch, der durch die Schlauchpumpe zum Gefäßeinlass verläuft, am Boden des Spritzenbehälters befestigt ist. Dadurch kann die Schwerkraft die Schläuche zuführen und Luftblasen im System reduziert werden.
14. Saugen Sie das Durchflusssystem vorsichtig mit HLMVEC-Medien an. Injizieren Sie mit einer serologischen 50-ml-Pipette 30 ml Medium in den oberen Teil des Spritzenreservoirs (Abbildung 10B). Lassen Sie die Schlauchpumpe mit einer niedrigen Durchflussrate laufen, um den Schlauch zu füllen. Füllen Sie das Medium weiter in den Behälter, bis das System vollständig entleert und alle Blasen entfernt sind.
    HINWEIS: Luftblasen können Zellen während des Strömungsexperiments scheren.
15. Befestigen Sie den Schlauch mit einer Armatur, die an einem Gummistopfen befestigt ist, der oben am Behälter angebracht ist, am Einlass des Behälters (vom Auslass der Gefäßform) (Abbildung 10C).
16. Nehmen Sie das Durchflusssystem von der Schlauchpumpe ab und setzen Sie es auf die Metallwanne. Transportieren Sie das gesamte Setup schonend von der BSC in den Inkubator (37 °C, 5 % CO₂). Führen Sie den Schlauch durch die Rückseite des Inkubators zur Schlauchpumpe.
17. Bringen Sie die Peristaltikpumpe wieder an und stellen Sie sie auf die gewünschte Flussrate ein, um die Blutflussrate durch das Gefäßmodell zu emulieren.
18. Starten Sie die Pumpe und stellen Sie sicher, dass keine Lecks vorhanden sind. Lassen Sie das System 24 h oder die gewünschte Dauer laufen. Regelmäßig auf Undichtigkeiten prüfen.

Abbildung 8: Aufbau des Flow-Chips. Konstruktion des Fließchips. (A) Aspirieren Sie Medien aus der Zellkulturplatte. (B) PDMS halbiert sich, nachdem das Medium aspiriert wurde. (C) Entfernen Sie die PDMS-Hälften von der Platte mit anderen Materialien, die zum Aufbau des Chips benötigt werden (Stopfen, Spritzenfilter, 1/2-Zoll-Schlauchstücke, Silikondichtmittel, 10-fach-Schrauben und Acrylblöcke). (D) Legen Sie die PDMS-Hälften in die Acrylblöcke und tragen Sie Silikondichtstoff auf die rot markierten Stellen auf. (E) Platzieren Sie den Schlauch in den entsprechenden Ausschnitten. (F) Verbinden Sie die Durchflusskammerhälften und bringen Sie den Stopfen und den Spritzenfilter an. Erstellt mit BioRender.com Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 9: Einrichtung des Durchflusssystems. Einrichtung des Durchflusssystems. Das komplette Durchflusssystem besteht aus Schläuchen, Schlauchanschlüssen, einer Schlauchpumpe, einem Spritzenbehälter, einem Stützständer und dem Durchflusschip. Erstellt mit BioRender.com Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 10: Ansaugen des Strömungssystems. Grundieren des Strömungssystems mit Medien. (A) Einfache Einrichtung des Durchflusssystems ohne Medien. (B) Der Gummistopfen wird aus dem Spritzenbehälter entfernt und das Medium wird kontinuierlich nachgefüllt, bis der Schlauch gefüllt ist und sich 20-30 ml überschüssiges Medium im Reservoir befinden. (C) Durchflusssystem, das mit HLMVEC-Medien grundiert ist. Erstellt mit BioRender.com Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

6. Fixieren und Färben

1. Waschen Sie jedes PDMS-Gefäßsystem zur Hälfte 5 Minuten lang in PBS. Fügen Sie so viel hinzu, dass der gesamte Gefäßabschnitt untergetaucht ist.
2. Saugen Sie das PBS aus dem Gefäßsystem an, indem Sie die Platte kippen und das PBS ablaufen lassen, und saugen Sie dann den Abfluss ab.
3. Geben Sie 600 μl 4 % Paraformaldehyd (PFA) in PBS in jede Gefäßhälfte und inkubieren Sie es 20 Minuten lang bei Raumtemperatur (RT).
4. Saugen Sie die PFA-Lösung nach der Methode in Schritt 2 in einen geeigneten Abfallbehälter ab.
5. Waschen Sie fixierte Zellen 3x in PBS für jeweils 5 Minuten mit dem Verfahren in Schritt 2.
   HINWEIS: Entsorgen Sie jede dieser Wäschen in einem geeigneten Abfallbehälter für Formaldehyd.
6. Verstopfen Sie die Enden der PDMS-Gefäßhälften mit den sauberen 3D-gedruckten Steckern.
7. Bereiten Sie 3 % Rinderserumalbumin (BSA) in PBS zur Blockierung vor.
8. Füllen Sie die Gefäßhälften mit 600 μl Blockierungslösung und inkubieren Sie 30 Minuten lang bei RT.
9. Entfernen Sie die Stopfen und saugen Sie die Blockierlösung an.
10. Bereiten Sie eine 1:200-Verdünnung von Weizenkeim-Agglutinin (WGA)-Lektin mit einem konjugierten Biotin (Primärantikörper) in 3%iger BSA-Lösung vor, um GCX⁹ zu färben.
11. Bringen Sie die Stopfen zurück, um die Enden des Gefäßsystems zu verschließen, und geben Sie 500 μl Primärantikörperlösung in jede Gefäßhälfte.
12. Inkubieren Sie die Proben 1 h lang bei Raumtemperatur.
13. Aspirieren Sie den primären Antikörper vorsichtig nach der zuvor verwendeten Technik.
14. 3 Mal mit PBS für jeweils 5 min waschen.
15. Bereiten Sie eine Verdünnung von WGA-Streptavidin-Konjugat (Sekundärantikörper) in 3:500 % iger BSA-Lösung vor.
16. Kehren Sie die Stopfen zurück, um die Enden des Gefäßsystems zu verstopfen, und fügen Sie 500 μl Sekundärantikörperlösung zu jeder Gefäßhälfte hinzu.
17. Wiederholen Sie die Schritte 6.12-6.14.
18. Geben Sie DAPI-Eindeckmedium auf die Gefäßoberfläche, indem Sie in Abständen 30 μl-Tropfen abgeben, um das Gefäßsystem vollständig zu füllen.
19. Legen Sie Glasdeckgläser auf das PDMS, um die Gefäßkanäle abzudecken.
20. Versiegeln Sie die Deckglaskanten mit transparentem Nagellack.
21. Platten mit Alufolie abdecken und bis zur Bildgebung bei 4 °C lagern.

7. Bildgebung

1. Schalten Sie das Mikroskop ein und öffnen Sie die Betrachtungsanwendung auf dem angeschlossenen Computer.
2. Öffnen Sie das Mikroskop und erhöhen Sie das Licht. Befestigen Sie die richtige Plattform für die Proben (vielseitiger Petrischale-Halter).
3. Legen Sie eine Probe auf den Schalenhalter im Mikroskop, wobei der Interessenbereich über dem Objektiv zentriert ist.
4. Verringern Sie das Licht und schließen Sie den Mikroskopdeckel.
5. Wählen Sie in der Mikroskopsoftware die Option Standbild aufnehmen .
6. Wählen Sie den Probentyp, verwenden Sie vielseitig.
7. Wählen Sie das entsprechende Objektiv im Objektivbereich aus, um die beste Visualisierung zu erzielen.
8. Passen Sie in der Mikroskopsoftware die Objektivposition so an, dass sie an einem Bereich of Interest (ROI) ausgerichtet ist.
9. Wählen Sie Autofokus aus, und die Zellen sollten ungefähr scharf gestellt werden.
10. Passen Sie den Fokus manuell an, um das Bild vollständig zu verdeutlichen.
11. Passen Sie die Helligkeit und Belichtung an, um die Zellen klarer zu visualisieren.
12. Aktivieren Sie Mehrfarbig und Farbe in der Software.
13. Aktivieren Sie in den CH-Einstellungen CH1 Floor DAPI und CH2 Floor GFP.
14. Passen Sie die Helligkeit jedes Kanals separat an, um die Bilder klar zu visualisieren.
15. Wählen Sie Z-Stack in der Mikroskopsoftware.
16. Stellen Sie den Fokus auf die höchste Bildebene ein und wählen Sie Festlegen, um die Obergrenze festzulegen
17. Stellen Sie den Fokus auf die unterste Bildebene ein und wählen Sie Festlegen, um die untere Grenze festzulegen
18. Wählen Sie die gewünschte Schichtdicke aus und drücken Sie Aufnahme starten , um das Bild aufzunehmen.
    HINWEIS: Diese Bilder werden auch zur weiteren Bearbeitung an eine Mikroskopanalysesoftware ausgegeben.

Ergebnisse

Die Ergebnisse der Transientar-Flow-Steady-State-Studie der Fluidsimulation zeigten einen Anstieg der Scherspannung in bestimmten Bifurkationen in den Pneumonektomiemodellen im Vergleich zum Kontrollmodell, das in Abbildung 11 dargestellt ist. Die in Schritt 2.8 des Protokolls visualisierten roten Bereiche kennzeichnen Bereiche mit hoher Schubspannung, während die blauen Bereiche Bereiche mit geringer Schubspannung anzeigen.

Diskussion

Die Gefäßmodellierung ist ein wichtiges neues Feld für die Erkundung. Die erfolgreiche Erstellung eines präzisen Gefäßmodells ist vielversprechend für die Weiterentwicklung des Tissue Engineering und der Arzneimittelentwicklung. In diesem Artikel wird eine neuartige Methode zur Generierung eines OOC-Gefäßsystems vorgestellt, das zur Emulation einer Pneumonektomie oder eines anderen Gefäßsystems oder einer anderen Gefäßgeometrie verwendet werden kann, um einen möglichen Zusammenhang zwisc...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
#8-32 x 3/4 Zoll Combo-Rundkopf-verzinkte Maschinenschraube (8er-Pack)	Everbilt	204274613	-
0,25% EDTA-Trypsin	ThermoFisher Scientific	25200056	-
15 ml konische sterile Zentrifugenröhrchen aus Polypropylen	Thermo Scientific	12-565-269	-
35x10mm Schale, Nunclon Delta	Thermo Scientific	153066	-
50 ml konische sterile Zentrifugenröhrchen aus Polypropylen	Thermo Scientific	12-565-271	-
Verschiedene Gummistopfen	Fisherbrand	14-132
BioLite Mit Zellkulturen behandelte Kolben (25cm^2)	Thermo Scientific	12-556-009	-
BioLite Mit Zellkulturen behandelte Kolben (75cm^2)	Thermo Scientific	12-556-010	-
COMSOL Multiphysik	COMSOL	N/A	-
Doppelseitiger Klebstoff	3M	16758005	-
Epredia Richard-Allan Scientific Deckglas	Thermo Scientific	22-050-218	-
Fötales Rinderserum	ThermoFisher Wissenschaftlich	A5256701	-
Fibronektin	ThermoFisher Wissenschaftlich	33016015	20 μ g/mL Verdünnung
Fisherbrand Isotemp Wasserbäder mit Digitalsteuerung: Modell 210	Fisherbrand	Artikel-Nr.: 15-462-10Q	-
Fisherbrand Sterile Spritze (60 ml)	Fisherbrand	14-955-461	-
Mikrovaskuläre Endothelzellen der menschlichen Lunge	Sigma Aldrich	540-05A	-
Keyence BZX810 Fluoreszenzmikroskop	Keyence	N/A	-
Krayden Dow Sylgard 184 Silikon-Elastometer-Kit. Klar, (1.1LB)	Dow	4019862	-
Marga Cipta gegossene Acrylplatte 1/2' dick, 48x96'	Marga Cipta	N/A	-
Masterflex L/S Easy-Load II Pumpenkopf	MasterFlex (Englisch)	77200-50
Masterflex L/S Präzisions-Pumpenschläuche, platingehärtetes Silikon, L/S 16; 25 Fuß	MasterFlex (Englisch)	96410-16	-
Masterflex L/S Standard-Schlauchpumpe	Masterflex	07522-20
Mikropipette 0,2 bis 2 μ; L	Fisherbrand	FBE00002	-
Mikropipette 10 bis 100 μ L	Fisherbrand	FBE00100	-
Mikropipette 100 bis 1000 μ; L	Fisherbrand	FBE01000	-
Mikropipette 5 bis 50 μ L	Fisherbrand	FBE00050	-
Mikrovaskuläres Endothelzell-Wachstumsmedium (500ml)	Sigma - Aldrich	111-500	-
Nalgene Sterile Spritzenvorsatzfilter	Thermo Scientific	725-2520	-
Nikon Eclipse TS-100 Leuchtstoffröhrenmikroskop	Nikon	NI-TS100
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (DPBS, 10X), Dulbecco-Formel	Thermo Scientific	Nr. J61917. K3	-
Prusament PLA Prusa Galaxy Schwarz 1kg	Prusa	PRM-PLA-GLX-1000	-
Rebel Hybrid-Mikroskop, aufrecht und invertiert, Discover Echo	ECHO	76376-746	-
Silikon-Dichtstoff	Loctite	908570	-
SolidWorks	Dassault Systèmes	N/A
Sterile serologische Einwegpipetten aus Polystyrol mit Lupenstreifen (10 ml)	Fisherbrand	13-678-11E	-
Sterile serologische Einwegpipetten aus Polystyrol mit Lupenstreifen (25 ml)	Fisherbrand	13-678-11	-
Sterile serologische Einwegpipetten aus Polystyrol mit Lupenstreifen (50 ml)	Fisherbrand	13-678-11F	-
Sterile serologische Einwegpipetten aus Polystyrol mit Lupenstreifen (5 ml)	Fisherbrand	13-678-11D	-
Streptavidin, Alexa Fluor 488 Konjugat	Invitrogen	Nr. S32354
Streptavidin, Alexa Fluor 488 Konjugat	Invitrogen	Nr. S32354	-
Spritzen-Resevoir	BD	300865
Thermo Scientific Alfa Aesar 1LT Albumin, Rind, Fraktion V, 35 % Soln., Reagenzqualität, fettsäurefrei, mit Azid als Konservierungsmittel	Thermo Scientific	N12H004	-
Schlauch-Verbinder	Fisherbrand	01-000-161	-
VECTASHIELD Antifade Eindeckmedium mit DAPI	Vectashield	H-1200-10	-
VWR Inkubator mit Wassermantel CO2	Avantar	10810-744	-
WGA Biotinylierter Antikörper	Vektor	Nr. B-1025	-