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Methodenartikel

Überwachung von Elektroporations-induzierten Veränderungen der Aktionspotentialbildung in gentechnisch veränderten Tet-On-Spiking-HEK-Zellen

1.1K Aufrufe

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DOI:

10.3791/67257

⸱

6. September 2024

 ,  , 
1Faculty of Electrical Engineering, University of Ljubljana

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Zur Untersuchung der Reaktionen erregbarer Zellen in vitro beschreibt das Protokoll die optische Überwachung von Änderungen der Aktionspotentialerzeugung aufgrund der Elektroporation an einem einfachen erregbaren Zellmodell von gentechnisch veränderten Tet-on-Spiking-HEK-Zellen sowie von Änderungen der Transmembranspannung mit automatisierter Extraktion relevanter Parameter.

Zusammenfassung

Erregbare Zellen wie Neuronal- und Muskelzellen können primäre Ziele in schnell aufkommenden Elektroporations-basierten Behandlungen sein. Sie können jedoch auch bei Therapien, bei denen sie nicht die primären Ziele sind, von elektrischen Impulsen beeinflusst werden, was zu unerwünschten Nebenwirkungen führen kann. Um die auf Elektroporation basierende Behandlung von erregbaren und nicht erregbaren Geweben zu optimieren, ist es daher notwendig, die Auswirkungen von elektrischen Impulsen auf erregbare Zellen, ihre Ionenkanäle und die Erregbarkeit in vitro zu untersuchen. Zu diesem Zweck wurde ein Protokoll zur optischen Überwachung von Veränderungen der Aktionspotentialerzeugung durch Elektroporation an einem einfachen erregbaren Zellmodell von gentechnisch veränderten Tet-on-Spiking-HEK-Zellen entwickelt. Mit Hilfe eines potentiometrischen Fluoreszenzfarbstoffs wurden die Änderungen der Transmembranspannung unter einem Fluoreszenzmikroskop überwacht und relevante Parameter der Zellantworten mit einer MATLAB-Anwendung automatisch extrahiert. Auf diese Weise konnten die erregbaren Zellantworten auf verschiedene elektrische Pulse und das Zusammenspiel zwischen Anregung und Elektroporation effizient ausgewertet werden.

Einleitung

Bei der Elektroporation bewirken elektrische Hochspannungsimpulse eine Erhöhung der Plasmamembranpermeabilität für Moleküle, die sonst schlecht permeiert sind1. Elektroporationsbasierte Techniken sind heute in Anwendungen in der Medizin2, Biotechnologie3 und Lebensmitteltechnologie4 weit verbreitet.

Erregbare Zellen wie neuronale Zellen und Muskelzellen gehören zu den primären Zielen bei schnell aufkommenden Elektroporations-basierten Behandlungen des Herzens, des Gehirns und der Skelettmuskulatur5. Darüber hinaus können sie auch bei Therapien, bei denen sie nicht die primären Ziele sind, von elektrischen Impulsen beeinflusst werden, was zu unerwünschten Nebenwirkungen wie Schmerzen, Muskelzuckungen und Nervenschäden führenkann 6. Elektrische Pulse können nämlich eine elektrische Stimulation von erregbaren Zellen bewirken: Sie aktivieren spannungsgesteuerte Ionenkanäle und lösen Aktionspotentiale (AP) aus. Bei höheren elektrischen Feldern wird jedoch die Plasmamembran der Zellen permeabilisiert, und es entsteht zusätzlicher Ionenstrom durch Poren/Defekte7. Dieser zusätzliche Ionenstrom beeinflusst die Erregbarkeit der Zellen in einem komplexen Zusammenspiel zwischen Anregung und Elektroporation. Um die auf Elektroporation basierende Behandlung von erregbaren und nicht erregbaren Geweben zu optimieren, ist es daher notwendig, die Auswirkungen von elektrischen Impulsen auf erregbare Zellen, ihre Ionenkanäle und die Erregbarkeit in vitro zu untersuchen.

In einer kürzlich durchgeführten Studie8 untersuchten wir gentechnisch veränderte humane embryonale Nierenzellen (HEK), die von Cohen et al.9,10 entwickelt wurden, als wertvolles Werkzeug zur Untersuchung der Elektroporation in erregbaren Zellen. In diesen ansonsten nicht erregbaren Zellen wird ein minimales Komplement an Natrium- und Kaliumkanälen (NaV1,5 und Kir2,1) exprimiert, das für die Erregbarkeit benötigt wird. Die Expression von Kir2.1 in diesen Zellen wird durch ein Doxycyclin-induziertes Tet-on-System gesteuert, das die Etablierung von zwei Zellvarianten ermöglicht: erregbare spikende S-HEK (mit NaV1,5 und Kir2.1) und nicht erregbare nicht-spikende NS-HEK-Zellen (die nur NaV1,5-Kanäle enthalten). Dies ermöglicht es uns, die Auswirkungen von elektrischen Impulsen auf erregbare und nicht erregbare Varianten desselben Zelltyps zu vergleichen. Im Vergleich zu isolierten primären erregbaren Zellen, erregbaren Zellen, die aus embryonalen oder induzierten pluripotenten Stammzellen differenziert wurden, und Zelllinien, die aus erregbaren Geweben gewonnen wurden, haben S-HEK-Zellen mehrere Vorteile: Sie sind einfach zu handhaben, kultivieren und zu vermehren, haben gut definierte Natrium- und Kaliumkanäle und erzeugen robuste APs8.

Wir haben ein Protokoll zur Überwachung von Änderungen der Transmembranspannung (TMV) entwickelt, die durch elektrische Impulse unterschiedlicher Amplituden unter Verwendung eines potentiometrischen Fluoreszenzfarbstoffs ausgelöst werden. Auf diese Weise können wir untersuchen, wie sich die Elektroporation auf die AP-Bildung in S-HEK-Zellen und andere Veränderungen des TMV sowohl in S-HEK- als auch in NS-HEK-Zellen auswirkt. Kurz gesagt, die S-HEK- oder NS-HEK-Zellen werden alle 2 Minuten einem einzelnen elektrischen Impuls von 100 μs ausgesetzt, und relative Änderungen der Fluoreszenz werden für etwa 3 s um jede Pulsanwendung aufgezeichnet. Die angelegten Pulse haben eine zunehmende Spannung, die zunächst APs in Zellen und bei einem höheren elektrischen Feld eine Elektroporation auslöst. Das 2-Minuten-Intervall zwischen der Pulsapplikation wurde gewählt, um die möglichen kumulativen Effekte aufeinanderfolgender Pulse zu minimieren und gleichzeitig die Experimente kurz genug zu halten, um die Zellen nicht zu verschlechtern. Die Bildverarbeitung wurde mit einer speziellen MATLAB-Anwendung automatisiert, um relevante Parameter der Fluoreszenzreaktionen des potentiometrischen Farbstoffs zu extrahieren und so die Veränderungen des TMV (APs und anhaltende Depolarisation aufgrund von Elektroporation) in S-HEK- und NS-HEK-Zellen zu bewerten.

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Protokoll

1. Vorbereitung der Reagenzien und Zellkultur

  1. Bereiten Sie das Zellkulturmedium vor, indem Sie Dulbecco's Modified Eagle's Medium-high Glucose mit 10 % fötalem Rinderserum, 2 mM Glutamin, Penicillin-Streptomycin (Penicillin 100 U/ml, Streptomycin 100 μg/ml), 2 μg/ml Puromycin, 5 μg/ml Blasticidin und 200 μg/ml Geneticin ergänzen.
  2. Bereiten Sie phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) mit 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4 und 1,8 mM KH2PO4, pH 7,4 vor. Filtern Sie es durch einen sterilisierenden Membranfilter mit einer Porengröße von 0,22 μm.
  3. Bereiten Sie die Tyrodenlösung mit 2 mM KCl, 125 mM NaCl, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 10 mM HEPES, 30 mM Glukose, pH 7,3 vor. Bereiten Sie eine kaliumarme Tyrodenlösung mit 0,5 mM KCl, 126,5 mM NaCl, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 10 mM HEPES, 30 mM Glukose, pH 7,3 vor. Filtrieren Sie beide Lösungen durch einen sterilisierenden Membranfilter mit einer Porengröße von 0,22 μm.
  4. Bereiten Sie 1 mg/ml Poly-L-Lysin-Stammlösung vor, indem Sie 5 ml PBS in eine Durchstechflasche mit 5 mg Poly-L-Lysin geben.
  5. Bereiten Sie 2 mg/ml Doxycyclin-Stammlösung in destilliertem Wasser vor und filtrieren Sie sie durch einen sterilisierenden Membranfilter mit einer Porengröße von 0,22 μm.
  6. Bereiten Sie 4 mM potentiometrischen Farbstoff ElectroFluor630 Stammlösung in reinem Ethanol vor (geben Sie 25 μl reines Ethanol in das Röhrchen mit 100 nM - 73 μg des Farbstoffs).
  7. Kultivieren Sie gentechnisch veränderte HEK-Zellen in einem T25-Kolben in 6 ml des Zellkulturmediums, wie zuvor beschrieben8. Die Inhaltsstoffe des Nährmediums sind lichtempfindlich; Halten Sie das Medium daher vor Licht geschützt (wickeln Sie den Mittelkolben in Alufolie ein) und führen Sie die Passage bei schlechten Lichtverhältnissen durch.
  8. Passieren Sie die Zellen alle 3-4 Tage, indem Sie 3 x 10,5 oder 5 x 105 Zellen in einen frischen T25-Kolben aussäen. Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer. Die Zellen werden in einem Hauptkolben als nicht erregbare NS-HEK-Zellen ohne Doxycyclin-Zugabe aufbewahrt, da sie eine anhaltende Kir2.1-Expression nicht tolerieren. Verwenden Sie in den Experimenten Zellen aus Passagen unter 14.

2. Vorbereitung der Probe

  1. Poly-L-Lysin-Beschichtung von Deckglas-Objektträgern
    1. Pipettieren Sie 1 ml PBS in eine Vertiefung der 2-Well-Objektträger mit Deckglas, fügen Sie 10 μl sterile 1 mg/ml-Poly-L-Lysin-Lösung hinzu und mischen Sie sie gut mit einer Pipette.
    2. 1,5 h bei Raumtemperatur unter sterilen Bedingungen in einer Laminar-Flow-Haube inkubieren. Entfernen Sie das PBS mit Poly-L-Lysin ohne weiteres Waschen.
  2. Aussaat der Zellen
    1. Bereiten Sie eine 1:10-Verdünnung der Doxycyclin-Stammlösung in einem Kulturmedium in einem 1,5-ml-Röhrchen vor. Für jede Vertiefung sind 30 μl 1:10 Doxycyclin-Verdünnung erforderlich (3 μl Doxycyclin-Stammlösung und 27 μl Kulturmedium), das endgültige Volumen wird in Abhängigkeit von der Gesamtzahl der experimentellen Vertiefungen vorbereitet.
    2. Nehmen Sie das Kulturmedium aus dem T25-Kolben und trypsinisieren Sie die Zellen mit 2,5 ml Trypsin-EDTA-Lösung in einem CO2 -Inkubator bei 37 °C für 2 min.
    3. Fügen Sie 2,5 ml frisches Nährmedium hinzu und lösen Sie die Zellen durch vorsichtiges Pipettieren von der Oberfläche. Mischen Sie die Zellsuspension gut.
    4. Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer und bestimmen Sie die Dichte der Zellen in Suspension.
    5. Berechnen Sie das Volumen der trypsinisierten Zellsuspension, das für die Etablierung der Kultur benötigt wird. Bei einer 2-Tage-Kultur werden 2,5 x 105 Zellen und bei einer 3-Tage-Kultur 1 x 105 Zellen pro Vertiefung gesät. Passen Sie bei Bedarf die genaue Anzahl der Zellen an.
    6. Berechnen Sie das Volumen des Kulturmediums, indem Sie das zuvor berechnete Zellsuspensionsvolumen von 1470 μl subtrahieren. Die restlichen 30 μl stellen das Volumen einer 1:10-Doxycyclin-Verdünnung dar. Das Gesamtvolumen in jeder Vertiefung beträgt 1500 μl (Zellen, Doxycyclin und Kulturmedium).
    7. Zur Vorbereitung von Proben mit erregbaren S-HEK-Zellen pipettieren Sie das berechnete Volumen des Kulturmediums und der trypsinisierten Zellsuspension in eine Vertiefung und fügen Sie 30 μl 1:10 Doxycyclin-Verdünnung hinzu. Verwenden Sie nur eine Vertiefung der Kammern mit zwei Vertiefungen, da das Experiment viel Zeit in Anspruch nimmt (ca. 40 Minuten). Mischen Sie gut durch vorsichtiges Pipettieren, bevor Sie die Kammern in den CO2 -Inkubator einsetzen.
    8. Für die Vorbereitung von Proben mit nicht erregbaren NS-HEK-Zellen pipettieren Sie das berechnete Volumen des Kulturmediums in eine Vertiefung und fügen Sie 90 % des berechneten Volumens der Zellsuspension für S-HEK-Zellen ohne Doxycyclin hinzu. NS-HEK-Zellen wachsen etwas schneller als S-HEK-Zellen.
    9. Inkubieren Sie die Kammern in einem 5%igen CO2 - Inkubator bei 37 °C für 2-3 Tage vor dem Experiment. Bei Proben mit Doxycyclin ist diese Inkubationszeit ausreichend, um die Zellen erregbar zu machen.
  3. Beschriftung der Zellen
    1. Vor dem Experiment pipettieren Sie 3 μl potentiometrische Farbstoff-Stammlösung in ein 1,5-ml-Röhrchen und lassen Sie das offene Röhrchen bei Raumtemperatur in einer Laminar-Flow-Haube, damit das Ethanol verdampfen und der potentiometrische Farbstoff trocknen kann (ca. 15 Minuten). Geben Sie 997 μl kaltes Kulturmedium (aus dem Kühlschrank bei 4 °C) in das Röhrchen und lösen Sie den Farbstoff auf eine Endkonzentration von 12 μM auf.
    2. Nehmen Sie das Kulturmedium aus der Vertiefung und geben Sie 1 ml potentiometrische Farbstofflösung in die Zellen. Bei 4 °C in den Kühlschrank stellen und 20 Min. inkubieren.
    3. Entfernen Sie die potentiometrische Färbelösung und bewahren Sie sie zur weiteren Wiederverwendung in der Tube auf (für bis zu sechs aufeinanderfolgende Experimente an 1 Tag).
    4. Waschen Sie die Zellen vorsichtig 3x mit Tyrode-Lösung und pipettieren Sie nach dem letzten Waschen 1 ml kaliumarme Tyrode-Lösung in die Vertiefung.

3. Elektrostimulation und Elektroporation

  1. Konfigurieren Sie die Synchronisation der Impulsabgabe mit der Bildaufnahme unter Verwendung eines TTL-Signals vom Mikroskopsystem, das den Impulsgenerator auslöst. Verwenden Sie zur Erzeugung von Hochspannungsimpulsen einen benutzerdefinierten Impulsgenerator11 oder einen beliebigen Impulsgenerator, der extern mit einem TTL-Signal ausgelöst werden kann.
    HINWEIS: In der vorgestellten experimentellen Konfiguration wird die LAS X-Software für die Bildaufnahme verwendet, die so konfiguriert werden kann, dass während einer Zeitrafferaufnahme ein TTL-Signal zu einem vorgewählten Zeitpunkt gesendet wird.
  2. Platzieren Sie zwei parallele Pt/Ir-Drahtelektroden mit einem Durchmesser von 0,8 mm und einem Abstand von 5 mm zwischen den Innenkanten am Boden der Kammer und fixieren Sie die Kammer unter dem Mikroskop.
  3. Schließen Sie die Elektroden an den Impulsgeber an. Verbinden Sie den Ausgang des Impulsgenerators mit einem Oszilloskop über eine Spannungs- und eine Stromsonde, um zu überprüfen, ob die Impulse während des Experiments korrekt abgegeben wurden.
  4. Fokussieren Sie die Zellen im Hellfeld. Stellen Sie sich die Zellen vor, die sich etwa in der Mitte zwischen den Elektroden befinden.
  5. Starten Sie die erste Aufnahme von Fluoreszenzbildern im Zeitraffermodus mit einem 40-fach-Objektiv, wobei das Fluoreszenzsignal im gesamten Sichtfeld aufgezeichnet wird. Die Kamera sollte schnell genug sein, um einen klaren Zeitverlauf eines Aktionspotentials zu erfassen (idealerweise höher als 25 Bilder/s).
    1. Nehmen Sie 80 Bilder im Zeitraffermodus mit mindestens 25 Bildern/s auf, um den Verlauf des Aktionspotenzials in Echtzeit aufzulösen. Die Gesamtdauer der Bildaufnahme beträgt ca. 3 s. Beleuchten Sie die Zellen während der Bildaufnahme mit einer Anregungswellenlänge von 635 nm, einer Belichtungszeit von 10 ms und detektieren Sie die Emission bei etwa 700 nm. Wenden Sie bei dieser ersten Akquisition keinen Impuls an - diese Akquisition wird verwendet, um die nachfolgenden Akquisitionen für das Färbe-Photobleaching zu korrigieren. Warten Sie nach dieser Akquisition 2 Minuten.
      HINWEIS: Dieses Experiment verwendet eine Periode von 27,8 Bildern/s, d.h. eine Periode von 36 ms, was der Zeit vom Beginn der ersten Bildaufnahme bis zum Beginn der nächsten Bildaufnahme in der Zeitrafferaufnahme entspricht.
  6. Nehmen Sie alle 2 Minuten einen Zeitraffer auf, auf die gleiche Weise wie in Schritt 3.5. Für diese Aufnahmen wird zum Zeitpunkt der Aufnahme des 10. Bildes (bei 324 ms) ein einzelner Impuls von 100 μs angewendet. Nehmen Sie Bilder mit den folgenden Impulsspannungen auf: 63 V, 75 V, 88 V, 100 V, 125 V, 150 V, 175 V und 200 V. Schätzen Sie das elektrische Feld, dem die Zellen ausgesetzt sind, als angewendetes Spannungs-Elektroden-Abstandsverhältnis (E = 126, 150, 176, 200, 250, 300, 350 und 400 V/cm).
    HINWEIS: Bei niedrigeren elektrischen Feldern lösen die Impulse Aktionspotentiale aus; Bei höheren elektrischen Feldern lösen sie eine Elektroporation aus, die sich in einer anhaltenden Depolarisation äußert. Die Dauer des Experiments an jeder Zellprobe beträgt ca. 40 Minuten (20 Minuten für die Markierung und 20 Minuten für die Mikroskopie).

4. Datenanalyse

  1. Exportieren Sie die Zeitrafferaufnahmen in das TIFF-Format.
  2. Platzieren Sie Zeitrafferaufzeichnungen aller angelegten Spannungen während eines einzelnen Experiments (eine Probe von Zellen) in einem einzigen Ordner. Benennen Sie die Zeitrafferaufnahmen so um, dass das elektrische Feld E von der MATLAB-Anwendung erkannt werden kann: Vcm (z.B. 126Vcm für 126 V/cm). Die restlichen Teile des Namens können beliebig sein. Für die Erfassung zu Beginn des Experiments, bei der kein Impuls angelegt wird, benenne sie mit der Phrase 000Vcm um. Ein Beispiel für die Namen der Zeitrafferaufnahmen: 2022_1_20 1DOX 000Vcm, 2022_1_20 1DOX 126Vcm, 2022_1_20 1DOX 150Vcm usw.
  3. Öffnen Sie die Anwendung, die Sie von
    https://github.com/bor-kos/fluorescenceActionPotential. Klicken Sie auf Datenordner auswählen , um den Ordner auszuwählen, der die Zeitrafferaufzeichnungen eines Experiments enthält.
  4. Wählen Sie die Pixel aus, die für die weitere Datenanalyse verwendet werden sollen. Verwenden Sie dazu zwei Schieberegler, um die untere Schwelle für ein klares Bild der Membranen (in violett) und die obere Schwelle für die Beseitigung von Ablagerungen (große Flecken mit hoher Fluoreszenz) aus der Analyse (in grün) zu bestimmen.
  5. Wählen Sie Daten analysieren aus. Auf der Registerkarte Analyse wird eine Tabelle mit extrahierten Parametern angezeigt. Auf der rechten Seite der Tabelle erscheinen Diagramme der relativen Fluoreszenz in der Zeit für jedes verwendete E. Wählen Sie Diagramme für ein bestimmtes E aus dem Dropdown-Menü auf der linken Seite über der Tabelle aus.
  6. Untersuchen Sie alle Diagramme und führen Sie eine manuelle Korrektur durch, falls ein falscher Peak erkannt wird. Wählen Sie unten auf der Registerkarte Analyse die Option AUTO-Peaks löschen aus, und die Peaks, die automatisch erkannt wurden, werden gelöscht. Klicken Sie auf das Diagramm , um manuell einen neuen Spitzenzeitpunkt zu bestimmen.
  7. Wählen Sie unten auf der Registerkarte Analyse die Option AUTO Peak Detection erneut ausführen aus, um die automatische Peak-Erkennung erneut durchzuführen. Die extrahierten Parameter werden nun an den neuen Peak angepasst.
  8. Wählen Sie unten rechts auf der Registerkarte Analyse die Option Daten exportieren aus, um Daten in Form einer .mat-Datei, einer Tabellenkalkulationsdatei und PNG-Bildern für jedes verwendete E in denselben Ordner zu exportieren.

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Ergebnisse

Veränderungen des TMV in erregbaren Zellen in vitro , die durch elektrische Pulse ausgelöst werden, können mit diesem Protokoll optisch überwacht werden, und die Fluoreszenzsignale können analysiert werden, um ihre relevanten Parameter zu extrahieren.

Der Versuchsaufbau ist in Abbildung 1A dargestellt. Ein typisches Signal von 100 μs elektrischem Impuls, das in Experimenten verwendet wird, ist in Abbildung 1B dargestellt. Zel...

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Diskussion

S-HEK-Zellen sind ein einfaches erregbares Zellmodell mit gut definierten Natrium- und Kaliumkanälen, NaV1,5 und Kir2,19. Dies ermöglicht es uns, eingehend zu untersuchen, wie erregbare Zellen auf angelegte elektrische Pulse reagieren, und die experimentellen Daten mit mathematischen Modellen zu verknüpfen, die auf den bekannten theoretischen Eigenschaften der in S-HEK-Zellen exprimierten Kanäle basieren. In unserer vorherigen Studie

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Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass kein Interessenkonflikt besteht.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde von der Slowenischen Agentur für Forschung und Innovation (ARIS) im Rahmen des Forschungsprogramms P2-0249, des Infrastrukturprogramms I0-0022 und des Forschungsprojekts J2-2503 unterstützt. Die Arbeit wurde teilweise von ARIS und der Universität Ljubljana durch die Finanzierung von Start-up-Forschungsprogrammen unterstützt. Die Arbeit wurde teilweise von der Europäischen Union und ARIS durch NextGenerationEU und NOO-Mittel im Rahmen des Projekts MN-0023 unterstützt. Die Arbeit wurde teilweise von der Europäischen Union durch den ERC Starting Grant (Nr. 101115323 - REINCARNATION) und das Marie-Skłodowska-Curie-Stipendium (Nr. 893077 - EPmIC) unterstützt. Die geäußerten Ansichten und Meinungen sind jedoch nur die des Autors/der Autoren und spiegeln nicht unbedingt die Ansichten und Meinungen der Europäischen Union oder des Europäischen Forschungsrats wider. Weder die Europäische Union noch die Bewilligungsbehörde können für sie verantwortlich gemacht werden. Die Autoren danken der Gruppe von Adam E. Cohen von der Harvard University für die freundlicherweise zur Verfügung gestellte HEK-Zellen und Duša Hodžić für ihre Hilfe im Zellkulturlabor.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
1,5 mL RöhrchenRatiolab 5615000
2-Well Nunc Lab-Tek II Chambered #1.5 Deutsches DeckglassystemThermo Fisher Scientific 
ADP305 DifferenzspannungssondeTeledyne LeCroy
AP015 StromzangeTeledyne LeCroy
Blasticidin Thermo Fisher Scientific 
CO2-Inkubator PHCbi MCO -230AICUV
Doxycyclin Sigma-Aldrich/MerckD9891
Dulbecco' s Modifed Eagle" s Mittelhohes GlukosewachstumsmediumSigma-Aldrich/MerckD5671
ElektroFluor630 (Di-4-ANEQ(F)PTEA)Potentiometrische Sonden31795
Fötales RinderserumSigma-Aldrich/MerckF2442
GeneticinThermo Fisher Scientific 
GlutaminSigma-Aldrich/MerckG7513
Laminar-Flow-HaubeIskra Pio MC 15-2
MATLABMathworks
Penicillin– StreptomycinSigma-Aldrich/MerckP07681
Poly-L-Lysinhydrobromid Sigma-Aldrich/MerckP9155-5MG   
Impulsgenerator Sonderanfertigungensiehe Referenz11
PuromycinThermo Fisher Scientific 
T25 25 cm & sup2; GewebekulturflascheTPP 90026
HEK-Zellen mit Tet-on-SpikingType Culture Collection ATCCCRL-3479
Thunder Imager Lebendzellensystem für die FluoreszenzmikroskopieLeica Microsystems 
Trypsin-EDTA-LösungSigma-Aldrich/MerckT3924
WavePro 7300A OszilloskopTeledyne LeCroy
155379A111390310131035A1113803 American

Referenzen

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