Überwachung von Elektroporations-induzierten Veränderungen der Aktionspotentialbildung in gentechnisch veränderten Tet-On-Spiking-HEK-Zellen

Summary

Zur Untersuchung der Reaktionen erregbarer Zellen in vitro beschreibt das Protokoll die optische Überwachung von Änderungen der Aktionspotentialerzeugung aufgrund der Elektroporation an einem einfachen erregbaren Zellmodell von gentechnisch veränderten Tet-on-Spiking-HEK-Zellen sowie von Änderungen der Transmembranspannung mit automatisierter Extraktion relevanter Parameter.

Abstract

Erregbare Zellen wie Neuronal- und Muskelzellen können primäre Ziele in schnell aufkommenden Elektroporations-basierten Behandlungen sein. Sie können jedoch auch bei Therapien, bei denen sie nicht die primären Ziele sind, von elektrischen Impulsen beeinflusst werden, was zu unerwünschten Nebenwirkungen führen kann. Um die auf Elektroporation basierende Behandlung von erregbaren und nicht erregbaren Geweben zu optimieren, ist es daher notwendig, die Auswirkungen von elektrischen Impulsen auf erregbare Zellen, ihre Ionenkanäle und die Erregbarkeit in vitro zu untersuchen. Zu diesem Zweck wurde ein Protokoll zur optischen Überwachung von Veränderungen der Aktionspotentialerzeugung durch Elektroporation an einem einfachen erregbaren Zellmodell von gentechnisch veränderten Tet-on-Spiking-HEK-Zellen entwickelt. Mit Hilfe eines potentiometrischen Fluoreszenzfarbstoffs wurden die Änderungen der Transmembranspannung unter einem Fluoreszenzmikroskop überwacht und relevante Parameter der Zellantworten mit einer MATLAB-Anwendung automatisch extrahiert. Auf diese Weise konnten die erregbaren Zellantworten auf verschiedene elektrische Pulse und das Zusammenspiel zwischen Anregung und Elektroporation effizient ausgewertet werden.

Introduction

Bei der Elektroporation bewirken elektrische Hochspannungsimpulse eine Erhöhung der Plasmamembranpermeabilität für Moleküle, die sonst schlecht permeiert sind¹. Elektroporationsbasierte Techniken sind heute in Anwendungen in der Medizin², Biotechnologie³ und Lebensmitteltechnologie⁴ weit verbreitet.

Erregbare Zellen wie neuronale Zellen und Muskelzellen gehören zu den primären Zielen bei schnell aufkommenden Elektroporations-basierten Behandlungen des Herzens, des Gehirns und der Skelettmuskulatur⁵. Darüber hinaus können sie auch bei Therapien, bei denen sie nicht die primären Ziele sind, von elektrischen Impulsen beeinflusst werden, was zu unerwünschten Nebenwirkungen wie Schmerzen, Muskelzuckungen und Nervenschäden führen^{kann 6}. Elektrische Pulse können nämlich eine elektrische Stimulation von erregbaren Zellen bewirken: Sie aktivieren spannungsgesteuerte Ionenkanäle und lösen Aktionspotentiale (AP) aus. Bei höheren elektrischen Feldern wird jedoch die Plasmamembran der Zellen permeabilisiert, und es entsteht zusätzlicher Ionenstrom durch Poren/Defekte⁷. Dieser zusätzliche Ionenstrom beeinflusst die Erregbarkeit der Zellen in einem komplexen Zusammenspiel zwischen Anregung und Elektroporation. Um die auf Elektroporation basierende Behandlung von erregbaren und nicht erregbaren Geweben zu optimieren, ist es daher notwendig, die Auswirkungen von elektrischen Impulsen auf erregbare Zellen, ihre Ionenkanäle und die Erregbarkeit in vitro zu untersuchen.

In einer kürzlich durchgeführten Studie⁸ untersuchten wir gentechnisch veränderte humane embryonale Nierenzellen (HEK), die von Cohen et ^al.9,10 entwickelt wurden, als wertvolles Werkzeug zur Untersuchung der Elektroporation in erregbaren Zellen. In diesen ansonsten nicht erregbaren Zellen wird ein minimales Komplement an Natrium- und Kaliumkanälen (Na_V1,5 und K_ir2,1) exprimiert, das für die Erregbarkeit benötigt wird. Die Expression von K_ir2.1 in diesen Zellen wird durch ein Doxycyclin-induziertes Tet-on-System gesteuert, das die Etablierung von zwei Zellvarianten ermöglicht: erregbare spikende S-HEK (mit Na_V1,5 und K_ir2.1) und nicht erregbare nicht-spikende NS-HEK-Zellen (die nur Na_V1,5-Kanäle enthalten). Dies ermöglicht es uns, die Auswirkungen von elektrischen Impulsen auf erregbare und nicht erregbare Varianten desselben Zelltyps zu vergleichen. Im Vergleich zu isolierten primären erregbaren Zellen, erregbaren Zellen, die aus embryonalen oder induzierten pluripotenten Stammzellen differenziert wurden, und Zelllinien, die aus erregbaren Geweben gewonnen wurden, haben S-HEK-Zellen mehrere Vorteile: Sie sind einfach zu handhaben, kultivieren und zu vermehren, haben gut definierte Natrium- und Kaliumkanäle und erzeugen robuste APs⁸.

Wir haben ein Protokoll zur Überwachung von Änderungen der Transmembranspannung (TMV) entwickelt, die durch elektrische Impulse unterschiedlicher Amplituden unter Verwendung eines potentiometrischen Fluoreszenzfarbstoffs ausgelöst werden. Auf diese Weise können wir untersuchen, wie sich die Elektroporation auf die AP-Bildung in S-HEK-Zellen und andere Veränderungen des TMV sowohl in S-HEK- als auch in NS-HEK-Zellen auswirkt. Kurz gesagt, die S-HEK- oder NS-HEK-Zellen werden alle 2 Minuten einem einzelnen elektrischen Impuls von 100 μs ausgesetzt, und relative Änderungen der Fluoreszenz werden für etwa 3 s um jede Pulsanwendung aufgezeichnet. Die angelegten Pulse haben eine zunehmende Spannung, die zunächst APs in Zellen und bei einem höheren elektrischen Feld eine Elektroporation auslöst. Das 2-Minuten-Intervall zwischen der Pulsapplikation wurde gewählt, um die möglichen kumulativen Effekte aufeinanderfolgender Pulse zu minimieren und gleichzeitig die Experimente kurz genug zu halten, um die Zellen nicht zu verschlechtern. Die Bildverarbeitung wurde mit einer speziellen MATLAB-Anwendung automatisiert, um relevante Parameter der Fluoreszenzreaktionen des potentiometrischen Farbstoffs zu extrahieren und so die Veränderungen des TMV (APs und anhaltende Depolarisation aufgrund von Elektroporation) in S-HEK- und NS-HEK-Zellen zu bewerten.

Protocol

1. Vorbereitung der Reagenzien und Zellkultur

1. Bereiten Sie das Zellkulturmedium vor, indem Sie Dulbecco's Modified Eagle's Medium-high Glucose mit 10 % fötalem Rinderserum, 2 mM Glutamin, Penicillin-Streptomycin (Penicillin 100 U/ml, Streptomycin 100 μg/ml), 2 μg/ml Puromycin, 5 μg/ml Blasticidin und 200 μg/ml Geneticin ergänzen.
2. Bereiten Sie phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) mit 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na₂HPO₄ und 1,8 mM KH₂PO₄, pH 7,4 vor. Filtern Sie es durch einen sterilisierenden Membranfilter mit einer Porengröße von 0,22 μm.
3. Bereiten Sie die Tyrodenlösung mit 2 mM KCl, 125 mM NaCl, 2 mM CaCl₂, 1 mM MgCl₂, 10 mM HEPES, 30 mM Glukose, pH 7,3 vor. Bereiten Sie eine kaliumarme Tyrodenlösung mit 0,5 mM KCl, 126,5 mM NaCl, 2 mM CaCl₂, 1 mM MgCl₂, 10 mM HEPES, 30 mM Glukose, pH 7,3 vor. Filtrieren Sie beide Lösungen durch einen sterilisierenden Membranfilter mit einer Porengröße von 0,22 μm.
4. Bereiten Sie 1 mg/ml Poly-L-Lysin-Stammlösung vor, indem Sie 5 ml PBS in eine Durchstechflasche mit 5 mg Poly-L-Lysin geben.
5. Bereiten Sie 2 mg/ml Doxycyclin-Stammlösung in destilliertem Wasser vor und filtrieren Sie sie durch einen sterilisierenden Membranfilter mit einer Porengröße von 0,22 μm.
6. Bereiten Sie 4 mM potentiometrischen Farbstoff ElectroFluor630 Stammlösung in reinem Ethanol vor (geben Sie 25 μl reines Ethanol in das Röhrchen mit 100 nM - 73 μg des Farbstoffs).
7. Kultivieren Sie gentechnisch veränderte HEK-Zellen in einem T25-Kolben in 6 ml des Zellkulturmediums, wie zuvor beschrieben⁸. Die Inhaltsstoffe des Nährmediums sind lichtempfindlich; Halten Sie das Medium daher vor Licht geschützt (wickeln Sie den Mittelkolben in Alufolie ein) und führen Sie die Passage bei schlechten Lichtverhältnissen durch.
8. Passieren Sie die Zellen alle 3-4 Tage, indem Sie 3 x 10,⁵ oder 5 x 10⁵ Zellen in einen frischen T25-Kolben aussäen. Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer. Die Zellen werden in einem Hauptkolben als nicht erregbare NS-HEK-Zellen ohne Doxycyclin-Zugabe aufbewahrt, da sie eine anhaltende K_ir2.1-Expression nicht tolerieren. Verwenden Sie in den Experimenten Zellen aus Passagen unter 14.

2. Vorbereitung der Probe

1. Poly-L-Lysin-Beschichtung von Deckglas-Objektträgern
   1. Pipettieren Sie 1 ml PBS in eine Vertiefung der 2-Well-Objektträger mit Deckglas, fügen Sie 10 μl sterile 1 mg/ml-Poly-L-Lysin-Lösung hinzu und mischen Sie sie gut mit einer Pipette.
   2. 1,5 h bei Raumtemperatur unter sterilen Bedingungen in einer Laminar-Flow-Haube inkubieren. Entfernen Sie das PBS mit Poly-L-Lysin ohne weiteres Waschen.
2. Aussaat der Zellen
   1. Bereiten Sie eine 1:10-Verdünnung der Doxycyclin-Stammlösung in einem Kulturmedium in einem 1,5-ml-Röhrchen vor. Für jede Vertiefung sind 30 μl 1:10 Doxycyclin-Verdünnung erforderlich (3 μl Doxycyclin-Stammlösung und 27 μl Kulturmedium), das endgültige Volumen wird in Abhängigkeit von der Gesamtzahl der experimentellen Vertiefungen vorbereitet.
   2. Nehmen Sie das Kulturmedium aus dem T25-Kolben und trypsinisieren Sie die Zellen mit 2,5 ml Trypsin-EDTA-Lösung in einem CO₂ -Inkubator bei 37 °C für 2 min.
   3. Fügen Sie 2,5 ml frisches Nährmedium hinzu und lösen Sie die Zellen durch vorsichtiges Pipettieren von der Oberfläche. Mischen Sie die Zellsuspension gut.
   4. Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer und bestimmen Sie die Dichte der Zellen in Suspension.
   5. Berechnen Sie das Volumen der trypsinisierten Zellsuspension, das für die Etablierung der Kultur benötigt wird. Bei einer 2-Tage-Kultur werden 2,5 x 10⁵ Zellen und bei einer 3-Tage-Kultur 1 x 10⁵ Zellen pro Vertiefung gesät. Passen Sie bei Bedarf die genaue Anzahl der Zellen an.
   6. Berechnen Sie das Volumen des Kulturmediums, indem Sie das zuvor berechnete Zellsuspensionsvolumen von 1470 μl subtrahieren. Die restlichen 30 μl stellen das Volumen einer 1:10-Doxycyclin-Verdünnung dar. Das Gesamtvolumen in jeder Vertiefung beträgt 1500 μl (Zellen, Doxycyclin und Kulturmedium).
   7. Zur Vorbereitung von Proben mit erregbaren S-HEK-Zellen pipettieren Sie das berechnete Volumen des Kulturmediums und der trypsinisierten Zellsuspension in eine Vertiefung und fügen Sie 30 μl 1:10 Doxycyclin-Verdünnung hinzu. Verwenden Sie nur eine Vertiefung der Kammern mit zwei Vertiefungen, da das Experiment viel Zeit in Anspruch nimmt (ca. 40 Minuten). Mischen Sie gut durch vorsichtiges Pipettieren, bevor Sie die Kammern in den CO₂ -Inkubator einsetzen.
   8. Für die Vorbereitung von Proben mit nicht erregbaren NS-HEK-Zellen pipettieren Sie das berechnete Volumen des Kulturmediums in eine Vertiefung und fügen Sie 90 % des berechneten Volumens der Zellsuspension für S-HEK-Zellen ohne Doxycyclin hinzu. NS-HEK-Zellen wachsen etwas schneller als S-HEK-Zellen.
   9. Inkubieren Sie die Kammern in einem 5%igen CO_{2 -} Inkubator bei 37 °C für 2-3 Tage vor dem Experiment. Bei Proben mit Doxycyclin ist diese Inkubationszeit ausreichend, um die Zellen erregbar zu machen.
3. Beschriftung der Zellen
   1. Vor dem Experiment pipettieren Sie 3 μl potentiometrische Farbstoff-Stammlösung in ein 1,5-ml-Röhrchen und lassen Sie das offene Röhrchen bei Raumtemperatur in einer Laminar-Flow-Haube, damit das Ethanol verdampfen und der potentiometrische Farbstoff trocknen kann (ca. 15 Minuten). Geben Sie 997 μl kaltes Kulturmedium (aus dem Kühlschrank bei 4 °C) in das Röhrchen und lösen Sie den Farbstoff auf eine Endkonzentration von 12 μM auf.
   2. Nehmen Sie das Kulturmedium aus der Vertiefung und geben Sie 1 ml potentiometrische Farbstofflösung in die Zellen. Bei 4 °C in den Kühlschrank stellen und 20 Min. inkubieren.
   3. Entfernen Sie die potentiometrische Färbelösung und bewahren Sie sie zur weiteren Wiederverwendung in der Tube auf (für bis zu sechs aufeinanderfolgende Experimente an 1 Tag).
   4. Waschen Sie die Zellen vorsichtig 3x mit Tyrode-Lösung und pipettieren Sie nach dem letzten Waschen 1 ml kaliumarme Tyrode-Lösung in die Vertiefung.

3. Elektrostimulation und Elektroporation

1. Konfigurieren Sie die Synchronisation der Impulsabgabe mit der Bildaufnahme unter Verwendung eines TTL-Signals vom Mikroskopsystem, das den Impulsgenerator auslöst. Verwenden Sie zur Erzeugung von Hochspannungsimpulsen einen benutzerdefinierten Impulsgenerator¹¹ oder einen beliebigen Impulsgenerator, der extern mit einem TTL-Signal ausgelöst werden kann.
   HINWEIS: In der vorgestellten experimentellen Konfiguration wird die LAS X-Software für die Bildaufnahme verwendet, die so konfiguriert werden kann, dass während einer Zeitrafferaufnahme ein TTL-Signal zu einem vorgewählten Zeitpunkt gesendet wird.
2. Platzieren Sie zwei parallele Pt/Ir-Drahtelektroden mit einem Durchmesser von 0,8 mm und einem Abstand von 5 mm zwischen den Innenkanten am Boden der Kammer und fixieren Sie die Kammer unter dem Mikroskop.
3. Schließen Sie die Elektroden an den Impulsgeber an. Verbinden Sie den Ausgang des Impulsgenerators mit einem Oszilloskop über eine Spannungs- und eine Stromsonde, um zu überprüfen, ob die Impulse während des Experiments korrekt abgegeben wurden.
4. Fokussieren Sie die Zellen im Hellfeld. Stellen Sie sich die Zellen vor, die sich etwa in der Mitte zwischen den Elektroden befinden.
5. Starten Sie die erste Aufnahme von Fluoreszenzbildern im Zeitraffermodus mit einem 40-fach-Objektiv, wobei das Fluoreszenzsignal im gesamten Sichtfeld aufgezeichnet wird. Die Kamera sollte schnell genug sein, um einen klaren Zeitverlauf eines Aktionspotentials zu erfassen (idealerweise höher als 25 Bilder/s).
   1. Nehmen Sie 80 Bilder im Zeitraffermodus mit mindestens 25 Bildern/s auf, um den Verlauf des Aktionspotenzials in Echtzeit aufzulösen. Die Gesamtdauer der Bildaufnahme beträgt ca. 3 s. Beleuchten Sie die Zellen während der Bildaufnahme mit einer Anregungswellenlänge von 635 nm, einer Belichtungszeit von 10 ms und detektieren Sie die Emission bei etwa 700 nm. Wenden Sie bei dieser ersten Akquisition keinen Impuls an - diese Akquisition wird verwendet, um die nachfolgenden Akquisitionen für das Färbe-Photobleaching zu korrigieren. Warten Sie nach dieser Akquisition 2 Minuten.
      HINWEIS: Dieses Experiment verwendet eine Periode von 27,8 Bildern/s, d.h. eine Periode von 36 ms, was der Zeit vom Beginn der ersten Bildaufnahme bis zum Beginn der nächsten Bildaufnahme in der Zeitrafferaufnahme entspricht.
6. Nehmen Sie alle 2 Minuten einen Zeitraffer auf, auf die gleiche Weise wie in Schritt 3.5. Für diese Aufnahmen wird zum Zeitpunkt der Aufnahme des 10. Bildes (bei 324 ms) ein einzelner Impuls von 100 μs angewendet. Nehmen Sie Bilder mit den folgenden Impulsspannungen auf: 63 V, 75 V, 88 V, 100 V, 125 V, 150 V, 175 V und 200 V. Schätzen Sie das elektrische Feld, dem die Zellen ausgesetzt sind, als angewendetes Spannungs-Elektroden-Abstandsverhältnis (E = 126, 150, 176, 200, 250, 300, 350 und 400 V/cm).
   HINWEIS: Bei niedrigeren elektrischen Feldern lösen die Impulse Aktionspotentiale aus; Bei höheren elektrischen Feldern lösen sie eine Elektroporation aus, die sich in einer anhaltenden Depolarisation äußert. Die Dauer des Experiments an jeder Zellprobe beträgt ca. 40 Minuten (20 Minuten für die Markierung und 20 Minuten für die Mikroskopie).

4. Datenanalyse

1. Exportieren Sie die Zeitrafferaufnahmen in das TIFF-Format.
2. Platzieren Sie Zeitrafferaufzeichnungen aller angelegten Spannungen während eines einzelnen Experiments (eine Probe von Zellen) in einem einzigen Ordner. Benennen Sie die Zeitrafferaufnahmen so um, dass das elektrische Feld E von der MATLAB-Anwendung erkannt werden kann: Vcm (z.B. 126Vcm für 126 V/cm). Die restlichen Teile des Namens können beliebig sein. Für die Erfassung zu Beginn des Experiments, bei der kein Impuls angelegt wird, benenne sie mit der Phrase 000Vcm um. Ein Beispiel für die Namen der Zeitrafferaufnahmen: 2022_1_20 1DOX 000Vcm, 2022_1_20 1DOX 126Vcm, 2022_1_20 1DOX 150Vcm usw.
3. Öffnen Sie die Anwendung, die Sie von
   https://github.com/bor-kos/fluorescenceActionPotential. Klicken Sie auf Datenordner auswählen , um den Ordner auszuwählen, der die Zeitrafferaufzeichnungen eines Experiments enthält.
4. Wählen Sie die Pixel aus, die für die weitere Datenanalyse verwendet werden sollen. Verwenden Sie dazu zwei Schieberegler, um die untere Schwelle für ein klares Bild der Membranen (in violett) und die obere Schwelle für die Beseitigung von Ablagerungen (große Flecken mit hoher Fluoreszenz) aus der Analyse (in grün) zu bestimmen.
5. Wählen Sie Daten analysieren aus. Auf der Registerkarte Analyse wird eine Tabelle mit extrahierten Parametern angezeigt. Auf der rechten Seite der Tabelle erscheinen Diagramme der relativen Fluoreszenz in der Zeit für jedes verwendete E. Wählen Sie Diagramme für ein bestimmtes E aus dem Dropdown-Menü auf der linken Seite über der Tabelle aus.
6. Untersuchen Sie alle Diagramme und führen Sie eine manuelle Korrektur durch, falls ein falscher Peak erkannt wird. Wählen Sie unten auf der Registerkarte Analyse die Option AUTO-Peaks löschen aus, und die Peaks, die automatisch erkannt wurden, werden gelöscht. Klicken Sie auf das Diagramm , um manuell einen neuen Spitzenzeitpunkt zu bestimmen.
7. Wählen Sie unten auf der Registerkarte Analyse die Option AUTO Peak Detection erneut ausführen aus, um die automatische Peak-Erkennung erneut durchzuführen. Die extrahierten Parameter werden nun an den neuen Peak angepasst.
8. Wählen Sie unten rechts auf der Registerkarte Analyse die Option Daten exportieren aus, um Daten in Form einer .mat-Datei, einer Tabellenkalkulationsdatei und PNG-Bildern für jedes verwendete E in denselben Ordner zu exportieren.

Results

Veränderungen des TMV in erregbaren Zellen in vitro , die durch elektrische Pulse ausgelöst werden, können mit diesem Protokoll optisch überwacht werden, und die Fluoreszenzsignale können analysiert werden, um ihre relevanten Parameter zu extrahieren.

Der Versuchsaufbau ist in Abbildung 1A dargestellt. Ein typisches Signal von 100 μs elektrischem Impuls, das in Experimenten verwendet wird, ist in Abbildung 1B dargestellt. Zellen in den Kammern, die unter das Mikroskop gelegt werden, sehen typischerweise aus wie die Zellen in Abbildung 1C (Hellfeldbild) und Abbildung 1D (Fluoreszenzbild). Wir führen ein Experiment durch, bei dem alle 2 Minuten ein elektrischer Impuls mit steigender Spannung an dieselben Zellen angelegt wird. Beachten Sie, dass die Interpulszeit von 2 Minuten möglicherweise nicht lang genug ist, um eine vollständige Wiederversiegelung und Wiederherstellung der Zellmembranen zu ermöglichen, insbesondere bei der Verwendung von Impulsen mit der höchsten Amplitude, die mit einer ausgeprägten Elektroporation verbunden sind. Somit sind einige kumulative Effekte der Impulse zu erwarten. Um diese kumulativen Effekte zu vermeiden, kann die Interpulsverzögerung verlängert werden, jedoch auf Kosten der Reduzierung der Anzahl der getesteten Pulsamplituden und um zu vermeiden, dass die Zellen zu lange am Mikroskop bleiben.

Nachdem Sie Fluoreszenzbilder in Experimenten aufgenommen haben, analysieren Sie sie mit der benutzerdefinierten MATLAB-Anwendung. Bestimmen Sie zunächst die Pixelschwellenwerte (Abbildung 2A). Durch Einstellen des unteren Schwellenwerts erhalten wir ein klares Bild der Membranen um die Zellen herum (in violett), und durch Einstellen des oberen Schwellenwerts entfernen wir das Signal von Ablagerungen (grün). Die Anwendung bestimmt dann die durchschnittliche Fluoreszenzintensität aller Schwellenpixel für jeden abgegebenen aufeinanderfolgenden Impuls, um ein zeitabhängiges Signal für die relative Änderung der Fluoreszenz F/F0 zu erhalten. Dieses Signal wird für das Farbstoff-Photobleaching korrigiert, indem die Steigung der linearen Abnahme von F subtrahiert wird, die aus der Kontroll-Zeitrafferaufzeichnung bestimmt wurde, bei der kein Impuls angelegt wurde (Abbildung 2B). Nach der Korrektur des Signals werden die Parameter der Reaktionen in Form einer In-App-Tabelle und eines Diagramms des korrigierten Fluoreszenzsignals extrahiert (Abbildung 2C). In seltenen Fällen erkennt der Algorithmus einen offensichtlichen Peak nicht oder erkennt störende Rauschsignale als falsch positive Ergebnisse. In diesen Fällen hat der Benutzer die Möglichkeit, den entsprechenden Punkt im Fluoreszenzsignal manuell als Peak auszuwählen oder den detektierten falschen Peak zu entfernen (Abbildung 2D-Entfernung eines kleinen Peaks, der anomal detektiert wurde, bevor der elektrische Impuls angelegt wurde).

Mit der MATLAB-Anwendung können wir Bilder von TMV-Reaktionen auf elektrische Pulse sowohl in erregbaren S-HEK- (Abbildung 3A) als auch in nicht-erregbaren NS-HEK-Zellen (Abbildung 3B) erhalten. Die folgenden Ansprechparameter werden extrahiert (Tabelle 1): Anzahl der Peaks (NoPeaks), durchschnittliche Peak-to-Peak-Zeit (wenn mehr als ein Peak erkannt wird, MPPT), maximales Ansprechen (MR), Zeit bis zum ersten Peak (TtFP) und Zeit vom Peak bis zu 25 %, 50 %, 75 % bzw. 90 % Wiederfindung (T25, T50, T75, T90). Diese Parameter ermöglichen die Bewertung der Reaktionen auf verschiedene elektrische Impulse (z.B. Bestimmung der Anzahl der Peaks, die durch elektrische Impulse unterschiedlicher E ausgelöst werden, Abbildung 3C) und des Zusammenspiels zwischen Anregung und Elektroporation.

Abbildung 1: Der Aufbau, die Wellenform und die S-HEK-Zellen. (A) Das Bild der Kammer auf dem Mikroskoptisch. (B) Beispiel für die Wellenform eines Impulses, die in der Studie verwendet wurde (Spannung (U) über die Zeit). (C, D) Das Bild der S-HEK-Zellen ((C): Hellfeld, (D): Fluoreszenz), Maßstabsbalken: 100 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 2: Anwendung der Datenanalyse. (A) Das Bild der Anwendungsschnittstelle - Schwellenwerte. (B) Das Diagramm des rohen und korrigierten Signals der Fluoreszenzänderung. (C) Das Bild der Anwendungsschnittstelle - extrahierte Daten. (D) Manuelle Korrektur der Peak-Detektion (Entfernung eines kleinen Peaks, der vor dem Anlegen des elektrischen Impulses anomal detektiert wurde, markiert mit einem roten Pfeil). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Repräsentative Ergebnisse. (A, B) Auslösen von Änderungen des TMV in (A) erregbarem S-HEK und (B) nicht erregbarem NS-HEK mit 100 μs elektrischen Pulsen unterschiedlicher Amplitude, Ergebnisse repräsentativer Experimente. Aus Gründen der Übersichtlichkeit werden nur die Reaktionen auf ausgewählte Impulse in der angewendeten Impulssequenz angezeigt. (C) Die Parameter der TMV-Antworten, die durch die 100-μs-Impulse unterschiedlicher Amplituden ausgelöst werden: Das Beispiel zeigt die Anzahl der Peaks. Die Ergebnisse werden als Durchschnitt ± SE ausgedrückt, Anzahl der Versuche: N = 13. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Index	E-Stärke (V/cm)	Keine Spitzen (-)	MPPT (ms)	HERR (-)	TtFP (ms)	T25 (ms)	T50 (ms)	Nr. T75 (ms)	T90 (ms)
1	0
2	126	9	224	0.104	360	72	108	144	180
3	150	6	354	0.097	108	72	108	144	180
4	176	2	144	0.089	36	72	108	144	180
5	200	1		0.075	0	108	144	180	252
6	250	2	396	0.064	0	108	216	432	2052
7	300	1		0.059	0	180	1188	2448
8	350	1		0.053	0	1008	2340
9	400	1		0.047	0	1512

Tabelle 1: Parameter der TMV-Antworten, die durch die 100-μs-Impulse unterschiedlicher Amplituden ausgelöst werden.

Discussion

S-HEK-Zellen sind ein einfaches erregbares Zellmodell mit gut definierten Natrium- und Kaliumkanälen, Na_V1,5 und K_ir2,1⁹. Dies ermöglicht es uns, eingehend zu untersuchen, wie erregbare Zellen auf angelegte elektrische Pulse reagieren, und die experimentellen Daten mit mathematischen Modellen zu verknüpfen, die auf den bekannten theoretischen Eigenschaften der in S-HEK-Zellen exprimierten Kanäle basieren. In unserer vorherigen Studie⁸ haben wir die Reaktionen dieser Zellen auf 100 μs Pulse mit steigendem E sowohl experimentell als auch theoretisch beschrieben. Bei niedrigerem E reagieren die S-HEK-Zellen mit einem oder mehreren Aktionspotentialen, während bei höherem E die APs verlängert werden und sich in eine anhaltende Depolarisation umwandeln. Da die anhaltende Depolarisation auch in einer nicht erregbaren Version dieser Zellen (NS-HEK) deutlich sichtbar ist, wird sie auf die Elektroporation und die damit verbundene Erhöhung des nichtselektiven Ionenstroms zurückgeführt.

Die Verwendung des fluoreszierenden potentiometrischen Farbstoffs erwies sich als sehr effektive Methode, um APs und Elektroporation in erregbaren Zellen zu untersuchen. Im Vergleich zu klassischen elektrophysiologischen Methoden, wie z.B. Patch Clamp, sind optische Messungen wesentlich komfortabler, zeiteffizienter und erfordern keine besonderen technischen Fähigkeiten. Darüber hinaus stört die Verwendung von elektrischen Hochspannungsimpulsen die Messungen nicht, was bei Patch-Clamp-Messungen zu einem Problem werden kann¹². Die Hauptnachteile dieses Protokolls hängen jedoch mit der Art des Farbstoffs zusammen. Aufgrund seiner Photobleichung muss das erfasste Fluoreszenzsignal korrigiert werden. Der Farbstoff diffundiert spontan in die Zelle, so dass das Signal von den Membranen mit der Zeit abnimmt. Aus diesem Grund eignet sich der Farbstoff zur Überwachung von Aktionspotentialen und anderen kurzfristigen Veränderungen des TMV (~3 s in diesen Experimenten). Da der Farbstoff eine ratiometrische Bildgebung¹³ ermöglicht, könnte eine solche Bildgebung einige Probleme mit der Farbstoffdiffusion vermeiden, jedoch auf Kosten einer geringeren erreichbaren Bildgebungsgeschwindigkeit. In dieser experimentellen Konfiguration wäre die ratiometrische Bildgebung zu langsam, um die Form von Aktionspotentialen korrekt zu erfassen. Darüber hinaus liefern die gemessenen Änderungen der Farbstofffluoreszenz qualitative Informationen über die Änderung des TMV; Dennoch kann der Farbstoff kalibriert werden, um quantitative Messungen zu ermöglichen.

Die automatisierte Bildanalyse mit einer benutzerdefinierten MATLAB-Anwendung ermöglicht es uns, eine große Datenmenge zu analysieren und wertvolle Merkmale von TMV-Reaktionen in kurzer Zeit effizient zu extrahieren. Die Anwendung ist so konfiguriert, dass sie das Fluoreszenzsignal von Membranen aller Zellen im Sichtfeld erfasst. Dies verbessert das Signal-Rausch-Verhältnis, aber auf Kosten des Verlusts von Informationen darüber, wie sich das TMV auf der Ebene der einzelnen Zellen verändert. In der gegebenen experimentellen Konfiguration war das Signal der einzelnen Zellen zu verrauscht, um brauchbare Messungen zu ermöglichen. Zudem waren die Membranen benachbarter Zellen schwer zu unterscheiden. Dennoch exprimieren HEK-Zellen endogen Gap Junctions, durch die sie elektrisch verbunden sind. Die mathematische Modellierung, die in der vorherigen Studie⁸ vorgestellt wurde, zeigte, dass die Zellen innerhalb des Sichtfeldes aufgrund ihrer elektrischen Verbindungen nahe genug beieinander liegen, um AP gleichzeitig auszulösen. Darüber hinaus wird AP mit hoher Geschwindigkeit (ca. 34 mm/s, geschätzt auf der Grundlage der Bildgebung bei 5-facher Objektivvergrößerung) entlang der Zellmonoschicht vermehrt)^8,9. Unter Berücksichtigung der Seitenlänge des Sichtfeldes (~0,33 mm) würde der AP diese Länge in etwa 10 ms zurücklegen, was kürzer ist als unsere Bildaufnahmeperiode. Daher ist der AP-Ausbreitungseffekt bei dieser Vergrößerung und Aufnahmegeschwindigkeit nicht zu sehen. Nichtsdestotrotz kann die Ausbreitung des AP von den Elektroden in das Gesichtsfeld zu einer Verzögerung zwischen dem angelegten Impuls und dem erfassten AP⁸ führen.

Sowohl in der vorangegangenen Studie⁸ als auch in dieser Veröffentlichung werden die Auswirkungen von Pulsen mit einer Dauer von 100 μs auf das Wechselspiel zwischen Erregbarkeit und Elektroporation beschrieben. Dieses Protokoll kann jedoch angepasst werden, um elektrische Pulse mit anderen Parametern (unterschiedlicher Dauer, Spannung, Anzahl, Wiederholrate oder Form) oder anderen erregbaren Zellen zu untersuchen.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,5 mL Röhrchen	Ratiolab	5615000
2-Well Nunc Lab-Tek II Chambered #1.5 Deutsches Deckglassystem	Thermo Fisher Scientific
ADP305 Differenzspannungssonde	Teledyne LeCroy
AP015 Stromzange	Teledyne LeCroy
Blasticidin	Thermo Fisher Scientific
CO2-Inkubator	PHCbi	MCO -230AICUV
Doxycyclin	Sigma-Aldrich/Merck	D9891
Dulbecco' s Modifed Eagle" s Mittelhohes Glukosewachstumsmedium	Sigma-Aldrich/Merck	D5671
ElektroFluor630 (Di-4-ANEQ(F)PTEA)	Potentiometrische Sonden	31795
Fötales Rinderserum	Sigma-Aldrich/Merck	F2442
Geneticin	Thermo Fisher Scientific
Glutamin	Sigma-Aldrich/Merck	G7513
Laminar-Flow-Haube	Iskra Pio	MC 15-2
MATLAB	Mathworks
Penicillin– Streptomycin	Sigma-Aldrich/Merck	P07681
Poly-L-Lysinhydrobromid	Sigma-Aldrich/Merck	P9155-5MG
Impulsgenerator	Sonderanfertigungen		siehe Referenz11
Puromycin	Thermo Fisher Scientific
T25 25 cm & sup2; Gewebekulturflasche	TPP	90026
HEK-Zellen mit Tet-on-Spiking	Type Culture Collection ATCC	CRL-3479
Thunder Imager Lebendzellensystem für die Fluoreszenzmikroskopie	Leica Microsystems
Trypsin-EDTA-Lösung	Sigma-Aldrich/Merck	T3924
WavePro 7300A Oszilloskop	Teledyne LeCroy