Einstufige Extraktion und zymographische Analyse von bakteriellen Gelatinasen

Zusammenfassung

Proteinasen sind für die bakterielle Pathogenese von entscheidender Bedeutung und ermöglichen die Invasion und Immunumgehung. Die einstufige Extraktion von zytoplasmatischen und Membranproteinen von Bakterien in ihrer aktiven Form ist erschütternd. Dieser Videoartikel zeigt die Extraktion ganzzellulärer Proteine von Leptospira für die Zymographie-Analyse zum Nachweis und zur Charakterisierung von Gelatinasen.

Zusammenfassung

Proteinasen pathogener Bakterien tragen zur Invasion und Pathogenese bei, indem sie die Komponenten der extrazellulären Matrix (EZM) und die zellulären Barrieren des Wirts aktiv abbauen, die Immunantwort des Wirts modifizieren und das Abwehrsystem des Wirts abbauen. Dies macht die Proteinasen zu einem der virulentesten Moleküle, und ihre Identifizierung und Charakterisierung sind für die Vorbeugung und Kontrolle von Krankheiten unerlässlich. Viele Bakterien besitzen auch äußere membrangebundene Proteinasen. Die Isolierung und Charakterisierung von Proteinen der äußeren Membran in ihren aktiven Formen stellt aufgrund ihrer Lokalisierung innerhalb der äußeren Membran eine große Herausforderung dar. In dieser Studie demonstrieren wir eine einstufige Methode zur Extraktion sowohl zytoplasmatischer als auch äußerer membranassoziierter Gelatinasen aus Leptospiren und demonstrieren ihre enzymatische Aktivität mittels Zymographie. Bei dieser Methode verwenden wir Natriumdesoxycholat, um die Zellmembran aufzubrechen und die gebundenen Proteine freizusetzen, und 6-Aminocapronsäure, um das freigesetzte Membranprotein in seiner nativen Form zu lösen. Des Weiteren zeigen wir eine zymographische Analyse der leptospiralen Gelatinasen. Dieser Ansatz bietet einen vielseitigen Rahmen für die Isolierung, Reinigung und Charakterisierung von Metalloproteasen, Kollagenasen und Gelatinasen aus verschiedenen bakteriellen Krankheitserregern.

Einleitung

Die meisten bakteriellen Krankheitserreger müssen während der Invasion und der Ausbreitung in die Zielorgane während der Pathogenese auf die extrazelluläre Matrix (EZM) des Wirts treffen. Kollagen bildet den Hauptbestandteil in der EZM tierischer Gewebe¹. Gelatinasen sind eine Gruppe von Proteasen, die auf Kollagen und seine hydrolysierte Form, Gelatine, wirken. Der ECM-Abbau wird hauptsächlich von einer Gruppe von Proteasen ausgeführt, zu denen Kollagenasen und Gelatinasen gehören ^2,3. Bakterielle Krankheitserreger verwenden Kollagenasen und Gelatinasen, um die Wirts-EZM für ihre Bequemlichkeit bei der Invasion und Pathogenese umzugestalten oder abzubauen ^4,5. Bakterielle EZM-abbauende Enzyme sind potenzielle Kandidaten für das Targeting von Impfstoffen und Medikamenten⁵.

Bakterielle Proteasen kommen in sekretorischer und membrangebundener Form vor 6,7,8,9. Viele Methoden zur Extraktion zellulärer Enzyme sind für die Isolierung membrangebundener bakterieller Gelatinasen und Kollagenasen unwirksam, da diese Verfahren die native Form membrangebundener Proteine möglicherweise nicht effizient erhalten. Ebenso gibt es membranspezifische Methoden, die nur membrangebundene Proteasen und Gelatinasen extrahieren. Herkömmliche Extraktionsmethoden für Gesamtproteine, einschließlich Membranproteine, beinhalten oft Detergenzien und chaotrope Ionen, die die enzymatische Aktivität beeinträchtigen können. Ein Extraktionsverfahren, das die Enzymaktivität und -löslichkeit aufrechterhält, ist für die elektrophoretische Trennung unerlässlich und ermöglicht die Entwicklung von Zymographien zum Nachweis der Proteaseaktivität.

Natriumdesoxycholat, ein ionisches Detergens, das Zellen durch Aufbrechen der Zellmembran lysieren kann, ermöglicht die Freisetzung des Zellinhalts und des Membranproteins. Die 6-Aminocapronsäure kann das freigesetzte Membranprotein in seiner nativen Form lösen. Die Solubilisierung durch 6-Aminocapronsäure hat den Vorteil, dass sie die Elektrophorese nicht beeinflusst. In dieser Arbeit demonstrieren wir die Extraktion von zellulären und membrangebundenen bakteriellen Proteinasen unter Verwendung von Natriumdesoxycholat und 6-Aminocapronsäure und stabilisieren sie in ihrer nativen löslichen Form 10,11,12. Bei diesem Verfahren werden Proteine aus der Zelle und der Membran effektiv gelöst, die ohne störende Elektrophorese direkt verwendet werden können^13,14. Je nach Anwendung können verschiedene enzymatische Charakterisierungen durchgeführt werden, indem die im Aktivierungspuffer verwendeten Proteaseinhibitoren und Metallionen geändert werden.

Protokoll

1. Extraktion von bakteriellen Gelatinasen

HINWEIS: Siehe Tabelle 1 zur Vorbereitung von Reagenzien und Materialien.

1. Der Organismus wird in Ellinghausen McCullough Johnson Harris (EMJH) Medium mit 10 mg/ml Rinderserumalbumin bei 30 °C gezüchtet. In der mittleren logarithmischen Wachstumsphase werden 10 ml Leptospira-Kultur mit 3,5 × 10⁸ Zellen/ml für die Extraktionsproteinasen^13,14 entnommen. Verwenden Sie die direkte mikroskopische Zählung mit einer Petroff-Hausser-Zählkammer unter einem Dunkelfeldmikroskop, um die Wachstumsphase in der Mitte des Logarithmus zu beobachten.
2. Die Zellen werden durch Zentrifugation bei 6.000 × g für 10 min geerntet und der Überstand zur Dekontamination in einen Behälter durch Autoklavieren bei 121 °C für 60 min entsorgt.
3. Übertragen Sie das Pellet, indem Sie es in 1 ml Waschpuffer suspendieren, in ein 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen und zentrifugieren Sie es 5 Minuten lang bei 6.000 × g . Wiederholen Sie diese Wäsche.
4. Extrahieren Sie das Protein aus dem Pellet, indem Sie 100 μl Extraktionspuffer für ein Leptospira-Pellet aus 10 mL Kultur und Vortex für 5 Minuten hinzufügen. Die Extraktion wird fortgesetzt, indem 1 h lang bei 4 °C inkubiert wird. Sammeln Sie das extrahierte Protein durch Zentrifugation bei 15.000 × g bei 4 °C für 10 min und entsorgen Sie das Pellet in einem Behälter zur Dekontamination, indem Sie es 60 Minuten lang bei 121 °C autoklavieren.
5. Verwenden Sie den Proteinextrakt direkt für die Zymographie, indem Sie ein gleiches Volumen von 2x Probenpuffer hinzufügen.
6. Verwenden Sie den Bradford-Schätzassay, um die Proteinkonzentration zu bestimmen.
7. Wenn die Proteinkonzentration niedrig ist, fällt es mit Aceton aus, indem das Protein mit einem 4-fachen Volumen Aceton für die Fällung gemischt und über Nacht bei -20 °C inkubiert wird. Am nächsten Tag zentrifugieren Sie die Probe bei 10.000 × g für 10 min, trocknen Sie das resultierende Pellet an der Luft und resuspendieren Sie es in PBS oder lösen Sie es im gewünschten Puffer auf und lagern Sie es bei -20 °C für bis zu 1 Monat. Verwenden Sie die Lyophilisation für die Langzeitlagerung oder den Transport.
   HINWEIS: Aufgrund der aktiven Proteasen im Extrakt und des Fehlens von Proteaseinhibitoren können Proteine in der Probe abgebaut werden.

2. Zymographie der Gelatinasen

1. Herstellung des gelatine-copolymerisierten SDS PAGE-Gels
   1. Gel auflösen
      1. Stellen Sie die auflösende Gelmischung her, indem Sie die Komponenten in den erforderlichen Mengen hinzufügen, um das Gel zu gießen. Zu 3,86 ml Wasser in einem 50-ml-Becherglas 2,5 ml Tris-HCl (pH 8,8), 0,1 ml aus der 10%igen Gelatine-Stammlösung, 3,34 ml Acrylamid-bis-Acrylamidlösung (ABA), 0,1 ml 10 % SDS, 0,006 ml TEMED und 0,1 ml 10 % Ammoniumpersulfat hinzufügen und ohne Schaumbildung und Blasenbildung gut mischen. Das erwähnte System (Normale Glasplatten; 18 x 8 cm) benötigt 10 mL auflösende Gelmischung.
         HINWEIS: Wenn die Gelatine aus einem gefrorenen Aliquot stammt, tauen Sie sie auf, bis sie schmilzt, um die Lösung ohne Klumpen zu reinigen. Fügen Sie Ammoniumpersulfat kurz vor dem Gießen hinzu, da die Polymerisation unmittelbar nach der Zugabe von Ammoniumpersulfat beginnt.
      2. Gießen Sie die auflösende Gelmischung bis zu ~3-5 mm unterhalb der Markierung für den Boden der Vertiefungen in die Gießkammer. Vermeiden Sie Luftblasen.
      3. Gießen Sie langsam etwas Wasser ein, um eine gleichmäßige Schicht von 1 mm auf der Oberseite des Gels zu erhalten und Blasen zu entfernen. Lassen Sie das Gel 1 Stunde lang einwirken.
         HINWEIS: Die Gelbildung kann bestätigt werden, indem nach einer Phasentrennung zwischen der Wasserschicht und dem Gel gesucht wird. Das Gel kann nicht ausgegossen werden, auch wenn die Gelkassette gekippt ist.
   2. Gel zum Stapeln
      1. Bereiten Sie das Stapelgel vor, indem Sie die folgenden Komponenten mischen. Zu 1,84 ml Wasser in einem 10-ml-Becherglas werden 2,5 ml Tris-Cl (pH 6,6), 0,35 ml ABA, 0,03 ml 10 % SDS und 0,006 ml TEMED gegeben. Das 8 x 10 cm große System mit einer Dicke von 1 mm benötigt 3 ml auflösende Gelmischung.
      2. Dekantieren Sie das oben auf dem Gel gebildete Wasser aus der Gelkassette, indem Sie das Gel-Setup zur Seite kippen und das gesammelte Wasser mit einem schmalen Streifen Filterpapier aus der Ecke abtupfen.
      3. 0,03 ml 10 % APS zu der in Schritt 2.1.2.1 genannten Mischung geben und ohne Blasenbildung mischen.
      4. Gießen Sie das Stapelgel auf das Auflösungsgel und platzieren Sie den Kamm sofort in Position, ohne Luftblasen unter den Kammzähnen zu bilden, wobei Sie eine Dicke von 3-5 mm Stapelgel zwischen dem Auflösungsgel und der Unterseite der Kammzähne lassen. Warten Sie mindestens 3 Stunden, bis die Gelatine vollständig polymerisiert und vernetzt ist.
      5. Nehmen Sie den unteren Abstandshalter heraus und befestigen Sie das Gel auf dem Elektrophoresegerät.
      6. Geben Sie das Gel langsam in den Tank mit 1x Elektrodenpuffer und stellen Sie sicher, dass sich keine Luft am Boden des Gels befindet.
2. Vorbereitung der Probe
   1. Geben Sie dem Extrakt ein gleiches Volumen Probenpuffer hinzu und inkubieren Sie ihn 30 Minuten lang bei 37 °C, damit SDS an das Protein binden kann. Als Positivkontrolle ist eine Probe mit 2 μl Humanserum mit dem gleichen Volumen Probenpuffer zu verwenden.
3. Laden der Probe
   1. Laden Sie die Probe vorsichtig mit einer Pipette mit schmaler Spitze oder einer Hamilton-Spritze (0,5-1 ml) in die Vertiefungen. Fügen Sie nach und nach Elektrodenpuffer hinzu, um die verbleibenden Teile der Vertiefungen, die Oberseite des Gels und den oberen Tank der Elektrophoreseeinheit zu füllen, ohne die geladenen Proben zu stören.
      HINWEIS: Die Hamilton-Spritze sollte zwischen den Proben gründlich gewaschen werden, um Kreuzkontaminationen zu vermeiden.
4. Laufende Elektrophorese
   1. Starten Sie die Elektrophorese bei 6 mA pro Gel und lassen Sie sie laufen, bis die Farbstofffront in das auflösende Gel eintritt. Erhöhen Sie dann den Strom auf 12 mA pro Gel und fahren Sie fort, bis die Farbstofffront 1 cm über dem Boden des Gels liegt.
      HINWEIS: Die Laufzeit kann sich je nach verwendeter ABA-Konzentration und Größe des Zielproteins ändern.
5. Markieren der Ausrichtung der Bänder der Norm
   1. Nach Abschluss der Elektrophorese zerlegen Sie die Glasplatten vorsichtig mit einem Plattentrennwerkzeug oder einem Kunststoffspatel und markieren Sie die Ausrichtung der Probenbeladung, indem Sie die rechte untere Ecke des Gels abschneiden, und markieren Sie die vorgefärbten Markierungsbänder, indem Sie Löcher in der Nähe stanzen oder das Gel scannen.
6. Renaturierung aufgelöster Enzyme
   1. Tauchen Sie das Gel in eine Renaturierungslösung, die Triton X-100 enthält, in eine Gelschale und inkubieren Sie es 30 Minuten lang bei Raumtemperatur ohne Schütteln.
      HINWEIS: Triton X-100 renaturiert die Proteine, da das Zymogramm-Gel, das aufgelöste Proteine enthält, denaturiert werden und in Gegenwart von SDS seine Aktivität verlieren kann.
7. Inkubation für Proteaseaktivität
   1. Ersetzen Sie die Renaturierungslösung durch einen Aktivierungspuffer, der das Gel vollständig eintaucht, und inkubieren Sie bei 37 °C für 18 Stunden in einem Inkubator.
      HINWEIS: Modifizieren Sie den Aktivierungspuffer durch Zugabe von Inhibitoren oder Aktivatoren von Proteinasen von Interesse, um die Proteinaseaktivität nach Bedarf zu charakterisieren.
8. Färbung des Zymogramms
   1. Entfernen Sie nach der Inkubation den Aktivierungspuffer und spülen Sie das Gel 1 Minute lang kurz mit Wasser aus, um verbleibende Triton X-100 zu entfernen und eine Schaumbildung während des Schüttelns zu verhindern.
   2. Geben Sie die Färbelösung in die Schale und stellen Sie sicher, dass das Gel vollständig eingetaucht ist. Schütteln Sie das Gel vorsichtig bei niedriger Geschwindigkeit, um Schäden zu vermeiden. Färben Sie weiter, bis das Gel vollständig blau wird.
   3. Entfernen Sie überschüssige Flecken von der Geloberfläche, indem Sie sie 1 Minute lang mit Wasser abspülen. Geben Sie die Entfärbungslösung in das Tablett und schütteln Sie sie leicht. Ersetzen Sie die Entfärbungslösung mehrmals durch eine frische Lösung, bis der gewünschte Bandenkontrast auf dem blauen Hintergrund erreicht ist.
      HINWEIS: Überwachen Sie das Gel während der Entfärbung kontinuierlich, um sicherzustellen, dass es nicht vollständig entfärbt wird, um die Beobachtung und Aufzeichnung der proteolytischen Banden zu ermöglichen.
   4. Scannen Sie das Gel in einem Gel-Dokumentationssystem oder Dokumentenscanner und bestimmen Sie die Molekülmasse der Proteinbanden, indem Sie sie mit den Proteinstandards vergleichen.

Ergebnisse

Das Ergebnis zeigt das Zymogramm des leptospiralen Proteins und der Gelatinasen aus humanem Serum. Die Ergebnisse, die in Abbildung 1 gezeigt sind, stellen Proteasen als weiße, klare Banden auf blauem Hintergrund dar. Die Banden stellen Bereiche dar, in denen die copolymerisierte Gelatine abgebaut und daher nicht gefärbt ist, während andere Bereiche des gesamten Gels aufgrund des Vorhandenseins von Gelatine blau gefärbt sind. Des Weiteren zeigt sich, dass, obwohl Gelatine auch ein Protein is...

Diskussion

Bei der Herstellung des Acrylamidgels copolymerisiert Gelatine mit der Acrylamidpolymermatrix. Folglich bleibt die copolymerisierte Gelatine im Gel immobilisiert und wandert während der Elektrophorese nicht, obwohl es sich um ein Protein handelt. Nach der Elektrophorese trennen sich die mit Desoxycholat und 6-Aminocapronsäurepuffer extrahierten nativen Proteine nach ihrer Masse und Ladung. Nach der Entfernung des SDS werden diese Proteine in Gegenwart von Triton X-100 renaturiert und erh...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
6-Aminocapronsäure	Merck	Nr. A2504
Essigsäure	Sigma	695092
Aceton	Sigma	32201
Acrylamid	Sigma	Nr. A-3553
Ammoniumpersulfat	Sigma	Nr. A-3678
Bis Acrylamid	Sigma	Nr. M7279
Rinderserumalbumin Fraktion V (BSA)	Sigma	Nr. A-8022
Bromphenol Blau	Sigma	Nr. B-8026
CaCl2	Merck	Nr. C4901
Coomassie brillantblau	Sigma	1.12553
Desoxycholat	Sigma-Aldrich	Nr. D6750
Ellinghausen– McCullough– Johnson– Harris (EMJH) medium, Difco	Difco	279410
Gelatine	Merck	Nr. G9382
Glycerin	Merck	Nr. G5516
Glycin G8790	Sigma	Nr. G-8898
Leptospira interrogans Serovar Copenhageni Stamm Fiocruz L1-130 (ATCC BAA-1198) , gepflegt im Biorepository des ICMR-RMRC Portblair	Gepflegt im Biorepository des ICMR-RMRC Port Blair		Optimale Wachstumstemperatur 30 & Grad; C
Magnesiumchlorid M8266	Sigma	M8266
Methanol	Sigma	17995-7
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung	Sigma	P4417
Werkzeug zum Trennen von Platten	Wunder Wedgle
Rotor	Thermowissenschaftlich	FIBERLite F15 8x50 Zylinder
Natriumdodecylsulfat (SDS)	Sigma	Nr. L-4396
TEMED	Sigma	T-9281
Triton X-100	Sigma-Aldrich	Nr. T8787
Trizma Basis (TRIS)	Sigma	Nr. T6066