Assemblierung und Quantifizierung von Co-Kulturen, die heterotrophe Hefe mit phototrophen zuckersezernierenden Cyanobakterien kombinieren

Zusammenfassung

Dieses Protokoll bietet eine umfassende Richtlinie für den Aufbau und die quantitative Überwachung von Co-Kulturen, einschließlich photoautotropher zuckersezernierender Cyanobakterien und heterotropher Hefen.

Zusammenfassung

Mit der steigenden Nachfrage nach nachhaltigen Biotechnologien werden Mischkonsortien aus einer phototrophen Mikrobe und heterotrophen Partnerarten als Methode für die solargetriebene Bioproduktion erforscht. Ein Ansatz beinhaltet die Verwendung von CO₂ -fixierenden Cyanobakterien, die organischen Kohlenstoff sezernieren, um den Stoffwechsel eines co-kultivierten Heterotrophen zu unterstützen, der den Kohlenstoff wiederum in höherwertige Waren oder Dienstleistungen umwandelt. In diesem Protokoll wird eine technische Beschreibung zur Unterstützung des Experimentators bei der Etablierung einer Co-Kultur bereitgestellt, die einen Saccharose-sezernierenden Cyanobakterienstamm mit einem oder mehreren Pilzpartnern, wie sie durch Modellhefearten repräsentiert wird, kombiniert. Das Protokoll beschreibt die wichtigsten Voraussetzungen für die Etablierung von Kokulturen: Die Definition der Medienzusammensetzung, die Überwachung der Wachstumsmerkmale einzelner Partner und die Analyse von Mischkulturen mit mehreren Arten, die im selben Wachstumsgefäß kombiniert sind. Grundlegende Labortechniken für die Überwachung von Co-Kulturen, einschließlich Mikroskopie, Zellzähler und Einzelzell-Durchflusszytometrie, werden zusammengefasst, und Beispiele für nicht-proprietäre Software zur Datenanalyse von FCS-Rohdateien (Flow Cytometry Standard) in Übereinstimmung mit den FAIR-Prinzipien (Findable, Accessible, Interoperable, Reusable) werden bereitgestellt. Schließlich wird ein Kommentar zu den Engpässen und Fallstricken gegeben, die häufig beim Versuch auftreten, eine Co-Kultur mit zuckersezernierenden Cyanobakterien und einem neuen heterotrophen Partner zu etablieren. Dieses Protokoll bietet eine Ressource für Forscher, die versuchen, ein neues Paar co-kultivierter Mikroben zu etablieren, das ein Cyanobakterium und eine heterotrophe Mikrobe umfasst.

Einleitung

Mit der raschen Verbreitung genomischer Werkzeuge und DNA-Technologien in den letzten Jahren sind biotechnologische Bemühungen zunehmend in der Lage, gemischte Gemeinschaften von Mikroben als geeignet für Bioproduktionsstrategien zu betrachten, anstatt sich nur auf axenische Kulturen zu konzentrieren. Mikrobielle Konsortien bieten im Vergleich zu Einzelkulturen mehrere potenzielle Vorteile, darunter Spezialisierung und Arbeitsteilung, Anpassungsfähigkeit und Robustheit sowie Effizienz der Substratausnutzung¹. Die vorhersagbare Entwicklung von Konsortien mit mehreren Arten wird jedoch durch Unsicherheiten erschwert, die durch Verhaltensweisen höherer Ordnung verursacht werden, die sich aus Interaktionen zwischen den Arten ergeben². Die speziesübergreifende Signalgebung und der Austausch von Metaboliten stehen im Mittelpunkt des Prinzips der Arbeitsteilung, führen aber auch zu unerwarteten Synergien und Antagonismen zwischen den Teilnehmern der Konsortien³. Eine beträchtliche Entwicklung auf diesem Gebiet ist notwendig, wenn das volle Potenzial gemischter mikrobieller Konsortien ausgeschöpft werden kann, einschließlich des Einsatzes flexibler 2- und 3-Partner-Co-Kulturplattformen, die zur besseren Charakterisierung und besseren Verstehung der mikrobiellen Interaktivität von "bottom up" verwendet werden können.

Einige dominante Arten von Co-Kulturplattformen sind derzeit in diesem Bereich im Einsatz, darunter komplementäre auxotrophe Partner und Mikroben, die Metaboliten absondern, die im Allgemeinen für ein breites Spektrum mikrobieller Spezies von Vorteil sind. In der letzteren Kategorie wurden Cyanobakterien durch die Einführung von Signalwegen, die zur Sekretion leicht verstoffwechselbarer Kohlenhydrate führen, zu verbesserten Primärproduzenten entwickelt und wurden nun in einer Vielzahl von rational gestalteten Konsortien erforscht. Kurz gesagt, in solchen manipulierten mikrobiellen Gemeinschaften ist der cyanobakterielle Partner in der Lage, Licht und CO₂ als primäre Inputs zu nutzen, und durch den Prozess der oxygenen Photosynthese können diese Stämme zentrale Kohlenstoffzucker als öffentliches Gut absondern. Eine Klasse solcher gentechnisch veränderten Cyanobakterienstämme sind solche, die so verändert wurden, dass sie das Disaccharid Saccharose⁴ sezernieren. Solche Stämme haben wahrscheinlich ihren Erfolg genossen, weil Saccharose ein Metabolit ist, der für viele Arten nahe am zentralen Kohlenstoffstoffwechsel liegt und auch häufig als sogenannter "kompatibler gelöster Stoff" hyperakkumuliert ist, um sich an eine Vielzahl von abiotischen Umweltbelastungen anzupassen⁵. Eine minimale Anzahl genetischer Eingriffe kann zu einer effizienten Saccharosesekretion in einer Reihe von cyanobakteriellen Modellorganismen führen⁴.

Saccharose-sezernierende Cyanobakterien sind eine nützliche Plattform für die Untersuchung rational gestalteter mikrobieller Konsortien, da ein breites Spektrum heterotropher Spezies Saccharose als ihre dominierende Kohlenstoff- und Energiequelle verstoffwechseln kann. In der Tat haben viele Laboratorien unter Verwendung einiger weniger Modell-Cyanobakterien mit Saccharose-sezernierenden Fähigkeiten rational gemischte Co-Kulturen und Konsortien entworfen, die eine oder mehrere heterotrophe Mikroben enthalten und die letztendlich durch die primären Einträge von Licht und CO₂ ohne Supplementierung von organischen Kohlenstoff-Rohstoffen unterstützt werden⁴. Die heterotrophen Stämme können sich einfach von den von Cyanobakterien abgeleiteten Kohlenhydraten ernähren oder sie können verwendet werden, um das Saccharose-Ausgangsmaterial in höherwertige Bioprodukte (z. B. Kraftstoffe, Polymere, Pigmente usw.) umzuwandeln. Solche vereinfachten Kokulturen sind nicht nur eine potenzielle Strategie für eine nachhaltige Bioproduktion, sondern können auch als Plattform für die Untersuchung neu auftretender Wechselwirkungen zwischen nicht verwandten mikrobiellen Arten nützlich sein.

Dieser Videoartikel befasst sich mit Methoden und Voraussetzungen für die Nutzung zuckerproduzierender Cyanobakterien als flexible Plattform für das Design einfacher mikrobieller Konsortien, die durch die Ergänzung von nur leichten und anorganischen Kohlenstoffeinträgen stabil sein können. Während der Aufbau und die Überwachung von Kulturen, die einzelne etablierte Mikroorganismen enthalten, meist unkompliziert sind und mit Hilfe der optischen Dichte (OD) oder der Rückstreumethode leicht zu erreichen sind, ist dies nicht möglich, sobald zwei oder mehr Organismen in einem Gefäß kombiniert werden. Der Hauptgrund dafür ist, dass diese Methoden nicht zwischen den verschiedenen Mikroorganismen unterscheiden, also nur ein Gesamtbild der Kultur liefern und das Wachstum der einzelnen Organismen nicht auflösen. Darüber hinaus haben Cyanobakterien ein breites Absorptionsspektrum im Bereich von 400-750 nm, so dass die Messung des OD₆₀₀ eines Heterotrophen aufgrund von Phycocyanin (das in 620 nm absorbiert) zu falschen Ergebnissen führen würde. Daher werden spezifische Protokolle für den Aufbau von Cyanobakterien-heterotrophen Mischgemeinschaften im Labor sowie nützliche generische Protokolle für die Analyse der Leistung dieser Konsortien im Zeitverlauf zur Verfügung gestellt. Während sich die Protokolle auf eine spezifische Paarung einer Modell-Cyanobakterienspezies mit einer oder mehreren heterotrophen Modellmikroben konzentrieren, besteht die Absicht dieser Arbeit darin, Forschern, die neue Speziespaarungen entwerfen möchten, eine Ressource zur Verfügung zu stellen und die Optimierungsphase für die Etablierung solcher Kulturen zu beschleunigen. Daher sind neben artspezifischen Protokollen auch Informationen und Strategien enthalten, die verwendet werden können, um diese Protokolle für benutzerdefinierte Gemeinschaften anzupassen und zu verallgemeinern, wie sie von den Bedürfnissen des Lesers definiert werden.

Aufgrund der hierin beschriebenen Flexibilität der Co-Kulturplattform werden Protokolle für eine Reihe verschiedener heterotropher Spezies beschrieben, die zuvor in Co-Kultivierung mit zuckersezernierenden Cyanobakterien berichtet wurden. So wird beispielsweise das Schritt-für-Schritt-Protokoll für eine Co-Kultur von Synechococcus elongatus PCC 7942 mit der gängigen Laborhefe Saccharomyces cerevisiae zur Verfügung gestellt. Der Artikel enthält jedoch auch Protokolle, die geeignet sind, um die Leistung von Co-Kulturen zu testen, die andere Modellarten enthalten, einschließlich der Hefeform von Ustilago maydis.

Der Artikel konzentriert sich auf einen Kernsatz von Protokollen, die für die Etablierung einer Cyanobakterien/heterotrophen Co-Kultur und eine grundlegende Charakterisierung der Leistung dieser gemischten Konsortien im Laufe der Zeit erforderlich sind. Insbesondere werden Einzelzell-Durchflusszytometrie- und Partikelzählmethoden, die für eine genaue Zählung verschiedener Spezies geeignet sind, sowie mikroskopische Ansätze zur Bewertung der Zellmorphologie hervorgehoben. Diese Protokolle sollen als Grundlage für die Anpassung an die Bedürfnisse und die verfügbaren Geräte dienen. Wichtig ist, dass technische Hinweise und andere Überlegungen, die für die Einrichtung und Überwachung von Co-Kulturen innerhalb des Labors wichtig sind, zur Verfügung gestellt werden. Schließlich sind Beispiele für nicht-proprietäre Alternativen für die Datenanalyse von FCS^6-Rohdateien mit Python-Paketen enthalten. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass das Ziel darin besteht, auf Cyanobakterien basierende Co-Kulturtechniken einem breiteren wissenschaftlichen Publikum zugänglicher zu machen.

Protokoll

HINWEIS: Dieses Protokoll enthält detaillierte Anweisungen zum Aufbau und zur Quantifizierung von Kokulturen von zuckersezernierenden S. elongatus und heterotrophen Modellhefearten. Im Allgemeinen ist das Protokoll auf alle Hefearten anwendbar, die für genetische Manipulationen geeignet sind.

1. Etablierung von Kokulturen, die phototrophe Cyanobakterien und heterotrophe Hefen kombinieren

1. Vorbereitungen für die Co-Kultivierung: Medien und Vorkultivierung
   HINWEIS: Bereiten Sie alle Medien und Stammlösungen mit ultrareinem gefiltertem Wasser vor. Alle Glaswaren (Messbecher, Messzylinder, Vorratsflaschen und Kultivierungskolben) sollten gereinigt und autoklaviert werden. Sterile Medien können bei Raumtemperatur (RT) gelagert werden. Es muss ein Gerät verfügbar sein, das mit den Anforderungen des photoautotrophen Anbaus kompatibel ist.
   1. Bereiten Sie das Co-Kulturmedium mindestens 3-4 Tage vor dem beabsichtigten Beginn der Co-Kultur vor. Die meisten Rezepturen für Co-Kulturmedien sind Variationen des gängigen BG-11-Mediums⁷ , das für die routinemäßige Kultivierung vieler cyanobakterieller Modellspezies verwendet wird. Dieses Protokoll verwendet das zuvor berichtete CoYBG-11-Medium als Beispiel (⁸; Siehe Tabelle 1). Das vorbereitete Medium wird je nach Bedarf im Autoklaven (121 °C, 20 min) oder mit dem Filter sterilisiert (0,22 μm Porengröße).
      HINWEIS: Im Abschnitt Diskussion finden Sie Vorschläge zur Anpassung eines Mediums, das für andere Artenpaarungen geeignet ist.
   2. Molekulare Reagenzien vorbereiten: Für die Induktion der cscB-Expression und des Saccharoseexports ^9,10,11 ist ein 1 M Vorrat an Isopropyl-β-thiogalactosid (IPTG) herzustellen.
      HINWEIS: Der Einsatz von Antibiotika während der Co-Kultur ist suboptimal, aber wenn alle Stämme Resistenzkassetten tragen, können sie verwendet werden. Bereiten Sie in diesem Fall Antibiotika-Vorräte entsprechend den Bedürfnissen der verwendeten Stämme vor.
   3. Bereiten Sie eine Cyanobakterium-Vorkultur vor: Mindestens 3 Tage vor Beginn der Co-Kultur werden Zellen aus einer Vorkultur des zuckersezernierenden Stammes von Cyanobakterien, die in BG-11-Medium wachsen, in einen frischen Kolben mit Blende übertragen, der^{CoY-BG-11-Medium} enthält (Tabelle 1).
      HINWEIS: Mehrere Spezies und Stämme von Cyanobakterien wurden inzwischen so verändert, dass sie Zucker absondern. Eine umfassende Übersicht über die zum Zeitpunkt der Erstellung dieses Artikels verfügbaren Stämme finden Sie unter⁴. In dieser Referenz sind auch heterotrophe Spezies aufgeführt (siehe 1.1.4), für die bereits über Cyanobakterien-Cokulturen berichtet wurde.
      1. Messen Sie den OD₇₅₀ der Vorkultur. Berechnen Sie das erforderliche Volumen der Vorkultur, um einen Ziel-OD₇₅₀ von 0,3 (C₁) zu erreichen, unter Verwendung der Gleichung V₁ = C₂ x V₂/C₁ , wobei C₂ = Ziel-OD, V₂ = Zielvolumen und V₁ = erforderliches Volumen der Vorkultur ist. Wenn beispielsweise eine 30-ml-Kultur (V₂) inokuliert wird, beträgt die Menge x der zu verwendenden Flüssigkultur V₁ (ml) = (0,3 x 30)/(gemessener OD₇₅₀).
         HINWEIS: Die optische Dichte ist eine Annäherung an die Zelldichte und hängt von den Wachstumsbedingungen und der Zellmorphologie ab. Daher ist es für Forscher notwendig, Methoden zur Korrelation der optischen Dichte mit der absoluten Zellzahl zu verwenden (siehe Abschnitte 2.1, 2.2 und 2.3), um die Leistung von Co-Kulturen angemessen bewerten zu können. Bei Cyanobakterien sollten Lichtwellenlängen innerhalb des photosynthetisch aktiven Spektrums (d. h. 400-700 nm) nicht zur Bestimmung der optischen Dichte verwendet werden, da sie von Chlorophyll und anderen Pigmenten absorbiert werden. Daher werden routinemäßig dunkelrote Wellenlängen verwendet (z. B. 750 nm).
      2. Inkubieren Sie die verdünnte Kultur in einem geeigneten Photoinkubator. Typische Inkubation
         Die Bedingungen für Modell-Cyanobakterien sind wie folgt: 30 °C, 150 U/min (25 mm Wurfweite), 2 % CO₂ -Kopfraum, ~200 μmol Photonen ^m-2·^{s-1 LED-Beleuchtung} , 75 % Luftfeuchtigkeit.
         HINWEIS: Eine Supplementierung mit CO₂ wird dringend empfohlen, um die Menge der freigesetzten Saccharose zu optimieren.
      3. Wiederholen Sie diesen Verdünnungsvorgang jeden Tag für mindestens 3 Tage, bevor Sie die Co-Kultur einrichten, um sicherzustellen, dass sich die Cyanobakterien in exponentiellem Wachstum befinden. Dies wird dazu beitragen, die Konsistenz der Co-Kulturleistung zwischen den verschiedentägigen Experimenten zu verbessern.
   4. Bereiten Sie mindestens 2 Tage vor Beginn der Co-Kultur eine heterotrophe Vorkultur vor. Wie bereits erwähnt, wurden eine Reihe von Hefearten und -unterstämmen bereits in Co-Kultur mit Cyanobakterien gezüchtet ^8,12,13.
      1. Zellen in einer Verdünnung von 1:100 (250 μl) aus einer Flüssigkultur der heterotrophen Spezies, die in einer reichhaltigen Kulturbrühe (siehe Tabelle 1) wachsen, werden in 50 mL CoY^BG-11-Medium , ergänzt mit 20 g/L, in einen 250 mL Isolierkolben überführt.
      2. Inkubieren Sie über Nacht bei der gleichen Temperatur wie die Kultivierungsbedingungen für den Cyanobakterien-Partner.
   5. OD₆₀₀ mindestens 24 Stunden vor dem vorgesehenen Zeitpunkt der Inokulation der Co-Kultur kontrollieren, um sicherzustellen, dass der heterotrophe Stamm für den Versuchsbedarf ausreichend gewachsen ist (siehe 1.2): erforderlichenfalls in frischem Medium verdünnen, um ein exponentielles Wachstum aufrechtzuerhalten.
2. Co-Kultur-Inokulation und -Pflege
   HINWEIS: Siehe den Abschnitt Diskussion für Überlegungen zum Impfverhältnis zwischen den photo- und heterotrophen Mikroorganismen.
   1. Zur Inokulation der Co-Kultur beide Vorkulturen durch Zentrifugation anreichern.
      1. Berechnen Sie das Volumen der konzentrierten Zellsuspension, um die gewünschte Ausgangsdichte für beide Spezies zu erreichen, unter Verwendung der Standardgleichung C₁ x V₁ = C₂ x V₂ , wobei C₁ = OD der angereicherten Kultur. Um beispielsweise eine 25-ml-Kultur von S. elongatus mit einem Anfangs-OD₇₅₀ von 0,5 (aus einer axenischen Kultur mit 1,5 OD) und S. cerevisiae mit einem Start-OD₆₀₀ von 0,05 (aus einer axenischen Kultur von 0,7 OD) herzustellen, werden auf der Grundlage der obigen Gleichung 8,33 ml S. elongatus-Startkultur und 1,79 ml angereicherte heterotrophe Kultur benötigt, und 14,88 mL CoY^BG-11 Medium.
      2. Zentrifugieren Sie die Kulturen mit 13.000 x g für 10 min bei RT. Unter sterilen Bedingungen den Überstand dekantieren und entsorgen.
         HINWEIS: Für die Pelletierung von S. cerevisiae kann eine geringere relative Zentrifugalkraft (RCF; xg) verwendet werden, da sie im Vergleich zu S. elongatus größere Zellen sind (2x-3x), aber achten Sie darauf, dass der Überstand transparent wird. Für die Sammlung der cyanobakteriellen Biomasse können ebenfalls weniger als 13.000 x g verwendet werden, dies würde jedoch eine längere Zeit für die Zentrifugation erfordern (z. B. können 4.000 x g für 20 min verwendet werden).
      3. Resuspendieren Sie das Cyanobakterien-Pellet in 25 ml sterilem CoY^BG-11-Medium . Unter den gleichen Zentrifugationsbedingungen wie zuvor wird der Überstand anschließend verworfen und dekantiert.
      4. Wiederholen Sie diesen Vorgang zweimal für S. elongatus und 4 weitere Male für S. cerevisiae.
         HINWEIS: Es ist wichtig, die Pellets von Cyanobakterien und Heterotrophen (S. cerevisiae) zu waschen, um Reste des Mediums zu entfernen. Da S. cerevisiae zuvor in Gegenwart von Saccharose gewachsen ist, wird durch die erhöhte Anzahl von Waschschritten sichergestellt, dass möglicher Restzucker entfernt wird.
      5. Sobald die OD überprüft ist, werden die Volumina von S. elongatus und S. cerevisiae in einem 250-ml-Kolben mit Blende unter sterilen Bedingungen kombiniert und CoY^BG-11 zu einem endgültigen Volumen von 50 ml hinzugefügt. Aus dem zuvor vorbereiteten 1 M IPTG-Bestand auf eine Endkonzentration von 1 mM verdünnen (dies soll die Cyanobakterien dazu veranlassen, Saccharose in das Medium zu exportieren). Für eine 50-ml-Kultur verwenden Sie 50 μl aus dem 1-m-IPTG-Stamm.
         HINWEIS: Leitkolben sind in der Regel besser, da sie eine bessere Belüftung und Durchmischung für Cyanobakterien bieten.
      6. Den Kolben aus dem vorherigen Schritt auf 200 μmol Photonen·^m-2·^{s-1 LED-Beleuchtung}, ergänzt mit 2 % CO₂ , bei 30 °C mit orbitalem Schütteln bei 150 U/min (25 mm Wurfweite) und 75 % Luftfeuchtigkeit aufstellen.
         HINWEIS: Die oben genannten Bedingungen können variieren und müssen auf der Grundlage des experimentellen Ergebnisses optimiert werden.
      7. Überwachen Sie das Wachstum der Kultur durch sterile Probenahme (1 ml) alle 12 h oder 24 h (siehe Abschnitt 2). Optional können die Proben zur Durchführung von Standard-Lebendzellmikroskopie und zur Bestimmung koloniebildender Einheiten (KBE¹⁴) von Hefezellen auf einem geeigneten Medium verwendet werden, um die Zellmorphologie und Fitness zu verfolgen und die Menge lebender heterotropher Zellen sowie die Kontamination zu überwachen.
         HINWEIS: KBE werden nicht als Methode zur Überwachung der genauen Zelldichte der Cyanobakterienspezies empfohlen, die beim Übergang von der Kultivierung im flüssigen zu dem festen Medium erheblichen Belastungen ausgesetzt sein können. Daher sollten Agarplatten mit einem für das Wachstum der Hefepartnerspezies geeigneten reichhaltigen Mediums, wie z. B. Hefeextrakt Pepton-Traubenzucker (YEPD)¹⁵, gewählt werden.

Chemische Verbindung	BG-11 (Konzentration mg/L)	CoY BG-11 (Konzentration mg/L)
NaNO3	1500	1500
K2HPO4	40	40
MgSO4,7H 2O	75	75
CaCl2 · 2H2O	36	36
Zitronensäure	6	6
Eisen(III)-Ammoniumcitrat	6	6
EDTA (Dinatriumsalz)	1	1
Na2CO3	20	20
Zusammensetzung von Spurenmetallen
H3BO3	2.86	2.86
ZnSO4,7H 2Ω	0.222	0.222
Co(NR.3)2 · 6H2T�	0.0494	0.0494
MnCl2,4H 2Ω	1.81	1.81
CuSO4 · 5H2Ω	0.079	0.079
NaMoO4·2H2Ω	0.39	0.39
Zusätzlich
HEPPSO	7160	7160
Hefestickstoffbase (YNB), ohne Aminosäuren, ohne Ammoniumsulfat	–	Tel.: 3608, 120013
Titrationsmittel pH 8,3	KOH	KOH
KPO3	–	118
Saccharose (nur für Heterotrophe)	–	13690

Tabelle 1: Medienzusammensetzung von BG-11 und CoY^BG-11. Die gegebenen Konzentrationen von Hefe-Stickstoff-Basenkonzentrationen in CoY^BG-11 stammen aus den veröffentlichten Ressourcen ^8,12,13.

2. Instrumente und Methoden zur Überwachung des Wachstums von Kokulturen

HINWEIS: Dieses Protokoll ist ein Leitfaden für die Analyse und Überwachung von Co-Kulturen, von einfachen, aber arbeitsintensiven Techniken wie Mikroskopie und Zählkammern bis hin zu Hochdurchsatzanwendungen wie Partikelzählern und Einzelzell-Durchflusszytometrie. Neben der eigentlichen Co-Kultur empfiehlt es sich, axenische Kulturen der einzelnen Mikroorganismen einzubeziehen, um eine umfassende Analyse zu ermöglichen. Bestimmen Sie als allgemeinen Ausgangspunkt für die Analyse die OD der Kulturen. In diesem Abschnitt werden verschiedene Methoden beschrieben, die verwendet werden können, um relative Maße der Zelldichte (d. h. OD) in absolute Werte der Zellzahl pro Volumen umzuwandeln. Die OD_750-Messung wird häufig zur Bestimmung der Zelldichte von Cyanobakterienkulturen (aufgrund der Absorption von 400-700 nm-Wellenlängen) verwendet, während die OD₆₀₀ für heterotrophe Organismen verwendet wird. Beide Messungen liefern ungefähre Richtwerte mit beliebigen Einheiten. Beachten Sie, dass die Werte zwischen den Instrumenten stark variieren können.

1. Mikroskopische Quantifizierung mit Zählkammern
   HINWEIS: Zählkammern (d.h. Neubauer (verbessert)/Hämozytometer) sind ein einfaches und kostengünstiges Mittel, um die Zusammensetzung von Co-Kulturen zu bestimmen, die aus Zellen bestehen, die morphologisch leicht unterschieden werden können. i.e.nach ihren Zellformen (Abbildung 1A). Es besteht aus einem dicken Glasobjektträger und einem Deckglas. Wenn das Deckglas richtig auf dem Objektträger positioniert ist, entstehen zwei Präzisionsvolumenkammern mit gravierten Gittern (Abbildung 1B-D). Durch das Zählen einer definierten Fläche eines Gitters kann die Zellkonzentration einer Suspension berechnet werden. Zählkammern sind in unterschiedlichen Tiefen erhältlich. Abhängig von der Zelldicke sollte eine geeignete Kammertiefe gewählt werden. Für Pilzzellen wie U. maydis oder S. cerevisiae, Eine Tiefe von 0,1 mm funktioniert gut. Diese Kammertiefe ist für kleinere Zellen wie Cyanobakterien zu groß, und die Zellen schwimmen in der Kammer. Eine Kammer mit einer Tiefe von 0,02 mm eignet sich sowohl für Cyanobakterien als auch für Co-Kulturen von Cyanobakterien und Pilzen.
   1. Stellen Sie sicher, dass die Zählkammer und das Deckglas frei von Staub und Zellen sind.
      HINWEIS: Die Reinigung mit 70% (v/v) Ethanol und fusselfreien Tüchern wird direkt vor der Anwendung empfohlen.
   2. Um das Deckglas richtig zu positionieren, schieben Sie es mit etwas Druck auf die beiden Stützstangen, aber seien Sie vorsichtig, um einen Bruch zu vermeiden.
      HINWEIS: Für diese Anwendung ist ein spezielles, dickes Deckglas erforderlich (siehe Kammerhandbuch). Da das Deckglas bei der Montage manchmal zerbricht, ist es gut, Ersatz zur Hand zu haben.
   3. Wenn das Deckglas richtig positioniert ist, beobachten Sie die sogenannten Newtonschen Ringe (Abbildung 1B) zwischen den beiden Glasoberflächen und dass das Deckglas nicht mehr verrutscht.
      HINWEIS: Ein sanfter Hauch des Deckglases vor der Montage verbessert oft das Ergebnis.
   4. Mischen Sie die Zellsuspension gründlich und tragen Sie einige Mikroliter (~2-10 μL je nach Kammertiefe) der Zellsuspension auf den Kammerrand auf und lassen Sie sie durch Kapillarkraft vollständig füllen. Verwenden Sie eine geeignete Verdünnung der Zellsuspension, um eine zuverlässige Zählung zu ermöglichen, z. B. 20 bis 200 Zellen pro großem Quadrat (Abbildung 1D, rotes Rechteck).
   5. Verwenden Sie ein geeignetes (z.B. 10x) Objektiv eines Lichtmikroskops (Hellfeld- oder Phasenkontrastmodus) und fokussieren Sie auf die Gitterlinien der Zählkammer. Für die Orientierung sorgt das Raster. Beginnen Sie mit dem Zählen der Zellen in den Quadraten, die für die angegebene Zellengröße geeignet sind.
      HINWEIS: Verwenden Sie ein technisches Hilfsmittel wie einen Handzähler oder eine geeignete Smartphone-Anwendung zum Zählen (z. B. allgemeiner "Dingzähler" oder spezielle Hämozytometer-Apps, die äußerst hilfreiche Funktionen bieten). Definieren Sie eine Regel für die Zählung von Zellen, die sich an den Rasterrändern befinden, um Doppelzählungen zu vermeiden. Beispielsweise können Zellen am oberen und linken Rand jedes Quadrats gezählt werden, während die Zellen am rechten und unteren Rand ausgeschlossen werden. Es gibt alternative Regeln¹⁶. Wird ein Fluoreszenzmikroskop verwendet, können die Zellen auch anhand ihrer Autofluoreszenz- oder Fluoreszenzmarker unterschieden werden.
   6. Ermitteln Sie nach dem Zählen, z. B. alle vier großen Quadrate in den Ecken, den Mittelwert für jeden Zelltyp. Mit diesen Mittelwerten, der Fläche des verwendeten Quadrats und der Tiefe der gegebenen Kammer (siehe Herstellerangaben) werden die Zellkonzentrationen berechnet (siehe Repräsentative Ergebnisse).
      HINWEIS: Je nach Zellengröße können unterschiedliche Quadrate zum Zählen verwendet werden. Für Hefe- und Cyanobakterienzellen funktionieren die vier großen Quadrate in den Ecken gut (Abbildung 1D, rotes Rechteck).
   7. Reinigen Sie die Kammer nach Gebrauch unter Berücksichtigung der Anforderungen der Proben (z. B. gentechnisch veränderte Organismen angemessen inaktivieren).
2. Quantifizierung mit Hilfe von Partikelzählern
   HINWEIS: Abhängig von den Eigenschaften der Zellen in einer Co-Kultur kann ein Partikelzähler angewendet werden, um die Zellzahlen der Partner zu bestimmen. Für die Anwendbarkeit dieser Methode müssen sich die Zellen stark in ihrer Größe unterscheiden; So kann z.B. eine Unterscheidung von Bakterien- und Hefezellen erreicht werden. Axenische Kulturen der einzelnen Mikroorganismen des Konsortiums müssen einbezogen werden, um eine Interpretation der Ergebnisse zu ermöglichen. Co-Kulturen, die Zellen ähnlicher Größe oder mehr als 2 Partner beherbergen, sollten mit der in den Abschnitten 2.1 oder 2.3 beschriebenen Methodik analysiert werden.
   1. Vorbereitungen
      1. Stellen Sie den OD der Kultur auf 0,1 ein und verdünnen Sie die Probe 1.000-fach mit einem isotonischen Messpuffer (siehe Gerätehandbuch) in einem Gesamtvolumen von 10 mL. Bereiten Sie technische Triplikate aller Proben vor.
      2. Wählen Sie eine geeignete Porengröße der Kapillare für das Experiment.
         HINWEIS: Die Porengröße sollte im Bereich der kleinsten Zellen in der Co-Kultur liegen, sollte aber auch die größeren Zellen umfassen. Gehen Sie nicht zu klein vor, da die Pore aufgrund der Zellaggregation, die durch die Zellteilung entstehen kann, verstopfen kann. Die verfügbaren Porengrößen unterscheiden sich. Eine Kapillare von 45 μm beginnt beispielsweise, Zellen mit einem Durchmesser von 0,7 μm zu erkennen (U. maydis und S. cerevisiae 3,5 μm-5,5 μm, S. elongatus/Synechocystis sp. ~1-2,5 μm).
   2. Quantifizierung von Zellen in einem Partikelzähler
      1. Starten Sie das Gerät. Führen Sie schließlich einen Selbsttest zur Qualitätskontrolle durch (konsultieren Sie das Handbuch des jeweiligen Geräts).
      2. Legen Sie die Proben in die Probenbecher, schließen Sie den Deckel und mischen Sie die Probe, indem Sie den Becher leicht kippen.
         HINWEIS: Versuchen Sie, Schaumbildung und Blasenbildung zu vermeiden. Verwenden Sie immer einen Becher für jede Messung. Die Becher können mehrfach gereinigt und wiederverwendet werden. Entsorgen Sie Tassen, wenn Rückstände vorhanden sind, die nicht entfernt werden können. Wenn die Probe längere Zeit im Becher verbleibt, mischen Sie sie vor der Messung erneut.
      3. Aufzeichnung in einem Bereich von 0-30 μm, da die Zellaggregate möglicherweise größer sind als die einzelnen Zellen.
         HINWEIS: Verwenden Sie zunächst jede der axenischen Kulturen der Co-Kulturpartner, um eine Vorstellung von der Größe der Zellen zu erhalten und festzustellen, ob sie anhand ihrer Größe unterschieden werden können.
      4. Bestimmen Sie nach der Auswertung auf die gleiche Weise die Zusammensetzung der Co-Kultur.
3. Quantifizierung des Konsortiums mittels Einzelzell-Durchflusszytometrie
   HINWEIS: Die Einzelzell-Durchflusszytometrie ist eine Hochdurchsatzmethode, die zur Bestimmung der Zellzahlen einzelner Partner in der Co-Kultur eingesetzt werden kann, da die Partner anhand ihrer Größe/ihrer Lichtstreueigenschaften und/oder Fluoreszenz unterschieden werden können. Wichtig ist, dass für die Etablierung der Methode axenische Kulturen der Co-Kulturpartner benötigt werden, um ihre Eigenschaften im Zytometer zu analysieren und die Populationstore entsprechend anzupassen. Für Stämme, die einen fluoreszierenden Reporter tragen, werden Stämme ohne den fluoreszierenden Reporter als Negativkontrollen benötigt. Eine grundlegende Vertrautheit mit Zytometeranwendungen erleichtert die erfolgreiche Implementierung des folgenden Protokolls^{17,18,19,20,21}. In diesem Beispiel wird ein künstliches Gemisch aus 3 Mikroorganismen analysiert (siehe Repräsentative Ergebnisse): Synechocystis (exprimiert einen zytosolischen Reporterfluorophor, mVenus) und die beiden Hefen S. cerevisiae und U. maydis. Für eine präzise Unterscheidung von S. cerevisiae und U. maydiswurden Fluoreszenzmarker in Form von zytoplasmatischem grün fluoreszierendem Protein (GFP) (U. maydis eGFP) und das rot fluoreszierende Protein (RFP) mKate2 (S. cerevisiae mKate2) unter Verwendung grundlegender molekularer Klonierungstechniken. Wenn möglich, sollten Stämme mit genomischer Integration von Reportern bevorzugt werden, um die Notwendigkeit eines kontinuierlichen Selektionsdrucks zu vermeiden.
   1. Probenvorbereitung
      1. Messen Sie den OD der Kulturen in einem bestimmten Wachstumsstadium, das analysiert werden soll.
      2. Stellen Sie den Außendurchmesser der Proben auf einen für die Messung geeigneten Bereich ein. Verwenden Sie einen ungefähren OD₇₅₀ von 0,05-0,5 für die Cyanobakterien und einen OD₆₀₀ von 0,2-1,5 für die Hefe unter Verwendung eines frischen Nährmediums (Endvolumen: mindestens 500 μL). Für Co-Kulturen streben Sie einen OD₇₅₀ zwischen ~0,1 und 0,5 an und notieren Sie den Verdünnungsfaktor. Für die Berechnung ist die Formel in Schritt 1.1.3.1 anzuwenden. Dadurch wird sichergestellt, dass die Zellzahl in einem Bereich von 1.000 - 10.000 Zellen/s bei einer Flussrate von 10 μL/min (entspricht 6.000 - 60.000 Zellen/μL) bleibt.
         HINWEIS: Zur Verdünnung können Medien oder Puffer ohne Autofluoreszenz und Partikel verwendet werden (z. B. BG-11). Seien Sie vorsichtig bei Medien, die komplexe Inhaltsstoffe wie Hefeextrakt enthalten, die sich bei der Messung als Partikel zeigen könnten.
      3. Übertragen Sie 300 μl jeder Probenzellensuspension in eine einzelne Vertiefung in einer 96-Well-Platte (standardmäßige runde Vertiefung, klarer Boden).
         HINWEIS: Alternativ können Sie 0,5-2 mL in ein Fluoreszenz-aktiviertes Zellsortierungsröhrchen (FACS) übertragen, wenn der halbautomatische Probenmodus anstelle des Plattenlesemodus verwendet wird.
   2. Messung in der Zytometrie
      1. Starten Sie das Zytometer und führen Sie das Startprogramm und die Qualitätskontrolle (QC) gemäß den Anweisungen des Herstellers durch.
      2. Beladen (Plattenlader oder halbautomatische Probenahme) und führen Sie die Proben durch. Beginnen Sie mit den Kontrollproben unter Verwendung der axenischen Kulturen jedes Co-Kulturpartners, um jede Spezies anhand ihrer Eigenschaften zu identifizieren, bevor Sie versuchen, sie in einer Co-Kulturprobe zu trennen.
      3. Offene Punktdiagramme und/oder Histogramme für die für die Proben relevanten Fluoreszenz- und Streukanäle (z. B. Vorwärtsstreuung [FSC] oder Seitenstreuung [SSC] Höhe [-H] oder Fläche [-A]).
      4. Suchen Sie nach der/den gewünschte(n) Zellpopulation(en) und passen Sie den Schwellenwert an, um technisches Rauschen und kleine Partikel aus dem Medium auszuschließen.
         HINWEIS: Es wird empfohlen, in einem Punktdiagramm von FSC-H über FSC-Breite oder FSC-H über SSC-H nach der Zellpopulation zu suchen und die Skala für kleine Zellen wie Bakterien (typischerweise 1-3 μm) von linear bis logarithmisch anzupassen. Legen Sie den Schwellenwert im FSC-H- oder SSC-H-Kanal fest. Für Zellen mit einem Durchmesser von weniger als 1 μm verwenden Sie für eine bessere Auflösung den violetten SSC (VSSC) im violetten Laser bei 405 nm.
      5. Stellen Sie die Verstärkung für jeden interessierenden Kanal manuell auf einen Bereich von 25 bis 2.500 ein. Passen Sie die Verstärkungen so an, dass die Negativkontrolle (z. B. ohne den Fluoreszenzmarker) in einem Bereich von 1 x 10^2-1 x 10³ und die Positivkontrolle (z. B. mit dem Fluoreszenzmarker) in einem Bereich von 1 x 10^5-1 x 10⁶ liegt, um die beste Trennung zu erzielen und innerhalb des Bereichs von 1 x 10^1-1 x 10⁷ zu bleiben.
         HINWEIS: Die Standardgewinne aus der Qualitätskontrolle können auch als gute Referenz beibehalten werden.
      6. Um die Zellkonzentration in der Probe zu bestimmen, erfassen Sie ein definiertes Probenvolumen mit der Aufzeichnungsfunktion (z. B. 10 μL bei einer Flussrate von 10 μL/min). Teilen Sie später die für dieses Volumen gemessenen Einzelzellzahlen durch das aufgezeichnete Volumen, um eine Zellzahl pro μl für jede Population zu erhalten.
         HINWEIS: Berücksichtigen Sie bei der Berechnung der Zellkonzentration in der Kultur/Probe den anfänglichen Verdünnungsfaktor.
   3. Gating/Selektion von Zellpopulationen
      HINWEIS: Unabhängig von dem Gerät, das zur Durchführung der Messungen verwendet wird, können die Analyse und das Gating in der Zytometer-Betriebssoftware oder in der kommerziellen Analysesoftware durchgeführt werden, wie unten dargestellt²². Darüber hinaus kann die Analyse von Durchflusszytometriedaten mit nicht-proprietärer Software effizient mit verschiedenen Open-Source-Tools wie FlowCytometryTools durchgeführt werden²³ oder FlowKit unter Verwendung von FlowUtils²⁴ Pakete in Python. Im Geiste der offenen Wissenschaft teilt dieses Protokoll ein beispielhaftes JupyterNotebook, das die Verwendung dieser Pakete für die grundlegende Datenexploration demonstriert. Natürlich kann auch alternative Software für die Durchführung von Bioinformatik in der Durchflusszytometrie geeignet sein.²⁵.
      1. Wählen Sie bestimmte Zellpopulationen aus, indem Sie in einem Punktdiagramm Gates um sie zeichnen oder Teiler- oder Liniensegmente um Peaks in einem Histogramm festlegen (Abbildung 4).
         HINWEIS: Die Auto-Gate-Funktion des Programms kann als Referenz verwendet werden.
      2. Trennen Sie die Signale für photo- und heterotrophe Organismen basierend auf der Autofluoreszenz des phototrophen Organismus (hauptsächlich durch Chlorophyll verursacht) im roten Bereich des Spektrums. Beispiel: Verwenden Sie das Histogramm des APC-H-Kanals (Anregung (z.B.) bei 638 nm, Emission (em.) bei 660/10 nm) und setzen Sie einen vertikalen Teiler zwischen dem rechten Peak (phototroph = Chlorophyll-Autofluoreszenz-positive Population) und dem linken Peak/en (heterotroph = Chlorophyll-Autofluoreszenz-negative Population) (Abbildung 4A).
         HINWEIS: Fluoreszierende Marker können auch verwendet werden, um zwei (oder mehr) phototrophe Partner innerhalb derselben Kultur zu unterscheiden (z. B. mVenus für Synechocystis).
      3. Trennen Sie die beiden heterotrophen Organismen anhand ihrer Fluoreszenzmarker oder Streueigenschaften (FSC, SSC, wenn möglich).
         HINWEIS: Die Trennung auf der Grundlage der Streueigenschaften ist nur anwendbar, wenn die Zellen z.B. eine unterschiedliche Zellgröße oder Morphologie aufweisen, die zu sichtbaren Veränderungen in der Streuung führt (z.B. Synechocystis: kugelförmige Zellen mit ~1,5-3 μm Durchmesser vs. U. maydis längliche Zellen mit einer Länge von 10 μm und etwa 1-2 μm Durchmesser²⁶).
      4. Beispiel: Verwenden Sie das Histogramm des FITC-H-Kanals (z. B. 488 nm, em.: 525/40 nm), das nur die "heterotrophe" Population anzeigt, um zwischen den heterotrophen Zellen, die GFP enthalten (z . B. U. maydis eGFP), und denen ohne GFP (z . B. S. cerevisiae RFP/mKate2) zu unterscheiden (Abbildung 4B). Alternativ können Sie das Histogramm des PC5.5-H-Kanals (z. B. 561 nm, em.: 710/50 nm) verwenden, das nur die "heterotrophe" Population anzeigt, um zwischen den heterotrophen Zellen, die RFP enthalten (z . B. S. cerevisiae RFP/mKate2), und den Zellen ohne RFP (z . B. U. maydis GFP) zu unterscheiden (Abbildung 4C).
         HINWEIS: Beachten Sie, dass zwei (oder mehr) verschiedene Zelltypen während der Messung "zusammenkleben" können. Diese "Dubletten" oder "Multipletts" können leicht in Punktdiagrammen beider Fluoreszenzmarker nachgewiesen werden (z. B. APC-H über FITC-H zur Identifizierung von Dubletten von phototrophen und GFP-markierten heterotrophen Partnern).
      5. Befolgen Sie für die grundlegende Datenanalyse in Python die Anweisungen in diesem Jupyter (https://git.rwth-aachen.de/computational-life-science/cytoflow).
         HINWEIS: Dieses Notebook unterstützt drei Schritte der Datenanalyse. i) Daten importieren: Import von FCS-Dateien. ii) Qualitätskontrolle durchführen: Überprüfen Sie die Datenintegrität und die Anzahl der Ereignisse. iii) Daten visualisieren: Verwenden Sie Diagramme wie Histogramme, Streudiagramme und Dichtediagramme, um Daten zu visualisieren. Darüber hinaus wird das Verfahren zum Durchführen von Gating zur Isolierung von interessierenden Populationen in Abbildung 4 gezeigt.
         Um die Analyse von Co-Kulturen in Langzeitprojekten zu erleichtern, wird dem Forscher empfohlen, die oben genannten Methoden zur Zählung der Zellzahlen zu verwenden und Standardkurven zu erstellen, um OD-Werte mit absoluten Zellzahlen zu vergleichen. Die optische Dichte ist ein relatives Maß, das je nach Spezies, Dehnung, Wachstumsbedingungen und Spektrometer variieren kann. Daher ist die Generierung von "hauseigenen" Standardkurven für die genaue Umrechnung von OD-Werten in Zellnummern notwendig.

Abbildung 1: Mikroskopische Quantifizierung morphologisch unterscheidbarer Zellen. (A) Eine Neubauer-Zählkammer. (B) Die Newtonschen Ringe zeigen die korrekte Positionierung des speziellen Deckglases an. (C) Schematische Darstellung der Kammerarchitektur mit dem zentralen Hohlraum mit definiertem Volumen für die Zellzählung. (D) Das Raster der abgebildeten Neubauer-Zählkammer besteht aus neun großen Quadraten mit einer Größe von 1^mm2 (rot). Die vier großen Quadrate in den Ecken sind weiter in 16 Quadrate unterteilt (blau). Das zentrale große Quadrat ist in 25 Gruppenquadrate mit einer Größe von 0,04 mm² (orange) unterteilt. Jedes Gruppenquadrat besteht aus 16 kleinsten Quadraten (grün). Die Zahl wurde auf Basis öffentlich zugänglicher Herstellerinformationen ermittelt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Ergebnisse

Etablierung von Co-Kulturen aus phototrophen S. elongatus und heterotrophen Hefen
Wir haben bereits über detaillierte Ergebnisse aus der Co-Kultivierung von Synechococcus elongatus PCC 7942 mit einer Vielzahl von Unterstämmen von S. cerevisiae berichtet. Eine umfassende Beschreibung der Co-Kulturergebnisse mit diesem Cyanobakterien/Hefe-Paar finden Sie unter⁸. Aus Gründen der Kürze und Genauigkeit werden diese Ergebnisse hier nicht wiedergegeben. Kurz gesagt, die bisherigen Ergebnisse weisen auf eine Reihe von Überlegungen hin, die für die Etablierung von Langzeit-Cyanobakterien-Hefe-Cokulturen wichtig sind. Von größter Bedeutung ist, dass die Fähigkeit der Hefe, unter Bedingungen zu überleben, unter denen Cyanobakterien die einzigen Formen von fixiertem Kohlenstoff liefern, stark von der Effizienz abhängt, mit der der Hefestamm Saccharose verwerten kann. S. cerevisiae-Stämme, die so entwickelt oder verändert wurden, dass sie Saccharose effizienter metabolisieren^27,28, überlebten mit größerer Wahrscheinlichkeit den Übergang in den Co-Kultur-Wachstumsmodus, erreichten höhere Zelldichten und zeigten eine höhere Robustheit in Langzeitexperimenten (Tage bis Wochen) cyanobakterieller Co-Kulturexperimente⁸. Die Anfangsphase der Inokulation einer Co-Kultur war besonders wichtig für die Lebensfähigkeit der Hefe, wahrscheinlich aufgrund von Belastungen durch die Verdünnung der Kultur, den Wechsel der Medienzusammensetzung und/oder den Entzug einer konzentrierteren Kohlenstoffquelle. Daher können Bemühungen, den Übergang von einem reichhaltigeren Wachstumsmedium zu einer minimalen Kohlenstoffverfügbarkeit zu Beginn der Co-Kultur zu erleichtern, die experimentelle Leistung und Konsistenz verbessern (siehe Schritt 1.2.1.1). Darüber hinaus zeigten S. cerevisiae Stressreaktionen, die mit Hyperoxie vereinbar sind, wenn sie in dichte Kulturen von S. elongatus inokuliert wurden, was mit der Bildung von O₂ als primärem Nebenprodukt der oxygenen Photosynthese übereinstimmt. Daher könnten Bemühungen, das übermäßige Wachstum des cyanobakteriellen Partners und/oder abwechselnde "Tag/Nacht"-Lichtzyklen zu verhindern, die Lebensfähigkeit von S. cerevisiae in Langzeit-Cokulturen erheblich verlängern. Im Abschnitt Diskussion finden Sie eine zusätzliche Zusammenfassung der Phänomene, die in Kokulturen im Vergleich zu axenischen Kontrollproben häufig auftreten.

Überwachung des Wachstums von Kokulturen mit verschiedenen Methoden
Im folgenden Abschnitt wird die exemplarische Quantifizierung eines künstlich gemischten dreigliedrigen Konsortiums aus Synechocystis und den beiden Hefen S. cerevisiae und U. maydis mit drei verschiedenen Methoden beschrieben. Für die Mischung wurden OD₇₅₀ (für Cyanobakterien) und OD₆₀₀ (für die Heterotrophen) von Einzelkulturen bestimmt und auf OD 0,1 angepasst. Einzelkulturen wurden in einem Verhältnis von 1:1:1 unter Verwendung der optischen Dichte (die sich von der Zellzahl unterscheidet, siehe oben) gemischt. Um die Unterscheidung der Hefen im Zytometer zu erleichtern, wurden Reporterstämme von gentechnisch veränderten S. cerevisiae FY1679-O1B²⁹ , die konstitutiv zytoplasmatisches mKate2 (Genotyp: URA3Δ/pTDH3::mKate2; Stamm: S. cerevisiae mKate2³⁰) produzieren, und U. maydis Stamm AB33³¹ , konstitutiv produzierendes eGFP (Genotyp: pep4Δ/pRpl40::egfp; Stamm: U. maydis eGFP³²)) verwendet wurden. Bemerkenswert ist, dass der Cyanobakterienstamm mit einem replikativen Plasmid ausgestattet war, das die konstitutive, starke Expression der gelb fluoreszierenden Proteinversion mVenus (Synechocystis sp. PCC 6803 pSHDY-Pcpc560-mVenus, Stamm Synechocystis mVenus, ähnlich³³) und weist darüber hinaus aufgrund des Vorhandenseins der Photosynthesemaschinerie die typische starke Autofluoreszenz auf.

Mikroskopische Quantifizierung mit Zählkammern: Alle Zelltypen in der verwendeten künstlichen Mischung aus drei Mikroorganismen lassen sich mikroskopisch leicht unterscheiden (Abbildung 2A): Synechocystis und S. cerevisiae sind durch kugelförmige Zellen vertreten, die sich jedoch in ihrem Durchmesser stark unterscheiden (Synechocystis: ca. Durchmesser von 1,5-3 μm, S. cerevisiae: ca. Durchmesser von 3-6 μm), während U. maydis-Zellen eine längliche, zigarrenförmige Morphologie und eine Länge von mindestens 10 μm aufweisen (Abbildung 2A). Diese eindeutigen morphologischen Merkmale ermöglichen eine genaue Quantifizierung jedes Partners in der Mischung. Als anschauliches Beispiel werden 37, 18, 36 und 21 S. cerevisiae-Zellen in den jeweils vier großen Quadraten gezählt (Abbildung 2B). Der Mittelwert liegt bei 28 Zellen. Da ein großes Quadrat des verwendeten Hämozytometers eine Fläche von 1^mm2 hat und die Kammertiefe 0,02 mm betrug, ergeben sich 28 Zellen pro 0,02 μL. Dies entspricht 1.400 Zellen/μL, was 1,4 x 10⁶ Zellen/ml entspricht. Die anderen Zelltypen wurden gezählt und die Konzentrationen entsprechend bestimmt (Abbildung 2C, Tabelle 2).

Abbildung 2: Mikroskopische Quantifizierung eines dreigliedrigen Konsortiums bestehend aus Synechocystis und den Hefen S. cerevisiae und U. maydis. (A) Mikroskopisches Differenzkontrastbild (DIC) einer künstlich kombinierten Mischung der angegebenen Mikroorganismen. Alle Arten lassen sich leicht anhand ihrer Morphologie unterscheiden. Maßstabsbalken: 10 μm. (B) Beispielhafte Zählergebnisse für eine künstlich zusammengesetzte Mischung der angegebenen Stämme auf der Grundlage axenischer Kulturen mit einem OD von 0,1. Die vier großen Quadrate an den Gitterkanten wurden analysiert (rote Markierung in Abbildung 1D). (C) Der Mittelwert der verschiedenen Zellen, die in den vier Quadraten gezählt wurden, wurde verwendet, um die Konzentration der Zellen in der Suspension unter Verwendung der folgenden Gleichung zu berechnen: Mittelwert/(Kammertiefe [0,02 mm] x Größe des gezählten Quadrats [1 mm²] x 1.000). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Quantifizierung mit Partikelzählern: Partikelzähler bestimmen die Anzahl der Partikel in einer Suspension in Abhängigkeit von ihrer Größe. Im Beispieldatensatz wurde ein Partikelzähler mit einer 45 μm Kapillare verwendet. Da S. cerevisiae - und U. maydis-Zellen ähnliche Abmessungen aufweisen, können sie im Partikelzähler nicht unterschieden werden, während die kleineren Synechocystis-Zellen eindeutig voneinander getrennt werden können. Die Analyse von Einzelkulturen zeigt daher Peaks an identischen Positionen, bezogen auf 3 bis 6 μm für die beiden Hefen (Abbildung 3A). Während der Messung wird ein Unterdruck angelegt, der dazu führt, dass die Zellen in die Kapillare gelangen. Dadurch wird der elektrische Widerstand kurzzeitig verändert, so dass das Gerät anhand der Veränderung die Partikelgröße bestimmen kann. In der Mischkultur können zwei unterschiedliche Peaks nachgewiesen werden, von denen einer mit den kleineren Cyanobakterienzellen assoziiert ist und der andere eine gemeinsame Fraktion der beiden Hefearten darstellt (Abbildung 3B). Wichtig ist, dass zusätzlich zu den Peaks, die die lebenden Zellen widerspiegeln, zusätzliche Peaks bei etwa 1 μm (Abbildung 3) detektiert wurden, die Zelltrümmern und kleineren Partikeln entsprechen. Signale, die bei größeren Durchmessern als erwartet auftreten würden, können durch Zellaggregationen verursacht werden. Bemerkenswert ist, dass die Form der Peaks die Homogenität der Zellen widerspiegelt: Ein scharfer Peak zeigt sehr homogene Zellen, was für eine Co-Kultur unwahrscheinlich ist. In einer Co-Kultur ist mit einem sehr breiten Peak oder sogar zwei Peaks zu rechnen, wenn die Partner der Co-Kultur deutlich unterschiedlich groß sind. Für die axenischen Kulturen heterotropher Pilze könnte der Peak ein mittelbreiter Peak sein.

Abbildung 3: Quantifizierung eines dreigliedrigen Konsortiums bestehend aus Synechocystis mVenus und den Hefen S. cerevisiae mKate2 und U. maydis eGFP mit Hilfe eines Partikelzählers. (A) Visuelle Ausgabe der Analysen von axenischen Kulturen der drei Stämme, wie in den Grafiken dargestellt (Zellzähler mit 45 μm Kapillare). (B) Beispielhafte visuelle Ausgabedatei für die Analyse des künstlichen dreigliedrigen Konsortiums unter identischen Bedingungen. Der Partikelzähler unterstützt nicht die Unterscheidung der beiden Hefearten, die beide durch den zweiten Peak repräsentiert werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Quantifizierung mittels Einzelzellzytometrie: Mit dem Einzelzell-Durchflusszytometer können die verschiedenen Zellpopulationen anhand ihrer (Auto-) Fluoreszenz- und Lichtstreueigenschaften leicht unterschieden werden. Phototrophe Zellen (Synechocystis) können von heterotrophen Zellen (U. maydis und S. cerevisiae) anhand der roten Autofluoreszenz der photosynthetischen Pigmente unterschieden werden, die im APC-H-Kanal gemessen wird (Abbildung 4A). Basierend auf dieser anfänglichen Trennung von phototrophen und heterotrophen Zellen können die beiden heterotrophen Populationen anhand ihrer Fluoreszenzmarker eGFP im FITC-H-Kanal und mKate2 im PC5.5-Kanal unterschieden werden (Abbildung 4B,C). In einem Punktdiagramm, das die Streueigenschaften aller drei Populationen (FSC-H und FSC-Width) zeigt, können die Populationen auch mit nur geringfügigen Überlappungen der Populationen unterschieden werden (Abbildung 4D).

Mit dieser Methode wurden 10 μL der verdünnten Proben mit einer Flussrate von 10 μL/min analysiert, was eine Quantifizierung von ca. 70.000 Zellen in 1 min ermöglichte. Etwa 60 % dieser Zellen konnten Synechocystis zugeordnet werden (4,23 x 10⁶ Zellen/ml), während die restlichen 40 % gleichmäßig auf U. maydis (1,35 x 10⁶ Zellen/ml) und S. cerevisiae (1,36 x 10⁶ Zellen/ml, Abbildung 4E, Tabelle 2) verteilt waren.

Abbildung 4: Quantifizierung eines dreigliedrigen Konsortiums bestehend aus dem Cyanobakterium Synechocystis mVenus und den Hefen U. maydis eGFP und S. cerevisiae mKate2 mittels Einzelzell-Durchflusszytometrie. Beispieldiagramme nach Messung einer Mischkultur von Synechocystis mVenus (dunkelgrün), U. maydis eGFP (hellgrün) und S. cerevisiae mKate2 (rot) in einem Verhältnis von 1/3 OD₇₅₀ / 1/3 OD₆₀₀ / 1/3 OD₆₀₀ auf einem Zytometer (A) mit einem Histogramm der Ereigniszahl und der Fluoreszenz im APC-H-Kanal (z. B. 638 nm, Em.: 660/10 nm) aller Zellen, die zur Unterscheidung von phototrophen und heterotrophen Zellen anhand ihrer Autofluoreszenz verwendet werden. (B) Ein Histogramm der Ereigniszahl und der Fluoreszenz im FITC-H-Kanal (z. B. 488 nm, em.: 525/40 nm) aller heterotrophen Zellen, die zur Unterscheidung von U . maydis eGFP- und S. cerevisiae mKate2-Zellen auf der Grundlage ihrer grünen Fluoreszenzeigenschaften verwendet werden. (C) Ein Histogramm der Ereigniszahl und der Fluoreszenz im PC5,5-H-Kanal (z. B. 561 nm, em.: 710/50 nm) aller heterotrophen Zellen, die zur Unterscheidung von U . maydis eGFP- und S. cerevisiae mKate2-Zellen auf der Grundlage ihrer roten Fluoreszenzeigenschaften verwendet werden. (D) Ein Punktdiagramm der Streusignale in der FSC-Breite über dem FSC-H-Kanal, das zur Identifizierung der Zellpopulationen ohne Fluoreszenzeigenschaften verwendet wird. (E) Die Populationsstatistik einschließlich der Ereigniszahlen, Prozentsätze sowie arithmetischen Mittelwerte und Standardabweichungen (SD) der relevanten Fluoreszenzkanäle. Die Gesamtmenge der Zellen, zusammen mit ihrer Größe und Fluoreszenz, wurde in einem Volumen von 10 μL mit einer Flussrate von 10 μL/min bestimmt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Um den Output der verschiedenen Quantifizierungsmethoden vergleichend zu visualisieren, werden die ermittelten Zellzahlen in den folgenden beiden Tabellen (Tabelle 2 und Tabelle 3) dargestellt. Die Endkonzentrationen von Zellen, die mit den drei zuvor beschriebenen Methoden bestimmt werden, liegen bei allen Methoden in einem ähnlichen Bereich. Das Zytometer liefert die höchste Probengröße, gefolgt vom Partikelzähler und der mikroskopischen Quantifizierung, mit einer Abnahme von etwa einer Größenordnung zwischen den Methoden.

Co-Kultur 1:1:1		Photometer	Zytometer		Partikel-Zähler		Zählkammer für Mikroskopie
Organismus		AD750/600	Zellzahl	Zellen/ml	Zellzahl	Zellen/ml	Zellzahl	Zellen/ml
Saccharomyces cerevisiae mKate2		0.0333	13,618	1,36 x 106 cm	1,546*	2,58 x 106*	112	1,40 x 106 cm
Ustilago maydis eGFP		0.0333	13,541	1,35 x 106 cm			89	1,11 x 106 cm
PCC 6803 mVenus		0.0333	42,330	4,23 x 106 cm	3,094	5,16 x 106 cm	271	3,39 x 106 cm

Tabelle 2: Vergleich der verschiedenen Quantifizierungsmethoden: Künstliche Mischkultur. Beachten Sie, dass U. maydis und S. cerevisiae nicht mit einem Partikelzähler (*) unterschieden werden können.

Einheitliche Kultur		Photometer	Zytometer		Partikel-Zähler		Zählkammer für Mikroskopie
Organismus		AD750/600	Zellzahl	Zellen/ml	Zellzahl	Zellen/ml	Zellzahl	Zellen/ml
Saccharomyces cerevisiae mKate2		0.1	38,936	3,89 x 106 cm	1,928	3,21 x 106 cm	403	4,03 x 106 cm
Ustilago maydis eGFP		0.1	36,927	3,69 x 106 cm	2,465	4,11 x 106 cm	307	3,07 x 106 cm
PCC 6803 mVenus		0.1	127,864	1,28 x 107 cm	8,186	1,36 x 107 cm	428	1,07 x 107 cm

Tabelle 3: Vergleich der verschiedenen Quantifizierungsmethoden: Kalibrierung mit Einzel-/Axenkulturen.

Diskussion

Der Umgang mit Mikroorganismen in einzelnen axenischen Kulturen im Laborkontext ist seit Jahrzehnten für viele mikrobielle Modelle etabliert. Doch obwohl die vorherrschende Lebensform in der Natur mikrobielle Gemeinschaften sind, ist die Kombination von zwei oder mehr Partnern in einem einzigen Kultivierungsgefäß weniger etabliert, und Herausforderungen ergeben sich aus Lücken im bestehenden Wissen und in der Methodik. Es ist auch schwieriger, das Verhalten von Zellen in einer Gemeinschaft vorherzusagen, da emergente Interaktionen und Metabolitenaustausch zwischen den Zellen auftreten, die das Schicksal der Co-Kultur stark beeinflussen^34,35. Daher ist die Etablierung von Kokulturen nicht trivial, auch nicht auf der Ebene der Definition von Wachstumsmedien, der Identifizierung gemeinsamer Wachstumsbedingungen, des Austauschs von Spurenmetaboliten/-signalen zwischen den Spezies und der daraus resultierenden Zusammensetzung der Kokultur im Laufe der Zeit. Die Fortschritte der letzten Jahre bei der Assemblierung von phototrophen, zuckersezernierenden Cyanobakterien mit heterotrophen Partnern erlauben es nun, erste Regeln und Methoden abzuleiten, die eine hilfreiche Richtlinie für das Design neuartiger Co-Kultivierungspaare liefern können. Basierend auf diesen Erkenntnissen wird im ersten Teil dieses Protokolls eine Schritt-für-Schritt-Anleitung für den Zusammenbau von Co-Kulturen gegeben, die ein Saccharose-Sekretionscyanobacterium und eine oder mehrere Hefen enthalten.

Eine wichtige Überlegung beim ersten Versuch, eine Co-Kultur zwischen nicht verwandten Mikroben zu etablieren, ist die Zusammensetzung eines gemeinsamen Wachstumsmediums, das alle Nährstoffanforderungen für die zwei oder mehr Arten erfüllt. Aus Platzgründen ist es nicht möglich, hier ein vollständig detailliertes Protokoll für diesen Prozess bereitzustellen, der in einigen Fällen auch ein hohes Maß an Anpassung erfordern kann, aber stattdessen skizziert das Folgende wichtige Überlegungen, die zu beachten sind. Ein einfacher erster Ansatz besteht darin, das typische cyanobakterielle Wachstumsmedium (z. B. BG11; siehe Tabelle 1) mit allen etablierten minimalen Medien zu vergleichen, die für die heterotrophe Spezies von Interesse zusammengesetzt sind. Die Ergänzung des Standard-Cyanobakterienmediums mit fehlenden Bestandteilen, die im heterotrophen Minimalmedium enthalten sind, ist ein guter Ausgangspunkt für erste Tests ^8,36. Denken Sie daran, dass minimale Medien oft mit einer signifikanten organischen Kohlenstoffquelle für heterotrophes Wachstum (z. B. 1 % bis 4 % Glukose) ergänzt werden, so konzipiert sind, dass sie eine höhere heterotrophe Zelldichte unterstützen, als dies wahrscheinlich in ersten Co-Kulturexperimenten erreicht wird. Ebenso können einige gängige Mediumkomponenten unabhängig von der Photosynthese, die vom Cyanobakterienpartner (z. B. Citrat) bereitgestellt wird, auch als organische Kohlenstoffquelle fungieren, was die spätere Analyse von Cyanobakterien/heterotrophen Cokulturen erschweren kann. Daher ist es bei der Entwicklung eines Co-Kulturmediums möglicherweise nicht erforderlich, das minimale Cyanobakterienmedium mit der vollen Konzentration der fehlenden Elemente zu ergänzen. Zum Beispiel variieren viele Organismen in ihrer Effizienz bei der Verwendung verschiedener Formen von Umweltstickstoff (z. B. N₂, Nitrat, Nitrit, Harnstoff) und sind möglicherweise völlig unfähig, einige der stärker oxidierten Stickstoffquellen zu nutzen. In ähnlicher Weise benötigen viele Mikroben möglicherweise eine Supplementierung mit essentiellen Vitaminen (z. B. Vitamin B₁₂), Co-Faktoren oder essentiellen Aminosäuren, da ihnen vollständige Biosynthesewege für die direkte Synthese dieser Verbindungen fehlen. Aus diesen Gründen kann es am praktischsten sein, damit zu beginnen, einfach das etablierte Minimalmedium des Cyanobakterienpartners (z. B. BG11) mit einem wohldefinierten Minimalmedium des Heterotrophen (z. B. synthetisch definiertes [SD]) zu "verschmelzen". Spätere Zyklen des wiederholten Entfernens/Reduzierens überflüssiger Komponenten können verwendet werden, um das Medium zu optimieren und die Häufigkeit von Verbindungen zu reduzieren, die für das Wachstum eines der Partner hemmend sein könnten. Ein nützlicher Ausgangspunkt ist die Pufferung des Mediums bei einem neutralen oder leicht basischen pH-Wert, da dies Bedingungen sind, die von den meisten Cyanobakterien-Modellarten bevorzugt werden.

An dieser Stelle ist es oft hilfreich, Vorversuche zum Wachstum des gestützten Heterotrophen im neuen Co-Kulturmedium durchzuführen, wenn ein Überschuss an Saccharose zugeführt wird. Natürlich ist es bei der Auswahl eines potentiellen Heterotrophen wichtig, eines auszuwählen, das in der Lage ist, die primäre(n) Quelle(n) für organischen Kohlenstoff, die vom Cyanobakterienpartner geliefert werden, zu katabolisieren. Es ist nützlich zu beachten, dass Saccharose als dominierendes Kohlenhydrat, das in vielen gentechnisch veränderten cyanobakteriellen/heterotrophen Kulturen geliefert wird⁴, kein Kohlenhydrat ist, das von heterotrophen Mikroben so universell verwertet wird wie Glukose: Dedizierte Saccharosetransporter müssen von den heterotrophen Spezies kodiert werden, oder extrazelluläre Invertasen können notwendig sein, um Saccharose in Fruktose und Glukose umzuwandeln, die oft von Transportern mit höherer Affinität erkannt werden⁸. Eine wichtige Beobachtung, die häufig von mehreren Laboratorien berichtet wird, die gemischte mikrobielle Gemeinschaften erforschen, ist, dass Synergien und Antagonismen höherer Ordnung zwischen den phototrophen und heterotrophen Partnern entstehen ^4,8,13. Zum Beispiel können andere natürlich sekretierte Metaboliten (z. B. organische Säuren, reduzierte Formen von Stickstoff) oder Co-Faktoren (z. B. Siderophore) höhere Wachstumsraten eines oder beider Partner ermöglichen, wenn sie im selben Medium im Vergleich zu axenischen Kontrollen kultiviert werden. Umgekehrt wurde berichtet, dass potenziell schädliche metabolische Nebenprodukte, wie z. B. die Hyperoxygenierung des Mediums durch photosynthetische Wasserspaltung, eine Hemmung des Wachstums zwischen den Spezies bei einem oder beiden Partnern verursachen⁸. Daher können axenische Kontrollen einen nützlichen Benchmark liefern, aber die Leistung der Co-Kultur kann aufgrund dieser emergenten Eigenschaften von den Erwartungen abweichen.

Abhängig vom heterotrophen Partner und der Fähigkeit von S. elongatus, Saccharose auszuscheiden (basierend auf dem Induktionsniveau, der verwendeten IPTG-Konzentration), sollten unterschiedliche Verhältnisse beider Organismen getestet werden. Der Erfolg der Kulturen hängt in erster Linie von der Fähigkeit von S. elongatus ab, das Wachstum des heterotrophen Partners aufrechtzuerhalten (d.h. ob er genügend Kohlenstoffquelle produzieren kann). Während das Überwachsen des heterotrophen Stammes typischerweise durch den Mangel an organischem Kohlenstoff in der Zusammensetzung des Co-Kulturmediums begrenzt ist, können Cyanobakterien die heterotrophen überholen, was zu emergenten inhibitorischen Wechselwirkungen führen kann (z. B. hyperoxische Bedingungen ^8,13). Beim Versuch, zunächst geeignete Verhältnisse der Zelldichte für die Cyanobakterium-Hefe zu bestimmen, ist eine gute Näherungsregel, dass der cyanobakterielle Partner ein gleiches Zellvolumen der begleitenden heterotrophen Zellen tragen kann. Da eukaryotische Hefen dazu neigen, ein erheblich größeres Zellvolumen zu haben als Modell-Saccharose-sezernierende Cyanobakterien, könnte dies wahrscheinlich bedeuten, dass die Dichte der Cyanobakterienzellen im stationären Zustand erheblich höher ist (z. B. 50-100-fach für S. cerevisiae). Ein guter Ausgangspunkt für den Aufbau einer neuen Co-Kultur mit den forscherspezifischen Labor- und Speziesbedingungen wäre daher die Berechnung des durchschnittlichen Zellvolumens sowohl für das Cyanobakterium als auch für die Hefe (basierend auf veröffentlichten Werten; siehe z.B. B10NUMB3R5³⁷), um das volumetrische Verhältnis abzuschätzen. Anfangskolben können mit diesem Zellverhältnis besiedelt werden. Um den Lösungsraum zu erforschen, möchte der Forscher möglicherweise die Konzentration der Cyanobakterien konstant halten (z. B. OD₇₅₀ = 0,3), während er die Konzentration der Hefezellen in Schritten um etwa eine Größenordnung nach oben oder unten variiert, basierend auf dem Durchsatz, der durch den verfügbaren phototrophen Kultivierungsraum des Forschers zugelassen wird. Natürlich hängt diese volumetrische "Faustregel" davon ab, mit welcher Geschwindigkeit der phototrophe Partner in der Lage ist, organische Photosynthesen (z. B. Saccharose) zu sezernieren, die vom heterotrophen Partner verwertet werden können. Sobald die Bedingungen für die Co-Kultur etabliert sind, wird eine sorgfältige Überwachung der Wachstumsleistung beider Partner im Laufe der Zeit wertvolle Daten über die idealen Artenverhältnisse liefern, insbesondere wenn frühe Co-Kulturen über Tage bis Wochen aufrechterhalten werden können, wodurch der Forscher das gegen Ende einer Co-Kultur erreichte Steady-State-Verhältnis identifizieren kann. Diese Informationen können bei der Auswahl der anfänglichen Inokulationsdichte für jede Partnerspezies in nachfolgenden Experimenten genutzt werden, um der Kultur zu helfen, schneller das selbstbestimmte ideale Speziesverhältnis zu erreichen.

Im zweiten Teil des Protokolls werden detaillierte Anweisungen für die Co-Kultur-Analytik gegeben. Eine zuverlässige Quantifizierung der Co-Kulturen ist der Schlüssel zu ihrer erfolgreichen Implementierung: Das Wachstum (oder zumindest die metabolische Aktivität) des phototropen, kohlenstoffsezernierenden Partners ist essentiell für den Erhalt der Heterotrophen. Während das Verhältnis von Cyanobakterien zu Heterotrophen, das zur Inokulation der Kultur verwendet wird, nicht immer entscheidend für die Optimierung ist, da längerfristige Co-Kulturen dazu neigen, sich in Richtung stabiler Proportionen zu konvergieren, kann es wichtig sein, Methoden zu integrieren, um das ungehinderte Wachstum eines Partners durch Kulturverdünnung oder Verkapselung einer oder mehrerer Spezies zu kontrollieren 36,38,39,40. Wie oben erwähnt, können Nebenprodukte des cyanobakteriellen Partners bei hohen Konzentrationen (z. B. O₂) für das Heterotrophe hemmend sein, und einige Produkte des heterotrophen Stoffwechsels können auch schädlich für die Gesundheit der Cyanobakterien sein. Die meisten veröffentlichten Co-Kulturen verwenden Heterotrophe, die eine schnellere Wachstumsrate aufweisen als die meisten Modell-Cyanobakterienarten; Daher wird die heterotrophe Wachstumsrate tendenziell durch die Zufuhr von organischem Kohlenstoff begrenzt, der vom Cyanobakterium produziert wird. Nichtsdestotrotz ist die Bestimmung der Dynamik der Artenhäufigkeit über die Zeit ein kritischer Wert für die Aufklärung von Stabilitätsfehlern und die Optimierung für robuste Kokulturen in der Langzeitkultivierung.

Protokolle für die Quantifizierung mit Zählkammern, Partikelzählern und Einzelzell-Durchflusszytometrie werden bereitgestellt. Alle Techniken sind wertvolle Werkzeuge für die Charakterisierung von Co-Kulturen, jedoch mit unterschiedlichen Voraussetzungen, Vorteilen und Einschränkungen. Zählkammern sind sehr breit für die Quantifizierung von Co-Kulturen anwendbar, vorausgesetzt, dass alle Partner in der Kultur visuell durch ihre Zellformen oder andere Eigenschaften unterschieden werden können. Der große Vorteil ist der niedrige Preis dieses Geräts, so dass es grundsätzlich für jedes Labor erreichbar ist. Neben Informationen über die Zusammensetzung der Co-Kultur und das Verhältnis der verschiedenen Partner kann ein Eindruck über die Morphologie und Fitness der Zelle gewonnen und potenzielle Schadstoffe nachgewiesen werden. Allerdings ist der Einsatz der Zählkammer auch sehr zeitaufwendig, mit einem hohen Arbeitsaufwand verbunden und kann nur einen geringen Durchsatz unterstützen.

Sowohl Partikelzähler als auch Einzelzell-Durchflusszytometrie bieten die enormen Vorteile eines hohen Durchsatzes und einer bequemen, zeitsparenden Handhabung. Während der Zellzähler auf deutlichen Unterschieden in der Zellgröße der Partner in der Co-Kultur beruht, kann die Einzelzellzytometrie auch Fluoreszenzmarkierungen unterscheiden, was dazu führt, dass Co-Kulturen mit mehr als zwei Mitgliedern der gleichen Größe oder sogar zwei verschiedenen Mutanten desselben Organismus anhand unterschiedlicher Fluoreszenzmarker quantifiziert werden können. In dem vorliegenden Beispiel einer künstlichen Assemblierung von Synechocystis mit S. cerevisiae und U. maydis wurden die intrazellulären Fluoreszenzreporter mKate2 und eGFP zur Unterscheidung der beiden Hefen verwendet. Dieselben fluoreszierenden Reporter könnten auch verwendet werden, um zwei genetisch veränderte Stämme desselben Organismus (z. B. S. cerevisiae) zu unterscheiden, die nicht allein aufgrund ihrer Lichtstreueigenschaften getrennt werden konnten. Ähnliche Strategien wurden implementiert, um synthetische Bakterienkonsortien^{zu verfolgen 41}. Abhängig vom Zelltyp, der Anzahl der Partner in einem Konsortium und ihrem potenziellen Bereich der Autofluoreszenz(en) erfordert die Auswahl der Fluoreszenzmarker besondere Aufmerksamkeit, um eine Überlappung der spektralen Qualitäten zu vermeiden, insbesondere angesichts der autofluoreszierenden Eigenschaften von Cyanobakterien. ⁴²

Wir plädieren hier dafür, wie die FAIR-Leitprinzipien in Bezug auf die Speicherung, das Management und den Austausch wissenschaftlicher Daten eingehalten werden können. FAIR ist ein Akronym, das für Findable, Accessible, Interoperable, and Reusable⁴³ steht. Mit zunehmender Akzeptanz dieser Prinzipien versprechen sie, die Landschaft der biologischen Forschung zu verändern und einen offeneren, kollaborativeren und effizienteren Ansatz für die Datenverwaltung und -nutzung zu fördern. Während kritische Komponenten der Barrierefreiheit durch die Hinterlegung von Daten im Annotated Research Context (ARC)⁴⁴ sichergestellt werden können, ist es wichtig, die Reproduzierbarkeit der Datenverarbeitungsschritte mit Open-Access-Software zu ermöglichen. In FCS-Rohdateien werden sowohl Daten als auch Metadaten (Informationen über Laser und Detektoren, einschließlich Wellenlängen, Filter usw.) über Durchflusszytometrie-Experimente^{gespeichert 45}. Sie können außerhalb proprietärer Software geladen und gelesen werden, die eine ausgefeilte Datenanalyse ermöglicht, z.B. steht eine Reihe von Paketen zur Verfügung, um mit Rohdaten innerhalb der Python-Umgebung zu arbeiten. Das entwickelte Paket demonstriert, wie rohe .fcs-Dateien mit Zytometriedaten außerhalb der proprietären Software geladen, gelesen und visualisiert werden können, indem eines der vielen verfügbaren Pakete in Python²³ verwendet wird. Die Verwendung offener Software wie oben beschrieben eliminiert die Notwendigkeit kostspieliger Lizenzgebühren, die mit proprietärer Software verbunden sind, bietet die volle Kontrolle über die Datenverarbeitung (z. B. Transformation, Kompensation, Gating) und ermöglicht zusätzlich die Integration zahlreicher Tools an einem Ort.

Ein wertvoller zusätzlicher Vorteil der Einzelzellzytometrie in Verbindung mit einem Zellsortierer ist die Möglichkeit, auch Zellen eines bestimmten Typs per FACS zu sammeln. Dies kann äußerst wertvoll sein, um beliebige -omics-Technologien für detaillierte Einblicke in die Interaktion der Spezies innerhalb der Co-Kultur zu erhalten, wie z.B. RNASeq oder Metabolomik. Der klare Nachteil dieser Geräte sind ihre hohen Preise, so dass die Erschwinglichkeit und Verfügbarkeit solcher Geräte in einigen Labors eine offensichtliche Einschränkung darstellen könnte.

Interessanterweise ergab ein direkter Vergleich der vorgestellten Methoden zur Quantifizierung der drei Partner in einem Konsortium eine sehr gute Übereinstimmung zwischen den verschiedenen Techniken, was darauf hindeutet, dass das Gemisch, das auf der Grundlage von OD-Messungen zusammengestellt wurde, mit allen beschriebenen Methoden zuverlässig quantifiziert wird. Interessanterweise war die Gesamtzahl der Cyanobakterien etwa 3-4 Mal höher als die Anzahl der beiden Hefearten, ein Phänomen, das wahrscheinlich auf ihre kleinere Zellgröße zurückzuführen ist. Diese Beobachtung stimmt gut mit dem allgemeinen Wissen überein, dass ODs ohne Kalibrierung keine Informationen über die tatsächliche Zellzahl liefern⁴⁶. Die Hefen wiesen jedoch Zählungen auf vergleichbarem Niveau auf (Tabelle 2 und Tabelle 3). Darüber hinaus zeigt der Vergleich mit der Quantifizierung der Einzelkulturen, dass alle drei Methoden zuverlässige Werkzeuge zur Unterscheidung der Zelltypen sind, mit Ausnahme des Partikelzählers, der die beiden Hefearten nicht trennte.

Im Wesentlichen sind Einzelzellzytometrie-Anwendungen eindeutig das leistungsstärkste Werkzeug zur Überwachung der Zusammensetzung von Co-Kulturen, da sie die Zählung von 1.000 bis 10.000 Zellen pro Sekunde ermöglichen. Dies gilt insbesondere dann, wenn sich die Anzahl der Partner auf mehr als zwei erhöht oder wenn die Partner in Form und/oder Durchmesser ähnlich sind. Insbesondere gibt es eine Vielzahl von Alternativen, die die Überwachung von Co-Kulturen ermöglichen. Das Wachstum fluoreszenzmarkierter Mikroben in Cokulturen kann beispielsweise durch Fluorimetrie oder Mikrobioreaktoren kontinuierlich verfolgt werden⁴⁷. Diese sind jedoch oft auf eine Co-Kultur von zwei Partnern beschränkt und erfordern ein sorgfältiges experimentelles Design, zum Beispiel bei der Wahl der Fluoreszenzmarker. Die Amplikon-Sequenzierung (16S rRNA-Sequenzierung) und andere Next-Generation-Sequencing-Techniken in Kombination mit ausgefeilter Bioinformatik ist eine weitere Option für die Charakterisierung synthetischer Gemeinschaften 48,49,50. Diese Techniken eignen sich für Hochdurchsatzansätze und können etablierte Wechselwirkungen in Langzeitkulturen, evolutionäre Fragen oder die Verfolgung von Mutationen mit mehreren mikrobiellen Partnern adressieren.

Zusammengenommen bieten vereinfachte mikrobielle Kokulturen, die rational konzipiert sind, einen leistungsstarken "Bottom-up"-Ansatz für die Untersuchung der Dynamik zwischen den Arten, der innerhalb von Gemeinschaften mit mehreren Arten, die die natürliche Welt dominieren, schwieriger zu erreichen sein kann ^51,52,53. Hierin wird ein gestrafftes Protokoll bereitgestellt, das von der wissenschaftlichen Gemeinschaft leicht für die Etablierung und Analyse neuartiger Paare von Cyanobakterien und heterotrophen Partnern angepasst werden kann. Es liegt auf der Hand, dass viel Forschung erforderlich ist, um sowohl die potenziellen grundlegenden Erkenntnisse zu nutzen, die aus künstlichen mikrobiellen Cokulturen gewonnen werden können, als auch um festzustellen, ob synthetisch gestaltete mikrobielle Konsortien das Potenzial erreichen können, das ihnen in der Literatur oft für biotechnologische Anwendungen zugeschrieben wird.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
10x Ph1 Objektiv	Carl Zeiss AG	46 04 01-9904
525/40 nm Bandpassfilter	Beckman Coulter, Inc.	A01-1-0051	FITC-Filter (in 488 nm Laser)
660/10 nm Bandpassfilter	Beckman Coulter, Inc.	A01-1-0055	APC-Kanal (in 638 nm Laser)
710/50 nm Bandpassfilter	Beckman Coulter, Inc.	B71092	PC5.5 Kanal (in 561 nm Laser)
Accuvetten für Multisizer 4e	Beckman Coulter, Inc.	A35473	Probenbecher mit Deckel Öffnungsrohr
30 μ M für Multisizer 4e	Beckman Coulter, Inc.	C92760
Kapillar-Autoklav	Lab Associates	EQM-ARBP	zur Sterilisation von Material
Prallkolben ROTILABO®, Gerals, 250 ml	Carl Roth GmbH + Co. KG	LY95.1
BG11 / CoYBG11 Komponenten	verschiedene Lieferanten		siehe Tabelle 1
Sterilfilter mit Flaschenaufsatz	Sigmaaldrich	Z222593	für sterile Medien, wenn Sie den Autoklaven
Capillary 45 & micro; m	Omni Life Science	OLS 5651738
CASY Zellzähler Modell TTC	Schaerfe Systems
CASY Cups	Omni Life Science	OLS 5651794
CASYclean	Omni Life Science	OLS 5651786	Reinigungslösung
CASYton Lösung	Omni Life Science	OLS 5651808	Isotonische Lösung
Zentrifugenröhrchen (50 mL)	Sigmaaldrich	CLS430828
CO2	BOC	270182-L	zur Versorgung von Cyanobakterien-Axenkulturen und Co-Kulturen
CONTRAD® 70	Beckman Coulter, Inc.	81911	Tiefenreinigungslösung
Deckglas 20 x 26 x 0,4 mm	VWR International GmbH	631-1190	Deckglas für Zählkammer
Küvetten	Sarstedt	67.742
Cyanobakterien BG-11 Süßwasserlösung	Merck KGaA	C3061
CytExpert Software v. 2.6	Beckman Coulter, Inc.		Anwendungssoftware für Zytometer
CytoFLEX Sheath Fluid	Beckman Coulter, Inc.	B51503	Sheat
Fluid Cytometer CytoFLEX S	Beckman Coulter, Inc.
DxH Reiniger für Multisizer 4e	Beckman Coulter, Inc.	628022	Reinigungslösung
Eppendorf Röhrchenzentrifuge (klein)	Labstac	CEN16-15	zum Zentrifugieren von weniger als 2mL Kultur
Ethanol	Carl Roth GmbH + Co. KG	K928.1
FACS Röhrchen	Beckman Coulter, Inc.	2523749	Tuben für den halbautomatischen Betrieb
FlowClean Reinigungsmittel, 500ml	Beckman Coulter, Inc.	C48093	Täglich saubere Lösung
Messzylinder	Sigmaaldrich	Z131121	für die Vorbereitung von Medien
HEPPSO	Merck KGaA	R426725
Infors MultiTron Photoinkubator	Infors AG		weißes LED-Licht
IPTG	Merck KGaA	I6758	Aliquots vorbereiten, lagern bei -20°; C, auftauen und auf Eis halten
Isoton II für Multisizer 4e	Beckman Coulter, Inc.	8448011	Isotonische Lösung
Kaluza gegen 2.2	Beckman Coulter, Inc.	B16406	Software zur Datenanalyse der Zytometrie
KimWipes	VWR International GmbH	115-2221	Fusselfreie Gewebe
KOH	Merck KGaA	221473
KPO3	Noah Chemicals	7790-53-6
Messbecher	VWR	213-3747
Mikrotestplatte, 96 Well, Stülpdeckel, flacher Boden, PS, transparent	SARSTEDT AG & Co. KG	82.1581.001
Mikroskopsockel	Carl Zeiss AG	47 09 18-9902/16
Mikroskopischer Kopf	Carl Zeiss AG	47 30 14
Milli-Q Wasseraufbereitungssystem	Merck Millipore	C85358
Mulitisizer 4e Partikelzähler	Beckman Coulter, Inc.	B23005	Alternative zum CASY Zellzähler
Neubauer verbessert, Tiefe 0,02 mm	Assistent Deutschland		Zählkammer
Neubauer verbessert, Tiefe 0,1 mm	Paul Marienfeld GmbH & Co. KG	640010	Zählkammer
Sofort einsatzbereit Täglich QC Fluorosphären	Beckman Coulter, Inc.	C65719	Referenz für QC
SCHOTT Flaschen	Dutscher	90347	zur Lagerung
Specord® 200 Plus Spektralphotometer	Analytic Jena GmbH		OD600/750
Saccharose	Merck KGaA	84100
Tischzentrifuge (groß)	Labstac	CEN18-06R	Sammelkultur Biomasse
Hefe Stickstoff Base, ohne Aminosäuren, ohne Ammoniumsulfat	Thermo Fisher Scientific Inc.