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Methode zur Untersuchung des Stoffwechsels in lymphatischen Zellen mit Hilfe der Chemie zur Messung des Puromycin-Einbaus durch Durchflusszytometrie

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DOI:

10.3791/67377

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15. August 2025

 ,  , 
1Laboratory of Immune System Biology, NIAID, NIH, 2Department of Pediatrics, Kyoto University Graduate School of Medicine

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Das Protokoll zeigt eine auf Durchflusszytometrie basierende Methode, die Chemie verwendet, um den Energiestoffwechsel in Zellen zu untersuchen.

Zusammenfassung

Nach der Antigenstimulation durchlaufen naive T-Zellen eine schnelle Proliferation und Expansion zu Effektor-T-Zellen. Der Stoffwechsel spielt eine wichtige Rolle bei der Erzeugung von Biomasse, die für diese schnell vermehrenden Zellen benötigt wird, und bei der Erzeugung von Molekülen, die für die Differenzierung und Funktion von Effektor-T-Zellen benötigt werden und das Ergebnis der adaptiven Immunantwort bei Infektionen oder Krebserkrankungen beeinflussen. Naive T-Zellen programmieren ihren Stoffwechsel nach antigener Stimulation um, um die Produktion von ATP zu erhöhen, das zur Unterstützung ihres Wachstums, ihrer Biosynthese und ihrer Effektorfunktionen erforderlich ist. ATP kann in einer Zelle entweder über den Weg der mitochondrial-oxidativen Phosphorylierung (OXPHOS) oder über den glykolytischen Weg erzeugt werden. Da der größte Teil des in einer sich teilenden, wachsenden Zelle erzeugten ATP für die Synthese von Proteinen verbraucht wird, wurde die Proteinsynthese als Surrogat für den ATP-Spiegel verwendet. Die Proteinsynthese kann durch den Einbau von Puromycin gemessen werden, das das 3'-Adenosin einer tRNA nachahmt, die mit einem modifizierten Tyrosin geladen ist, und zu einer spontanen Beendigung der Proteintranslation führt. Metabolische Inhibitoren wie 2-Desoxyglucose (2DG), das den glykolytischen Signalweg blockiert, und Oligomycin (O), das den Komplex 5 der Elektronentransportkette (ETC) blockiert, können verwendet werden, um die Abhängigkeiten der zellulären ATP-Bildung von diesen beiden Signalwegen in Verbindung mit der Bewertung der Proteinsynthese in einer Methode namens SCENITH zu untersuchen. Wir beschreiben hier eine Variation dieser Methode, die den Einbau von Puromycin mittels Durchflusszytometrie mittels Chemie nachweist. Diese Methode zur Untersuchung des Stoffwechsels ist relativ einfach und kann zur Bewertung seltener Zellpopulationen sowie von Patientenproben mittels Durchflusszytometrie verwendet werden.

Einleitung

In den letzten Jahren wurde die wichtige Rolle des Stoffwechsels bei der Regulation von T-Zellen zunehmend anerkannt. Der zelluläre Stoffwechsel reguliert viele kritische Funktionen in Lymphozyten, einschließlich der klonalen Expansion von pathogenspezifischen T-Zellen und ihrer Differenzierung in Effektorzell-Untergruppen, die eine Vielzahl von Effektormolekülen synthetisieren, einschließlich inflammatorischer Zytokine und zytolytischer Granzyme, die zur Abtötung von Krankheitserregern erforderlich sind1. Die Untersuchung des T-Zell-Stoffwechsels ist daher sowohl für die Bewertung der normalen T-Zell-Funktion als auch für die Entwicklung potenzieller Therapeutika wichtig.

Naive T-Zellen sind metabolisch ruhig und für ihren Energiebedarf auf den katabolen Stoffwechsel und die oxidative Phosphorylierung (OXPHOS) angewiesen 1,2. Nach der Aktivierung des T-Zell-Rezeptors (TCR) durchlaufen T-Zellen eine schnelle metabolische Reprogrammierung, die zum Teil durch die Hochregulierung von Nährstofftransportern auf der Zelloberfläche angetrieben wird, die die Aufnahme von Glukose und mehreren Aminosäuren, einschließlich Glutamin, aus der Umwelt erhöhen. Diese Nährstoffbausteine werden dann in anabolen Wegen verwendet, um Makromoleküle herzustellen, die zum Zellwachstum beitragen und den erhöhten Energiebedarf unterstützen, der mit einem erhöhten Zellwachstum und einer erhöhten Zellteilung verbunden ist 1,2,3. Die metabolische Reprogrammierung in aktivierten T-Zellen macht die Zellen für ihren Energiebedarf abhängiger von aerober Glykolyse und Glutaminolyse 1,2,3. Bei der TCR-Stimulation spielt die Aufnahme von Nährstoffen auch eine entscheidende Rolle bei der Aktivierung nachgeschalteter molekularer Signalwege3. Zum Beispiel aktivieren die Aufnahme von Aminosäuren und eine erhöhte lokale Aminosäurekonzentration die mTORC1-Signalgebung4. Umgekehrt verringert sich durch die Verringerung der Verfügbarkeit intrazellulärer Aminosäuren der mTORC1-Signalweg 2,3,5,6,7. So sind Stoffwechsel und zelluläre Funktion in einer Effektor-T-Zelle eng miteinander verknüpft.

Die starke Zunahme der Biomasse, die für die schnelle Teilung von T-Zellen erforderlich ist, erfordert eine Hochregulierung der Proteinsynthese/-translation8. Die Proteinsynthese kann in einer Zelle quantifiziert werden, indem der Einbau von Puromycin9 untersucht wird, einer Tyrosyl-tRNA-Nachahmung, die die Translation blockiert, indem sie längliche Polypeptidketten von translatierenden Ribosomen9 einbaut, markiert und freisetzt. Die Proteintranslation ist ein hochenergieabhängiger Prozess; Tatsächlich wird der größte Teil des ATP, das bei sich teilenden, wachsenden Zellen erzeugt wird, für die Synthese von Proteinen verwendet. Daher wurde die Proteinsynthese als Surrogatmessung für zelluläres ATP10 verwendet. Um ATP zu erzeugen, verlassen sich Zellen üblicherweise auf die Glykolyse und/oder den mitochondrialen OXPHOS-Signalweg11. Bei der Glykolyse werden zwei ATP-Moleküle pro Glukosemolekül erzeugt. Der OXPHOS-Signalweg erzeugt 36 ATPs pro Glukose12,13, aber die Glykolyse kann ATP schneller erzeugen14. Daher sind sich schnell teilende aktivierte T-Zellen, wie Krebszellen, stark auf den glykolytischen Weg für die ATP-Bildung angewiesen.

Die Abhängigkeit einer Zelle von jedem Stoffwechselweg kann durch den Einsatz spezifischer Inhibitoren untersucht werden. Der Glykolytische Signalweg-Inhibitor 2-Desoxyglucose (2-DG), der ein Glukoseanalogon ist, wirkt als kompetitiver Inhibitor für das glykolytische Enzym Hexokinase15. 2-DG wird durch Hexokinase zu 2DG-Phosphat (2DG-P) phosphoryliert. 2DG-P kann nicht weiter durch Phosphohexose-Isomerase metabolisiert werden, die normalerweise Glucose-6-phosphat (G-6-P) in Fructose-6-phosphat16 umwandelt. 2DG-P wird daher eingeschlossen und reichert sich in den Zellen an, was zu einer Hemmung der Glykolyse und einer Erschöpfung des zellulären ATP führt, wodurch die Proteinsynthese blockiertwird 17. In ähnlicher Weise kann die Abhängigkeit von Zellen vom mitochondrialen OXPHOS-Signalweg mit Hilfe von Oligomycin untersucht werden, das an den Protonenkanal der ATP-Synthase der Elektronentransportkette (ETC)18 bindet und so die mitochondriale ATP-Synthese blockiert (Abbildung 1). Die Verwendung dieser Inhibitoren in Verbindung mit einer Bewertung der Proteinsynthese kann ein Bild des Stoffwechselzustands von Zellen liefern und wurde in einer leistungsstarken Einzelzellmethode namens SCENITH verwendet, die den Einbau von Puromycin mittels Durchflusszytometrie bewertet10. Die Verfügbarkeit von SCENITH-Reagenzien kann jedoch eingeschränkt sein. Andere häufig verwendete Techniken zur Bewertung von Glykolyse und OXPHOS sind extrazelluläre Flussanalysen von Seepferdchen, die eine größere Zellzahl erfordern, was experimentell möglicherweise nicht durchführbar ist. In diesem Artikel beschreiben wir eine alternative Methode zur Bewertung des Puromycin-Einbaus unter Verwendung eines kommerziell erhältlichen Click-it-Chemiereagenzes. Die Leichtigkeit dieser Methode ermöglicht eine schnelle Bewertung des Stoffwechselzustands von Lymphozyten, einschließlich seltener Zellpopulationen und Patientenproben.

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Protokoll

Die Tierhaltung und die Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit dem genehmigten Protokoll G98-3 des National Human Genome Research Institute's Animal Use and Care Committee, NIH, und dem vom National Institute of Allergy and Infectious Diseases Animal Care and Use Committee, NIH, genehmigten Protokoll LISB 22E durchgeführt. Für die vorliegende Studie wurden männliche C57Bl/6J-Mäuse im Alter von 6-12 Wochen verwendet, die unter spezifischen pathogenfreien (SPF) Bedingungen gezüchtet und gehalten wurden. Ähnliche Ergebnisse wurden mit weiblichen Mäusen erzielt. Menschliches Vollblut wurde aus der NIH-Blutbank im Rahmen des vom NIH Clinical Center IRB genehmigten Protokolls 99-CC-0168 "Collection and Distribution of Blood Components from Healthy Donors for In Vitro Research Use" gewonnen. Die schriftliche Einverständniserklärung wurde von allen Probanden in Übereinstimmung mit der Erklärung von Helsinki eingeholt.

1. Isolierung und Kultivierung von CD4+ T-Zellen an der Maus

  1. Reinigen Sie naive CD4+ T-Zellen durch Negativselektion aus gepoolten einzelligen Suspensionen von Maus, Milz oder Lymphknoten von männlichen Mäusen im Alter von 6 bis 12 Wochen unter Verwendung eines magnetischen Zelltrennsystems gemäß dem Protokoll des Herstellers.
  2. Kulturzellen (wie unten beschrieben) in IMDM-Medien, die L-Alanyl-L-Glutamin-Dipeptid enthalten und mit 10 % fötalem Rinderserum, 2 mM L-Glutamin, 100 μl/ml-Penicillin, 100 μm/ml Streptomycin und 0,05 μM 2-β-Mercaptoethanol ergänzt werden.
  3. Co-kultivierte naive CD4-T-Zellen in einem Verhältnis von 1:8 mit Mitomycin-C-behandelten T-depletierten Splenozyten (siehe unten) als APCs in 48-Well-Platten unter unpolarisierten (1 μg/ml anti-CD3 [Klon 2C11] und 3 μg/ml anti-CD28 [Klon 37.51]) und Th0-Bedingungen (1 μg/ml anti-CD3, 3 μg/ml anti-CD28, je 10 μg/ml anti-IFNg [Klon XMG1.2], anti-IL-12 [Klon C17.8] und anti-IL-4 [Klon 11B11]) für 72 h bei 37 °C. Einrichten von Kulturen mit 1 x 106 APCs und 0,13 x 106 naiven CD4-T-Zellen pro Well einer 48-Well-Platte (Materialtabelle)
  4. Erzeugung von Mitomycin-C-behandelten T-depletierten Splenozyten als APCs: Kurz gesagt, färben Sie eine Einzelzellsuspension der Mausmilz mit FITC-konjugierten CD4- und CD8-Antikörpern. Anschließend markieren Sie die Zellen magnetisch mit Anti-FITC-Mikrokügelchen (siehe Materialtabelle). Anschließend wird mit einem magnetischen Zelltrennsystem gemäß dem Protokoll des Herstellers die APCs aus den T-Zellen negativ selektiert. Anschließend werden die APCs 40 min lang bei 37 °C Inkubator mit 50 μg/mL Mitomycin C behandelt, anschließend 3x mit 1x PBS gewaschen.

2. Isolation und Kultur menschlicher PBMCs

  1. Isolieren Sie PBMCs aus Vollblut unter Verwendung von Lymphozytentrennmedien und gemäß dem Protokoll des Herstellers (siehe Materialtabelle).
  2. Kultur-PBMCs in RPMI-Medien, ergänzt mit 2 mM L-Glutamin, 0,01 M HEPES, 1 mM Natriumpyruvat, 1 % nicht-essentiellen Aminosäuren, 100 U/ml Penicillin und Streptomycin, 0,05 mM 2-β-Mercaptoethanol und 5 % Humanserum.
  3. Kultivieren Sie 1 x 106 PBMC pro Vertiefung einer 96-Well-Platte mit U-Boden mit 5 μg/ml Phytohämagglutinin-L (PHA-L) für 18-24 h bei 37 °C.

3. Metabolischer Assay

HINWEIS: Es ist wichtig, alle Zellen, Inhibitoren [Oligomycin (O), 2-Desoxyglucose (2-DG), DMSO (Co)] und O-Propargyl-Puromycin (OPP)-Reagenz so nah wie möglich an 37 °C zu halten. Aliquotieren Sie die Zellen, Inhibitoren und das OPP-Reagenz auf 96-Platten mit U-Boden und belassen Sie die Platten so weit wie möglich in einem 37 °C-Inkubator. Aliquot die Inhibitoren 2-DG und O in kleinere Volumina, um mehrfaches Einfrieren und Auftauen zu vermeiden.

  1. Es wird eine 2 M (20x) Stammlösung aus 2-DG und eine 40 μM (40x) Stammlösung aus O hergestellt. Für OPP verdünnen Sie 1 μl OPP in 49 μl Medium, so dass die Konzentration 400 μM beträgt – dies ist die 20-fache Stammlösung.
  2. Stellen Sie sicher, dass alle anderen Komponenten des OPP-Proteinsynthesekits (siehe Materialtabelle) Raumtemperatur (RT) haben, bevor Sie mit dem Experiment beginnen.
  3. Bereiten Sie 1x OPP-Reaktionspuffer vor, indem Sie ein Aliquot aus der Flasche der Komponente C 1:10 mit deionisiertem Wasser verdünnen. Lagern Sie nach Gebrauch die restliche 1x Lösung bei 2-8 °C.
  4. 0,1-2 x 10 x6 Zellen pro Well einer 96-Well-Platte mit rundem Boden für jede Bedingung (Co / DG / O / DGO) in 100 μl vollständiger IMDM (für CD4-T-Zellen der Maus) oder vollständiger RPMI (für humane PBMCs) oder einem vollständigen Medium Ihrer Wahl ausstechen. Bewahren Sie die Platte so weit wie möglich im Inkubator auf.
  5. 1x Inhibitoren aus Stammlösungen (5 μl von 20x DG, Co), (2,5 μl von 40x O) zugeben und 15 min bei 37 °C, 5 % CO2 inkubieren. Die Endkonzentrationen auf den Zellen betragen 100 mM DG und 1 μM O. Mischen Sie die Inhibitoren vorsichtig mit einer Pipette mit den Zellen. Zur Vereinfachung aliquotieren Sie die Inhibitoren in einer 96-Well-Platte, fügen Sie den Inhibitoren Zellen hinzu und mischen Sie sie gut, indem Sie einige Male auf und ab pipettieren.
  6. In die DGO-Probe 1x DG (5 μl) geben, vorsichtig mit einer Pipette mischen und 10 min bei 37 °C, 5 % CO2 inkubieren. Fügen Sie dann 1x O (2,5 μL) hinzu, pipettieren Sie ein paar Mal und inkubieren Sie 5 Minuten lang bei 37 °C, 5 % CO2.
  7. Ohne die Inhibitoren auszuwaschen, geben Sie 5 μl OPP aus der 20x (400 μM) Stammlösung zu jeder Probe, so dass die Konzentration in den Zellen 20 μM beträgt, pipettieren Sie mehrmals auf und ab und inkubieren Sie 30 min bei 37 °C, 5 % CO2. Zur Vereinfachung aliquotieren Sie OPP auf eine 96-Well-Platte, fügen Sie Zellen mit Inhibitoren zum OPP-Reagenz hinzu und mischen Sie es gut.
    HINWEIS: Bei weniger metabolisch aktiven Zellen und Zellen, die direkt ex vivo isoliert wurden, ist die Inkubationszeit nach OPP-Zugabe zu erhöhen. Die Inkubationszeit mit OPP muss für jeden Zelltyp standardisiert werden.
  8. Nach der Inkubation mit OPP fügen Sie 100-150 μl eiskalten FACS-Puffer (2% FBS und 1 mM EDTA in 1x PBS) hinzu. Zentrifugieren bei 750 x g für 2 min bei 4°C. Entsorgen Sie den Überstand und wiederholen Sie den Waschschritt.
  9. Färbezellen mit geeigneten Oberflächenmarkern, Anti-Maus-CD4-Antikörper (verwendet bei 1/200 Verdünnung) oder Anti-Human-CD4-Antikörper (verwendet bei 1/50 Verdünnung), Lebend/Tot-Reagenz (verwendet bei 1/600 Verdünnung), in Gegenwart von Fc Block (verwendet bei 1/200 Verdünnung). 25-30 min bei 4 °C im Dunkeln inkubieren.
  10. Waschen Sie die Platte mit 150-200 μl FACS-Puffer und zentrifugieren Sie sie bei 750 x g für 2 min bei 4 °C. Schnippen Sie vorsichtig mit der Platte, um den Überstand zu entfernen, und wiederholen Sie dann den Waschschritt. In diesem Stadium werden die Zellen auf der Oberfläche gefärbt.
  11. Die Zellen in 1% PFA in PBS resuspendieren, gut mischen und 10-15 min bei 4 °C inkubieren. Vor Licht schützen.
  12. Mit FACS-Puffer waschen und bei 750 x g 2 min bei 4 °C zentrifugieren und den Waschgang wiederholen.
  13. Resuspendieren Sie das Zellpellet in 200 μl kaltem 1x Saponin-Permeabilisierungspuffer (0,1 % (Gew./vol) Saponin + 3 % FBS in 1x PBS). Inkubieren Sie bei RT und lichtgeschützt für 5-15 Minuten. Die Zellen sind zu diesem Zeitpunkt fixiert und permeabilisiert.
  14. 1x OPP Reaktionspuffer Additiv (Komponente E) herstellen, indem die 10x Lösung 1:10 in entionisiertem Wasser verdünnt wird. Bereiten Sie diese Lösung frisch zu und verwenden Sie sie am selben Tag.
  15. Bereiten Sie den OPP-Reaktionscocktail gemäß Tabelle 1 vor. Verwenden Sie den Reaktionscocktail innerhalb von 15 Minuten nach der Zubereitung.
  16. Die Proben aus Schritt 3.13 bei 750 x g für 2 min zentrifugieren. Entsorgen Sie den Überstand. Waschen Sie die Zellen 2x mit 200 μL 1x Saponin-Permeabilisierungspuffer. Drehen Sie den Überstand und werfen Sie ihn ab.
  17. 50-100 μl OPP-Reaktionscocktail (hergestellt in Schritt 3.12) in jede Vertiefung geben und gut mischen. 30 min bei RT lichtgeschützt inkubieren. Dann die Platten bei 750 x g oder 2 min bei 4 °C drehen. Entsorgen Sie den Überstand.
  18. Das Pellet wird in 200 μl 1x Saponin-Permeabilisierungspuffer resuspendiert und die Proben bei 750 x g für 2 min bei 4 °C zentrifugiert. Entsorgen Sie den Überstand.
  19. In 50 μl Reaktionsspülpuffer (Komponente F) pro Vertiefung resuspendieren und 2 min bei 4 °C bei 750 x g zentrifugieren. Resuspendieren Sie gefärbte Zellen in 200 μl FACS-Puffer.
  20. Analysieren Sie die Proben noch am selben Tag mittels Durchflusszytometrie (siehe ergänzende Abbildung 1) oder lagern Sie die Zellen im Dunkeln bei 4 °C und analysieren Sie sie am nächsten Tag.

4. Analyse des metabolischen Assays

  1. Messen Sie den Einbau von Puromycin (OPP) als Surrogat für die Proteinsynthese unter den folgenden Bedingungen: 1) Kontrollbedingung (Co); 2) in Zellen, in denen der glykolytische Signalweg durch 2-DG blockiert wird; 3) in Zellen, in denen der mitochondriale OXPHOS-Signalweg durch O blockiert wird; und 4) in Zellen, in denen sowohl der glykolytische als auch der mitochondriale Signalweg durch Inhibitoren (DGO) blockiert sind, durch Bewertung der mittleren Fluoreszenzintensität (MFI) von OPP (Abbildung 2).
  2. Analysieren Sie die Abhängigkeit von Zellen von einem bestimmten Signalweg, indem Sie sich den MFI von OPP in jeder Bedingung ansehen. Bewerten Sie den MFI direkt als Maß für die Proteinsynthese. Berechnen Sie die Glukoseabhängigkeit, die glykolytische Kapazität, die Fettsäureoxidationskapazität (FAO) und die Aminosäureoxidationskapazität (AAO) sowie die mitochondriale Abhängigkeit gemäß10.

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Ergebnisse

Naive CD4+ T-Zellen wurden aus der Milz und den Lymphknoten von Mäusen isoliert und für 72 Stunden zu Th0 oder nicht-polarisierten (NP) Linien differenziert. Die Zellen wurden nach 0 h, 48 h und 72 h Kultur geerntet, und der OPP-Einbau wurde anhand des MFI des OPP gemessen. Naive CD4+ T-Zellen waren weniger synthetisch als die aktivierten T-Zellen, wie der MFI von OPP zeigt (Abbildung 3). Naive Zellen waren teilweise von der Glykolyse abhängig, aber mehr noch vom OXPHOS...

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Diskussion

Diese Arbeit stellt eine Methode zur Untersuchung des Stoffwechsels in lymphatischen Zellen mittels Durchflusszytometrie vor, die auf der SCENITH-Technologie basiert, jedoch unter Verwendung der chemischen Markierung von eingebautem Puromycin. Obwohl wir uns auf Lymphozyten konzentriert haben, kann dieses Protokoll angepasst werden, um den Stoffwechsel in jedem Zelltyp zu untersuchen. Diese Methode ist auch vorteilhaft, um den Stoffwechsel in seltenen Zellpopulationen und Patientenproben...

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Offenlegungen

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Danksagungen

Wir danken Dr. Qin Xu und Dr. Avik Dutta für die Bereitstellung von PBMC-Proben und wertvollen experimentellen Vorschlägen. Diese Forschung wurde teilweise von der Abteilung für intramurale Forschung des NIAID, NIH, unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
2-MercaptoethanolThermo Fisher21985-023
Alexa Fluor 488 Anti-Puromycin AntikörperBiolegend381506Verwendete Verdünnung: 1/100
Alexa Fluor 647 Anti-Human-CD4-AntikörperBiolegend357422Verwendete Verdünnung:  1/50
BD Horizon BUV737 Ratte Anti-Maus CD4BD Biosciences612761verwendete Verdünnung:  1/200
Click-iT Plus OPP Alexa Fluor 488 Protein Synthesis Assay KitThermo FisherC10456
HEPES (1 m)Thermo Fisher15630080
Human SerumMillipore SigmaH4522
IMDM, GlutaMAX Supplement, 500 mlThermo Fisher31980030
InVivoMAb Anti-Maus CD28, Klon:  37.51BioXcellBE0015-1
InVivoMAb Anti-Maus-CD3ε, Klon:  145-2C11BioXcellBE0001-1
InVivoMAb Anti-Maus-IFNγ, Klon:  XMG1.2BioXcellBE0055
InVivoMAb Anti-Maus IL-12 p40, Klon:  C17.8BioXcellBE0051
InVivoMAb Anti-Maus IL-4, Klon:  11B11BioXcellBE0045
L-Glutamin (200 mM)Thermo Fisher25030081
LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit, für 405 nm AnregungThermo FisherL34966Verwendete Verdünnung:  1/600
LSM Lymphozyten-TrennmediumMP Biomedicals50494X
MEM Lösung für nicht-essentielle Aminosäuren (100X)Thermo Fisher11140050
Mitomycin C aus Streptomyces caespitosusSigmaM0503-10X2MG
Naives CD4-Isolationskit, MausMiltenyi Biotec130-104-453
Paraformaldehyd 16% wässrige Lösung EMGrade ElektronenmikroskopieSciences 15710
PBS (1X), pH 7,4, 500 mLQuality Biologicals114-058-101
Penicillin-Streptomycin (10.000 U/ml). 100 mLThermo Fisher15140122
Phytohämagglutinin-L (PHA-L)Millipore Sigma11249738001
Premium Grade Fötales Rinderserum (FBS)Avantor97068-085
RPMI 1640 Medium, kein GlutaminThermo Fisher21870076
SaponinThermo FisherA18820.22
Natriumpyruvat (100 mM)Thermo Fisher11360070

Referenzen

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Schlagwörter

Stoffwechsel lymphoider ZellenT Zell ProliferationProteinsynthesemetabolische Reprogrammierungglykolytischer Wegoxidative Phosphorylierungmetabolische InhibitorenSCENITH Methode
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