Methodenartikel

Korrelative optische Spektroskopie und Massenspektrometrie Bildgebungsmethoden zur Visualisierung der Wirkstoffverteilung in einem Weichteilschnitt

DOI:

10.3791/67383

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20. Juni 2025

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1Chemical & Biological Sciences Department, National Physical Laboratory, 2Department of Life Sciences, University of Bath, 3Haleon CH SARL, 4School of Chemistry & Chemical Engineering, University of Surrey

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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In dieser Arbeit wird eine Methode zur korrelativen Bildgebung von Arzneimitteln in Weichgeweben mittels nichtlinearer optischer Spektroskopie und massenspektrometrischer Bildgebung vorgestellt. Die Kombination von hochauflösender Hautbildgebung mit sensitiver Wirkstoffdetektion bietet einen wertvollen Ansatz zur Untersuchung der Wirkstoffverteilung in der Haut, der für die Entwicklung überlegener topischer Produkte von entscheidender Bedeutung ist.

Zusammenfassung

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Eine neue korrelative Bildgebungsmethode, die eine räumliche Auflösung im Submikrometerbereich mit einer empfindlichen Wirkstoffdetektion durch optische Spektroskopie und massenspektrometrische Bildgebung kombiniert, wurde entwickelt, um die chemische Verteilung bei der Anwendung von Medikamenten im Weichgewebe zu visualisieren. In diesem Beispiel wurde das Verfahren an exzidiertem Hautgewebe nach 16-stündiger topischer In-vitro-Anwendung eines kommerziellen nichtsteroidalen entzündungshemmenden Arzneimittels getestet. Zerstörungsfreie optische spektroskopische Methoden, einschließlich stimulierter Raman-Streuung, Erzeugung der zweiten Harmonischen und Zwei-Photonen-Fluoreszenzmikroskopie, wurden zunächst eingesetzt, um die Hautstruktur und -morphologie zu kartieren. Anschließend wurden dieselben Hautgewebeproben mittels Flugzeit-Sekundärionen-Massenspektrometrie (ToF-SIMS) analysiert, was eine erhöhte Sensitivität für den Nachweis von Diclofenac in den äußersten Hautschichten - Epidermis und Dermis - ermöglichte. Es wurden Bildregistrierungsmethoden entwickelt, um die optischen und massenspektrometrischen Daten zu integrieren. Dieser Ansatz kombiniert die markierungsfreie, hochauflösende Visualisierung der Gewebestruktur mit der sensitiven chemischen Detektion und stellt ein wertvolles Werkzeug für die Untersuchung der Wirkstoffverteilung in der Haut und möglicherweise in anderen weichen biologischen Geweben dar.

Einleitung

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Das Verständnis der Rate, des Ausmaßes und der Treiber der Verteilung von pharmazeutischen Wirkstoffen in weichbiologischen Geweben nach ihrer topischen oder systemischen Anwendung ist entscheidend für die Aufklärung der Mechanismen, die der gewebespezifischen Wirkstoffaufnahme, dem Metabolismus und der Clearance zugrunde liegen (d. h. ein tieferes Verständnis der Pharmakokinetik von Arzneimitteln). In dieser Arbeit stellen wir ein neuartiges korrelatives Bildgebungsverfahren vor, das nichtlineare optische Spektroskopie und massenspektroskopie-Bildgebung zur markierungsfreien Visualisierung der Gewebestruktur und der Verteilung topischer Wirkstoffe innerhalb derselben Gewebeprobe integriert1.

Die Raman-Spektroskopie (RS) hat sich als wertvolles Werkzeug für die Kartierung der Wirkstoffverteilung in Zellen und Geweben mit hoher räumlicher Auflösung und molekularer Spezifität erwiesen2. RS beruht auf der inelastischen Streuung des Lichts3 durch eine interessierende Probe, die eine detaillierte chemische Charakterisierung über die charakteristischen Schwingungsmoden der darin enthaltenen Moleküle ermöglicht, ohne dass externe Markierungen erforderlich sind. Die langen Erfassungszeiten für die Erstellung hochauflösender Bilder können jedoch die Integrität empfindlicher biologischer Proben beeinträchtigen. Darüber hinaus kann bei der Untersuchung tieferer Gewebeschichten die Streuung und Absorption von Licht durch das Gewebe das Raman-Signal abschwächen, was seine Empfindlichkeit weiter einschränkt. Die stimulierte Raman-Streuung (SRS)-Mikroskopie stellt einen bedeutenden Fortschritt gegenüber der herkömmlichen RS dar, da sie die gepulste Laseranregung und die Detektion des stimulierten Raman-Signalsnutzt 4. Die SRS-Mikroskopie ermöglicht eine schnelle 2D- und 3D-Bildaufnahme mit hoher räumlicher Auflösung und kann - wenn sie zusammen mit der Mikroskopie der zweiten harmonischen Erzeugung (SHG) und der Zwei-Photonen-angeregten Fluoreszenz (TPEF) durchgeführt wird - ein umfassendes Bild von Bindegewebe, Kollagen und Elastinliefern 1,5,6,7,8,9 . Die SHG-Mikroskopie ist eine nichtlineare optische Technik, die auf der Wechselwirkung von Licht mit nicht-zentrosymmetrischen Strukturen in einer Probe beruht und ein Signal bei der halben Wellenlänge des einfallenden Lichts erzeugt. Es ist besonders nützlich für die Abbildung geordneter Strukturen wie Kollagen in biologischen Geweben. TPEF ist eine weitere nichtlineare Mikroskopietechnik, bei der zwei Photonen mit niedrigerer Energie gleichzeitig ein Fluorophor anregen, wodurch es Fluoreszenz emittiert. TPEF ermöglicht eine tiefe Gewebebildgebung mit reduzierter Lichtschädigung, da das Anregungslicht im nahen Infrarotbereich liegt und tiefer in biologische Proben eindringt.

Die massenspektrometrische Bildgebung (MSI) ist eine leistungsstarke Analysetechnik, die die Fähigkeiten der Massenspektrometrie mit räumlichen Informationen kombiniert und so die markierungsfreie Identifizierung eines breiten Spektrums von Molekülen ermöglicht 10,11,12. Bei der Flugzeit-Massenspektrometrie (ToF-SIMS) wird die Probenoberfläche mit hochenergetischen Primärionen beschossen, wodurch Sekundärionen von der Oberfläche ausgestoßen werden. Diese Sekundärionen werden dann zu einem Flugzeitanalysator beschleunigt, wo ihr Masse-Ladungs-Verhältnis bestimmt wird. Diese Analyse ermöglicht die Identifizierung von molekularen Fragmenten und Isotopenvariationen mit hoher Empfindlichkeit und Auflösung. Wertvolle Anwendungen von ToF-SIMS wurden in der biologischen und pharmazeutischen Forschung für die Untersuchung von Chemikalien und Biomolekülen in Zellen13, Geweben14,15 und Organen15 nachgewiesen.

Sowohl SRS als auch ToF-SIMS wurden unabhängig voneinander verwendet, um die Verteilung von Medikamenten in verschiedenen Hautmodellen zu untersuchen. Es ist jedoch am wertvollsten, diese Techniken in Kombination zu verwenden, um von ihrer Komplementarität zu profitieren. In dieser Studie beschreiben wir einen Arbeitsablauf zur Kombination der optischen Mikroskopie (SRS, TPEF und SHG) mit ToF-SIMS, um Bilder der Hautmorphologie mit einer räumlichen Auflösung im Submikrometerbereich (durch die optischen Methoden) zu erhalten, die mit dem mit überlegener Empfindlichkeit detektierten Wirkstoffsignal (bereitgestellt durch das ToF-SIMS) überlagert werden. Der Ansatz wurde verwendet, um das schwierige Beispiel der Visualisierung der Verteilung von Diclofenac in exzidierten Hautgeweben anzugehen, die mit einer kommerziellen topischen Formulierung (Voltaren-Gel) behandelt wurden. Zu den Erfolgskriterien gehörten eine hohe chemische Sensitivität zum Nachweis von Diclofenac in seiner therapeutischen Konzentration und eine ausreichende räumliche Auflösung, um die Hautstruktur aufzulösen. Obwohl der Diclofenac-Gehalt in verschiedenen Hautschichten nach topischer Behandlung durch aufwändige und technisch anspruchsvolle Methoden wie Tape-Stripping mit anschließender Quantifizierung16 oder durch Open-Flow-Mikroperfusion17 quantifiziert werden kann, können diese Ansätze die hilfsstoffabhängige Diclofenac-Partitionierung, Penetration, Reretention und Tiefenverteilung in den einzelnen Hautschichten nicht aufklären, die wesentliche Faktoren zur Unterstützung der Produktentwicklungsphase sind.

Vor der unten beschriebenen Messmethodik wurde Voltaren Forte Gel (mit 2,32 % Diclofenacdiethylammonium) oder ein entsprechendes Placebo-Gel (geliefert von Haleon CH SARL) für unterschiedliche Zeiträume (4, 12, 16 oder 24 h) auf die Hautoberfläche aufgetragen. Nach Entfernung aller Formulierungsrückstände wurden SRS- und ToF-SIMS-Messungen an denselben Hautproben durchgeführt; Ausführliche Informationen zur Methodik sind im Originalmanuskript1 beschrieben.

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Protokoll

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Ethische Erklärung: Menschliche Hautproben wurden von Tissue Solutions Ltd., Glasgow, Großbritannien, von Charles River Laboratories (CRL) in Edinburgh, Großbritannien, entnommen. Alle anonymen Proben wurden in Übereinstimmung mit den rechtlichen und ethischen Standards des Entnahmelandes mit ethischer Genehmigung und informierter Zustimmung der Spender oder ihrer engsten Verwandten entnommen.

1. Schalentrennung

Mit einem Kryostaten wurden Schnitte des Hautgewebes hergestellt.

  1. Transportieren Sie die behandelten Hautscheiben aus dem -20 °C Gefrierschrank und schneiden Sie ein kleines Stück (~1,0 cm x 1,0 cm) aus der Mitte der Scheibe ab.
  2. Montieren Sie die Probe auf dem Futter im Kryostaten über einem gefrorenen Wassertröpfchen. Verwenden Sie keine Mischung mit optimaler Schnitttemperatur (OCT) oder andere Einbettmedien.
  3. Stellen Sie die Temperatur der Klinge und der Probe auf -20 °C bzw. - 16 °C ein.
  4. Schnitt 30 μm dicker Schnitt auf einem Glasdeckglas (#1.5, Fisher Scientific).
  5. Führen Sie SRS und ToF-SIMS sofort durch oder alternativ kann die Probe für die Lagerung bei -80 °C vakuumverpackt werden.
  6. Vor Gebrauch 20 Minuten trocknen lassen.

2. SRS-Bildgebung

Die SRS-, SHG- und TPEF-Mikroskopie wurde mit einem kohärenten Raman-Mikroskop durchgeführt. Zwei Pikosekunden-Laserpulse wurden von einem 1031,2 nm Stokes-Strahl erzeugt, die räumlich und zeitlich mit einem abstimmbaren Pumpstrahl überlagert wurden. Der Stokes-Strahl, moduliert bei 20 MHz, ermöglichte die Detektion von stimulierten Raman-Verlustsignalen per Transmission. Für die Signaldetektion wurde ein siliziumbasierter Detektor in Verbindung mit einem Lock-in-Verstärker verwendet. Ein weiterer Kanal wurde verwendet, um die zweite Harmonische und die emittierten Fluoreszenzsignale zu sammeln, wobei eine Photomultiplierröhre zur Detektion verwendet wurde.

  1. Installieren Sie geeignete Objektiv- und Kondensorlinsen für die Multiphotonen-Gewebebildgebung, in diesem Fall eine Wasserimmersionslinse mit 40-facher Vergrößerung (1,1 NA) in Verbindung mit einer Luftkondensorlinse mit kurzem Arbeitsabstand (0,9 NA).
  2. Platzieren Sie den montierten Gewebeschnitt so auf dem Probentisch des SRS-Mikroskops, dass sich das Gewebe auf derselben Fläche des Objektträgers befindet wie die Kondensorlinse. Fokussieren Sie die Objektivlinse auf den Gewebeschnitt und optimieren Sie dann die Kondensorhöhe.
  3. Stellen Sie die Laserleistung auf geeignete Werte ein, um ein gutes Signal-Rausch-Verhältnis zu erzielen, ohne das Gewebe zu beschädigen. In diesem Beispiel wurden etwa 10 mW für den Pumpstrahl und 30 mW für den Stokes-Strahl an die Probe angelegt. Beziehen Sie sich auf Tsikritsis et al . für praktische Überlegungen zu SRS-Messungen4.
  4. Erfassen Sie ein Mosaikbild des gesamten Schnitts mit einer Auflösung von 512 x 512 Pixeln, entsprechend 290 μm x 290 μm bei X1-Zoom mit einer Bildgeschwindigkeit von 400 Hz und einem Liniendurchschnitt von 1 bei 2850 cm-1 , was einer CH2-Dehnung entspricht.
  5. Wählen Sie innerhalb des Mosaikbildes des gesamten Schnitts einen Bereich of Interest (ROI) mit folgenden Überlegungen: (i) Er wird in der Mitte positioniert, wobei die äußersten 20 % des Probenumfangs vermieden werden, wo sich undosierte Haut befinden könnte, die in der Franz-Zell-Apparatur eingeklemmt wurde; ii) er ist flach genug, um innerhalb der gleichen optischen Tiefe untersucht zu werden; iii) es weist ausgeprägte strukturelle Merkmale auf, die seine visuelle Identifizierung bei der Übertragung der Probe an ToF-SIMS erleichtern würden.
  6. Wenden Sie in der gesamten Studie konsistente Verstärkungseinstellungen für SRS- und SHG/Fluoreszenzdetektoren an und erfassen Sie Bilder in (i) dem C-H-Dehnungsbereich (bei 2945 cm-1, 2850 cm-1 und 2650 cm-1 entsprechend CH3, CH 2 bzw. Off-Resonanzkontrolle); (ii) der Fingerabdruckbereich (bei 1666 cm-1 und 1723 cm-1 entsprechend Amide I- bzw. Off-Resonanz-Kontrolle); iii) die Wellenzahl, die der Ein- und Aus-Resonanz in Bezug auf das aufgetragene Arzneimittel entspricht; in diesem Beispiel bei 1586 cm-1 und 1530 cm-1 , entsprechend C=C bzw. Off-Resonanz.

Übertragen Sie die Probe nach der SRS-Bildgebung sofort zur Analyse in das ToF-SIMS-Setup.

3. ToF-SIMS-Bildgebung

Die Flugzeit-Massenspektrometrie der Sekundärionen-Massenspektrometrie wurde mit einem 30 keV Bi3+ Primärionenstrahl mit einem Strom von 0,2 pA durchgeführt.

  1. Wählen Sie geeignete Akquisitionseinstellungen; In diesem Beispiel wurde eine negative Ionenpolarität mit einer Tastzeit von 100 ms, einem Massenbereich von m/z 0-900 und einem Strahldurchmesser von 5 μm verwendet. Zur Ladungskompensation wurde eine 20 eV Elektronenflutkanone bei 5 μA verwendet.
  2. Erfassen Sie ein Gesamtbild mit dem Makro-Raster-Modus der Bühne, um den gesamten Gewebeschnitt mit einem Sichtfeld in Abhängigkeit von den Gewebeabmessungen abzubilden (in unserem Fall haben wir 2,5 bis 3,0 mm x 8,5 bis 9,0 mm verwendet). Dieses Gesamtbild wird aus einem Mosaik kleinerer Bilder gebildet. In diesem Beispiel hatte jeder ein Sichtfeld von 0,5 mm x 0,5 mm (256 x 256 Pixel) mit 1 Ionenstrahlschuss pro Pixel, was zu einer Ionendosis von 8,18 x 108 Ionen/cm2 führte.
  3. Verwenden Sie die gleiche Methode, um Bilder des ROI zu erfassen, indem Sie ein geeignetes Sichtfeld auswählen. In diesem Fall waren es 1,0 mm x 0,5 mm, mit 4 Schüssen pro Pixel pro Frame und 10 Frames pro Patch, was einer Ionendosis von 1,31 x 1011 Ionen/cm2 entspricht.
  4. Um die Qualitätskontrolle zu gewährleisten, analysieren Sie das Gewebe und homogenisieren Sie die Proben unmittelbar vor und nach der Untersuchung jedes Hautabschnitts. Verwenden Sie ein Sichtfeld von 0,5 mm x 0,5 mm (256 x 256 Pixel) mit 1 Aufnahme pro Pixel und 1 Bild pro Scan, um insgesamt 15 Scans durchzuführen. Dieser Aufbau entspricht einer Ionendosisdichte von 3,27 x 1010 Ionen/cm2.
  5. Nach der Aufnahme können die resultierenden Massenspektren mit H-, C-, C2- und C3-Ionen kalibriert werden.
  6. Die Datenerfassung und -extraktion erfolgte mit der Software Surface Lab 7.1.

4. Bildregistrierung und Datenanalyse mit MATLAB

  1. Reduzieren Sie SIMS- und SRS-Bilder auf jeweils 3 Dimensionen mit nicht-negativer Matrixfaktorisierung, um sie als rote, grüne und blaue Farbkanäle zu visualisieren.
  2. Wählen Sie übereinstimmende Merkmale zwischen diesen beiden Nicht-Matrix-Faktorisierungsbildern aus, indem Sie das Matlab-Kontrollpunktauswahlwerkzeug "cpselect" auswählen (Matlab, Mathworks, 2019b und Image Processing Toolbox).
  3. Verwenden Sie die Funktionen "cp2tform" und "imtransform", um die Registrierung durchzuführen, indem Sie eine affine Transformation mit den SIMS-Daten als fixierten Bildern und den optischen Spektroskopiedaten als bewegten Bildern durchführen.
  4. Wenn in den ToF-SIMS-Daten für das interessierende Arzneimittel mehrere Peaks festgestellt werden, summieren Sie die Intensitäten dieser Peaks, um eine kombinierte Ionenintensität des Arzneimittels zu erhalten.
  5. Extrahieren Sie die durchschnittliche Gesamtionenzahl der beiden Homogenatdatensätze (vorher und nachher) für jede entsprechende Hautgewebeprobe. Normalisieren Sie mit diesem entsprechenden Wert die Intensitäten in den ToF-SIMS-Daten des Wirkstoffions in jedem Hautbild.
  6. Erstellen Sie nach der Registrierung eine Überlagerung der optischen Spektroskopie und der SIMS-Daten, indem Sie die jeweiligen Bilder den RGB-Kanälen zuweisen: rot (SRS-Bild für CH2), grün (SHG-Bild für Kollagen) und blau (SIMS-Bild für Diclofenac, einschließlich Signale von verschiedenen Ionen bei m/z 214.04, 216.04, 250.02, 252.02, 294.01 und 296.01).

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Ergebnisse

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Abbildung 1 zeigt die Ergebnisse der merkmalsbasierten Bildregistrierung, wobei die registrierten Overlay-Bilder von SRS, SHG und SIMS für zwei Hautproben gezeigt werden - eine mit einem Placebo (Abbildung 1a) und die anderen mit Voltaren-Gel für 4 Stunden (Abbildung 1b) und 16 Stunden (Abbildung 1c). In diesem Bild ist das summierte Wirkstoffintensitätssignal (aus ToF-S...

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Diskussion

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Diese Methode ermöglicht eine korrelative Bildgebung mit nichtlinearer optischer Spektroskopie und massenspektrometrischer Bildgebung, um die Wirkstoffverteilung im Weichgewebe mit räumlicher Auflösung im Submikrometerbereich und hoher Empfindlichkeit zu detektieren. Wichtig ist, dass die Bildgebung ohne die Verwendung von potenziell störenden Markierungen erreicht wird, die für fluoreszenzbasierte Mikroskopie erforderlich wären. Eine weitere Validierung des Arbeitsablaufs umfasste die k...

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Offenlegungen

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MBB ist Mitarbeiter der Haleon CH SARL, der Förderinstitution der Studie.

Danksagungen

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Diese Studie wurde von Haleon CH SARL finanziert. Die Beiträge von NAB und RHG wurden teilweise von der Food and Drug Administration (FDA) des US-Gesundheitsministeriums (HHS) durch eine finanzielle Unterstützung (1-U01-FD006533) unterstützt. Diese Arbeit wurde vom britischen Ministerium für Wirtschaft, Energie und Industriestrategie im Rahmen der Projekte NMS/ID74 und NMS/ST18 des UK National Measurement System finanziert. Der Inhalt dieses Artikels ist der der Autoren und stellt nicht unbedingt die offizielle Meinung der FDA/HHS oder der US-Regierung dar, noch stellt dies eine Befürwortung durch die FDA/HHS dar. Die NAB ist dankbar für die Unterstützung durch die Community for Analytical Measurement Science für den CAMS Fellowship Award 2020, der vom Analytical Chemistry Trust Fund finanziert wird.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Kohärentes Raman-Mikroskop Leica Microsystemshttps://www.leica-microsystems.com/products/confocal-microscopes/p/leica-tcs-sp8-cars/
Menschliche Hautproben Tissue Solutions Ltd, Glasgow
Leica CM 1850 KryostatLeica Biosystemshttps://www.leicabiosystems.com/en-fr/histology-equipment/cryostats/leica-cm1850/Abkündigung
PicoEmerald-S LasersystemAPE Berlinhttps://www.ape-berlin.de/en/cars-srs/
ToF SIMS 5IONToF GmbHhttps://spectral.se/products/tof-sims-5

Referenzen

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Schlagwörter

Korrelative BildgebungHautgewebestimulierte Raman StreuungZwei Photonen FluoreszenzTime of Flight SIMSBildregistrierungWirkstoffpenetration

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