Bewertung der LC3-II-Freisetzung über extrazelluläre Vesikel in Bezug auf die Akkumulation intrazellulärer LC3-positiver Vesikel

Zusammenfassung

Hier stellen wir die Methodik zur prägnanten Bestimmung des Autophagosomenmarkers LC3-II-Spiegel in extrazellulären Vesikeln (EVs) durch Immunblotting vor. Die Analyse der LC3-II-Spiegel in EVs, der Autolysosomenbildung und der Omegasomenbildung deutet auf die neue Rolle von STX6 bei der Freisetzung von LC3-II-positiven EVs hin, wenn die Autophagosomen-Lysosomenfusion gehemmt wird.

Zusammenfassung

Die (Makro-)Autophagie stellt einen fundamentalen zellulären Abbauweg dar. Bei diesem Prozess verschlingen doppelmembranige Vesikel, die als Autophagosomen bekannt sind, zytoplasmatische Inhalte und verschmelzen anschließend mit Lysosomen zum Abbau. Über die kanonische Rolle hinaus modulieren Autophagie-bezogene Gene auch einen sekretorischen Signalweg, der die Freisetzung von Entzündungsmolekülen, Gewebereparaturfaktoren und extrazellulären Vesikeln (EVs) beinhaltet. Insbesondere der Prozess der Dissemination pathologischer Proteine zwischen den Zellen, insbesondere bei neurodegenerativen Erkrankungen, die das Gehirn und das Rückenmark betreffen, unterstreicht die Bedeutung des Verständnisses dieses Phänomens. Neuere Forschungsergebnisse deuten darauf hin, dass das transaktive DNA-bindende Protein 43 kDa (TDP-43), ein Schlüsselakteur bei amyotropher Lateralsklerose und frontotemporaler Lobärdegeneration, autophagieabhängig über EVs freigesetzt wird, die mit dem Autophagosomenmarker Mikrotubuli-assoziierte Proteine 1A/1B Leichtkette 3B-II (LC3-II) angereichert sind, insbesondere wenn die Autophagosom-Lysosomen-Fusion gehemmt wird.

Um den Mechanismus aufzuklären, der der Bildung und Freisetzung von LC3-II-positiven EVs zugrunde liegt, ist es unerlässlich, eine zugängliche und reproduzierbare Methode zur Bewertung sowohl intrazellulärer als auch extrazellulärer LC3-II-positiver Vesikel zu etablieren. In dieser Studie wird ein detailliertes Protokoll zur Bestimmung der LC3-II-Spiegel mittels Immunblotting in zellulären und EV-Fraktionen vorgestellt, die durch differentielle Zentrifugation gewonnen wurden. Bafilomycin A1 (Baf), ein Inhibitor der Autophagosom-Lysosomen-Fusion, dient als Positivkontrolle zur Erhöhung der Spiegel intrazellulärer und extrazellulärer LC3-II-positiver Vesikel. Das Tumor-Suszeptibilitätsgen 101 (TSG101) wird als Marker für multivesikuläre Körper verwendet. Unter Anwendung dieses Protokolls wird gezeigt, dass der siRNA-vermittelte Knockdown von Syntaxin-6 (STX6), einem genetischen Risikofaktor für die sporadische Creutzfeldt-Jakob-Krankheit, die LC3-II-Spiegel in der EV-Fraktion von Zellen, die mit Baf behandelt wurden, erhöht, während er keinen signifikanten Effekt auf die TSG101-Spiegel zeigt. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass STX6 die extrazelluläre Freisetzung von LC3-II über EVs negativ regulieren kann, insbesondere unter Bedingungen, unter denen die Autophagosom-Lysosomen-Fusion beeinträchtigt ist. In Kombination mit etablierten Methoden zur Bewertung der Autophagie liefert dieses Protokoll wertvolle Einblicke in die Rolle spezifischer Moleküle bei der Bildung und Freisetzung von LC3-II-positiven EVs.

Einleitung

Das Transaktivierungsantwort-DNA-bindende Protein 43 (TDP-43) ist ein weit verbreitetes heterogenes nukleäres Ribonukleoprotein, das an der Regulierung des Exon-Spleißens, der Gentranskription und der mRNA-Stabilität beteiligt ist, die für das Überleben der Zellen von entscheidender Bedeutung sind ^1,2. Bei neurodegenerativen Erkrankungen wie der amyotrophen Lateralsklerose (ALS) und der frontotemporalen Lobärdegeneration (FTLD) reichert sich das Kernprotein TDP-43 abnormal im Zytoplasma an. Diese Verschiebung führt zu einem Verlust der TDP-43-Funktion im Zellkern und einem toxischen Funktionsgewinn im Zytoplasma. Die pathologische Akkumulation von TDP-43 beginnt in bestimmten Regionen des Gehirns und des Rückenmarks und breitet sich in diesen Bereichen prionenartig aus, ein Prozess, der eng mit dem Fortschreiten der Krankheit verbunden ist³. Der genaue Mechanismus, durch den sich die TDP-43-Pathologie durch das Gehirn und das Rückenmark ausbreitet, ist jedoch unbekannt.

TDP-43 wird über extrazelluläre Vesikel (EVs) sezerniert, und erhöhte TDP-43-Spiegel werden im Plasma und in der Zerebrospinalflüssigkeit (CSF) von ALS- und FTLD-TDP-Patienten nachgewiesen ^4,5,6. Liquor von Patienten, bei denen ALS und FTLD diagnostiziert wurden, induziert eine intrazelluläre Fehllokalisation und Aggregation von endogenem TDP-43 in menschlichen Gliomzellen⁷. Daher kann TDP-43, das extrazellulär über EVs freigesetzt wird, die Ausbreitung der TDP-43-Pathologie von Zelle zu Zelle vermitteln.

Autophagie ist ein gut erhaltener zellulärer Abbaumechanismus, bei dem unerwünschte Substanzen in Doppelmembranvesikeln, den sogenannten Autophagosomen, eingeschlossen werden, die durch LC3 markiert sind. Diese Autophagosomen fusionieren mit lysosomal-assoziierten Membranprotein 1 (LAMP1)-positiven Lysosomen zu Autolysosomen (LC3⁺/LAMP1⁺), was zu einer Degradation ihres Inhalts^{führt 8}. Histologische Analysen deuten darauf hin, dass sich Autophagosomen, die Einschlüsse verschlingen, in den Neuronen sporadischer ALS-Patienten ansammeln⁹. Einige ursächliche Gene der familiären ALS und FTLD-TDP sind mit der Regulation der Autophagie verbunden 10,11,12. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Autophagie bei ALS- und FTLD-TDP-Patienten unterdrückt ist.

Die vorangegangene Studie zeigte, dass TDP-43 über EVs sezerniert wird, die positiv für den Autophagosomenmarker LC3-II sind, wenn die Autophagosom-Lysosomen-Fusion gehemmt wird¹³. Eine Dysregulation des Autophagie-Lysosomen-Signalwegs könnte nicht nur die intrazelluläre Akkumulation von TDP-43, sondern auch die extrazelluläre Freisetzung von TDP-43 über EVs^{verursachen 14}. Es ist jedoch nicht bekannt, wie LC3-II-positive EVs freigesetzt werden und welche Bedeutung dies für die Ausbreitung der TDP-43-Pathologie hat.

EVs werden in große EVs (100 bis 1000 nm Durchmesser), die aus der Knospung der Zelloberfläche hergestellt werden, und kleine EVs (50 bis 150 nm Durchmesser), die aus der Knospung endosomaler Membranen im Inneren des Endosoms (bekannt als Exosomen) und des Golgi-Apparats entstehen, eingeteilt. Um große und kleine Elektrofahrzeuge getrennt zu sammeln, führen wir eine sequentielle Zentrifugation durch und sammeln Pellets durch Zentrifugation bei 20.000 × g bzw. 110.000 × g. Die Fraktion P1 EV (20.000 × g Pellets) wird zum Sammeln großer EVs vorbereitet, und die P2 EV-Fraktion (110.000 × g Pellets) ist für das Sammeln von kleinen EVs¹⁵ vorbereitet. Die Methodik zur Bestimmung der LC3-II-Spiegel in großen und kleinen EVs, die durch sequentielle Zentrifugation durch Immunblotting gewonnen wurden, ist stabil und reproduzierbar¹⁶. Neben der Analyse der LC3-II-Spiegel in EVs verbessert die Analyse der Autolysosomen- und Omegasomenbildung das Verständnis, wie eine Dysregulation der Autophagie zur Freisetzung von LC3-II-positiven EVs führt. Hier zeigt die vorliegende Studie die suppressive Rolle von Syntaxin 6 (STX6), einem SNARE-Protein, das die Bewegung von Transportvesikeln zu den Zielmembranen¹⁷ fördert, bei der Freisetzung von LC3-II-positiven EVs, wenn die Autophagosom-Lysosomen-Fusion gehemmt wird.

Protokoll

1. Präparation der Zell-, P1- und P2-EV-Fraktion aus dem Kulturmedium von HeLa-Zellen

1. Präparation der P1- und P2-EV-Fraktion aus dem Kulturmedium von HeLa-Zellen
   1. Tag 1
      1. Zählen Sie die Zellen mit einem Zellzähler und säen Sie 1 × 10⁶ Zellen auf einer 6 cm großen Platte, die ein Kulturmedium enthält, das aus DMEM High Glucose, 10 % FBS und 1 % Penicillin/Streptomycin besteht. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C mit 5 % CO₂ und kontrollierter Luftfeuchtigkeit für 24 Stunden.
   2. Tag 2 (fakultativ)
      1. Bereiten Sie eine 20 μM siRNA-Lösung vor.
      2. Mischen Sie 100 μl reduziertes Serummedium und 3 μl siRNA in einem Röhrchen mit niedriger Retention, um Lösung A herzustellen.
      3. Mischen Sie 100 μl reduziertes Serummedium und 5 μl Transfektionsreagenz in einem Röhrchen mit geringer Retention, um Lösung B herzustellen.
      4. Mischen Sie Lösung A und Lösung B und inkubieren Sie die Mischung dann 5 Minuten lang bei Raumtemperatur (RT).
      5. Geben Sie die Mischung aus den Lösungen A und B in das Medium, das für die Kultivierung der HeLa-Zellen verwendet wird. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C mit 5 % CO₂ und kontrollierter Luftfeuchtigkeit für 24 Stunden.
   3. Tag 3
      1. Waschen Sie die Zellen mit PBS und setzen Sie sie 5 Minuten lang 500 μl 0,25 % Trypsin und 1 mM EDTA-Lösung bei 37 °C mit 5 % CO₂ und kontrollierter Luftfeuchtigkeit aus.
      2. Geben Sie 2,5 ml des Kulturmediums in die Zellen und verwenden Sie eine Pasteur-Transferpipette mit einer 200-μl-Pipettenspitze, um eine Einzelzellsuspension herzustellen.
      3. Zählen Sie die Zellen mit einem Zellzähler und säen Sie 1 × 10⁶ Zellen auf einer 10 cm großen Platte. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C mit 5 % CO₂ und kontrollierter Luftfeuchtigkeit für 24 Stunden.
         HINWEIS: Es ist notwendig, mindestens 1 × 10⁶ Zellen vorzubereiten, um EVs aus dem für die Immunblotting-Analyse erforderlichen Kulturmedium zu gewinnen.
   4. Tag 4
      1. Bereiten Sie das Kulturmedium (siehe Schritt 1.1.1.1) vor, das entweder Vehikel (DMSO) oder 100 nM Bafilomycin A1 (Baf) enthält.
      2. Die Zellen werden dem Medium ausgesetzt, das entweder Vehikel oder 100 nM Baf enthält, und sie 24 Stunden lang bei 37 °C mit 5 % CO_{2 und} kontrollierter Luftfeuchtigkeit inkubieren.
   5. Tag 5
      1. Sammeln Sie das gesamte Kulturmedium von der 10-cm-Platte, geben Sie es in ein 15-ml-Röhrchen und zentrifugieren Sie es 10 Minuten lang bei 4 °C bei 3.000 × g , um Zelltrümmer zu entfernen.
         HINWEIS: Die verbleibenden Zellen in der 10-cm-Platte werden in Abschnitt 1.2.1 verwendet.
      2. Zur Isolierung der P1 EV-Fraktion wird der Überstand nach der Zentrifugation bei 3.000 × g in ein Zentrifugationsröhrchen überführt und anschließend bei 20.000 × g bei 4 °C für 1 h zentrifugiert.
      3. Zur Isolierung der P2 EV-Fraktion wird der Überstand nach der Zentrifugation bei 20.000 × g in ein Ultrazentrifugenröhrchen überführt und anschließend bei 110.000 × g bei 4 °C für 1 h zentrifugiert.
      4. Nachdem Sie die überschüssige Feuchtigkeit im Röhrchen mit einem Labortuch abgewischt haben, resuspendieren Sie die restlichen Pellets im Zentrifugationsröhrchen in 50 μl 2x Probenpuffer [2,5 % SDS, 125 mM Tris-HCl-Puffer (pH 6,8), 30 % Glycerin, 10 % 2-Mercaptoethanol, 0,4 % Bromphenolblau], um die P1 EV-Fraktion herzustellen.
      5. Entfernen Sie den Überstand durch Dekantieren, wischen Sie die überschüssige Feuchtigkeit im Inneren des Röhrchens mit einem Labortuch ab und resuspendieren Sie dann die restlichen Pellets im Ultrazentrifugationsröhrchen in 50 μl 2x Probenpuffer, um die P2 EV-Fraktion herzustellen.
      6. Die EV-Fraktionen P1 und P2 werden bei 100 °C auf einem Heizblock 10 min lang inkubiert.
         HINWEIS: Schütteln Sie die Röhrchen nach dem Zentrifugieren bei 20.000 × g und 110.000 × g nicht, um ein versehentliches Entsorgen der restlichen Pellets zu vermeiden. Nachdem Sie das Rohr gekippt haben, um den Überstand zu übertragen, halten Sie die Position des Rohrs aufrecht, um zu verhindern, dass das Pellet erneut in den verbleibenden Überstand eingetaucht wird.
2. Aufbereitung der Zellfraktion aus kultivierten HeLa-Zellen
   1. Tag 5
      1. Nach dem Transfer des Kulturmediums von der 10-cm-Platte in ein 15-ml-Röhrchen waschen Sie die Zellen in der 10-cm-Schale mit PBS und setzen Sie sie 5 Minuten lang 2 ml 0,25 % Trypsin und 1 mM EDTA-Lösung bei 37 °C mit 5 % CO₂ und kontrollierter Luftfeuchtigkeit aus.
      2. Geben Sie 8 ml Wachstumsmedium in die Zellen und verwenden Sie dann eine Pasteur-Transferpipette mit einer 200-μl-Pipettenspitze, um die Zellen zu pipettieren und eine Einzelzellsuspension herzustellen.
      3. Übertragen Sie die Zellsuspension in ein 15-ml-Röhrchen und zentrifugieren Sie sie bei 1.000 × g für 10 min bei 4 °C.
      4. Entfernen Sie den Überstand mit einem Aspirator, geben Sie PBS zum Zellpellet und zentrifugieren Sie dann 5 Minuten lang bei 4 °C bei 1.000 × g .
      5. Entfernen Sie das PBS mit einem Aspirator und beschallen Sie das Zellpellet in 1 ml A68-Puffer [10 mM Tris-HCl-Puffer, pH 7,5, 0,8 M NaCl, 1 mM Ethylenglykol-bis(β-aminoethylether)-N,N,N,N-Tetraessigsäure (EGTA)] mit 1 % Sarkosyl.
      6. Messen Sie die Proteinkonzentration des Zelllysats mit einem BCA-Protein-Assay-Kit.
      7. Mischen Sie 300 μL des Zelllysats mit 100 μL 4x Probenpuffer und inkubieren Sie die Mischung bei 100 °C auf einem Heizblock für 10 min, um die Zellfraktion vorzubereiten.

2. Immunoblotting-Analyse

1. Trennen Sie die äquivalenten Mengen an Proteinen in den Proben nach SDS-SEITE¹⁸.
2. Übertragen Sie die getrennten Proteine auf Polyvinylidendifluorid (PVDF)-Membranen.
3. Nach dem Transfer die Membranen mit dem Blockiermittel für 20 min verstopfen.
4. Inkubieren Sie die blockierte Membran über Nacht mit dem angegebenen Primärantikörper in Tris-Puffer mit 10 % (v/v) Kälberserum bei RT.
5. Waschen Sie die Membran 5 s lang mit Tris-Puffer und inkubieren Sie sie dann 2 h lang mit einem Biotin-konjugierten Sekundärantikörper bei RT.
6. Waschen Sie die Membran 5 s lang mit Tris-Puffer und inkubieren Sie sie dann 1 h lang mit Tris-Puffer, der 0,4 % (v/v) Lösungen A und Lösung B aus dem Kit bei RT enthält.
7. Waschen Sie die Membran mit PBS und inkubieren Sie sie dann mit PBS, das 0,04 % (w/v) Diaminobenzidin, 0,8 % (w/v) NiCl_{2,6H 2}O und 0,3 % (v/v) H₂O₂ für die kolorimetrische Detektion von Banden enthält.
   HINWEIS: Für die Detektion von Signalen ist auch eine Chemilumineszenzmethode akzeptabel.
8. Digitalisieren Sie das Bild der Membran mit einem Scanner und unterziehen Sie es einer Densitometrie-Analyse mit Fiji.
   1. Öffnen Sie das digitalisierte Bild mit Fiji und konvertieren Sie das RGB-Farbbild in ein 8-Bit-Bild, indem Sie auf Bild | Typ | 8-Bit.
   2. Klicken Sie auf das Rechteck-Werkzeug und passen Sie die Größe des Rechtecks an, indem Sie es ziehen, um die Bänder zu umgeben. Identifizieren Sie das zu analysierende Band, indem Sie auf Analysieren | Gele | Wählen Sie Erste Spur aus.
   3. Positionieren Sie das Rechteck auf dem zweiten und den nachfolgenden Bändern, und identifizieren Sie die Bänder für die Analyse, indem Sie auf Analysieren | Gele | Wählen Sie Nächste Spur aus.
   4. Nachdem Sie das endgültige Band erkannt haben, messen Sie die Densitometrie über das Rechteck, indem Sie auf Analysieren | Gele | Handlungsspuren.
   5. Umgeben Sie den Signalbereich des Bandes mit einer geraden Linie, klicken Sie auf das Zauberstabwerkzeug und dann in den Bereich, um die Signalintensität des Bandes zu berechnen.

3. Analyse der Anzahl der Autophagosomen und Autolysosomen

1. Tag 1
   1. Zählen Sie die Anzahl der HeLa-Zellen mit einem Zellzähler und säen Sie 1 × 10⁵ HeLa-Zellen, die LAMP1-GFP und mCherry-LC3 exprimieren, auf einer 3,5-cm-Schale. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C mit 5 % CO₂ und kontrollierter Luftfeuchtigkeit für 24 Stunden.
2. Tag 2 (fakultativ)
   1. Die in Abschnitt 1.1.2 beschriebenen Schritte in 3,5 cm Schalen durchführen.
3. Tag 3
   1. Entsorgen Sie das Nährmedium aus den 3,5-cm-Schalen.
   2. Waschen Sie die Zellen mit PBS, setzen Sie sie 400 μl 0,25 % Trypsin und 1 mM EDTA-Lösung aus und inkubieren Sie sie 5 Minuten lang bei 37 °C mit 5 % CO₂ und kontrollierter Luftfeuchtigkeit.
   3. Geben Sie 1,6 ml des Wachstumsmediums in die Zellen und pipettieren Sie sie mit einer Pasteur-Transferpipette, um eine Einzelzellsuspension herzustellen.
   4. Zählen Sie die Anzahl der Zellen mit dem Zellzähler und säen Sie 1 × 10⁴ Zellen auf einem Deckglas mit 8 Kammern. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C mit 5 % CO₂ und kontrollierter Luftfeuchtigkeit für 24 Stunden.
      HINWEIS: Zwei Vertiefungen des Deckglases mit Kammer sind für Kontroll- bzw. STX6-Knockdown-Zellen nach DMSO- bzw. Baf-Behandlung gemäß Abschnitt 3.4.2 vorbereitet.
4. Tag 4
   1. Bereiten Sie das Nährmedium ohne Phenolrot (DMEM ohne Phenolrot, 10 % FBS, 1 % Penicillin/Streptomycin) vor, das entweder Vehikel (DMSO) oder 100 nM Baf enthält, gelöst in DMSO.
   2. Das Kulturmedium wird durch das Medium ohne Phenolrot ersetzt, das entweder Vehikel oder 100 nM Baf enthält, und 4 Stunden lang inkubieren.
      HINWEIS: Um die Wirkung von Baf auf die Anzahl der Autophagosomen und Autolysosomen zu beurteilen, bereiten Sie vehikelbehandelte Zellen als Kontrollen vor.
   3. Färben Sie die Zellkerne vor der Betrachtung 30 min lang mit 0,33 μg/mL Hoechst 33342.
   4. Führen Sie die Bildgebung lebender Zellen mit einer 60-fach-Objektivlinse an einem konfokalen Lasermikroskop durch und erfassen Sie zehn verschiedene Bilder.
      1. Öffnen Sie das zusammengeführte RGB-Bild in Fidschi und teilen Sie es in die entsprechenden roten, grünen und blauen Bildkomponenten auf, indem Sie auf Bild | Farbe | Kanäle teilen.
      2. Legen Sie einen konstanten Schwellenwert für die roten und grünen Signale in jedem Bild fest, indem Sie auf Bild | Anpassen | Schwellenwert für jedes Experiment.
      3. Zählen Sie die Anzahl der Bereiche, die für rote oder grüne Signale positiv sind, indem Sie auf Analysieren | Partikel analysieren. Aktivieren Sie das Kontrollkästchen Zusammenfassen und klicken Sie dann auf OK. Notieren Sie die Werte aus der Zählung , um Autophagosomen- und Lysosomen-assoziierte Vesikel zu identifizieren.
      4. Um das grüne Bild mit dem roten Bild zu überlagern, setzen Sie den Übertragungsmodus auf UND , indem Sie auf Bearbeiten | Einfügen-Steuerelement. Kopieren Sie das grüne Bild und fügen Sie es dann in das rote Bild ein, um sie zusammenzuführen und Bereiche hervorzuheben, die sowohl für rote als auch für grüne Signale positiv sind.
      5. Um Autolysosomenzahlen zu identifizieren, zählen Sie die Anzahl der Bereiche, die sowohl für rote als auch für grüne Signale positiv sind, indem Sie auf Analysieren | Partikel analysieren. Aktivieren Sie das Kontrollkästchen Zusammenfassen , klicken Sie auf OK, und notieren Sie die Werte im Abschnitt Anzahl , um Vesikel zu identifizieren, die mit Autophagosomen und Lysosomen assoziiert sind.
   5. Teilen Sie die Gesamtzahl der Autolysosomen und Autophagosomen durch die Gesamtzahl der Zellen, um die Anzahl der Autolysosomen und Autophagosomen pro Zelle zu berechnen.
      HINWEIS: Zählen Sie mindestens 35 Zellen in jedem der drei unabhängigen Experimente.

4. Analyse auf Omegasomenbildung

1. Tag 1
   1. Zählen Sie die Anzahl der HeLa-Zellen mit einem Zellzähler und säen Sie 1 × 10⁵ Zellen auf einer 3,5-cm-Schale. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C mit 5 % CO₂ und kontrollierter Luftfeuchtigkeit für 24 Stunden.
2. Tag 2 (fakultativ)
   1. Führen Sie die in Abschnitt 1.1.2 beschriebenen Schritte aus.
3. Tag 3
   1. Bereiten Sie eine einzellige Suspension vor, wie in den Schritten 3.3.1 bis 3.3.2 beschrieben.
   2. Zählen Sie die Zellen mit dem Zellzähler und säen Sie 1 × 10⁵ Zellen auf einer 3,5 cm großen Schale. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C mit 5 % CO₂ und kontrollierter Luftfeuchtigkeit für 24 Stunden.
4. Tag 4
   1. Mischen Sie 1 μg pEGFP-C1-hAtg13, 3 μl des DNA-Transfektionsreagenzes und 100 μl reduziertes Serummedium in einem Röhrchen mit niedriger Retention. Inkubieren Sie die Mischung 20 Minuten lang und geben Sie sie dann in das Kulturmedium.
   2. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C mit 5 % CO₂ und kontrollierter Luftfeuchtigkeit für 24 Stunden.
5. Tag 5
   1. Trypsinisieren Sie die Zellen wie in den Schritten 3.3.1-3.3.2 beschrieben.
   2. Geben Sie 2,5 ml des Wachstumsmediums in die Zellen. Pipettieren Sie die Mischung mit einer Pasteur-Transferpipette, um eine einzellige Suspension herzustellen.
   3. Zählen Sie die Zellen mit dem Zellzähler und säen Sie 1 × 10⁴ Zellen auf einem 8-Kammer-Deckglas aus. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C mit 5 % CO₂ und kontrollierter Luftfeuchtigkeit für 24 Stunden.
6. Tag 6
   1. Führen Sie die Schritte 3.4.1 bis 3.4.4 aus, um die Zellen aus Schritt 4.5.3 mit einem konfokalen Lasermikroskop zu einer lebenden Zellbildgebung zu verarbeiten. Nehmen Sie zehn verschiedene Bildframes auf.
      1. Führen Sie die Schritte 3.4.4.1 bis 3.4.4.3 aus, um die zusammengeführten RGB-Bilder in die entsprechenden roten, grünen und blauen Bildkomponenten aufzuteilen, einen konstanten Schwellenwert für die grünen Signale in jedem Bild festzulegen und die GFP-Signalintensität zu bestimmen. Notieren Sie die Werte aus dem Abschnitt Total Area, um die Signalintensität von GFP-ATG13 zu bestimmen.
      2. Teilen Sie die Gesamtsignalintensität durch die Anzahl der untersuchten Zellen, um die Signalintensität pro Zelle zu berechnen.
         HINWEIS: Zählen Sie mindestens 34 Zellen in jedem der drei unabhängigen Experimente.

Ergebnisse

Wie in früheren Studien gezeigt, erhöhte die Baf-Behandlung die Spiegel von TSG101 (P1: P < 0,01, P2: P = 0,012, bestimmt durch die bidirektionale ANOVA in EZR¹⁹) und LC3-II (P1: P < 0,01, P2: P < 0,01, bestimmt durch die bidirektionale ANOVA in EZR¹⁹) in der EV-reichen Fraktion. Bemerkenswert ist, dass die Baf-Behandlung auch die STX6-Spiegel (P1: P < 0,01, P2: P < 0,01, bestimmt durch die Zwei-Wege-ANOVA in EZR¹⁹) in der EV-Fraktion erhöhte (Abbildung 1A), was darauf hindeutet, dass STX6 ein Bestandteil von EVs sein könnte. Proliferierendes zelluläres Kernantigen (PCNA) wurde in der EV-Fraktion nicht beobachtet. Das Immunoblotting von STX6 in der Zellfraktion zeigte, dass die STX6-Spiegel durch den siRNA-Knockdown um die Hälfte abnahmen (Abbildung 1B). Der STX6-Knockdown hatte keinen Einfluss auf die TSG101-Spiegel in der Zell- und EV-Fraktion sowohl unter Vehikel- als auch unter Baf-behandelten Bedingungen (Abbildung 1C). Der STX6-Knockdown erhöhte jedoch die LC3-II-Spiegel in der Zellfraktion unter der Vehikel-behandelten Bedingung, nicht jedoch unter der Baf-behandelten Bedingung. Der STX6-Knockdown erhöhte auch die LC3-II-Spiegel in der EV-Fraktion unter der Baf-behandelten Bedingung (Abbildung 1D). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Methoden zum Nachweis von LC3-II in EVs durch Immunblotting ausreichend sensitiv sind, auch wenn die Knockdown-Effizienz nicht signifikant ist. Darüber hinaus deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass der STX6-Knockdown die Anzahl der intrazellulären Autophagosomen erhöht und die extrazelluläre Freisetzung von Autophagosom-assoziierten Vesikeln unter Baf-Behandlung verbessert.

Um weiter zu untersuchen, ob der STX6-Knockdown die intrazelluläre Autophagosomen- und Autolysosomenzahl beeinflusst, wurden Autophagosomen und Lysosomen mit dem Autophagosomenmarker mCherry-LC3 und dem Lysosomenmarker LAMP1-GFP sichtbar gemacht. Konfokale Lebendzell-Bildgebung zeigte GFP- und mCherry-positive Vesikel in HeLa-Zellen, die LAMP1-GFP und mCherry-LC3 exprimieren (Abbildung 2A). Autolysosomen wurden als GFP- und mCherry-positive Vesikel identifiziert, während Autophagosomen als GFP-negative und mCherry-positive Vesikel identifiziert wurden. Der STX6-Knockdown erhöhte die Anzahl der Autophagosomen und Autolysosomen unter dem vehikelbehandelten Zustand (Abbildung 2B,C). Der STX6-Knockdown hatte jedoch keinen Einfluss auf die Anzahl der Autophagosomen und Autolysosomen unter der Baf-behandelten Bedingung (Abbildung 2B,C).

Um festzustellen, ob der Anstieg der intrazellulären Autophagosomenzahl aufgrund des STX6-Knockdowns auf eine verstärkte Autophagosomenbildung zurückzuführen ist, wurde die Omegasomenbildung, ein Prozess, der für die Autophagosomenbildung erforderlich ist, mit dem Omegasomenmarker GFP-ATG13 untersucht. Die konfokale Bildgebung von lebenden Zellen lieferte ein assembliertes Bild von GFP-ATG13, das auf die Bildung von Omegasomen hinweist (Abbildung 3A). Der STX6-Knockdown verringerte die Signalintensität von GFP-ATG13 (P = 0,023, bestimmt durch die Zwei-Wege-ANOVA in EZR¹⁹). Während der STX6-Knockdown die Signalintensität von GFP-ATG13 unter den mit Fahrzeugen behandelten Bedingungen nicht signifikant beeinflusste, verringerte er das Signal unter Baf-behandelten Bedingungen signifikant (Abbildung 3B). Zusammenfassend deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass der STX6-Knockdown die Freisetzung von LC3-II-positiven Vesikeln erhöht, die mit der Akkumulation von Autophagosomen-assoziierten Vesikeln verbunden sind.

Abbildung 1: Immunoblotting-Ergebnisse der Zell-, P1- und P2-Fraktionen aus HeLa-Zellen, die entweder mit Kontroll- oder STX6-siRNA im Rahmen einer Vehikel- oder Baf-Behandlung transfiziert wurden. HeLa-Zellen wurden nach der Transfektion mit Kontroll- oder STX6-siRNA für 24 h mit Vehikel (DMSO) oder 100 nM Baf behandelt. Die Zellfraktionen, P1 (20.000 × g Pellet) und P2 (110.000 × g Pellet) wurden isoliert. (A) Repräsentative Immunblotting-Bilder jeder Fraktion mit STX6, TSG101, LC3 und PCNA. (B-D) Die densitometrische Analyse für (B) STX6, (C) TSG101 und (D) LC3-II wurde anhand der Immunoblot-Bilder durchgeführt. Die Signalintensitäten wurden auf die Kontroll- oder STX6-siRNA-transfizierten Zellen normalisiert, die mit Vehikel oder Baf behandelt wurden. Die Balkendiagramme stellen Mittelwerte ± S.E.M. (N = 3) dar. * zeigt P < 0,05 durch einen zweiseitigen ungepaarten t-Test in Excel an. Abkürzungen: STX6 = Syntaxin 6; Baf = bafilomycin A1; DMSO = Dimethylsulfoxid; TSG101 = Tumor-Suszeptibilitäts-Gen 101; LC3 = Mikrotubuli-assoziierte Proteine 1A/1B, leichte Kette 3B; PCNA = proliferierendes zelluläres Kernantigen; S.E.M. = Standardfehler des Mittelwerts. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Konfokale Bildanalyse von HeLa-Zellen, die Lamp1-GFP und mCherry-LC3 co-exprimieren, transfiziert mit Kontroll- oder STX6-siRNA unter der Vehikel- und Baf-behandelten Bedingung. (A) Konfokale Bilder von HeLa-Zellen, die LAMP1-GFP und mCherry-LC3 stabil exprimieren, wurden 48 h lang mit Kontroll- oder STX6-siRNA transfiziert, gefolgt von einer Exposition mit DMSO oder 400 nM Baf für 4 h. Maßstabsbalken = 20 μm. (B,C) Die Qunatifizierung von (B) Autophagosomen (LAMP1-GFP negativ und mCherry-LC3 positive Punkte) und (C) Autolysosomen (LAMP1-GFP und mCherry-LC3 doppelt-positive Punkte) wurde mit Hilfe von Fiji-Software durchgeführt. Die Daten in den Balkendiagrammen werden als Mittelwerte ± S.E.M. (N = 3) dargestellt. * gibt P < 0,05 an, basierend auf einem zweiseitigen ungepaarten t-Test in Excel. Abkürzungen: Lamp1 = lysosomal-assoziiertes Membranprotein 1; LC3 = Mikrotubuli-assoziierte Proteine 1A/1B, leichte Kette 3B; STX6 = Syntaxin 6; Baf = bafilomycin A1; GFP = grün fluoreszierendes Protein; S.E.M. = Standardfehler des Mittelwerts. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Konfokale Bildgebung von HeLa-Zellen, die GFP-ATG13 exprimieren, entweder mit Kontroll- oder STX6-siRNA transfiziert und einer Vehikel- oder Baf-Behandlung unterzogen. (A) HeLa-Zellen wurden mit Kontroll- oder STX6-siRNA transfiziert, gefolgt von einer pEGFP-C1-hAtg13-Transfektion und 4 h lang mit DMSO oder 400 nM Baf behandelt. Maßstabsbalken = 20 μm. (B) Die relativen Signalintensitäten wurden bestimmt, indem das Signal in jeder Bedingung auf das von Kontroll-siRNA-transfizierten Zellen normalisiert wurde, die mit Baf behandelt wurden. Das Balkendiagramm zeigt die Daten als Mittelwert ± S.E.M. (N = 3). * zeigt P < 0,05 durch den zweiseitigen ungepaarten t-Test in Excel an. Abkürzungen: hAtg13 = humanes Autophagie-verwandtes Gen 13; STX6 = Syntaxin 6; Baf = bafilomycin A1; DMSO = Dimethylsulfoxid; S.E.M. = Standardfehler des Mittelwerts. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Ergänzende Abbildung S1: Immunoplot-Analyse der Zell-, P1- und P2-Fraktionen aus HeLa-Zellen, die mit Kontroll-siRNA transfiziert und mit Baf behandelt wurden. HeLa-Zellen wurden mit Kontroll-siRNA transfiziert und 24 h lang 100 nM Baf ausgesetzt. Anschließend wurden die Fraktionen hergestellt: Zelle, P1 (20.000 × g Pellet) und P2 (110.000 × g Pellet). Repräsentative Immunoblot-Bilder von ULK1 und PCNA, die ihre Spiegel in jeder Fraktion zum Vergleich zeigen. Abkürzungen: Baf = Bafilomycin A1; ULK1 = unc-51 wie Autophagie-aktivierende Kinase 1; PCNA = proliferierendes zelluläres nukleares Antigen. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Diskussion

Die Immunblotting-Studie ergab LC3-II- und TSG101-Spiegel in der zellulären Fraktion, der mikrovesikelreichen P1-EV-Fraktion und der exosomenreichen P2-EV-Fraktion. Die Bildgebung von lebenden Zellen wurde verwendet, um Autophagosomen, Autolysosomen und Omegasomen zu untersuchen und Aufschluss darüber zu geben, ob der STX6-Knockdown die Autophagie beeinflusst. Diese kombinierten Ergebnisse deuten darauf hin, dass der STX6-Knockdown die Freisetzung von LC3-II-positiven EVs beeinflusst, was möglicherweise mit einer Dysregulation des Autophagie-Signalwegs zusammenhängt. Ein wesentlicher Vorteil dieser Methode ist die Unterscheidung zwischen großen und kleinen Elektrofahrzeugen, die aus unterschiedlichen Quellen stammen. Die durchflusszytometrische Analyse mit spezifischen Markern für Mikrovesikel, Exosomen oder das Golgi-Gerät kann weiter klären, wie der STX6-Knockdown die Freisetzung von LC3-II-positiven Vesikeln beeinflusst.

Eine Einschränkung der Immunblotting-Studie besteht jedoch darin, dass unklar bleibt, ob der beobachtete Anstieg der LC3-II-Spiegel in der EV-Fraktion nach STX6-Knockdown unter Baf-Behandlung auf eine erhöhte Anzahl von LC3-II-positiven Vesikeln oder auf einen Anstieg der LC3-II-Spiegel pro EV zurückzuführen ist. Um zwischen diesen Möglichkeiten zu unterscheiden, kann die Zählung von Vesikeln mittels Nanopartikel-Tracking-Analyse oder Durchflusszytometrie-Analyse helfen zu bestimmen, ob die Anzahl der LC3-II-positiven Vesikel erhöht ist oder ob die LC3-II-Spiegel pro Vesikel erhöht sind.

Ein kritischer Schritt im Protokoll ist die Fraktionierung des Kulturmediums zur Herstellung der EV-Fraktion. EVs werden als winzige Kügelchen im Zentrifugationsröhrchen beobachtet. Um eine vergleichbare EV-Fraktion herzustellen, ist es wichtig, den Überstand nach der Zentrifugation vorsichtig zu übertragen oder zu verwerfen, um eine Verdünnung der Proteinkonzentration der EV-Pellets zu vermeiden. Um die Kontamination von der Zellfraktion in die EV-Fraktion zu untersuchen, wurden die Konzentrationen eines zytoplasmatischen Proteins, der unc-51-ähnlichen Autophagie-aktivierenden Kinase 1 (ULK1), und eines Kernproteins, PCNA, zwischen den Fraktionen in dieser Studie verglichen (Ergänzende Abbildung S1). Die Proteinkonzentration in der Zellfraktion spiegelt im Allgemeinen die Zellzahl wider, aber die zelluläre Proteinkonzentration wird durch die Zellzyklusstadien²⁰ oder Störungen der Proteostase beeinflusst²¹. Die Autophagie ist entscheidend für die Aufrechterhaltung der Proteostase²². Eine Dysregulation der Autophagie durch STX6-Knockdown oder Baf-Behandlung kann die Proteinkonzentration unabhängig von der Zellzahl verändern.

Der STX6-Knockdown wird durch siRNA-Transfektion erreicht, und die Überexpression von GFP-ATG13 wird durch DNA-Transfektion erreicht. Die Effizienz der Transfektion wird durch den Zelltyp, die Dichte und die Anzahl der Zellen beeinflusst. Eine effiziente Ausrichtung von siRNA-Sequenzen könnte sich auch auf die Knockdown-Effizienz auswirken. Anpassungen sind erforderlich, wenn die Transfektionseffizienz gering ist.

Die vorliegenden Ergebnisse deuten darauf hin, dass der STX6-Knockdown die Spiegel des Autophagosomenmarkers LC3-II in der EV-Fraktion unter Baf-behandelten Bedingungen erhöhte, aber die Spiegel von TSG101 nicht beeinflusste. Dies deutet darauf hin, dass STX6 die Freisetzung von Vesikeln unterdrückt, die von Autophagosomen, aber nicht von MVBs stammen, wenn die Autophagosomen-Lysosomen-Fusion gehemmt wird.

Der STX6-Knockdown erhöhte auch die zellulären LC3-II-Spiegel unter Wachstumsbedingungen, was darauf hindeutet, dass STX6 die Autophagie reguliert. Tatsächlich erhöhte der STX6-Knockdown die Anzahl der Autophagosomen und Autolysosomen, während er die Omegasomenbildung nicht verbesserte. Die Reifung von Autolysosomen führt zu einer autophagischen Lysosomenreformation²³. Es ist möglich, dass STX6 den Reifungsprozess von Autolysosomen vermittelt und sein Funktionsverlust die Anzahl der unreifen Autolysosomen erhöht, was zu einer Dysregulation der Autophagosomen-Lysosomen-Fusion aufgrund der Unterdrückung der autophagischen Lysosomenreformation führt.

Die Baf-Behandlung erhöhte die STX6-Spiegel in der EV-Fraktion, selbst wenn ihre Expression herunterreguliert war. Frühere Studien deuteten darauf hin, dass Autophagosomen-assoziierte Vesikel als EVs freigesetzt werden, wenn die lysosomale Funktion gehemmt wird^13,14. Es ist bekannt, dass STX6 an Autophagosomen-assoziierten Vesikeln lokalisiert, wie z. B. an Gruppe A Streptococcus (GAS)-haltigen Autophagosomen-ähnlichen Vakuolen²⁴. Daher könnte STX6 an Autophagosomen-assoziierten Vesikeln lokalisiert sein, die als EVs freigesetzt werden, wenn die Autophagosom-Lysosomen-Fusion gehemmt wird.

Die Ausbreitung der TDP-43-Pathologie ist eng mit dem Fortschreiten von ALS und FTLD-TDP³ verbunden. Obwohl unklar bleibt, wie sich die TDP-43-Pathologie durch das Gehirn und das Rückenmark ausbreitet, könnte der EV-Signalweg die Ausbreitung vermitteln. Frühere Studien haben gezeigt, dass eine Dysregulation des Autophagie-Lysosomen-Signalwegs zur Freisetzung von LC3-II-positiven EVs führt, die TDP-43 enthalten¹³. Die vorliegende Studie deutet auf eine Rolle von STX6 bei der Regulierung der EV-Freisetzung hin, wenn die Autophagosom-Lysosomen-Fusion gehemmt wird. Die Methodik zur Bestimmung der LC3-II-Spiegel in der Zell- und EV-Fraktion mittels Immunblotting sollte sich in zukünftigen Studien als hilfreich erweisen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
0,25 % Trypsin EDTA	Fujifilm Wako	201-16945
10 cm Schale	Thermo Fisher Scientific	150464
15 mL Tube	Thermo Fisher Scientific	339650
200 μ L Pipettenspitze	Nippon Genetics	FG-301	Pipettieren
2-Mercaptoethanol	Nacalai Tesque	21417-52	ein Material für Probenpufferlösung
3,3'-Diaminobenzidin Tetrahydrochlorid	Nacalai Tesque	11009-41	ein Material für DAB-Lösung
3,5 cm Schale	Thermo Fisher Scientific	150460
6 cm Schale	TrueLine	TR4001
Aluminium-Block-Thermostatbäder (trockene Thermobäder)	EYELA	273860
Aspirator	SANSYO	SAP-102	Inhalationslösung
Avanti JXN-30	Beckman Coulter	B34193
Bafilomycin A1	Adipogen	BVT-0252
Biotin-konjugierter Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG-Antikörpervektor	Laboratorien	BA-1000	2. Antikörper für Immunblotting
Biotin-konjugiertes Pferd Antimouse IgG Antikörper	Vektor Laboratorien	BA-2000	2. Antikörper für das Immunblotting
Blocking One	Nacalai Tesque	03953-95	ein Material für das Immunblotting
Bromophenol Blue	Nacalai Tesque	05808-61	ein Material für Probenpufferlösung
Kälberserum	cytiva	SH30073.03
CanoScan LiDE 220	Canon	CSLIDE220	Scanner
Zentrifuge 5702 R	eppendolf	5703000039
Counting Slides Dual Chamber	Bio-Rad	1450015J	Zellzählung
Digital Sonifier 450	BRANSON
Dimethylsulfoxid	nacalai tasque	09659-14	Fahrzeug
DMEM High Glucose	Nacalai Tesque	08458-45	Kulturmedium
DMEM ohne Phenolrot	Nacalai Tesque	08489-45	Nährmedium
EGTA	Dojindo	348-01311	ein Material für A68 Lösung
Excel	Microsoft	Version 16.16.27	satistische Analyse
EZR	Referenz Nr. 24	Version 1.68	satistische Analyse
FBS	Sigma	173012	Kulturmedium
Fidschi	NIH		Bildanalysewerkzeug
Glycerol	Nacalai Tesque	09886-05	ein Material für Probenpufferlösung
Hoehst33342	Dojindo	H342
Wasserstoffperoxid	Fujifilm Wako	080-0186	ein Material für DAB-Lösung
Kimwipe S-200	NIPPON PAPER CRECIA	62011	Reinigungstuch
Retention Tube	Nippon Genetics	FG-MCT015CLB	siRNA und DNA-Transfektion
LSM780 Konfokales Lasermikroskop	Carl Zeiss
Monoklonale Maus Anti-LC3 Antikörper	MBL	M186-3	1. Antikörper für Immunblotting
Nickel(II)-chlorid-Hexahydrat	Fujifilm Wako	149-01041	ein Material für DAB-Lösung
N-Lauroylsarcosin Natriumsalz	Nacalai Tesque	20117-12
Optima XE-90 Ultrazentrifuge	Beckman Coulter	A94471
Opti-MEM I reduziertes Serum Medium	Thermo Fisher Scientific	31985-070	siRNA- und DNA-Transfektion
pEGFP-C1-hAtg13	Addgene	22875
Penicillin/Streptomycin	Nacalai Tesque	26253-84	Kulturmedium
Pierce BCA Protein Assay Kits	Thermo Fisher Scientific	23225
Polyklonaler Kaninchen-Anti-PCNA-Antikörper	BioAcademia	70-080	1. Antikörper für Immunblotting
Polyklonales Kaninchen Anti-Syntaxin 6 Antikörper	ProteinTech	10841-1-AP	1. Antikörper für Immunblotting
Polyklonales Kaninchen Anti-TSG101 Antikörper	ProteinTech	28283-1-AP	1. Antikörper für Immunblotting
Polyklonales Kaninchen Anti-ULK1 Antikörper	ProteinTech	20986-1-AP	1. Antikörper für Immunblotting
Polyvinylidendifluorid Membran	Milliore	IPVH00010	ein Material für das Immunblotting
R	R Entwicklung Kernteam	Version 4.4.1	satistische Analyse
RNAiMAX	Thermo Fisher Scientific	13778	siRNA Transfektionsreagenz
siRNA STX6	Thermo Fisher Scientific	HSS115604	siRNA für die Transfektion
Natriumchlorid	Nacalai Tesque	31320-05	ein Material für Tris Puffer und A68-Lösung
Natriumdodecylsulfat,	Fujifilm Wako	192-13981	ein Material für Probenpufferlösung
, Spark Microplate Reader	TECAN
Stealth RNAi, Negative Control Duplexes, Med GC	Thermo Fisher Scientific	siRNA-Transfektion
Saccharose	Fujifilm Wako	193-00025	ein Material für die A68-Lösung
TC20 Automatisierter Zellzähler mit Thermodrucker	Bio-Rad	1450109J1
Zellzählung Thermobath	TOKYO RIKAKIKAI	MG-3100	Inkubation
TransIT-293	Mirus Bio	MIR 2700	DNA-Transfektionsreagenz
TransIT-LT1	Mirus Bio	DNA-Transfektionsreagenz
Tris(hydroxymethyl)aminomethan	Nacalai Tesque	35406-75	ein Material für Tris-Puffer, Probenpuffer und A68-Lösung
Trypan Blue Dye 0,40%	Bio-Rad	1450021	Zellzählung
Ultra-Clear Open-Top Tube, 16 x 96mm	Beckman Coulter	361706	Sammeln für die P1 EV Fraktion
Ultra-Clear Tube, 14 x 89 mm	Beckman Coulter	344059	Sammeln für die P2 EV
Fraktion Vectastain ABC Standard Kit	Vector Laboratories	PK-4000	Immunoblotting
Waschflasche	As One	1-4640-02	Waschmembran
μ-Slide 8 Well High	ibidi	80806