Die Beurteilung Neural Stem Cell Motilität Mit einem Agarosegel-basierte Mikrofluidikvorrichtung

Zusammenfassung

Wir zeigen, dass die Überexpression des epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptoren (EGFR) die Beweglichkeit der neuralen Stammzellen (NSCs) unter Verwendung eines neuartigen Agarosegel basierten mikrofluidischen Gerät verbessert. Diese Technologie kann ohne weiteres auf andere Säugetierzellen Systeme, bei denen Zellen Quellen sind rar, wie menschliche neurale Stammzellen, und die Umdrehung um Zeit ist von entscheidender Bedeutung.

Zusammenfassung

Während Mikrofluidik-Technologie erreicht einen neuen Grad der Reife für makromolekulare Assays sind zell-basierte Assays noch in den Kinderschuhen Stufe ^1. Dies ist vor allem wegen der Schwierigkeit, mit denen man eine Zelle-kompatibel und stabil Mikroumgebung mit herkömmlichen Mikrofabrikation Techniken und Materialien zu erstellen. Wir lösen dieses Problem durch die Einführung eines neuartige Mikro-Material, Agarosegel, als Basismaterial für die Mikrofluidik-Gerät. Agarose-Gel ist sehr formbar und gas-und Nährstoffe, die für das Überleben der Zelle und somit ein ideales Material für zell-basierte Assays. Wir haben früher die Agarosegel-basierte Geräte wurden bei der Untersuchung von Bakterien und neutrophilen Zellwanderung ² erfolgreichen gezeigt. In diesem Bericht werden drei parallel mikrofluidischen Kanälen in einem Agarosegel Membran von etwa 1 mm Dicke gemustert. Constant fließt mit Medien / Puffer sind in den beiden seitlichen Kanälen mittels einer peristaltischen Pumpe aufrechterhalten. Die Zellen werden in den Center-Kanal für die Beobachtung gehalten. Da die Nährstoffe und Chemikalien in die Seitenkanäle ständig diffundieren von der Seite zu Center-Kanal, die chemische Umgebung des Center-Kanals sind, ist leicht über die Strömung entlang der seitlichen Kanälen gesteuert. Mit diesem Gerät zeigen wir, dass die Bewegung der neuralen Stammzellen optisch kann mit Leichtigkeit unter verschiedenen chemischen Bedingungen überwacht werden, und die experimentellen Ergebnisse zeigen, dass die Überexpression des epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptoren (EGFR) die Beweglichkeit der neuralen Stammzellen erhöht. Motilität von neuralen Stammzellen ist ein wichtiger Biomarker für die Beurteilung der Zellen Aggressivität, damit tumorigenen Faktor ^3. Die Entschlüsselung der zugrunde liegende Mechanismus NSC Beweglichkeit erhalten einen Einblick in beide Störungen der neuronalen Entwicklung und in Hirntumoren Stammzellen Invasion ergeben.

Protokoll

Verfahren

Coating Folien mit Fibronektin

Vor der Montage der Mikrofluidikvorrichtung, sterilisieren Glasplättchen mit Fibronektin. Streichen Sie die Folien in einer biohood auf der Aufrechterhaltung der Sterilität. Richten Sie eine sterile PDMS spacer entlang der Ränder der Folie und markieren Sie die Seite, nach oben ist mit einem Permanent-Marker. 1 ml einer 5 mg / ml Lösung von Fibronektin (Sigma) im Inneren des PDMS spacer über die Gesamtheit der dem Glasträger. Lassen Sie die Dias ungestört für eine Stunde, dann vollständig trocknen mit _einer N2-Pistole. Die Folien können bei 4 ^o C für spätere Experimente aufbewahrt werden.

Zusammenbau des Geräts

Die gesamte Vorrichtung Montage-Protokoll ist in einer biohood unter sterilen Bedingungen durchgeführt, unter Verwendung der folgenden Verfahren:

1. Reinigen Sie die Silizium-Master mit den Mikrokanälen, die ihm durch Abwischen es mit 70% Ethanol und Trocknung mit dem N ₂ Waffe gemustert. Legen Sie eine sterile PDMS spacer von 1 mm Höhe mit einer Pinzette in das Relief Features des Meisters.
2. Bereiten Sie das Agarosegel in das Gerät durch Wiegen 0,3 g Agarose-Pulver (Fisher Scientific) und 10 ml CO verwendet _{2-unabhängigen} Medien (Invitrogen) in einer 50 ml-Becherglas. Rühren Sie die Mischung mit einem Spatel und Hitze in der Mikrowelle für 20 Sekunden auf HIGH. Wenn ungelöste Granulat vorhanden sind, das Gemisch für weitere 10 Sekunden und wirbeln die heiße Mischung, um loszuwerden, die letzten verbliebenen Körner. Wiederholen Sie den Vorgang mit einer Aufheizzeit von 8 Sekunden, und dann 5 Sekunden.
3. Schnell gießen Sie die Agarose-Lösung auf die Silizium-Master durch die PDMS spacer umgeben und sofort Deckung der Agarose-Gemisch mit einem sterilen Objektträger aus Glas. Tragen Sie einen konstanten, sanften Druck auf die Folie für ca. 2 Minuten, um sicherzustellen, dass die Agarose wird Gel auf die gleiche konstante 1 mm Höhe wie die PDMS spacer.
4. Nach dem Agarosegelen, Abziehen der gemusterten Agarosegel mit dem PDMS spacer aus dem Silizium-Master und den Transfer zu einem Fibronektin beschichteten Objektträger mit den Mikrokanälen im Agarosegel vor der Folie. Verwenden Sie eine 16-Gauge-Kanüle, um Löcher in das Reservoir Regionen der Mikrokanäle für Ein-und Auslass greift Punsch. Add 500 ul der CO _{2-unabhängigen} Medien, die gemusterten Agarosegel auf der Folie, um ein Austrocknen der Mikrokanäle zu verhindern.
5. Waschen Sie den Acryl-Verteiler in das Gerät mit 70% Ethanol verwendet und gründlich mit VE-Wasser. Richten Sie die Löcher in den Verteiler mit den Löchern in den Agarosegel mit den Mikrokanälen gestanzt. Dann richten Sie den Verteiler mit dem Gel, PDMS Spacer und das Fibronektin Folie mit dem Metallrahmen des Gerätes. Bringen Sie die Schrauben in das Gerät und ziehen Sie den Punkt des Widerstands mit einem Schraubendreher. Dies geschieht, um sicherzustellen, dass das Gerät nicht, um das Ausmaß der Verformung der Mikrokanäle in die Agarose zu stark angezogen. Ziehen Sie die Schrauben im Uhrzeigersinn, um sicherzustellen, dass das Gel im Inneren des Gerätes nicht verschiebt. Testen Sie das Gerät auf Undichtigkeiten und Verstopfungen in den Mikrokanälen mit einem 1ml Spritze. Die Spritze ist mit Tygon-Schlauch mit einem Gel-loading Pipettenspitze am Ende des Rohres angebracht, um CO _{2-unabhängigen} Medien in den Mikrokanälen zu injizieren. Ein Mikrokanal ist erfolgreich gebildet, wenn Medien beobachtet wird, nur aus der Steckdose des Mikrokanals verlassen, wenn Medien in die entsprechenden Einlass injiziert wird. Jetzt ist das Gerät einsatzbereit.

Vorbereitung und Aussaat der Zellen in das Gerät

Wenn die Zellen 70% Konfluenz (Zelldichte etwa 100.000 Zellen / ml) zu erreichen, sind sie bereit, in das Gerät ausgesät werden.

Vorbehaltlich der Zellen zu zwei DPBS (Invitrogen) wäscht. Geben Sie 200 ul von Trypsin-EDTA (Invitrogen), um die Zellen zu lösen. Übertragen Sie die Zellen in ein 15 ml Zentrifugenröhrchen mit 5 ml M2 serumhaltigen, um das Trypsin zu inaktivieren. Zentrifugiert das Wachstum Medien mit den Zellen bei 1000 rpm für 5 Minuten. Abgesaugt Überstand und das Pellet von Zellen mit 5 ml DPBS. Zentrifugieren Sie die DPBS Zellen wieder unter den gleichen Bedingungen. Abgesaugt Überstand wieder, und das Pellet der Zelle in 500 ul der CO _{2-unabhängige} Medien.

Seed resultierenden Suspension von Zellen in der Mitte Mikrokanal des Geräts über die Schwerkraft angetriebene Strömung. Fügen Sie die Ein-und Auslass des Zentrums Mikrokanal mit 60 ul der Zellsuspension und 20 ul CO _{2-unabhängige} Medium bzw.. Beachten Sie die Mitte Mikrokanal unter einem Hellfeld-Mikroskopie für die Zelladhäsion zu suchen. Die Zellen in der Regel nach 10 Minuten zu halten. Nachdem die Zellen, um den Kanal unten bei einer richtigen Dichte haften, pipettiert die restlichen Zellsuspension in den Einlass und den Medien in der Steckdose. Legen Sie 60 ul CO _{2-unabhängigen} Medien in beiden Ein-und Auslass des Center-Kanals. Legen Sie PDMS umfasst über the-Center Ein-und Auslass zu minimieren Verdunstung von Medien aus dem Center-Kanal.

Imaging der Zellen in das Gerät

Vor der Montage der Vorrichtung, Gewinde der sterile Schlauch-Schlauch durch die Wetterstation des Mikroskops (Olympus X81) und schließen mit der Schlauchpumpe (Watson-Marlow 205U/CA). Flush PBS durch den Schlauch mit einer Rate von 4 RPM. Nach der Montage des Gerätes, bereiten geeigneten Konzentrationen des epidermalen Wachstumsfaktors (EGF) (Sigma)-Lösungen in der CO _{2-unabhängigen} Medien in einem 15 ml Zentrifugenröhrchen. Vortex die EGF-Lösungen für 5 Sekunden und schließen mit dem Schlauch. Verbinden Sie die Schläuche mit entsprechenden EGF-Konzentrationen auf das Gerät markiert. Es dauert etwa eine Stunde für den EGF über den Kanal Grat diffundieren und einen stetigen chemischen Gradienten.

Ein Imaging-Software, Slidebook, wird verwendet, um eine Reihe von Bildern in alle 10 Minuten für ca. 5 Stunden in einem experimentellen Lauf zu nehmen. Die xy automatisierte Bühne ist so programmiert, dass zwei Teilbereiche (jeweils mit einer Fläche von 400μm x400μm) des gleichen Center-Kanal, und insgesamt drei Center-Kanäle zu einem bestimmten Zeitpunkt abgebildet werden. Zellen in verschiedenen Center-Kanäle (in der Regel 3 in einem Lauf) haben unterschiedliche EGF-Konzentrationen, wie auf dem Schlauch markiert.

Materialien und Geräte

Zelllinien: C17.2 Zellen NSCs aus dem externen Keimblattes der postnatalen Kleinhirn der Maus ^{6, 7} abgeleitet. Mit Hilfe dieser Zelllinie, haben wir zwei andere Mäuse-Stammzellen-Linien mit Retrovirus Transfektion Methode entwickelt. Diese beiden stabil transfizierter Zelllinien sind (1) wtEGFR -, dass über-Ausdruck der menschlichen Wildtyp-EGFR, und (2) ΔEGFR - das ist eine konstitutiv aktive EGFR-Mutante. Zur Erleichterung der Erkennung führen Retroviren ein Rückgrat mit dem Gen von Interesse durch eine interne Website für ribosomalen Bindungsstellen (IRES) und dem grün fluoreszierenden Protein (GFP) gefolgt.

Zellkultur: Die Maus C17.2 NSCs und deren Varianten wurden in einer 6-Well-Platte in M2-Medium (DMEM (Invitrogen) mit 10% fötalem Rinderserum (FBS) (Invitrogen), 5% Pferdeserum (HS) (Invitrogen gewachsen ) und 1% Penicillin / Streptomycin (Invitrogen).) Zellen wurden bei 37 ^o C in 80% Luft und 5% CO _{2 gehalten.}

Mikrofluidik-Gerät: Ein Kunststoff-Verteiler, ein PDMS spacer und einem Edelstahl-Rahmen zur Aufnahme des Gerätes in Kraft.

Imaging

Eine invertierte Fluoreszenzmikroskop (Olympus IX-81) verwendet wird, in Verbindung mit einer intensivierten CCD-Kamera (Orca, Hamamatsu). Die mikrofluidischen Gerät basiert auf einer automatisierten xyz Bühne montiert, und die Bühne wird von einer Klimakammer, die eine Temperatur von 37 ^o C. unterhält eingeschlossen Es gibt in der Regel 3-4 Geräte auf dem gleichen Chip, die zur gleichen Zeitpunkt mit dem automatisierten xyz Bühne gefilmt werden.

Flow-Pflege

Eine peristaltische Pumpe mit 8 parallelen Linien (Watson-Marlow 205U/CA) auto wird verwendet, um Strömungen in allen Sink-und Source-Kanäle zu erhalten.

Abb.. 1 Motilität von drei NSC-Stämme (Eltern, wtEGFR und D EGFR) in verschiedenen Konzentrationen EGF Alle Bahnen sind von der Verfolgung einen Film von 5 Stunden (mit Ausnahme von wtEGF 100ng/ml, 4 Stunden) genommen, und der Ursprung aller Tracks wurden neu auf (0,0) zu Vergleichszwecken.

Abb.. 2 Korrelation von EGFR Expression und Motilität (a) zwei Bilder wtEGF NSCs auf der Oberfläche eines mikrofluidischen Kanal mit 100ng/ml EGF. Das linke Bild ist ein Fluoreszenzbild und das Recht ist eine Übertragung Hellfeldbild. Der Maßstab ist 100 um, und die Kanalbreite 400 um. Die Zellen werden in zwei Populationen von der Helligkeit der GFP zum Ausdruck getrennt. Cells in den blauen Kreisen Dimmer sind, haben somit weniger EGFR-Expression Ebene; und Zellen in roten Kreise sind brigher, haben also höhere EGFR-Expression auf. (B) Trajektorien von Zellen mit niedriger und hoher EGFR-Expression auf. Diese Bahnen sind von einem 4 Stunden langen Film übernommen.

Diskussion

Abb.. 1 zeigt Trajektorien von drei NSC-Stämme, die elterliche Zellen, die wtEGFR und die ΔEGFR (Kontrolle). Jeder Satz von Trajektorien wurden aus einer 5 Stunden langen Film erhalten. Für Eltern Zellen, erreichte Zellbewegung bei EGF-Konzentration betrug ~ 10ng/ml; für wtEGFR Zellen verschoben Zellmotilität Spitze 100ng/ml oder höher; für ΔEGFR Zellen wurde die Zellbewegung unabhängig von EGF-Konzentration wie erwartet.

Die wtEGF Zellen mit 100ng/ml waren die beweglichen Zellen, zogen sie etwa 1,5 mal schneller als der elterlichen...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Dulbecco' s Modifiziertes Eagle-Medium (DMEM) (1X)	Reagenz	Invitrogen	11971-025
CO2-unabhängiges Medium	Reagenz	Invitrogen	18045-088	Ein proprietäres Medium, das nicht von HEPES stammt und zur Unterstützung des Zellwachstums einer Vielzahl von Epithel-, Fibroblasten- und lymphoiden Zelllinien unter atmosphärischen Bedingungen geeignet ist, enthält kein L-Glutamin
Trypsin-EDTA-Reagenz			Invitrogen 25200-072
PBS	Reagenz	Invitrogen	14190-144	Phosphatgepufferte Kochsalzlösung, ohne Calcium oder Magnesium
Pen/Strep	Reagenz	Invitrogen	15140-122	Enthält 10.000 Einheiten Penicillin (Base) und 10.000 g Streptomycin (Base)/ml unter Verwendung von Penicillin G (Natriumsalz) und Streptomycinsulfat in 0,85% Kochsalzlösung
FBS	Reagenz	Invitrogen	10437-028	Fötales Rind Serum, qualifiziertes
Pferdeserum	Reagenz	Invitrogen	16050-130	Pferdeserum, EIA-geprüftes (negatives) Serum
Fibronektin-Reagenz		Sigma-Aldrich	F0895	Fibronektin aus menschlichem Plasma, auch kaltes unlösliches Globulin
genannt EGF-Reagenz		Sigma-Aldrich	E4127	Epidermaler Wachstumsfaktor aus der submaxillären Drüse der Maus, lyophilisiert
	Agarose-Reagenz	Fisher Scientific	BP1356-500