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Methodenartikel

Entwicklung chimärer Antigenrezeptor-natürlicher Killerzellen zur Bekämpfung von Pilzinfektionen mit dem nicht-viralen Transposon-System von Dornröschen

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DOI:

10.3791/67424

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4. Oktober 2024

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1Medizinische Klinik und Poliklinik II und Lehrstuhl für Zelluläre Immuntherapie, Medizinische Klinik und Poliklinik II, Universitätsklinikum Würzburg, 2Fraunhofer-Institut für Zelltherapie und Immunologie IZI, Außenstelle Würzburg Zelluläre Immuntherapie

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Wir skizzieren ein Transfektionsprotokoll zur Herstellung von chimären Antigenrezeptor-natürlichen Killerzellen (CAR-NK), die auf pilzliche Krankheitserreger abzielen, unter Verwendung des nicht-viralen Dornröschen-Transposon-Systems. Um die antigenspezifische Aktivierung zu beurteilen, haben wir die gentechnisch veränderten Zellen mit Aspergillus fumigatus-Keimröhrchen co-kultiviert und die IFN-γ-Sekretion gemessen.

Zusammenfassung

Auf chimären Antigenrezeptoren (CAR) basierende Zelltherapien haben eine beeindruckende Wirksamkeit bei der Behandlung hämatologischer Malignome gezeigt. In jüngster Zeit werden diese Therapien für Infektionskrankheiten entwickelt, doch Studien zu Pilzinfektionen sind nach wie vor rar. Um optimale Ziele zu identifizieren und zelluläre Produkte zu optimieren, haben wir eine Methode entwickelt, um chimäre Antigenrezeptor-natürliche Killerzellen (CAR-NK) zu manipulieren und ihre Reaktion auf die Stimulation durch Pilze zu bewerten. Diese Arbeit beschreibt eine einfache und robuste Methode zur Erzeugung von CAR-NK-Zellen, die auf Pilzziele zugeschnitten sind, unter Verwendung des nicht-viralen Dornröschen-Transposon-Systems. NK-92-Zellen werden mit der hyperaktiven Transposase SB100X transfiziert, die als Minicircle-DNA (MC) vektorisiert ist, zusammen mit einem Plasmid-kodierten CAR-Transposon. Die Transfektionseffizienz wird 1 Woche später mittels durchflusszytometrischer Analyse beurteilt. Vor dem Funktionstest werden die Zellen, die das Transgen exprimieren, mittels magnetaktivierter Zellsortierung angereichert und für 1 weitere Woche kultiviert. Um die antigenspezifische Aktivierung zu bewerten, werden die gentechnisch veränderten Zellen für mindestens 6 Stunden mit Aspergillus fumigatus-Keimröhrchen co-kultiviert. Anschließend wird die Konzentration des sezernierten Interferon-gamma (IFN-γ) mit einem Enzyme-linked Immunosorbent Assay gemessen.

Einleitung

Aspergillus fumigatus (A. fumigatus) ist ein allgegenwärtiger Pilz, bei dem die durchschnittliche Person täglich zwischen 100 und 1.000 Konidien inhaliert1. Bei Patienten mit erworbenen oder angeborenen Immundefekten, wie z. B. bei Patienten, die sich einer Chemotherapie unterziehen oder an Leukämie leiden, kann A. fumigatus zu einer schweren invasiven Apsergillose führen. Jedes Jahr erkranken weltweit mehr als 200.000 Menschen an Aspergillose. Trotz des Einsatzes von Antimykotika zur Prävention und Therapie mit Azolderivaten liegt die Mortalitätsrate nach wie vor zwischen 30 % und 95 %2,3. Darüber hinaus hat die Behandlung erhebliche Nebenwirkungen, und 7 % der A. fumigatus-Kulturen sind bereits azolresistent4.

Die Therapie mit chimären Antigenrezeptor (CAR)-gezüchteten T-Zellen hat klinische Erfolge bei der Behandlung bösartiger Erkrankungen gezeigt und vielversprechende präklinische Ergebnisse bei der Bekämpfung von Infektionskrankheiten wie der invasiven Aspergillose erzielt 5,6,7,8. Unsere zuvor beschriebenen Af-CAR-T-Zellen, die auf ein Protein in der Zellwand von A. fumigatus hyphae abzielen, haben in präklinischen Modellen vielversprechende Ergebnisse gezeigt6.

Das verringerte Risiko einer Graft-versus-Host-Krankheit, eines Zytokinfreisetzungssyndroms und einer Neurotoxizität macht CAR-NK-Zellen zu einer wertvollen Alternative zu CAR-T-Zellen als "Standard"-Behandlung für akute Infektionen9. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass NK-Zellen eine entscheidende Rolle bei der antimykotischen Immunantwort spielen. Bei Stimulation mit A. fumigatus sezernieren NK-Zellen Zytokine wie IFN-ɣ und Chemokine wie CCL-3 und CCL-4 und setzen zytotoxische Granula frei10,11.

Die NK-92-Zelllinie ist eine beliebte Quelle für NK-Zellen für die Gentechnik und bietet den Vorteil einer schnellen Proliferation und Expansion unter relativ einfachen Kulturbedingungen12. Mehrere präklinische Studien haben das therapeutische Potenzial von CAR-transduzierten NK-92-Zellen bei der Behandlung von hämatologischen und soliden Tumoren gezeigt. Zahlreiche klinische Studien sind im Gange, um ihre Sicherheit, Wirksamkeit und potenzielle Verwendung als Zelltherapie "von der Stange" zu untersuchen13.

Das Erreichen einer hohen Transfektionseffizienz und einer stabilen Transgenexpression in NK-Zellen ist eine Herausforderung. Virale Methoden versprechen zwar eine hohe Effizienz, bergen aber das Risiko von Insertionsmutationen mit anschließender Onkogenese 9,14. Die neueste Generation von Dornröschen (SB)-Transposon-Vektoren bietet ein sicheres, wirksames und wirtschaftlich tragfähiges System für einen stabilen Gentransfer, das die Einschränkungen viraler und transienter nicht-viraler Genverabreichungsmethoden überwindet15.

Daher skizziert dieses Protokoll eine neuartige Methodik zur Erzeugung von Af-CAR-NK-92-Zellen, die möglicherweise als "Standard"-Therapieoption für Patienten mit lebensbedrohlicher invasiver Aspergillose dienen kann. Die Wirksamkeit dieses Ansatzes wird durch die erhöhte Produktion von IFN-ɣ nach Stimulation mit A. fumigatus-Hyphen veranschaulicht.

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Protokoll

Alle hier beschriebenen Versuche müssen unter sterilen Bedingungen durchgeführt werden. In diesem Protokoll zeigen wir zwei Bedingungen: (I) Scheintransfektion ohne DNA, die als Kontrolle dient, und (II) CAR-Transfektion mit dem zuvor beschriebenen Af-CAR6. Das Af-CAR-Plasmid enthält eine verkürzte epidermale Wachstumsfaktor-Rezeptor-Sequenz (EGFRt) stromabwärts des CAR, die als Transfektionsmarker verwendet wird (Ergänzende Abbildung S1). Für jede Bedingung werden 4 × 106 NK-92-Zellen benötigt.

1. Kultivierung der NK-92-Zellen

  1. Bereiten Sie ein bis zwei Tage vor der Transfektion frisches Zellkulturmedium mit folgender Zusammensetzung vor: 75 % (v/v) alpha-MEM-Medium (mit Nukleosiden) + 12,5 % (v/v) hitzeinaktiviertes fötales Rinderserum (FBS) + 12,5 % (v/v) hitzeinaktiviertes Pferdeserum + 2 mM L-Glutamin.
  2. Resuspendieren Sie mindestens 107 NK-92-Zellen bei einer Zelldichte von 5 × 105 Zellen/ml.
  3. Fügen Sie der Zellsuspension IL-2 in einer Konzentration von 150 UI/ml hinzu.
  4. Kultivieren Sie die Zellen in einem befeuchteten Inkubator bei 37 °C mit 5 % CO2.
    HINWEIS: IL-2 kann in einer Endkonzentration von 5 ng/ml verwendet werden.

2. Nicht-virale Transfektion

  1. Überprüfen Sie die Qualität der Zellen unter dem Mikroskop. Eine Suspension von Zellclustern und ein klarer Hintergrund deuten auf eine gesunde Zellkultur hin.
  2. In einer 6-Well-Platte fügen Sie für jede Bedingung 2 ml Zellkulturmedium pro Well hinzu. Stellen Sie die Platte in einen befeuchteten Inkubator bei 37 °C und 5 % CO2.
    HINWEIS: Antibiotika können die Lebensfähigkeit der Zellen nach der Transfektion verringern. Halten Sie das Medium antibiotikafrei.
  3. Zählen Sie die Zellen und überprüfen Sie die Lebensfähigkeit der Zellen mit Hilfe (z. B. Trypanblau-Färbung).
  4. Übertragen Sie 8 × 106 NK-92 Zellen in ein konisches 15-ml-Röhrchen mit konischem Boden. Zentrifugieren Sie bei 200 × g für 5 min mit einer Beschleunigung und Verzögerung von 3. Verwenden Sie dieses Programm für alle folgenden Zentrifugationsschritte.
  5. Bereiten Sie während der Zentrifugation zwei 1,5-ml-Reaktionsröhrchen vor. Pipettieren Sie die DNA für Af-CAR (8 μg Plasmid-DNA und 4 μg SB100X Mini Circle, Tabelle 1) in eines der Röhrchen. Halten Sie die zweite DNA-frei, um eine Scheinkontrolle zu sein.
  6. Wenn die Zentrifuge fertig ist, entsorgen Sie vorsichtig den Überstand und füllen Sie das Röhrchen mit den Zellen mit bis zu 15 ml vorgewärmter phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS).
  7. Zentrifugieren (Schritt 2.4).
  8. Bereiten Sie während der Zentrifugation ein Transfektionssystemröhrchen für jede Bedingung vor, indem Sie 3 ml elektrolytischen Puffer in jedes Röhrchen geben. Setzen Sie das erste Röhrchen in die Pipettenstation ein.
  9. Wenn die Zentrifuge fertig ist, wird der Überstand vorsichtig verworfen und das Zellpellet in 200 μl Resuspensionspuffer (100 μl/4 × 106 Zellen) resuspendiert.
    HINWEIS: Vermeiden Sie es, die Zellen länger als 15-30 Minuten im Resuspensionspuffer zu belassen, da dies die Lebensfähigkeit der Zellen und die Transfektionseffizienz verringert.
  10. Geben Sie jeweils 100 μl der Zellsuspension in jedes der beiden Reaktionsröhrchen. Vorsichtig mischen.
    HINWEIS: Vermeiden Sie Luftblasen beim Pipettieren, da Luftblasen Lichtbögen verursachen, die zum Zelltod führen.
  11. Pipettieren Sie das DNA-Zell-Gemisch aus dem ersten Reaktionsröhrchen mit der Pipette des Transfektionssystems und führen Sie die Pipette senkrecht in das in der Pipettierstation platzierte Röhrchen ein.
    HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Spitze richtig sitzt.
  12. Stellen Sie den ersten Impuls auf 1.650 V und die Impulszeit auf 20 ms ein und drücken Sie Start.
  13. Stellen Sie nach Abschluss des Vorgangs den zweiten Impuls auf 500 V und die Impulszeit auf 100 ms ein. Drücken Sie Start.
  14. Nehmen Sie die Pipette nach Abschluss langsam aus der Pipettierstation und überführen Sie die Zellen sofort in eine Vertiefung der vorbereiteten Kulturplatte mit 2 ml vorgewärmtem Zellkulturmedium (siehe Schritt 2.2). Bewegen Sie die Platte vorsichtig kreisförmig, um sicherzustellen, dass die Zellen gleichmäßig verteilt sind.
  15. Für die Mock-Probe werden 100 μl der Zellsuspension aus dem DNA-freien Reaktionsröhrchen entnommen (siehe Schritt 2.9) und das gleiche Verfahren von Schritt 2.11 bis Schritt 2.14 mit einem neuen Röhrchen und einer neuen Pipettenspitze wiederholt.
  16. Die Platte wird in einem befeuchteten Inkubator bei 37 °C mit 5 % CO2 inkubiert.
  17. Nach 30 Minuten Inkubation fügen Sie IL-2 in einer Endkonzentration von 150 IE/ml hinzu.

3. Überprüfung der Transfektionseffizienz mittels Durchflusszytometrie

  1. Nach 1 Woche Kultivierung und Teilung der Zellen jeden zweiten Tag nehmen Sie 1-5 × 105 Zellen jeder Bedingung in ein Polystyrol-Rundbodenröhrchen.
  2. Waschen Sie die Zellen durch Zugabe von 1 ml Puffer (PBS + 0,5 % (v/v) FBS + 2 mM EDTA); Zentrifugieren und den Überstand verwerfen.
  3. Resuspendieren Sie das Zellpellet in 50 μl Puffer. Fügen Sie 1 μl 7-AAD hinzu, um die abgestorbenen Zellen zu erkennen.
  4. Fügen Sie 5 μl anti-tEGFR-Alexa Fluor 647 Antikörper hinzu, um die transfizierten Zellen zu färben.
  5. 20 min bei 4 °C inkubieren.
  6. Waschen Sie die Zellen (siehe Schritt 3.2).
  7. Resuspendieren Sie das Zellpellet in 200 μl Puffer.
  8. Messen Sie die Proben auf einem Durchflusszytometer.
    HINWEIS: Wenn die Transfektionseffizienz nicht zufriedenstellend ist, fahren Sie mit der Anreicherung der Transgen-exprimierenden Zellen fort.

4. Anreicherung transgen-exprimierender Zellen durch magnetisch aktivierte Zellsortierung (MACS)

HINWEIS: Um optimale Ergebnisse zu erzielen, beginnen Sie das Protokoll mit 8-10 × 106 Zellen. Alle Zentrifugationsschritte werden bei 4 °C durchgeführt.

  1. Bereiten Sie den Puffer vor, wie in Schritt 3.2 beschrieben. Verdünnen Sie die Zellen in einer Konzentration von 1-2 × 106/100 μl mit dem Puffer in einem 15 mL konischen Bodenröhrchen.
  2. Fügen Sie 1 μl Anti-EGFRt-Biotin pro 1-2 × 106 Zellen hinzu und schwenken Sie das Röhrchen vorsichtig, um eine gleichmäßig verteilte Lösung zu gewährleisten.
  3. 25 Minuten bei 4 °C inkubieren und dann das Röhrchen mit bis zu 10 mL Puffer füllen.
  4. Zentrifuge. Entsorgen Sie den Überstand.
  5. 8 μl/1 × 106 Zellen kalten Puffer zugeben.
  6. Fügen Sie 2 μl Anti-Biotin-Magnetkügelchen pro 1 × 106 Zellen hinzu.
  7. 15 min bei 4 °C inkubieren.
  8. Waschen durch Befüllen von bis zu 10 mL mit Puffer.
  9. Zentrifuge. Den Überstand verwerfen und die Zellen in 500 μl Puffer resuspendieren.
  10. Setzen Sie eine LS-Säule in den MACS-Magneten ein und waschen Sie sie mit 3 mL Puffer.
  11. Sobald der Puffer vollständig durch die Säule gewandert ist, fügen Sie die Zellsuspension hinzu.
  12. Waschen Sie die Säule 3x mit jeweils 3 mL Puffer.
  13. Nehmen Sie die Säule vom Magneten und legen Sie sie in ein sauberes 15-ml-Röhrchen mit konischem Boden.
  14. Fügen Sie der Säule 5 ml Puffer hinzu. Spülen Sie die EGFR-positiven Zellen mit dem Kolben so schnell wie möglich aus.
  15. Kultivieren Sie die Zellen für einige Tage; Überprüfen Sie dann die Effizienz durch Durchflusszytometrie.

5. Funktionsprüfung

HINWEIS: Bereiten Sie für das bevorstehende Experiment das folgende Medium vor und verwenden Sie es: RPMI + 20% FBS.

  1. Tag 1 - Aussaat von Aspergillus fumigatus conidia
    1. Bereiten Sie eine A . fumigatus Conidiensuspension in einer Konzentration von 2,5 × 105 Conidium/ml im Medium vor.
    2. In einer 96-Well-Kulturplatte werden 100 μl der Konidiensuspension pro Vertiefung pipetiert und 16 Stunden lang bei 25 °C inkubiert.
      HINWEIS: Nach der Inkubationszeit keimen die Konidien (Abbildung 1).
  2. Tag 2 - Co-Kultur mit CAR NK-92 Zellen
    1. Waschen Sie die Mock- und Af-CAR NK-92-Zellen 2x mit dem Medium.
    2. Co-Kultur mit dem Pilz in einem Effektor-Ziel-Verhältnis von 2:1 durch Zugabe von 5 × 104 Zellen in 100 μl Medium pro Vertiefung (Abbildung 2).
    3. Für die Positivkontrolle fügen Sie 1 ng PMA und 100 ng Ionomycin pro Vertiefung in 100 μl Medium hinzu. Verwenden Sie Zellen im Medium nur als Negativkontrolle.
    4. Die Platte wird bei 37 °C in einem befeuchteten CO2 -Inkubator für mindestens 6 h inkubiert.
    5. Die Platte bei 300 × g 5 min zentrifugieren.
    6. Ernten Sie 100 μl von jeder Vertiefung; Vermeiden Sie es, den Boden zu berühren. Die Überstände werden in Reaktionsgefäße überführt.
      HINWEIS: Achten Sie darauf, dass nur der Überstand pipettiert wird und nicht der gewachsene Pilz. Im Zweifelsfall fügen Sie einen weiteren Zentrifugationsschritt hinzu.
    7. Führen Sie den IFN-ɣ ELISA gemäß den Anweisungen des Herstellers durch oder lagern Sie die Proben bis zur Verwendung bei -80 °C.

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Ergebnisse

Der gesamte Prozess der Erzeugung von Af-CAR NK-92-Zellen, einschließlich Transfektion, Rückgewinnung, Anreicherung und Expansion, dauert etwa 14 Tage. Nach der Transfektion werden die Zellen jeden zweiten Tag kultiviert und gespalten. Die Zellviabilität kann während der ersten Teilung zwei Tage nach der Transfektion abnehmen. In der Regel erholen sich die Zellen 4 Tage nach der Transfektion und beginnen sich zu vermehren, mit einer Verdopplungszeit von 48 Stunden.

Nach der Genesung wird die T...

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Diskussion

Das bereitgestellte Protokoll bietet eine einfache und zuverlässige Methode zur Herstellung von CAR-NK-Zellen, die auf pilzliche Krankheitserreger abzielen, unter Verwendung des nicht-viralen Sleeping Beauty-Transposon-Systems. Diese Methode ermöglicht die stabile und dauerhafte Insertion großer Transgene, was die Expansion von Zellen ermöglicht, um die notwendigen Mengen für die weitere Analyse zu erhalten14,16.

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Offenlegungen

M.H.: Erfinder bei Patentanmeldungen und erteilten Patenten im Zusammenhang mit der CAR-Technologie, teilweise lizenziert an die Industrie. Mitgründer und Anteilseigner der T-CURX GmbH, Würzburg. Honorare für Referenten: BMS, Janssen, Kite/Gilead, Novartis. Forschungsunterstützung: BMS. M. B. berichtet von Reiseunterstützung durch das Pharmaunternehmen "Eli Lilly and Company", die nichts mit dieser Studie zu tun hat. Bei den anderen Autoren bestehen keine Interessenkonflikte.

Danksagungen

Das Projekt wurde von der Wilhelm Sander Stiftung, Projekt 2020.017.1 an M.H., und J.L. finanziert und unterstützt; Deutsche Forschungsgemeinschaft (Sonderforschungsbereich/Transregio 124 Pathogene Pilze und ihr menschlicher Wirt: Interaktionsnetzwerke-FungiNet; Projekt A8 bis M.H. und H.E.).

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
15 ML Röhrchen mit konischem BodenGreiner Bio-One188271PP, 17/120 MM, CELLSTAR, STERIL
50 ML Röhrchen mit konischem BodenGreiner Bio-One227270PP, 30/115 MM, CELLSTAR, STERILE
6- und 96-Well- ZellkulturplatteCorning Inc. LifeSciences83-3736/ 83-3474TC-behandelte Mehrfach-Well-Platten, flache Böden, Behandelt für optimale Zellanhaftung, Sterilisiert durch Gammabestrahlung, Nichtpyrogener
7-AAD (7-Aminoactinomycin D)BD Biosciences559925leicht zu verwendender Nukleinsäurefarbstoff zum Ausschluss nicht lebensfähiger Zellen in durchflusszytometrischen Assays
Alexa Fluor 647 Anti-Human-EGFR-AntikörperBiolegend352918Klon AY13
Anti-Biotin MicroBeads UltraPureMiltenyi Biotec130-105-637UltraPure MicroBeads, konjugiert mit monoklonalem Maus-Antibiotin Antikörper
Aspergillus fumigatusATCC46645
Biosphären-Filterspitzen (20 und 100 μ L) Sarstedt70.3030.365 / 70.3030.275
Dulbecco′ s Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)Sigma-AldrichD8537  Modifiziert, ohne Calciumchlorid und Magnesiumchlorid, flüssig, sterilfiltriert, geeignet für Zellkulturen, Endotoxin,
geprüft ELISA MAX Deluxe Set Human IFN-& gamma;Biolegend430104
Ethylendiamintetraessigsäure Dinatriumsalzlösung (EDTA)Sigma-AldrichE7889für die Molekularbiologie, 0,5  M in H2O, DNase, RNase, NICKase und Protease, nicht nachgewiesen, 0,2 μ m gefiltert.
FACS cleanBD Biosciences340345
FACS Flow Swrap FluidBD Biosciences342003
FACS Rinse SolutionBD Bioscience340346
Fetal Bovine Serum (FBS)Sigma-AldrichF7524sterilfiltriert, geeignet für Zellkulturen, vor Gebrauch hitzeinaktiviert
Gibco, MEM α, NukleosideThermofisher Wissenschaftliche22571020Phenolrot, Ribonukleoside, Desoxyribonukleoside, Natriumbicarbonat
PferdeserumThermo Fisher Scientific16050122Steril gefiltert, vor Gebrauch von Hitze inaktiviert
Humanes IL-2 IS, ForschungsqualitätMiltenyi Biotec130-097-742Forschungsqualität. Der ED50 ist ≤ 0,3 ng/ml, entsprechend einer Aktivität von ≥ 3 & mal; 106 IE/mg.
IonomycinSigma-AldrichI0634-1MGaus Streptomyces conglobatus, verwendet als Positivkontrolle für die Zytokinsekretion 
L-GlutaminSigma-AldrichW368401Für Zellkultur
MACS LS SäuleMiltenyi Biotec130-042-401  Säulen und Kolben, steril verpackt
NK-92DSMZACC 488
Neon Transfektionssystem 100  μ L-KitThermo Fisher ScientificMPK10096Resuspension Puffer R, Elektrolytpuffer E2, 100 μ L Neonspitzen, Neon-Elektroporationsröhrchen
Phorbol-12-myristat-13-acetat (PMA)Sigma-AldrichP1585-1MGals Positivkontrolle für die Zytokinsekretion 
Polystyrol-Rundbodenröhrchen, 5 mLBD BioscienceS-452400für die Durchflusszytometrie
Reaktionsgefäß, 1,5 MLGreiner Bio-One7,26,90,001PP, transparent, Kappe aufgesetzt, mit injizierter Graduierung. Vor Gebrauch sterilisiert. 
RPMI 1640 Medium, GlutaMAXThermo Fisher Scientific72400021GlutaMax I,  Phenolrot, HEPES, steril gefiltert
TipOne 1000 μ L XL VerlaufsfilterspitzeStarLabS1122-1730
Equipment
BD FACSCaliburBD Bioscience
CO2 Inkubator C60 Labotect
Heraeus Multifuge 3SRThermo Scientific
HydroFLEX Mikroplatten-WaschmaschineTecan
NanoQuant Infinite M200 ProTecan
Neon TransfektionssystemInvitrogen
Pipetten Eppendorf
Quadro MACS Separator Miltenyi Biotec

Referenzen

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