Entwicklung chimärer Antigenrezeptor-natürlicher Killerzellen zur Bekämpfung von Pilzinfektionen mit dem nicht-viralen Transposon-System von Dornröschen

Zusammenfassung

Wir skizzieren ein Transfektionsprotokoll zur Herstellung von chimären Antigenrezeptor-natürlichen Killerzellen (CAR-NK), die auf pilzliche Krankheitserreger abzielen, unter Verwendung des nicht-viralen Dornröschen-Transposon-Systems. Um die antigenspezifische Aktivierung zu beurteilen, haben wir die gentechnisch veränderten Zellen mit Aspergillus fumigatus-Keimröhrchen co-kultiviert und die IFN-γ-Sekretion gemessen.

Zusammenfassung

Auf chimären Antigenrezeptoren (CAR) basierende Zelltherapien haben eine beeindruckende Wirksamkeit bei der Behandlung hämatologischer Malignome gezeigt. In jüngster Zeit werden diese Therapien für Infektionskrankheiten entwickelt, doch Studien zu Pilzinfektionen sind nach wie vor rar. Um optimale Ziele zu identifizieren und zelluläre Produkte zu optimieren, haben wir eine Methode entwickelt, um chimäre Antigenrezeptor-natürliche Killerzellen (CAR-NK) zu manipulieren und ihre Reaktion auf die Stimulation durch Pilze zu bewerten. Diese Arbeit beschreibt eine einfache und robuste Methode zur Erzeugung von CAR-NK-Zellen, die auf Pilzziele zugeschnitten sind, unter Verwendung des nicht-viralen Dornröschen-Transposon-Systems. NK-92-Zellen werden mit der hyperaktiven Transposase SB100X transfiziert, die als Minicircle-DNA (MC) vektorisiert ist, zusammen mit einem Plasmid-kodierten CAR-Transposon. Die Transfektionseffizienz wird 1 Woche später mittels durchflusszytometrischer Analyse beurteilt. Vor dem Funktionstest werden die Zellen, die das Transgen exprimieren, mittels magnetaktivierter Zellsortierung angereichert und für 1 weitere Woche kultiviert. Um die antigenspezifische Aktivierung zu bewerten, werden die gentechnisch veränderten Zellen für mindestens 6 Stunden mit Aspergillus fumigatus-Keimröhrchen co-kultiviert. Anschließend wird die Konzentration des sezernierten Interferon-gamma (IFN-γ) mit einem Enzyme-linked Immunosorbent Assay gemessen.

Einleitung

Aspergillus fumigatus (A. fumigatus) ist ein allgegenwärtiger Pilz, bei dem die durchschnittliche Person täglich zwischen 100 und 1.000 Konidien inhaliert¹. Bei Patienten mit erworbenen oder angeborenen Immundefekten, wie z. B. bei Patienten, die sich einer Chemotherapie unterziehen oder an Leukämie leiden, kann A. fumigatus zu einer schweren invasiven Apsergillose führen. Jedes Jahr erkranken weltweit mehr als 200.000 Menschen an Aspergillose. Trotz des Einsatzes von Antimykotika zur Prävention und Therapie mit Azolderivaten liegt die Mortalitätsrate nach wie vor zwischen 30 % und 95 %^2,3. Darüber hinaus hat die Behandlung erhebliche Nebenwirkungen, und 7 % der A. fumigatus-Kulturen sind bereits azolresistent⁴.

Die Therapie mit chimären Antigenrezeptor (CAR)-gezüchteten T-Zellen hat klinische Erfolge bei der Behandlung bösartiger Erkrankungen gezeigt und vielversprechende präklinische Ergebnisse bei der Bekämpfung von Infektionskrankheiten wie der invasiven Aspergillose erzielt 5,6,7,8. Unsere zuvor beschriebenen Af-CAR-T-Zellen, die auf ein Protein in der Zellwand von A. fumigatus hyphae abzielen, haben in präklinischen Modellen vielversprechende Ergebnisse gezeigt⁶.

Das verringerte Risiko einer Graft-versus-Host-Krankheit, eines Zytokinfreisetzungssyndroms und einer Neurotoxizität macht CAR-NK-Zellen zu einer wertvollen Alternative zu CAR-T-Zellen als "Standard"-Behandlung für akute Infektionen⁹. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass NK-Zellen eine entscheidende Rolle bei der antimykotischen Immunantwort spielen. Bei Stimulation mit A. fumigatus sezernieren NK-Zellen Zytokine wie IFN-ɣ und Chemokine wie CCL-3 und CCL-4 und setzen zytotoxische Granula frei^10,11.

Die NK-92-Zelllinie ist eine beliebte Quelle für NK-Zellen für die Gentechnik und bietet den Vorteil einer schnellen Proliferation und Expansion unter relativ einfachen Kulturbedingungen¹². Mehrere präklinische Studien haben das therapeutische Potenzial von CAR-transduzierten NK-92-Zellen bei der Behandlung von hämatologischen und soliden Tumoren gezeigt. Zahlreiche klinische Studien sind im Gange, um ihre Sicherheit, Wirksamkeit und potenzielle Verwendung als Zelltherapie "von der Stange" zu untersuchen¹³.

Das Erreichen einer hohen Transfektionseffizienz und einer stabilen Transgenexpression in NK-Zellen ist eine Herausforderung. Virale Methoden versprechen zwar eine hohe Effizienz, bergen aber das Risiko von Insertionsmutationen mit anschließender Onkogenese ^9,14. Die neueste Generation von Dornröschen (SB)-Transposon-Vektoren bietet ein sicheres, wirksames und wirtschaftlich tragfähiges System für einen stabilen Gentransfer, das die Einschränkungen viraler und transienter nicht-viraler Genverabreichungsmethoden überwindet¹⁵.

Daher skizziert dieses Protokoll eine neuartige Methodik zur Erzeugung von Af-CAR-NK-92-Zellen, die möglicherweise als "Standard"-Therapieoption für Patienten mit lebensbedrohlicher invasiver Aspergillose dienen kann. Die Wirksamkeit dieses Ansatzes wird durch die erhöhte Produktion von IFN-ɣ nach Stimulation mit A. fumigatus-Hyphen veranschaulicht.

Protokoll

Alle hier beschriebenen Versuche müssen unter sterilen Bedingungen durchgeführt werden. In diesem Protokoll zeigen wir zwei Bedingungen: (I) Scheintransfektion ohne DNA, die als Kontrolle dient, und (II) CAR-Transfektion mit dem zuvor beschriebenen Af-CAR⁶. Das Af-CAR-Plasmid enthält eine verkürzte epidermale Wachstumsfaktor-Rezeptor-Sequenz (EGFRt) stromabwärts des CAR, die als Transfektionsmarker verwendet wird (Ergänzende Abbildung S1). Für jede Bedingung werden 4 × 10⁶ NK-92-Zellen benötigt.

1. Kultivierung der NK-92-Zellen

1. Bereiten Sie ein bis zwei Tage vor der Transfektion frisches Zellkulturmedium mit folgender Zusammensetzung vor: 75 % (v/v) alpha-MEM-Medium (mit Nukleosiden) + 12,5 % (v/v) hitzeinaktiviertes fötales Rinderserum (FBS) + 12,5 % (v/v) hitzeinaktiviertes Pferdeserum + 2 mM L-Glutamin.
2. Resuspendieren Sie mindestens 10⁷ NK-92-Zellen bei einer Zelldichte von 5 × 10⁵ Zellen/ml.
3. Fügen Sie der Zellsuspension IL-2 in einer Konzentration von 150 UI/ml hinzu.
4. Kultivieren Sie die Zellen in einem befeuchteten Inkubator bei 37 °C mit 5 % CO₂.
   HINWEIS: IL-2 kann in einer Endkonzentration von 5 ng/ml verwendet werden.

2. Nicht-virale Transfektion

1. Überprüfen Sie die Qualität der Zellen unter dem Mikroskop. Eine Suspension von Zellclustern und ein klarer Hintergrund deuten auf eine gesunde Zellkultur hin.
2. In einer 6-Well-Platte fügen Sie für jede Bedingung 2 ml Zellkulturmedium pro Well hinzu. Stellen Sie die Platte in einen befeuchteten Inkubator bei 37 °C und 5 % CO₂.
   HINWEIS: Antibiotika können die Lebensfähigkeit der Zellen nach der Transfektion verringern. Halten Sie das Medium antibiotikafrei.
3. Zählen Sie die Zellen und überprüfen Sie die Lebensfähigkeit der Zellen mit Hilfe (z. B. Trypanblau-Färbung).
4. Übertragen Sie 8 × 10⁶ NK-92 Zellen in ein konisches 15-ml-Röhrchen mit konischem Boden. Zentrifugieren Sie bei 200 × g für 5 min mit einer Beschleunigung und Verzögerung von 3. Verwenden Sie dieses Programm für alle folgenden Zentrifugationsschritte.
5. Bereiten Sie während der Zentrifugation zwei 1,5-ml-Reaktionsröhrchen vor. Pipettieren Sie die DNA für Af-CAR (8 μg Plasmid-DNA und 4 μg SB100X Mini Circle, Tabelle 1) in eines der Röhrchen. Halten Sie die zweite DNA-frei, um eine Scheinkontrolle zu sein.
6. Wenn die Zentrifuge fertig ist, entsorgen Sie vorsichtig den Überstand und füllen Sie das Röhrchen mit den Zellen mit bis zu 15 ml vorgewärmter phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS).
7. Zentrifugieren (Schritt 2.4).
8. Bereiten Sie während der Zentrifugation ein Transfektionssystemröhrchen für jede Bedingung vor, indem Sie 3 ml elektrolytischen Puffer in jedes Röhrchen geben. Setzen Sie das erste Röhrchen in die Pipettenstation ein.
9. Wenn die Zentrifuge fertig ist, wird der Überstand vorsichtig verworfen und das Zellpellet in 200 μl Resuspensionspuffer (100 μl/4 × 10⁶ Zellen) resuspendiert.
   HINWEIS: Vermeiden Sie es, die Zellen länger als 15-30 Minuten im Resuspensionspuffer zu belassen, da dies die Lebensfähigkeit der Zellen und die Transfektionseffizienz verringert.
10. Geben Sie jeweils 100 μl der Zellsuspension in jedes der beiden Reaktionsröhrchen. Vorsichtig mischen.
    HINWEIS: Vermeiden Sie Luftblasen beim Pipettieren, da Luftblasen Lichtbögen verursachen, die zum Zelltod führen.
11. Pipettieren Sie das DNA-Zell-Gemisch aus dem ersten Reaktionsröhrchen mit der Pipette des Transfektionssystems und führen Sie die Pipette senkrecht in das in der Pipettierstation platzierte Röhrchen ein.
    HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Spitze richtig sitzt.
12. Stellen Sie den ersten Impuls auf 1.650 V und die Impulszeit auf 20 ms ein und drücken Sie Start.
13. Stellen Sie nach Abschluss des Vorgangs den zweiten Impuls auf 500 V und die Impulszeit auf 100 ms ein. Drücken Sie Start.
14. Nehmen Sie die Pipette nach Abschluss langsam aus der Pipettierstation und überführen Sie die Zellen sofort in eine Vertiefung der vorbereiteten Kulturplatte mit 2 ml vorgewärmtem Zellkulturmedium (siehe Schritt 2.2). Bewegen Sie die Platte vorsichtig kreisförmig, um sicherzustellen, dass die Zellen gleichmäßig verteilt sind.
15. Für die Mock-Probe werden 100 μl der Zellsuspension aus dem DNA-freien Reaktionsröhrchen entnommen (siehe Schritt 2.9) und das gleiche Verfahren von Schritt 2.11 bis Schritt 2.14 mit einem neuen Röhrchen und einer neuen Pipettenspitze wiederholt.
16. Die Platte wird in einem befeuchteten Inkubator bei 37 °C mit 5 % CO₂ inkubiert.
17. Nach 30 Minuten Inkubation fügen Sie IL-2 in einer Endkonzentration von 150 IE/ml hinzu.

3. Überprüfung der Transfektionseffizienz mittels Durchflusszytometrie

1. Nach 1 Woche Kultivierung und Teilung der Zellen jeden zweiten Tag nehmen Sie 1-5 × 10⁵ Zellen jeder Bedingung in ein Polystyrol-Rundbodenröhrchen.
2. Waschen Sie die Zellen durch Zugabe von 1 ml Puffer (PBS + 0,5 % (v/v) FBS + 2 mM EDTA); Zentrifugieren und den Überstand verwerfen.
3. Resuspendieren Sie das Zellpellet in 50 μl Puffer. Fügen Sie 1 μl 7-AAD hinzu, um die abgestorbenen Zellen zu erkennen.
4. Fügen Sie 5 μl anti-tEGFR-Alexa Fluor 647 Antikörper hinzu, um die transfizierten Zellen zu färben.
5. 20 min bei 4 °C inkubieren.
6. Waschen Sie die Zellen (siehe Schritt 3.2).
7. Resuspendieren Sie das Zellpellet in 200 μl Puffer.
8. Messen Sie die Proben auf einem Durchflusszytometer.
   HINWEIS: Wenn die Transfektionseffizienz nicht zufriedenstellend ist, fahren Sie mit der Anreicherung der Transgen-exprimierenden Zellen fort.

4. Anreicherung transgen-exprimierender Zellen durch magnetisch aktivierte Zellsortierung (MACS)

HINWEIS: Um optimale Ergebnisse zu erzielen, beginnen Sie das Protokoll mit 8-10 × 10⁶ Zellen. Alle Zentrifugationsschritte werden bei 4 °C durchgeführt.

1. Bereiten Sie den Puffer vor, wie in Schritt 3.2 beschrieben. Verdünnen Sie die Zellen in einer Konzentration von 1-2 × 10⁶/100 μl mit dem Puffer in einem 15 mL konischen Bodenröhrchen.
2. Fügen Sie 1 μl Anti-EGFRt-Biotin pro 1-2 × 10⁶ Zellen hinzu und schwenken Sie das Röhrchen vorsichtig, um eine gleichmäßig verteilte Lösung zu gewährleisten.
3. 25 Minuten bei 4 °C inkubieren und dann das Röhrchen mit bis zu 10 mL Puffer füllen.
4. Zentrifuge. Entsorgen Sie den Überstand.
5. 8 μl/1 × 10⁶ Zellen kalten Puffer zugeben.
6. Fügen Sie 2 μl Anti-Biotin-Magnetkügelchen pro 1 × 10⁶ Zellen hinzu.
7. 15 min bei 4 °C inkubieren.
8. Waschen durch Befüllen von bis zu 10 mL mit Puffer.
9. Zentrifuge. Den Überstand verwerfen und die Zellen in 500 μl Puffer resuspendieren.
10. Setzen Sie eine LS-Säule in den MACS-Magneten ein und waschen Sie sie mit 3 mL Puffer.
11. Sobald der Puffer vollständig durch die Säule gewandert ist, fügen Sie die Zellsuspension hinzu.
12. Waschen Sie die Säule 3x mit jeweils 3 mL Puffer.
13. Nehmen Sie die Säule vom Magneten und legen Sie sie in ein sauberes 15-ml-Röhrchen mit konischem Boden.
14. Fügen Sie der Säule 5 ml Puffer hinzu. Spülen Sie die EGFR-positiven Zellen mit dem Kolben so schnell wie möglich aus.
15. Kultivieren Sie die Zellen für einige Tage; Überprüfen Sie dann die Effizienz durch Durchflusszytometrie.

5. Funktionsprüfung

HINWEIS: Bereiten Sie für das bevorstehende Experiment das folgende Medium vor und verwenden Sie es: RPMI + 20% FBS.

1. Tag 1 - Aussaat von Aspergillus fumigatus conidia
   1. Bereiten Sie eine A . fumigatus Conidiensuspension in einer Konzentration von 2,5 × 10⁵ Conidium/ml im Medium vor.
   2. In einer 96-Well-Kulturplatte werden 100 μl der Konidiensuspension pro Vertiefung pipetiert und 16 Stunden lang bei 25 °C inkubiert.
      HINWEIS: Nach der Inkubationszeit keimen die Konidien (Abbildung 1).
2. Tag 2 - Co-Kultur mit CAR NK-92 Zellen
   1. Waschen Sie die Mock- und Af-CAR NK-92-Zellen 2x mit dem Medium.
   2. Co-Kultur mit dem Pilz in einem Effektor-Ziel-Verhältnis von 2:1 durch Zugabe von 5 × 10⁴ Zellen in 100 μl Medium pro Vertiefung (Abbildung 2).
   3. Für die Positivkontrolle fügen Sie 1 ng PMA und 100 ng Ionomycin pro Vertiefung in 100 μl Medium hinzu. Verwenden Sie Zellen im Medium nur als Negativkontrolle.
   4. Die Platte wird bei 37 °C in einem befeuchteten CO₂ -Inkubator für mindestens 6 h inkubiert.
   5. Die Platte bei 300 × g 5 min zentrifugieren.
   6. Ernten Sie 100 μl von jeder Vertiefung; Vermeiden Sie es, den Boden zu berühren. Die Überstände werden in Reaktionsgefäße überführt.
      HINWEIS: Achten Sie darauf, dass nur der Überstand pipettiert wird und nicht der gewachsene Pilz. Im Zweifelsfall fügen Sie einen weiteren Zentrifugationsschritt hinzu.
   7. Führen Sie den IFN-ɣ ELISA gemäß den Anweisungen des Herstellers durch oder lagern Sie die Proben bis zur Verwendung bei -80 °C.

Ergebnisse

Der gesamte Prozess der Erzeugung von Af-CAR NK-92-Zellen, einschließlich Transfektion, Rückgewinnung, Anreicherung und Expansion, dauert etwa 14 Tage. Nach der Transfektion werden die Zellen jeden zweiten Tag kultiviert und gespalten. Die Zellviabilität kann während der ersten Teilung zwei Tage nach der Transfektion abnehmen. In der Regel erholen sich die Zellen 4 Tage nach der Transfektion und beginnen sich zu vermehren, mit einer Verdopplungszeit von 48 Stunden.

Nach der Genesung wird die Transfektionseffizienz gemessen, die voraussichtlich 10-20 % erreichen wird (repräsentative Ergebnisse in Abbildung 3). Die Anreicherung von EGFR-positiven Zellen über MACS erhöht den Anteil der Af-CAR NK-92-Zellen auf über 95% (repräsentative Ergebnisse in Abbildung 4).

Für funktionelle Assays wurden Kulturen mit mehr als 95% Af-CAR-Zellen verwendet. Hier haben wir die Zellen mit A. fumigatus Keimröhrchen für 6 h co-kultiviert und die IFN-ɣ-Sekretion als Aktivierungsmarker gemessen. Wie in Abbildung 5 gezeigt, zeigten die Af-CAR-Zellen eine signifikante Zytokinsekretion (Mittelwert = 340,6 ± 86,5 pg/ml) im Vergleich zu Mock-NK-92-Zellen (Mittelwert = 75,6 ± 19,5 pg/ml), was auf eine wesentlich höhere Aktivierung der Af-CAR-Zellen hinweist (p-Wert = 0,03).

Abbildung 1: Keimschläuche von Aspergillus fumigatus. Mikroskopische Aufnahme von A. fumigatus nach 16 Stunden Inkubation. Keimröhren/kleine Hyphen werden beobachtet und homogen um die Vertiefung verteilt. Maßstabsleiste = 400 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Co-Kultur von Aspergillus fumigatus Keimröhrchen mit NK-92 Zellen. Mikroskopische Aufnahme einer Co-Kultur. Die NK-92-Zellen bilden Cluster und stehen in Kontakt mit den Keimschläuchen von A. fumigatus . Maßstabsleiste = 400 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Bewertung der Transfektionseffizienz durch Färbung für den Transfektionsmarker EGFR. Am Tag 5 wurden nach der Elektroporation NK-92-Zellen mit 7-AAD und Anti-EGFR gefärbt. Die Ergebnisse sind für ein repräsentatives Experiment für (A) Mock- und (B) Af-CAR NK-92-Zellen dargestellt. Die linke Spalte zeigt Punktdiagramme der Zellengröße im Vergleich zur Zellengranularität. das Gate ist auf die NK-92-Zellen gesetzt. Die toten Zellen werden mit Hilfe der 7-AAD-Markierung (zweite Spalte) ausgelagert. Der prozentuale Anteil lebender EGFR⁺ -Zellen ist in der dritten Spalte angegeben. Abkürzungen: EGFR = epidermaler Wachstumsfaktor-Rezeptor; 7-AAD = 7-Aminoactinomycin D; CAR = chimärer Antigenrezeptor. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4: Ergebnisse der Zelloberflächenfärbung nach Anreicherung von NK-92-Zellen, die das Transgen exprimieren. Auf der linken Seite werden die Mock-Zellen angezeigt. Auf der rechten Seite sind die Af-CAR-NK-Zellen dargestellt. Die roten Histogramme stellen die ungefärbten Zellen dar. Die blauen Histogramme stellen die entsprechenden gefärbten Zellen dar. Das Gate wird auf die EGFR⁺ -Zellen gesetzt; Die Zahlen zeigen den prozentualen Anteil positiver Zellen. Abkürzungen: EGFR = epidermaler Wachstumsfaktor-Rezeptor; CAR = chimärer Antigenrezeptor. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 5: Zytokinsekretion von NK-Zellen, die durch Aspergillus fumigatus-Keimschläuche aktiviert werden. Die Diagramme zeigen die Ergebnisse der IFN-ɣ-Sekretion von Af-CAR- und Mock-Zellen in Co-Kultur mit Pilzen, gemessen per ELISA nach 6 h Co-Kultur. Bei den gezeigten Daten handelt es sich um die mittlere ± SD von drei unabhängig voneinander durchgeführten Experimenten (n = 3). P-Wert, berechnet durch Welchs t-Test unter Verwendung von GraphPad Prism 10, * p < 0,05. Abkürzungen: NK = natürlicher Killer; IFN-ɣ = Interferon-Gamma; CAR = chimärer Antigenrezeptor; ELISA = Enzyme-linked Immunosorbent Assay. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

	Name	Firma	Bestandskonzentration	Referenz
Transposase	SB100X Mini-Kreis	PlasmidFabrik	1 μg/μL	19
Transposon	Af-CAR-Plasmid	Hergestellt im eigenen Haus	1 μg/μL	6

Tabelle 1: In diesem Protokoll verwendete DNA.

Ergänzende Abbildung S1: Plasmidkarte des Af-CAR-Transposons: Schema des Plasmidvektors und Design des CAR-Transposons. Abkürzungen: EF1 = Elongationsfaktor-1 Alpha-Promotor; ORI = bakterieller Ursprung der Replikation; LIR = links invertierte Wiederholung; RIR: rechtsinvertierte Wiederholung; Cyto = zytoplasmatisch; Tm = Transmembran. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Diskussion

Das bereitgestellte Protokoll bietet eine einfache und zuverlässige Methode zur Herstellung von CAR-NK-Zellen, die auf pilzliche Krankheitserreger abzielen, unter Verwendung des nicht-viralen Sleeping Beauty-Transposon-Systems. Diese Methode ermöglicht die stabile und dauerhafte Insertion großer Transgene, was die Expansion von Zellen ermöglicht, um die notwendigen Mengen für die weitere Analyse zu erhalten^14,16.

Mehrere Schlüsselfaktoren können den Erfolg der Transfektion beeinflussen, darunter die Anzahl und Lebensfähigkeit der Zellen, die Pulsstärke und -dauer sowie die Qualität und Quantität der DNA¹⁷. Es ist von entscheidender Bedeutung, die Gesundheit der Zellen zu beurteilen, bevor sie beginnen, um eine Lebensfähigkeit von mindestens 90 % zu gewährleisten. Es wurde gezeigt, dass eine erhöhte Pulsstärke die Transfektionseffizienz einer Zellpopulation verbessern kann. Dieser Ansatz kann jedoch auch zu einer deutlichen Verringerung der Lebensfähigkeit der Zellen führen. In Fällen mit überschüssigen Zellen und einer begrenzten Menge oder Qualität der DNA kann die Anzahl der Zellen, die das Plasmid erfolgreich aufnehmen, unzureichend sein¹⁷. Dennoch hat sich gezeigt, dass hohe DNA-Konzentrationen toxisch sind und die Lebensfähigkeit der Zellen verringern¹⁸.

Frühere Studien haben eine höhere Transfektionseffizienz erreicht, konzentrierten sich jedoch ausschließlich auf die transiente Proteinexpression¹⁷. Im Gegensatz dazu gewährleistet unser Protokoll eine stabile Transgen-Insertion. Um die geringe Transfektionseffizienz zu beheben, haben wir die Anreicherung von positiv transfizierten Zellen durchgeführt und etwa 95 % CAR-exprimierende Zellen erreicht. Dadurch erhöhte sich die Produktionszeit jedoch auf ~1 Woche. Wenn kürzere Produktionszeiten gewünscht werden, könnte die Transposon-DNA als Minikreis geliefert werden, was die Transfektionseffizienz erhöhen und die Notwendigkeit des Anreicherungsschritts¹⁹ beseitigen könnte. Dennoch kann die Produktionszeit nicht auf <1 Woche verkürzt werden, um die Zellrückgewinnung und -proliferation zu ermöglichen.

Angesichts des akuten Charakters der invasiven Aspergillose wären zelluläre Therapien "von der Stange" von Vorteil. Die Herausforderungen und Kosten, die mit der Isolierung von Zellen von Patienten und der Expansion von Primärzellen verbunden sind, haben die Popularität von NK-92 als geeignete Zelllinie für die CAR-NK-Zellproduktion erhöht²⁰. NK-92-Zellen sind im Allgemeinen robust und vermehren sich in Gegenwart von IL-2 schnell, was das Erreichen großer Zellmengen in relativ kurzer Zeit ermöglicht. Angesichts dieser Vorteile haben wir ein Protokoll zur Genmanipulation von NK-92-Zellen entwickelt, das zeigt, dass es möglich ist, zelluläre CAR-NK-Produkte sicher zu transfizieren und mit hoher Reinheit herzustellen. Obwohl dieses Protokoll zur Vorbereitung primärer CAR-NK-Zellen angepasst werden könnte, sollten einige Modifikationen in Betracht gezogen werden. Dazu gehören die Optimierung der Anzahl und Intensität der Impulse, die Menge der verwendeten DNA und die Etablierung eines geeigneten Expansionsprotokolls. Jegliche Änderungen am Protokoll würden eine gründliche Untersuchung erfordern, um die Wirksamkeit sicherzustellen. Nichtsdestotrotz bietet unser Protokoll eine grundlegende Vorlage, die in zukünftigen Experimenten für primäre NK-Zellen angepasst werden könnte.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass dieses innovative Transfektionsprotokoll zur Herstellung stabiler Af-CAR-NK-Zellen eine effiziente und reproduzierbare Methode ist, die auch bei anderen Erkrankungen eingesetzt werden kann. Darüber hinaus könnte es als kostengünstige Methode zum Screening auf neuartige CARs verwendet werden, die auf eine Vielzahl von Antigenen abzielen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
15 ML Röhrchen mit konischem Boden	Greiner Bio-One	188271	PP, 17/120 MM, CELLSTAR, STERIL
50 ML Röhrchen mit konischem Boden	Greiner Bio-One	227270	PP, 30/115 MM, CELLSTAR, STERILE
6- und 96-Well- Zellkulturplatte	Corning Inc. LifeSciences	83-3736/ 83-3474	TC-behandelte Mehrfach-Well-Platten, flache Böden, Behandelt für optimale Zellanhaftung, Sterilisiert durch Gammabestrahlung, Nichtpyrogener
7-AAD (7-Aminoactinomycin D)	BD Biosciences	559925	leicht zu verwendender Nukleinsäurefarbstoff zum Ausschluss nicht lebensfähiger Zellen in durchflusszytometrischen Assays
Alexa Fluor 647 Anti-Human-EGFR-Antikörper	Biolegend	352918	Klon AY13
Anti-Biotin MicroBeads UltraPure	Miltenyi Biotec	130-105-637	UltraPure MicroBeads, konjugiert mit monoklonalem Maus-Antibiotin Antikörper
Aspergillus fumigatus	ATCC	46645
Biosphären-Filterspitzen (20 und 100 μ L)	Sarstedt	70.3030.365 / 70.3030.275
Dulbecco′ s Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)	Sigma-Aldrich	D8537	Modifiziert, ohne Calciumchlorid und Magnesiumchlorid, flüssig, sterilfiltriert, geeignet für Zellkulturen, Endotoxin,
geprüft ELISA MAX Deluxe Set Human IFN-& gamma;	Biolegend	430104
Ethylendiamintetraessigsäure Dinatriumsalzlösung (EDTA)	Sigma-Aldrich	E7889	für die Molekularbiologie, 0,5  M in H2O, DNase, RNase, NICKase und Protease, nicht nachgewiesen, 0,2 μ m gefiltert.
FACS clean	BD Biosciences	340345
FACS Flow Swrap Fluid	BD Biosciences	342003
FACS Rinse Solution	BD Bioscience	340346
Fetal Bovine Serum (FBS)	Sigma-Aldrich	F7524	sterilfiltriert, geeignet für Zellkulturen, vor Gebrauch hitzeinaktiviert
Gibco, MEM α, Nukleoside	Thermofisher Wissenschaftliche	22571020	Phenolrot, Ribonukleoside, Desoxyribonukleoside, Natriumbicarbonat
Pferdeserum	Thermo Fisher Scientific	16050122	Steril gefiltert, vor Gebrauch von Hitze inaktiviert
Humanes IL-2 IS, Forschungsqualität	Miltenyi Biotec	130-097-742	Forschungsqualität. Der ED50 ist ≤ 0,3 ng/ml, entsprechend einer Aktivität von ≥ 3 & mal; 106 IE/mg.
Ionomycin	Sigma-Aldrich	I0634-1MG	aus Streptomyces conglobatus, verwendet als Positivkontrolle für die Zytokinsekretion
L-Glutamin	Sigma-Aldrich	W368401	Für Zellkultur
MACS LS Säule	Miltenyi Biotec	130-042-401	Säulen und Kolben, steril verpackt
NK-92	DSMZ	ACC 488
Neon Transfektionssystem 100  μ L-Kit	Thermo Fisher Scientific	MPK10096	Resuspension Puffer R, Elektrolytpuffer E2, 100 μ L Neonspitzen, Neon-Elektroporationsröhrchen
Phorbol-12-myristat-13-acetat (PMA)	Sigma-Aldrich	P1585-1MG	als Positivkontrolle für die Zytokinsekretion
Polystyrol-Rundbodenröhrchen, 5 mL	BD Bioscience	S-452400	für die Durchflusszytometrie
Reaktionsgefäß, 1,5 ML	Greiner Bio-One	7,26,90,001	PP, transparent, Kappe aufgesetzt, mit injizierter Graduierung. Vor Gebrauch sterilisiert.
RPMI 1640 Medium, GlutaMAX	Thermo Fisher Scientific	72400021	GlutaMax I,  Phenolrot, HEPES, steril gefiltert
TipOne 1000 μ L XL Verlaufsfilterspitze	StarLab	S1122-1730
Equipment
BD FACSCalibur	BD Bioscience
CO2 Inkubator C60	Labotect
Heraeus Multifuge 3SR	Thermo Scientific
HydroFLEX Mikroplatten-Waschmaschine	Tecan
NanoQuant Infinite M200 Pro	Tecan
Neon Transfektionssystem	Invitrogen
Pipetten	Eppendorf
Quadro MACS Separator	Miltenyi Biotec