Methodenartikel

Fortschritte bei humanen induzierten pluripotenten Stammzellen, die von chimären Antigenrezeptoren abgeleitet werden und natürliche Killerzellen exprimieren

DOI:

10.3791/67438

⸱

14. Februar 2025

 , 
1Department of Medicine, Division of Regenerative Medicine, University of California, San Diego, 2Sanford Stem Cell Institute, University of California, San Diego

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Hier stellen wir eine Methode zur Differenzierung und Erweiterung von humanen iPSC-abgeleiteten chimären Antigenrezeptoren (CAR)-exprimierenden natürlichen Killerzellen mit verbesserter Abtötung gegen verschiedene Malignome vor. Dieses Protokoll demonstriert die Differenzierung und Expansion von für natürliche Killer (NK) optimierten iPSC-abgeleiteten CAR-NK-Zellen und die Messung der Antitumoraktivität gegen verschiedene Tumorzelllinien.

Zusammenfassung

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Natürliche Killerzellen (NK-Zellen) sind Zellen des angeborenen Immunsystems, die eine entscheidende Rolle bei der Abwehr von Tumoren und Virusinfektionen spielen. Die Erzeugung von humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSC), die von chimären Antigenrezeptoren (CAR) abgeleitet sind und NK-Zellen exprimieren, hat sich als vielversprechender Weg für die Krebsimmuntherapie "von der Stange" erwiesen. Hier verwendeten wir ein NK-Zell-optimiertes CAR-Konstrukt, das die Transmembrandomäne von NKG2D, die 2B4-Co-stimulatorische Domäne und die CD3ζ-Signaldomäne umfasst, von der gezeigt wurde, dass sie eine robuste antigenspezifische NK-Zell-vermittelte Antitumoraktivität stimuliert. Die Verwendung von iPSCs für die CAR-NK-Zellgenerierung bietet mehrere Vorteile, darunter eine homogene CAR-Expression, Skalierbarkeit, Reproduzierbarkeit und das Potenzial für eine klinische Anwendung. Dieses detaillierte Schritt-für-Schritt-Protokoll vom Zellengineering bis zur Differenzierung ermöglicht die Generierung von NK-Zell-optimierten iPSC-abgeleiteten CAR-exprimierenden NK-Zellen, bietet eine standardisierte und zielgerichtete Krebsimmuntherapie mit verbesserter Antitumoraktivität und unterstreicht ihr Potenzial als vielversprechende Behandlungsoption für verschiedene Malignome.

Einleitung

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NK-Zellen, eine Art von Lymphozyten innerhalb des angeborenen Immunsystems, sind entscheidend für die frühe Abwehr von Tumoren und virusinfizierten Zellen 1,2,3. Im Gegensatz zu T-Zellen benötigen NK-Zellen keine Antigenpräsentation über MHC-Moleküle (Major Histocompatibility Complex). Stattdessen verfügen NK-Zellen über ein Repertoire an aktivierenden und hemmenden Rezeptoren, die ihre Aktivität regulieren3. Die zellvermittelte zytotoxische Aktivität von NK nutzt verschiedene Mechanismen, darunter die Freisetzung von Perforin und Granzymen, die Beteiligung von Todesrezeptoren und die Produktion von proinflammatorischen Zytokinen wie IFN-γ und TNF-α. Dieser einzigartige Wirkmechanismus positioniert NK-Zellen als attraktiven Kandidaten für die Krebsimmuntherapie, insbesondere bei der Behandlung solider Krebserkrankungen, bei denen die Immunevasion eine erhebliche Hürde darstellt 1,2,3,4.

Das hepatozelluläre Karzinom (HCC) ist eine der weltweit häufigsten und tödlichsten Formen von Leberkrebs5. Traditionelle therapeutische Ansätze, einschließlich Chirurgie, Chemotherapie und Strahlentherapie, bieten in der Regel einen begrenzten klinischen Nutzen und führen zu hohen Rezidivraten 6,7. Jüngste Fortschritte in der Immuntherapie und der zielgerichteten Therapie haben die Behandlung von HCC 8,9 erheblich beeinflusst. Immun-Checkpoint-Inhibitoren wie Nivolumab und Pembrolizumab haben vielversprechende Ergebnisse gezeigt, indem sie die Immunzellantwort gegen Krebszellen verstärken10,11. Diese Therapien haben bei einigen Patienten zu verbesserten Überlebensraten und besserer Lebensqualität geführt. Sie können jedoch auch immunbedingte Nebenwirkungen verursachen, die ihre Anwendung bei bestimmten Patienten einschränken können12. Zielgerichtete Therapien wie Sorafenib und Lenvatinib hemmen spezifisch Signalwege, die das Wachstum von Krebszellen und die Angiogenese fördern13. Diese Behandlungen haben eine bekannte Wirksamkeit, um das Fortschreiten der Krankheit zu kontrollieren und das Überleben zu verlängern 8,14. Nichtsdestotrotz entwickelt sich in der Regel eine Resistenz gegen zielgerichtete Therapien, und Nebenwirkungen der Behandlung sind häufig15,16. Zu den vielversprechenden Wegen in der Krebsimmuntherapie gehört das Aufkommen von chimären Antigenrezeptoren (CAR) CAR-T-Zellen, die die Krebsbehandlung revolutioniert haben, insbesondere bei der Behandlung hämatologischer Malignome wie Lymphome und multiples Myelom 17,18,19.

CAR-exprimierende NK-Zellen, die die angeborene zytotoxische Aktivität von NK-Zellen mit dem präzisen Targeting der CAR-Technologie kombinieren, stellen einen innovativen und potenziell transformativen Ansatz für solide Tumoren wie HCC 20,21,22,23,24 dar. CAR-gezüchtete Zellen können Tumorzellen, die das Zielantigen exprimieren, spezifisch erkennen und abtöten, während normales Gewebe geschont wird, wodurch das Risiko von Off-Target-Effekten im Zusammenhang mit herkömmlichen Therapien verringertwird 25,26,27. CAR-NK-Zellen, die aus NK-Zellen hergestellt werden, die aus peripherem Blut oder Nabelschnurblut isoliert wurden, werden typischerweise durch Transduzieren von NK-Zellen mit CAR-Konstrukten hergestellt, die aus einer extrazellulären Antigen-Erkennungsdomäne, einer Transmembrandomäne und intrazellulären Signaldomänen bestehen, die für die Aktivierung und Proliferation erforderlich sind 28,29,30.

Die Herausforderung, eine stabile und homogene Population von funktionell veränderten NK-Zellen für die klinische Behandlung zu entwickeln, kann durch den Einsatz von induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSCs) gelöst werden31,32. Das Engineering von humanen iPSCs mit NK-Zell-optimierten CARs liefert ein verbessertes Aktivierungs- und Proliferationssignal für NK-Zellen und liefert eine unerschöpfliche und homogene Population von CAR-exprimierenden NK-Zellen als standardisierte "Standardtherapie"20,33. In diesem Protokoll beinhaltet die genetische Modifikation von iPSCs zur Erzeugung von CAR-exprimierenden iPSC-abgeleiteten NK-Zellen die Integration eines NK-Zell-optimierten CAR-Konstrukts, das von NK-Zellen abgeleitete Transmembran- und Signaldomänen (NKG2D-2B4-CD3ζ) und ein Anti-Glypican-3 (GPC3) scFv umfasst, wie in unseren früheren Studienbeschrieben 23. Die gentechnisch veränderten iPSCs werden dann unter Verwendung eines zuvor entwickelten NK-Zelldifferenzierungsprotokolls differenziert und expandiert34. Diese manipulierten CAR-exprimierenden iPSC-abgeleiteten NK-Zellen haben die Fähigkeit, HCC und andere Tumorzellen, die spezifische tumorassoziierte Antigene exprimieren, wie z. B. Glypican 3 (GPC3), das in HCC und anderen Malignomen überexprimiert wird, zu erkennen und zu eliminieren 35,36,37,38.

Die Anwendung von iPSC-abgeleiteten CAR-NK-Zellen zur Behandlung verschiedener Krebsarten ist vielversprechend 30,39,40; Viele dieser iPSC-abgeleiteten CAR-NK-Zellen befinden sich derzeit in klinischen Studien 41,42,43. Um Fortschritte in diesem Bereich zu ermöglichen, ermöglicht dieses Protokoll die effiziente Produktion von gentechnisch veränderten iPSC-abgeleiteten CAR-NK-Zellen, vom Zellengineering über die Differenzierung in reife NK-Zellen bis hin zur In-vitro-Expansion.

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Protokoll

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1. Feeder-freie Kulturmethode für humane iPSCs

HINWEIS: Tauen Sie die gefrorenen undifferenzierten humanen iPS-Zellen auf und kultivieren Sie sie unter Verwendung von mTeSR 1-plus auf vorbeschichteten Matrigelplatten (im Folgenden als Basalmembranmatrix [BMM] bezeichnet), wie zuvor beschrieben23,34. Es ist sehr wichtig, sicherzustellen, dass die iPSCs vor und nach dem Engineering nicht differenziert werden. Frisch aufgetaute iPS-Zellen sollten für etwa 2-3 Passagen kultiviert werden, um eine Pluripotenzmorphologie zu zeigen, die mit den menschlichen pluripotenten Stammzellen übereinstimmt. Die folgenden Anweisungen gelten für das Passieren von Zellen aus einer Vertiefung einer 6-Well-Platte.

  1. Vor dem Passieren von iPSCs die neue 6-Well-Platte mit 1x BMM (1 mL/Well) beschichten und vor der Verwendung 2-4 h in einem 37 °C Inkubator inkubieren.
  2. Bereiten Sie 1x lösliches BMM vor.
    1. Tauen Sie ein 5-ml-Vorratsfläschchen mit BMM über Nacht bei 4 °C auf.
    2. Schnelles Aliquotieren von BMM mit vorgekühlten Spitzen in vorgekühlte Mikrozentrifugenröhrchen.
    3. Bei -80 °C bis zu 6 Monate lagern.
    4. Zur Herstellung von 1x BMM-Arbeitslösung wird ein BMM-Aliquot im Verhältnis 1:100 in ein kaltes DMEM/F12-Medium resuspendiert. Die 1x BMM Arbeitslösung kann bei -4 °C 2 Wochen gelagert werden.
    5. Beschichten Sie die Platte mit ausreichend Volumen, um die Oberfläche zu bedecken (verwenden Sie z. B. 1 ml pro Vertiefung einer 6-Well-Platte).
    6. Vor Gebrauch 2-4 h im 37 °C Inkubator inkubieren.
  3. Eine Durchstechflasche mit gefrorenen iPS-Zellen (in der Regel 1 × 106 Zellen/Durchstechflasche) in einem Wasserbad bei 37 °C auftauen.
  4. Geben Sie die aufgetauten iPS-Zellen nach und nach in ein konisches 15-ml-Röhrchen mit 5 ml vorgewärmtem mTeSR Plus-Medium, damit sich die Zellen akklimatisieren können, indem Sie sie Tropfen für Tropfen hinzufügen, um den Zellschock zu minimieren.
  5. Die Zellen bei 300 × g 5 min zentrifugieren.
  6. Aspirieren Sie den Überstand und waschen Sie die Zellen einmal mit 5 mL PBS.
  7. Resuspendieren Sie die Zellen in mTeSR Plus-Medium und plättieren Sie sie mit einer Dichte von ca. 200.000 Zellen/3 ml/Well in der BMM-vorbeschichteten 6-Well-Platte.
  8. Passage iPSCs.
    1. Sobald die iPSCs eine Konfluenz von 70-80 % erreicht haben, aspirieren Sie das Medium und führen Sie eine Einzelzellpassage mit TrypLE für 5 Minuten bei 37 °C durch (1 ml/Well in 6-Well-Platte).
    2. Fügen Sie nach 5 Minuten 3 mL 1x PBS hinzu, um die Dissoziationsreaktion zu stoppen, und waschen Sie die Zellen einmal mit 3 mL PBS.
    3. Die Zellen bei 300 × g 5 min zentrifugieren. Nach dem Waschen resuspendieren Sie die einzelligen iPSCs in mTeSR Plus-Medium und plattieren Sie sie dann auf eine BMM-vorbeschichtete 6-Well-Platte.
      HINWEIS: Das erforderliche Gesamtmedienvolumen beträgt 3 ml/Well in einer 6-Well-Platte. Das Medium muss alle 2-3 Tage gewechselt werden, und Schritt 1.8 muss wiederholt werden, wenn die Zellen mindestens 1-2 Passagen lang zu 70-80% konfluent sind, bevor die iPSCs konstruiert werden.
  9. Überprüfen Sie regelmäßig die Pluripotenz der iPSCs. Färben Sie die iPSCs mit Allophycocyanin (APC)-konjugierten TRA-1-81- und PE-Cy7-konjugierten stadienspezifischen embryonalen Antigen-4 (SSEA-4)-Antikörpern für 30 Minuten auf Eis und analysieren Sie sie dann mittels Durchflusszytometrie, wie zuvor beschrieben23,41.
    HINWEIS: Die in diesem Experiment verwendeten iPS-Zellen sind an TrypLE angepasst. iPSCs, die zuvor nicht mit TrypLE durchgelassen wurden, benötigen in der Regel 8-10 Passagen, um vollständig an TrypLE angepasst zu werden, was die Produktion hochwertiger Spin-Embryoidkörper (EBs) gewährleistet.

2. Entwicklung humaner iPSCs zur Expression von Anti-GPC3-CAR unter Verwendung eines piggyBac-Vektors

  1. Eine neue 6-Well-Platte mit BMM beschichten und mindestens 1 h bei 37 °C inkubieren (es kann länger dauern, solange die Flüssigkeit nicht trocknet).
  2. mTeSR Plus mit 10 μM Rho-assoziiertem Coiled-Coil-haltigem Proteinkinase (ROCK)-Inhibitor (Y-27632) (aus 1 mM Stamm, hergestellt in sterilem destilliertem Wasser) bei 37 °C vorwärmen.
  3. Schalten Sie das Nucleofection-System ein. Wählen Sie die Einheit X und dann die Positionen der zu transfizierenden Vertiefungen aus. Wählen Sie die P3-Lösung aus, und geben Sie den Code manuell ein (CA-137).
  4. Ernten Sie iPSCs bei 70-80% Konfluenz mit 1 mL TrypLE und inkubieren Sie sie 5 Minuten lang bei 37 °C. Überprüfen Sie unter dem Mikroskop, um die Dissoziation zu bestätigen.
  5. 4-6 Mal pipettieren, um eine einzellige Suspension zu erhalten, dann mit 5 ml PBS neutralisieren und 5 Minuten lang mit 300 × g pelletieren.
  6. Waschen Sie die Zellen noch einmal vorsichtig, um alle Spuren von TrypLE zu entfernen.
  7. In 1 mL mTeSR Plus mit Rock-Inhibitor resuspendieren und die Zellen zählen.
  8. Um Anti-GPC3-CAR-iPSCs herzustellen, verwenden Sie 1 × 106 Zellen pro Transfektion in einem Mikrozentrifugenröhrchen und schleudern Sie 5 Minuten lang bei 300 × g herunter.
  9. Kombinieren Sie während des Schleuderns die CAR-exprimierende Transposon-DNA mit dem Super-PiggyBac-Transposase-Expressionsvektor in einem 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen im Verhältnis 3:1 (z. B. 3 μg Plasmid, das das Transposon enthält, zu 1 μg Transposase-Plasmid).
  10. Dazu gehören eine Positivkontrolle des grün fluoreszierenden Proteins (GFP) unter Verwendung von 0,5 μl 1 mg/ml-Lösung und eine nicht transfizierte Negativkontrolle zur Bestätigung der GFP-Expression.
  11. Resuspendieren Sie das Zellpellet vorsichtig in 20 μl P3-Nukleofektorlösung bei Raumtemperatur (RT) mit dem im Nukleofektion-Kit enthaltenen Ergänzungsmittel. Geben Sie diese Mischung dann in ein 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen mit Plasmid-DNA, was zu einem Endvolumen von etwa 22-25 μl führt.
    HINWEIS: Resuspendieren Sie alle zu transfizierenden iPSCs in P3-Nukleofektorlösung, bevor Sie GPC3-CAR-Plasmide oder GFP-Kontrollplasmide zu den Zellen hinzufügen.
  12. Übertragen Sie die Zell-/DNA-Suspension auf einen 20-μl-16-Well-Streifen. Stellen Sie sicher, dass die Probe den Boden der Küvette ohne Blasen bedeckt.
  13. Klopfen Sie vorsichtig auf die 16-Well-Streifen auf der Tischplatte, um Luftblasen zu entfernen und Zellen an der Unterseite anzusiedeln.
  14. Legen Sie die 16-Well-Streifen, die iPSCs und CAR-DNA-Mix enthalten, in das Nukleofektion-System, wählen Sie Programm CA-137, P3-Lösung, und starten Sie dann das Programm. Dieses Programm endet in 1 s und zeigt ein grünes Häkchen an.
  15. Geben Sie 80 μl vorgewärmtes mTeSR Plus mit ROCK-Inhibitor-Medium in die Vertiefung und überführen Sie die Zellen vorsichtig in die mit BMM beschichtete 6-Well-Platte (Endvolumen 1 mL pro Well).
  16. Überprüfen Sie die Zellen unter dem Fluoreszenzmikroskop nach 4 Stunden kurz auf GFP-Expression, um die Erfolgsrate der Transfektion zu bestätigen.
  17. Screenen von iPSCs auf GFP-Expression zur Beurteilung der Transfektionseffizienz 24 h nach der Transfektion mittels Durchflusszytometrie23,41 zur Bestätigung der GFP-Expression.
  18. Inkubieren Sie 4 Tage lang bei 37 °C und wechseln Sie das Medium nach Bedarf, bevor Sie mit der Arzneimittelauswahl fortfahren.
    HINWEIS: Jede Nukleofektion erfordert 0,2-2 x 106 iPSCs pro Reaktion. Je nach Anzahl der Reaktionen können 24-Well-Platten oder 6-Well-Platten verwendet werden.

3. Klonale Selektion und Bestätigung der Pluripotenz von GPC3-CAR-iPSCs

  1. Führen Sie eine Reihe von Zeocin-Selektionen (1:10.000) an den transfizierten iPSCs durch, um GPC3-CAR-exprimierende iPSCs klonal auszuwählen.
  2. Um die Transfektionseffizienz zu bestätigen, ist die GFP-Expression mit einem Fluoreszenzmikroskop und Durchflusszytometrie zu messen23,41.
    ANMERKUNG: Das CAR-Konstrukt ist mit einem FLAG-Tag44,45 versehen, um die CAR-Expression sowohl während des iPSC-Stadiums als auch nach der NK-Zelldifferenzierung zu bewerten.
  3. Die transfizierten CAR-iPSCs werden so lange unter Wirkstoffauswahl gehalten, bis sie eine optimale CAR-Gen- und GFP-Expression erreichen.
  4. Um eine homogene GFP- und CAR-Expression zu gewährleisten, verlängern Sie die Dauer der Wirkstoffauswahl um 2-3 Wochen.
  5. Durchführung einer Zellsortierung auf der Grundlage von GFP- oder CAR-Expression mittels Durchflusszytometrie, um eine homogene Population klonal selektierter iPSCs zu erhalten23.
  6. Das hier verwendete CAR-Konstrukt enthält einen Zeocin-Wirkstoffauswahlmarker. Wählen Sie die Zellen aus, die mit dem GPC3-CAR-Gen transfiziert wurden, indem Sie Zeocin (50 μg/ml Zeocin) zum Kulturmedium hinzufügen.
  7. Nach der Zeocin-Selektion verdünnen Sie die transfizierten iPSCs des GPC3-CAR-Gens und plättieren Sie sie in eine 96-Well-Platte, um etwa eine Zelle pro Well zu erhalten. Dies kann durch serielle Verdünnung oder mit einem Zellsortierer erfolgen.
    HINWEIS: Verwenden Sie die fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS), um einzelne transfizierte Zellen basierend auf der Expression eines Fluoreszenzmarkers zu isolieren, der mit dem CAR-Konstrukt verknüpft ist.
  8. Lassen Sie die einzelnen Zellen in der 96-Well-Platte zu Kolonien expandieren.
  9. Füttern Sie die Zellen einmal alle 3-4 Tage mit frischem Kulturmedium und überwachen Sie die Vertiefungen auf Koloniewachstum.
  10. Durchsuchen Sie die Kolonien auf CAR-Ausdruck. Dies kann durch Polymerase-Kettenreaktion (PCR), quantitative Polymerase-Kettenreaktion (qPCR) oder Western-Blot erfolgen, um das Vorhandensein des CAR-Konstrukts zu verifizieren23,47.
  11. Alternativ kann die Durchflusszytometrie23,41 verwendet werden, um die Oberflächenexpression des CAR-Proteins zu detektieren.
    HINWEIS: In dieser Studie wurde die CAR-Expression durch FLAG-Tag-Expression mittels Durchflusszytometrie quantifiziert.
  12. Führen Sie zusätzlich eine Karyotypisierung durch, um Chromosomenanomalien zu identifizieren.
    HINWEIS: Dies kann von Drittorganisationen wie Wicell (wicell.org) oder Thermo Fisher Scientific (thermofisher.com) durchgeführt werden.
  13. Sobald die CAR-positiven Klone ohne Anomalien identifiziert sind, expandieren Sie diese Klone in größeren Kulturgefäßen wie einer 6-Well-Platte und einem T75-Kolben.
  14. Kryokonservierung der klonal expandierten CAR-iPSCs mit einem Kryokonservierungsmedium in mehreren Fläschchen für die zukünftige Verwendung.
    HINWEIS: In diesem Schritt werden die folgenden Punkte empfohlen: (i) Aufrechterhaltung optimaler Kulturbedingungen für iPSCs, um eine Differenzierung zu verhindern. (ii) Es ist 1-4 Wochen eingeplant, um nach der Wirkstoffauswahl eine homogene Population der CAR- und GFP-Expression in iPSCs zu erreichen. (iii) Kontinuierliche Überwachung der Zellen auf Stabilität der CAR-Expression und Pluripotenzmarker. iv) während der Screening- und Überprüfungsschritte geeignete Kontrollen durchführen. (v) Nach klonaler Selektion und Expansion ist die Pluripotenz durch Beurteilung der Expression von TRA-1-81 und SSEA-4 auf den CAR-exprimierenden iPSCs zu überprüfen.

4. Erzeugung von hämatopoetischen Vorläuferzellen aus gentechnisch veränderten CAR-iPSCs durch Bildung von Spin-Embryoidkörpern (EB)

ANMERKUNG: Ein Spin-EB oder hämatopoetisches Organoidprotokoll wird verwendet, um hämatopoetische Vorläuferzellenherzustellen 23,34. Die Zellen innerhalb der EBs differenzieren sich zu Stromazellen, um die Lymphozytenentwicklungzu unterstützen 38, wodurch die Notwendigkeit von Xeno-abgeleiteten Stromazellen wie OP9eliminiert wird 23,34,48. Im Folgenden finden Sie die Anweisungen für die Entnahme von Zellen aus einer einzelnen Vertiefung einer 6-Well-Platte für die EB-Bildung.

  1. Passage ~200.000 Zellen/Well einer 6-Well-BMM-vorbeschichteten Platte 2 Tage vor der Spin-EB-Bildung. Stellen Sie sicher, dass es am Tag der Einrichtung der Spin-EBs eine Konfluenz von 70-80 % erreicht. Im Allgemeinen ist 1 Vertiefung einer 6-Well-Platte für zwei Platten Spin-EB ausreichend.
  2. Entfernen Sie das Kulturmedium und lösen Sie die Zellen, indem Sie es 5 Minuten lang mit 1 ml vorgewärmtem TrypLE Select bei 37 °C inkubieren.
  3. Dissoziieren Sie die Zellaggregate vorsichtig mit einer 1-ml-Mikropipette zu einer Einzelzellsuspension und überführen Sie die Zellen in ein konisches 15-ml-Röhrchen. Fügen Sie 3 mL 1x PBS hinzu, um die Dissoziationsreaktion zu stoppen, und waschen Sie die Zellen einmal mit 3 mL PBS.
  4. Resuspendieren Sie die Zellen in mTesR Plus Medium und filtrieren Sie sie durch ein 70 μM Zellsieb, um Aggregate zu entfernen.
  5. Schleudern Sie die Zellen herunter, um den Überstand zu entfernen, und waschen Sie die Zellen erneut mit 5 ml PBS. Anschließend resuspendieren Sie die Zellen in 1 ml STEMdiff APEL-Medium (EB-Bildungsmedium).
  6. Zählen und verdünnen Sie die Zellen auf die entsprechende Dichte unter Verwendung des EB-Bildungsmediums, das die folgenden Zytokine (SCF: 40 ng/ml, BMP4: 20 ng/ml, VEGF: 20 ng/ml) plus 10 μM ROCK-Inhibitor enthält.
  7. 3000-10000 Zellen/Well in 100 μl Medium (100.000 Zellen/ml) in den 96-Well-Platten aussäen.
    HINWEIS: Die Anzahl der Zellen, die bei der EB-Bildung verwendet werden, kann je nach iPS-Linie variieren. Es wird empfohlen, zwischen 3.000 und 10.000 Zellen pro Well in 96-Well-Platten zu testen.
  8. Laden Sie die Zellsuspension mit einer Mehrkanalpipette in 96-Well-Platten mit 100 μl/Well.
    HINWEIS: Für eine bessere Bildung von Embryoidkörpern (EBs) wird empfohlen, 96-Well-Platten mit extrem geringer Bindung und rundem Boden zu verwenden.
  9. Zentrifugieren Sie die 96-Well-Platte 5 Minuten lang bei 300 × g und inkubieren Sie die Platten dann 6 Tage lang bei 37 °C mit 5 % CO2 .
    HINWEIS: Vorläufige Studien haben ergeben, dass 6 Tage ausreichen, um >30% CD34+ -Zellen für die CAR-iPSC-Linien in dieser Studie zu erzeugen.
  10. Überprüfen Sie die EB-Qualität durch Durchflusszytometrie23,41.
    1. Bereiten Sie 4 ml vorgewärmtes 0,25 % Trypsin mit 0,4 % Hühnerserum (16 μl für 4 ml Trypsin) zur Dissoziation von EBs vor.
    2. Übertragen Sie 10-30 EBs in ein konisches 15-ml-Röhrchen.
    3. Geben Sie die Trypsin/Hühnerserum-Lösung zu den EBs und inkubieren Sie sie 10 Minuten lang in einem Wasserbad, wobei Sie alle 30 s vortexen, um eine vollständige Dissoziation der EBs zu gewährleisten.
    4. Pipettieren Sie die trypsinisierten EBs. Mischen Sie mehrmals auf und ab, um das EBS gründlich zu dissoziieren.
    5. Fügen Sie 5 ml 1x PBS hinzu, um den Trypsinisierungsprozess zu stoppen.
    6. Filtrieren Sie die Zelllösung durch ein 70 μm Zellsieb in einem neuen konischen Röhrchen.
    7. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 300 x g für 5 min.
    8. Den Überstand aspirieren und in 3-5 ml frischem Medium resuspendieren.
    9. Zählen Sie die Zellen, färben Sie sie mit typischen EB-Markern wie CD34, CD31, CD43 und CD45 und analysieren Sie sie mit Durchflusszytometrie23,41 (Abbildung 3).
    10. Das empfohlene Volumen an Antikörpern gemäß den Anweisungen des Herstellers in jedes Röhrchen mit dissoziierten EB-Einzelzellen in 100 μl Flow-Puffer geben und 30 min lang auf Eis inkubieren39,41.
    11. Waschen Sie die Zellen nach der Inkubation zweimal mit Flusspuffer, fügen Sie SYTOX Blue Lebend-/Totfärbung hinzu und analysieren Sie sie mittels Durchflusszytometrie.
      HINWEIS: In der Regel werden >30% CD34+ -Zellen aus der Gesamtpopulation dissoziierter Spin-Embryoidkörper an Tag 6 unter Verwendung der in dieser Studie verwendeten iPS-Zellen gewonnen, obwohl dieser Prozentsatz je nach iPS-Quelle und Kulturbedingungen variieren kann.

5. Differenzierung von GPC3 CAR iPSC abgeleiteten NK-Zellen von Spin EBs

HINWEIS: Die GPC3 CAR-exprimierenden Spin EBs können entweder in 24-Well-Platten oder 6-Well-Platten überführt werden, die mit 2 % Gelatine beschichtet oder ohne Beschichtung sind. Für den Wechsel des Mediums sind 6-Well-Platten besser geeignet, während die 2%ige Gelatinebeschichtung die Haftung der EBs verbessert.

  1. Bereiten Sie gelatinebeschichtete 6-Well-Platten vor, indem Sie die folgenden Schritte ausführen.
    1. Bereiten Sie eine 2%ige (w/v) Gelatinelösung vor, indem Sie Gelatine in Wasser in Gewebekulturqualität auflösen.
    2. Sterilisieren Sie die Lösung, indem Sie sie 30 Minuten lang bei 121 °C und 15 psi autoklavieren.
    3. Beschichten Sie die Oberfläche jeder Vertiefung mit 5-10 μl Gelatinelösung pro cm2 (~1 mL pro Vertiefung einer 6-Well-Platte).
    4. Die Platten vor Gebrauch 2-4 h bei 37 °C inkubieren. Nach der Inkubation aspirieren Sie die verbleibende Gelatinelösung, bevor Sie mit dem EB-Transfer fortfahren.
  2. Bereiten Sie das NK-Zelldifferenzierungsmedium vor: Fügen Sie 56,6 % DMEM+ GlutaMAX-I, 28,3 % F12+ GlutaMAX-I, 15 % hitzeinaktiviertes humanes AB-Serum, 1 % P/S, 2 mM L-Glutamin, 1 μM β-Mercaptoethanol, 5 ng/ml Natriumselenit, 50 μM Ethanolamin und 20 mg/l Ascorbinsäure hinzu. Bei 4 °C im Dunkeln lagern.
  3. Geben Sie 3 ml NK-Differenzierungsmedium mit den folgenden Zytokinen in jede Vertiefung der gelatinebeschichteten 6-Well-Platten (IL-3: 5 ng/ml, SCF: 20 ng/ml, IL-7: 20 ng/ml und IL-15: 10 ng/ml).
  4. Übertragen Sie Spin EBs an Tag 6 direkt in die vorbereiteten, mit Gelatine beschichteten 6-Well-Platten mit NK-Differenzierungsmedium, indem Sie die folgenden Schritte ausführen.
    1. Übertragen Sie EBs vorsichtig von 96-Well-Platten in eine 10-cm-Schale, wobei Sie eine serologische 10-ml-Pipette verwenden, um den größten Teil des Mediums zu entfernen.
    2. Geben Sie 3 ml NK-Differenzierungsmedium, das die oben genannten Zytokine enthält, in jede Vertiefung der gelatinebeschichteten 6-Well-Platte.
    3. Verteilen Sie 16-20 EBs mit einer 1-ml-Mikropipette in jede Vertiefung der 6-Well-Platte.
      HINWEIS: Im Durchschnitt können die EBs aus einer einzelnen 96-Well-Platte verwendet werden, um eine 6-Well-Platte für die NK-Differenzierungsplatte zu säen.
  5. Führen Sie alle 5-7 Tage einen Mediumwechsel durch. Nach der ersten Woche der NK-Zelldifferenzierung schließen Sie IL-3 aus dem Medium aus.
    HINWEIS: Nach 14 Tagen muss das Medium alle 3-4 Tage gewechselt werden.
  6. Setzen Sie den Mediumwechsel für 3-4 Wochen fort. Evaluierung der Expression von NK-Zellmarkern (CD45+CD56+) mittels Durchflusszytometrie24,42 auf Suspensionszellen.
  7. Wenn >80 % der Suspensionszellen CD45+CD56+ exprimieren, ernten Sie die Zellen, indem Sie sie durch einen 70-μm-Filter leiten, um alle Klumpen zu entfernen.
  8. Co-Kultur geernteter NK-Zellen mit 100 grau bestrahlten aAPCs34,48 und Kultur in NK-Expansionsmedium, das IL-2 (100 ng/ml) und IL-15 (10 ng/ml) enthält.

6. Expansion von anti-GPC3 CAR iPSC abgeleiteten NK-Zellen

HINWEIS: In der Regel kann eine Ausbeute von 2-20 × 10 6-NK-Zellen aus einer einzigen 6-Well-Platte erzielt werden, sogar vor der Expansion. Um den weiteren Ausbau von NK-Zellen für Downstream-Anwendungen zu erleichtern, werden künstliche Antigen-präsentierende Zellen (aAPCs) eingesetzt, um >1 × 109 NK-Zellen zu erzeugen.

  1. Verwendung von technisch hergestellten K562-Zellen, die 41BBL exprimieren, und membrangebundenem IL-21 (41BBL-mbIL-21)48 als aAPCs, um die Expansion von NK-Zellen zu induzieren.
  2. Bevor Sie aAPCs mit NK-Zellen co-kultivieren, bestrahlen Sie aAPCs mit 100 Gray und konservieren Sie sie als gefrorene Bestände.
  3. Ernten Sie die Suspensionszellen aus der 6-Well-Platte und kultivieren Sie die NK-Zellen in NK-Expansionsmedium, ergänzt mit 50 μl/ml, IL-2 und IL-15 (10 ng/ml; frisch zugeben), bei einer Dichte von 5 × 105 Zellen/ml.
  4. Fügen Sie aufgetaute, bestrahlte aAPCs im Verhältnis 1:1 zu NK-Zellen hinzu.
  5. Füllen Sie das Nährmedium alle 3-4 Tage auf und fügen Sie frisches IL-2 und IL-15 in einer Konzentration von 50 U/ml bzw. 10 ng/ml hinzu.
  6. Stellen Sie sicher, dass CAR-iPSC-abgeleitete NK-Zellen die Expansionsfähigkeit über einen Zeitraum von >3 Monaten beibehalten und sowohl die Lebensfähigkeit der Zellen als auch die zytolytische Aktivität erhalten.

7. Phänotypische und funktionelle Charakterisierung von GPC3 CAR iPSC abgeleiteten NK-Zellen

HINWEIS: Die Charakterisierung von GPC3-CAR-iPSC-abgeleiteten NK-Zellen beinhaltet eine umfassende Bewertung ihres phänotypischen Profils und ihrer funktionellen Aktivität.

  1. Bewerten Sie die Expression der NK-Aktivierungsrezeptoren, einschließlich CD45, CD56, CD94, CD16, NKp30, NKp44, NKp46, NKG2D, DNAM, TRAIL und FasL, Expression auf den von Anti-GPC3-CAR-iPSCs abgeleiteten NK-Zellen durch Durchflusszytometrie24,42, um die Aktivität und den Reifungsstatus der CAR-NK-Zellen zu bestimmen (Abbildung 4).
  2. Bewertung der in vitro funktionellen Aktivität von GPC3-CAR-iPSC-abgeleiteten NK-Zellen unter Verwendung von durchflusszytometrischen Caspase-3/7-Assays, CD107a-Granule-Release-Assays, IFN-γ- und TNF-α-Zytokin-Release-Assays gegen verschiedene Tumorziele.
  3. Führen Sie für den Caspase3/7-Assay die folgenden Schritte aus.
    1. Zählen Sie die Zielzellen und färben Sie sie 15 Minuten lang bei 37 °C mit einem Fluoreszenzfarbstoff mit Zellverfolgung bei einer Endkonzentration von 5 μM in PBS vor.
    2. Waschen Sie gefärbte Zielzellen in einem vollständigen Kulturmedium, bevor Sie sie mit CAR-iPSC-abgeleiteten NK-Zellen bei verschiedenen Effektor-Ziel-Verhältnissen (E:T) bei 37 °C co-kultivieren.
    3. Nach 3 h und 30 min Co-Kultur fügen Sie Caspase-3/7 Green Detection Reagenz für weitere 30 min Inkubation hinzu, was zu einer Gesamtinkubationszeit von 4 h führt.
    4. Fügen Sie während der letzten 5 Minuten der Färbung 1 μl Lösung zum Färben toter Zellen hinzu und mischen Sie vorsichtig.
    5. Analysieren Sie die gefärbten Zellen mittels Durchflusszytometrie23,41 (Abbildung 5).
  4. Implementierung dieses Protokolls, um ein umfassendes Verständnis der phänotypischen Merkmale und der funktionellen Aktivität von GPC3-CAR-iPSC-abgeleiteten NK-Zellen zu gewährleisten und eine robuste Bewertung ihres therapeutischen Potenzials zu ermöglichen.
    HINWEIS: Es dauert in der Regel 4-5 Wochen, um >90% CD45+CD56+ Zellen aus Spin-EB-basierten, GPC3 CAR iPSC-abgeleiteten NK-Zelldifferenzierung und NK-Expansionsbedingungen unter Verwendung von GPC3 CAR iPSC-Linien zu erhalten. Einige iPSC-Zelllinien benötigen möglicherweise nur 3 Wochen, und einige Linien können länger dauern (etwa 4-5 Wochen).

8. Fehlerbehebung bei Elementen und Lösungen

HINWEIS: Die Fehlerbehebung bei der Differenzierung, Expansion und Funktionsprüfung von iPSC-abgeleiteten GPC3-CAR-NK-Zellen unter Verwendung der Spin-Embryoidkörper-Methode (EB) kann mehrere Schritte umfassen. Im Folgenden sind einige häufige Probleme aufgeführt, auf die man stoßen kann, zusammen mit Lösungsvorschlägen:

  1. Symptome einer inkonsistenten EB-Bildung
    1. Prüfen Sie, ob die EBs entweder zu klein oder zu groß sind und unregelmäßige Formen aufweisen.
  2. Lösung für inkonsistente EB-Bildung
    1. Passen Sie die Zentrifugengeschwindigkeit und -dauer an, die zur Bildung von EBs verwendet werden. Typisch ist eine Geschwindigkeit von ca. 200-300 × g für 5-10 min.
    2. Stellen Sie sicher, dass die entsprechenden U-Bodenplatten oder Kulturschalen mit extrem niedrigem Anhaftungsgrad verwendet werden, um die EB-Bildung zu erleichtern.
    3. Vergewissern Sie sich, dass die iPS-Zellen homogen und frei von differenzierten Zellen sind, die die EB-Bildung beeinflussen könnten.
  3. Symptome einer schlechten Differenzierung von iPS-Zellen zu NK-Zellen
    1. Überprüfen Sie, ob die Expression von NK-Zellmarkern (z. B. CD56, NKp46) niedrig ist.
    2. Überprüfen Sie, ob EBs nicht gebildet werden oder ob sie schlecht formatiert sind.
  4. Lösung für die schlechte Differenzierung von iPSCs zu NK-Zellen
    1. Stellen Sie sicher, dass die Konzentrationen essentieller Wachstumsfaktoren (z. B. VEGF, BMP4, Y-27632, FLT3, IL-15, IL-7, SCF und IL-3) optimal für die EB-Bildung und die Differenzierung von NK-Zellen sind. Passen Sie die Konzentrationen auf der Grundlage früherer Studien an 23,34,41.
    2. Stellen Sie sicher, dass die anfängliche Seeding-Dichte von iPSCs angemessen ist. Typischerweise wird eine Dichte von 8000-10.000 Zellen/100 μl für die Spin-EB-Bildung empfohlen.
    3. Stellen Sie sicher, dass das Differenzierungsmedium korrekt formuliert ist, einschließlich der notwendigen Nahrungsergänzungsmittel (z. B. Serum oder serumfreie Alternativen, andere Zytokine).
    4. Planen Sie ausreichend Zeit für die EB-Bildung ein, mindestens 6 Tage bis bis zu 12 Tage, bevor Sie auf NK-Zelldifferenzierungsmedium umstellen.
  5. Symptome einer schlechten Expansion von NK-Zellen
    1. Überprüfen Sie, ob die Zellausbeute während der Expansion begrenzt ist.
    2. Prüfen Sie, ob expandierte NK-Zellen vermindert lebensfähig sind.
  6. Lösungen für eine schlechte Expansion von NK-Zellen
    1. Erhöhen Sie die Konzentration von IL-15 und IL-2 während der Expansionsphase. Dies kann die Proliferation von NK-Zellen erheblich verbessern.
    2. Erwägen Sie die Verwendung von Feeder-Zellen wie bestrahlten aAPCs, um das Überleben und die Expansion der NK-Zellen zu verbessern.
    3. Überwachen Sie die Zelldichte regelmäßig und passieren Sie die Zellen, bevor sie überfüllt sind, um optimale Wachstumsbedingungen aufrechtzuerhalten.
  7. Symptome suboptimaler Funktionstestergebnisse
    1. Prüfen Sie, ob eine verminderte Zytotoxizität gegen Zielzellen vorliegt.
    2. Überprüfen Sie, ob die Zytokinsekretion niedrig ist (z. B. IFN-γ, TNF-α).
  8. Lösungen für suboptimale Funktionstestergebnisse
    1. Optimieren Sie das Ziel-Effektor-Verhältnis in Zytotoxizitätsassays. Beginnen Sie mit einem Verhältnis von 10:1 und passen Sie es basierend auf den Ergebnissen an.
    2. Stellen Sie sicher, dass NK-Zellen vor funktionellen Assays ausreichend aktiviert werden. Dies kann eine Prästimulation mit Zytokinen oder eine Co-Kultivierung mit bestrahlten aAPCs umfassen.
    3. Überprüfen Sie die Empfindlichkeit der Zielzelllinie gegenüber der NK-Zell-vermittelten Lyse. Verwenden Sie bekannte vertrauliche Ziele als Steuerelemente.
    4. Verlängern Sie die Dauer der funktionellen Assays, um genügend Zeit für die Manifestation der NK-Zellaktivität zu haben.
  9. Symptome variabler CAR-Expressionsniveaus
    1. Überprüfen Sie, ob die CAR-Expression zwischen NK-Zellen inkonsistent ist.
  10. Lösungen für variable CAR-Expressionsniveaus
    1. Überprüfen Sie die Wirksamkeit der CAR-Transfektionsmethode (z. B. Virustransduktion, Elektroporation). Passen Sie bei Bedarf das MOI (Multiplicity of Infection) oder die Elektroporationsbedingungen an.
    2. Implementieren Sie geeignete Auswahlmarker, um CAR+ NK-Zellen anzureichern. Verwenden Sie bei Bedarf die Auswahl von Antibiotika oder die Sortierung fluoreszierender Marker.

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Ergebnisse

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Schematische Darstellung der Differenzierung und Expansion von anti-GPC3-CAR iPSC-abgeleiteten NK-Zellen
Das schematische Diagramm veranschaulicht die in vitro Differenzierung von anti-GPC3-CAR-manipulierten NK-Zellen, die aus humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSCs) gewonnen wurden, und eine schematische Darstellung eines piggyBac-Vektors, der das GPC3-CAR-Konstrukt trägt. Zunächst werden unmodifizierte iPS-Zellen mit einem piggyBac-Vektor transfiziert, der für den GPC3-CAR (chi...

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Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dieses Protokoll beschreibt einen standardisierten und reproduzierbaren Ansatz zur Erzeugung von CAR-exprimierenden, iPSC-abgeleiteten NK-Zellen aus einer konsistenten Zellquelle, um eine gezielte Krebsimmuntherapie "von der Stange" zu ermöglichen. Mehrere präklinische und klinische Studien haben die Wirksamkeit einer adoptiven NK-Zell-basierten Immuntherapie bei der Behandlung von Krebserkrankungen bei gleichzeitiger Minimierung von Toxizitäten wie Graft-versus-Host-Krankheiten (GvHD) o...

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Offenlegungen

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DSK ist Mitbegründer und Berater von Shoreline Biosciences und hält eine Beteiligung an dem Unternehmen. DSK ist auch als Berater für Therabest und RedC Bio tätig, für die er Einnahmen und/oder Eigenkapital erhält. Die Bedingungen dieser Vereinbarungen wurden von der University of California, San Diego, in Übereinstimmung mit ihren Richtlinien für Interessenkonflikte überprüft und genehmigt. Die übrigen Autoren erklären keine konkurrierenden Interessen.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wir danken allen Mitgliedern des Kaufman-Labors für ihre Unterstützung, wissenschaftlichen Erkenntnisse und Diskussionen. Diese Studien wurden durch die NIH/NCI Grants U01CA217885, P30CA023100 (administrative Ergänzung) und das Sanford Stem Cell Institute an der UCSD unterstützt. JT: Verfassen und Überarbeiten des Manuskripts. DSK: Begutachtung und Redaktion des Manuskripts.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
aAPC Dekan A. Lee Labor N/A
a-MEM-NährmediumFisher Wissenschaftlich Cat#12634
APC anti-DYKDDDDK (FLAG Tag)BD Biosciences Kat#637308
APC-Anti-Mensch TRA-1-81 ThermoFisher17-8883-42 
APC-CD16BD Biowissenschaften Kat#302015
APC-CD43 BD BiosciencesKat# 560198 
APC-CD45 BD BiosciencesKat# 555485 
APC-GPC3BD Biowissenschaften Kat#DB100B
APC-NKG2D BD Biowissenschaften Kat# 558071 
CellEvent Caspase-3/7 Grünes Detektionsreagenz Thermo-Fischer Cat#C10423
CellTrace Violettes Zellproliferationskit Thermo-Fischer Cat#C34571Zellverfolgung Fluoreszenzfarbstoff 
CryoStor Lösung Stem Cell Technologieshttps://www.stemcell.com/products/cryostor-cs10.htmlKryokonservierungsmedium
CTS NK XpanderGibcoA5019001
CTS NK-Xpander MediumLife TechnologiesCat#A5019001
DMEMGibco11965084
DMEM, hoher Glukosegehalt, GlutaMAX Supplement, PyruvatGibco10569010
EasySep Humanes NK-Zellanreicherungskit StemCell Technologies, Inc. Cat#19055
EthanolaminSigma AldrichE9508
Fötales Rinderserum Fisher Wissenschaftlich Kat# 10437010
FITC-CD94 BD Biowissenschaften Cat#555888
GlutaMAX SupplementGibco35050061
GolgiPlug BD Biowissenschaften Kat#555029
GolgiStop BD Biowissenschaften Cat#554724
Ham's F-12 Nährstoffmischung, GlutaMAX SupplementGibco31765035
Pferdeserum Fisher Wissenschaftlich Katze#16050130
Menschliches Serum AB Sigma-AldrichCat#BP2525100
NucleofectorTM Kit für menschliche Stammzellen Lonza Kat# VPH-5012
Mensch: HePG2-Zellen ATCC Kat#HB-8065
Mensch: HePG2-td-tomaten-luc-Zellen Dan S. Kaufman LaborN/A
Mensch: iPS-Zellen Dan S. Kaufman Labor N/A
Mensch: SNU-449 Zellen ATCCKat#CRL-2234
Mensch: SNU-449-td-tomato-luc Zellen Dan S. Kaufman LaborN/A
IncuCyte Caspase-3/7 Green Apoptose Assay EssenBiowissenschaften Cat#4440
L-AscorbinsäureSigma AldrichA5960
MP Biomedicals  Humanserum, Typ ABMP BiomedicalsICN2938249
mTeSR plusStemCell Technologies, Inc. 100-0276
NovoExpress Software ACEA Biosciences 
PE/Cy7 Anti-Human-SSEA-4-Antikörper Biolegend330420
PE-CD16 BD Biowissenschaften Kat#560995 
PE-CD226BD Biowissenschaften Kat#559789
PE-CD34 BD BiosciencesKat# 555822 
PE-CD45 BD Biowissenschaften Kat# 555483 
PE-CD94 BD Biowissenschaften Kat#555888 
PE-cy7-CD56 BioLegendCat# 318318 
PE-FAS Ligand BD Biowissenschaften Kat#564261 
PE-NKp30BD BiowissenschaftenKat# 558407
PE-NKp44 BD Biowissenschaften Kat#558563 
PE-NKp46BD Biowissenschaften Kat#331908
PE-NKp46 BD Biowissenschaften Kat#557991 
Peripheres Blut Buffy Coat Blutbank von San Diego (https://www. sandiegobloodbank.org/) N/A
PE-TRAIL BD Biowissenschaften Kat#565499 
pKT2-mCAG-IRES-GFP-ZEO Branden Moriarity Labor N/A
pMAX-GFP PlasmidLonzaN/AGFP Positivkontrolle 
Prism 9Graphpad Version 9
pSpCas9 GenScriptPX165
RBC-Lysepuffer (10x)BiolegendCat#420301
Rekombinanter humaner bFGF basic Forschung & Forschung D Systems Cat#4114-TC
Rekombinantes humanes BMP-4 PeproTechCat#120-05
Rekombinanter humaner FLT-3-Ligand PeproTechCat# 300-19
Rekombinantes humanes IL-15 PeproTechCat# 200-15
Rekombinantes humanes IL-2 PeproTechCat# 200-02
Rekombinantes humanes IL-3 PeproTechCat#200-03
Rekombinantes humanes IL-7 PeproTechCat# 200-07
Rekombinantes humanes KnotenproteinR& D Systems Cat#3218-ND-025
Rekombinante menschliche SCF PeproTechCat# 300-07
Rekombinantes humanes TGF-β 1PeproTechCat#100-21
Rekombinantes humanes VEGF PeproTechCat# 100-20
RPMI1640Gibco11875093
NatriumselenitSigma Aldrich214485
STEMdiff APEL 2 MediumStemCell Technologies, Inc. 5270EB-Bildung
Medium STEMdiff APEL2 Mittel StemCell Technologies, Inc. Cat#05270
Super piggyBac Transposase ExpressionsvektorSBICat#PB210PA-1
SYTOX AADvanced Dead Cell Stain KitThermoFisher ScientificS10274, S10349Dead cell Staining Solution Kit
β-MercaptoethanolGibco21985023
https://www.agilent.com/en/product/research-flow-cytometry/flow-cytometry-software/novocyte-novoexpress-software-1320805

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