Entwicklung eines Kohl-Protoplasten-Systems zur Untersuchung der Hypoxietoleranz bei Brassica

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt ein effizientes Kohl-Mesophyll-Protoplasten-System. Verschiedene Behandlungen mit Sauerstoffmangel wurden getestet, und das System zeigte eine hohe Aktivierung von Hypoxie-responsiven Genen, was die Untersuchung der genetischen und molekularen Mechanismen der Überflutungstoleranz bei Brassicaceae-Gemüse erleichtert.

Zusammenfassung

Da der Klimawandel mehr Starkregen mit sich bringt, ist Kohl, ein wichtiges Gemüse der Brassicaceae , aufgrund von überschwemmungsbedingtem Hypoxie-Stress mit erheblichen Ertragseinbußen konfrontiert. Um die Mechanismen der Überschwemmungstoleranz bei Kohlköpfen zu identifizieren, wird eine vielseitige Plattform für genetische funktionelle Studien benötigt, um die transformationsresistente Natur von Kohlköpfen zu überwinden. In dieser Studie wurden ein transientes Kohl-Protoplasten-Expressionssystem und ein entsprechendes Protoplasten-Hypoxie-Induktionsprotokoll entwickelt. Dieses Protokoll erreichte eine hohe Ausbeute und Integrität der Protoplastenisolierung aus Kohlblättern mit einer Transfektionseffizienz von mehr als 40 % unter optimierten enzymatischen Bedingungen. Um einen möglichen hypoxischen Einfluss vor der Behandlung zu mildern, wurde die W5-Lösung mit Sauerstoffgas gefüllt, um den Gehalt an gelöstem Sauerstoff zu erhöhen. Es wurden mehrere Chemikalien zur Einstellung des Sauerstoffgehalts und physiologische Sauerstofffängerbehandlungen getestet, darunter EC-Oxyrase, OxyFluor, Natriumsulfit und ein Sauerstoffabsorberpaket. Dual-Luciferase-Assays zeigten, dass die Promotoren der anaeroben Atmungsreaktionsgene BoADH1 und BoSUS1L in Kohlprotoplasten nach Hypoxiebehandlungen aktiviert wurden, wobei das höchste Induktionsniveau nach der Behandlung mit dem Sauerstoffabsorberpaket beobachtet wurde. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass das transiente Expressionssystem von Kohlprotoplasten in Kombination mit der Hypoxiebehandlung eine effiziente und bequeme Plattform darstellt. Diese Plattform kann die Untersuchung der Genfunktion und der molekularen Mechanismen im Zusammenhang mit Hypoxiereaktionen bei Kohlköpfen erleichtern.

Einleitung

Der globale Klimawandel hat die Überschwemmungen verschärft, die sich weltweit zu einem immer wichtigeren Problem entwickelt haben. In den letzten Jahrzehnten ist die Häufigkeit von Überschwemmungen gestiegen, was zu erheblichen Ernteverlusten geführt hat ^1,2. Kohl (Brassica oleracea var. capitata L.), ein Gemüse von großer globaler Bedeutung, ist anfällig für die negativen Auswirkungen starker Regenfälle, was die Entwicklung von überschwemmungstoleranten Kohlsorten erforderlich macht, um eine nachhaltige Produktion angesichts extremer Wetterereignisse zu gewährleisten. Daher ist es wichtig, die molekularen Mechanismen zu verstehen, die mit Überflutungsstress in Kohl verbunden sind, um diese Herausforderung zu meistern.

Um die Mechanismen der Genregulation in Pflanzen unter getauchten Bedingungen zu verstehen, werden transgene Linien häufig für genetische funktionelle Studien verwendet. Dieser Ansatz wird jedoch durch hohe Kosten, zeitintensive Transformations- und Subkulturprozesse sowie geringe Transformationseffizienzen bei vielen Kulturarten eingeschränkt, was die Entwicklung alternativer Methoden erforderlich macht. Protoplasten-basierte transiente Expressionssysteme werden in der pflanzlichen Molekularforschung als vielseitige und effiziente Alternative eingesetzt. Diese Systeme erleichtern die Untersuchung der Promotoraktivität, der Signalwege als Reaktion auf Umweltreize, der Protein-Protein- oder Protein-DNA-Wechselwirkungen und der subzellulären Lokalisation³. Die Etablierung von transienten Protoplasten-Expressionssystemen wurde nicht nur in Modellpflanzen berichtet ^4,5, sondern auch in wirtschaftlich wichtigen Kulturpflanzen wie Zuckerrohr⁶, Nelke⁷, Phalaenopsis-Orchideen ⁸ und Aubergine⁹. Darüber hinaus wurden diese Systeme erfolgreich in Gehölzen eingesetzt, darunter Camellia oleifera¹⁰und Populus trichocarpa¹¹. Die Protokolle für die Anwendung von Protoplastensystemen zur Untersuchung von Blattgemüse unter Unterwasser-induziertem Hypoxie-Stress sind jedoch begrenzt. Daher wurde in dieser Arbeit ein integriertes Protokoll für diejenigen entwickelt, die an der Untersuchung von Hypoxiereaktionen in Blattgemüse unter Verwendung eines transienten Kohl-Protoplasten-Expressionssystems interessiert sind.

Um die submergence-induzierte Hypoxie-Reaktion auf zellulärer Ebene durchzuführen, wurden in früheren Studien verschiedene Methoden zur Sauerstoffabscheidung eingesetzt, um hypoxische Umgebungen zu simulieren. Dazu gehören die Verwendung von EC-Oxyrase, OxyFluor, Natriumsulfit und sauerstoffverbrauchenden Beuteln. EC-Oxyrase wird typischerweise zur anaeroben Behandlung der humanen Zelllinien¹² und der Arabidopsis-Protoplasten ¹³ eingesetzt. Es wurde festgestellt, dass OxyFluor bei der Abschwächung von Photobleichung, die durch reaktive Sauerstoffspezies verursacht wird, während der Fluoreszenzbildgebung lebender Zellen wirksam ist^14,15. Natriumsulfit wurde bei der anaeroben Behandlung von Nematoden¹⁶ und in jüngerer Zeit bei Reisprotoplasten in Verbindung mit Techniken wie Chromatin-Immunpräzipitationsassays (ChIP)¹⁷ eingesetzt. Sauerstoffabsorberpackungen, die hauptsächlich für anaerobe Bakterienkulturen¹⁸ verwendet werden, haben auch unter anaeroben Bedingungen eine Wirksamkeit bei der Induktion der Aktivierung von ZmPORB1-Promotoren in Maisprotoplasten gezeigt¹⁹.

Die vorliegende Arbeit zielt darauf ab, eine robuste Pipeline für die Isolierung und transiente Expression von Kohlprotoplasten zu etablieren. Anschließend wurde die Wirksamkeit verschiedener sauerstoffadjustierender Behandlungen bewertet, indem die Promotoraktivität von anaeroben Reaktionsgenen mit Hilfe von Dual-Luciferase-Assays bewertet wurde. Es wird erwartet, dass das in dieser Studie entwickelte Protokoll für zukünftige Forschungen im Zusammenhang mit Submergence oder Hypoxie-Stress in Brassica-Systemen wertvoll sein wird.

Protokoll

In dieser Studie wurden zwei kommerzielle Kohlsorten (B. oleracea var. capitata) verwendet: 'Fuyudori' und '228'. Eine grafische Darstellung des Protokoll-Workflows ist in Abbildung 1 dargestellt. Die Einzelheiten zu den Reagenzien und der Ausrüstung, die in dieser Studie verwendet wurden, sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Vorbereitung der Kohlsetzlinge

1. Säen Sie Kohlsamen der Sorten 'Fuyudori' und '228' mit handelsüblichem Pflanzensubstrat in runde, quadratische Löcher (T 4,5 cm x H 4,5 cm) von 48-Well-Steckschalen (L 49 cm x B 28 cm x H 5 cm). Betten Sie die Samen ca. 1 cm tief in das Substrat ein.
2. Züchten Sie Kohlsämlinge in einem Anbauraum bei 22 °C mit einem Hell-Dunkel-Zyklus von 16/8 Stunden. Halten Sie die Lichtintensität von 100 μmol ^m-2·^s-1 (weiße Leuchtstoffröhre) während der Lichtphase aufrecht.
3. Verwenden Sie nach 2-3 Wochen Wachstum Kohlsämlinge im 2-Blatt-Stadium, um die Mesophyll-Protoplasten weiter zu isolieren.
   HINWEIS: Die empfohlene Größe von Kohlsämlingen ist ein 2-Blatt-Stadium, in dem das zweite echte Blatt vollständig ausgebreitet ist, das dritte wahre Blatt jedoch nicht ausgebreitet ist und seine Länge kürzer als 1 cm ist (Abbildung 2A). Um die Entwicklungsstadien der Kohlsetzlinge zu synchronisieren, müssen 'Fuyudori'-Samen aufgrund ihrer unterschiedlichen Wachstumsraten etwa 2 Tage früher gesät werden als '228'-Samen. Diese Anpassung sorgt für ein gleichmäßiges Wachstum und eine gleichmäßige Reife der Kohlpflanzen im gewünschten Stadium.

2. Isolierung der Kohlprotoplasten

1. Bereiten Sie vor jeder Protoplastenisolierung 12,5 ml Enzymlösung (Tabelle 1) vor.
   1. Eine Lösung mit 10 mM MES (pH 5,7) und 0,6 M Mannitol auf 55 °C vorwärmen. Erwärmen Sie die Lösung 10 Minuten lang bei 55 °C, nachdem Sie 1,5 % Cellulase R10 und 0,75 % Macerozym R10 hinzugefügt haben.
   2. Nachdem die Enzymlösung auf Raumtemperatur (25 °C) abgekühlt ist, fügen Sie 10 mM CaCl₂ und 0,1 % Rinderserumalbumin (BSA) hinzu. Filter: Sterilisieren Sie die vorbereitete Enzymlösung in einer 9 cm Petrischale mit einem 0,22 μm Spritzenfilter.
      HINWEIS: Das Vorwärmen der Lösung erhöht die Löslichkeit des Enzyms und inaktiviert die Protease. Die Verdauungseffekte variieren je nach den verschiedenen Arten von Cellulade-Enzymen. Die Kombination von Cellulase R10 und Macerozyme R10 eignet sich zur Isolierung von Kohlprotoplasten.
2. Sammle die zweiten, neu expandierten Blätter von fünf bis acht Kohlsämlingen und schneide sie mit einer scharfen Rasierklinge in 0,5-1,0 mm große Streifen. Sofort die Blattstreifen in die frisch zubereitete Enzymlösung überführen.
   HINWEIS: Die Auswahl gesunder und ausgewiesener Blätter aus Kohl zum richtigen Zeitpunkt ist entscheidend. Die zweiten, neu expandierten echten Blätter von Kohlsämlingen im 2-Blatt-Stadium bieten die höchste Protoplastenisolationseffizienz. Überreife Pflanzen, Keimblätter oder gealterte Blätter werden für die Protoplastenisolierung nicht empfohlen. Fünf bis zwölf gut expandierte echte Blätter können in 12,5 ml Enzymlösung erfolgreich Kohlprotoplasten liefern. Die Anzahl der für die Protoplastenisolierung erforderlichen Blätter hängt von der gewünschten Menge an benötigten Protoplasten ab. Typischerweise reichen Protoplasten aus fünf bis acht Blättern für nachfolgende experimentelle Verfahren aus.
3. Nach einer Vakuuminfiltration von 30 min im Dunkeln (Abbildung 2B) die in die Enzymlösung (Abbildung 2C) getauchten Kohlblattstreifen weitere 4-16 h bei Raumtemperatur im Dunkeln aufbewahren.
   HINWEIS: Die Verdauungszeit der Enzyme kann je nach Kohlsorte variieren und sollte je nach Genotyp optimiert werden. Zum Beispiel benötigt 'Fuyudori' eine längere Verdauungszeit (16 h) im Vergleich zu '228' (4 h), da die Blätter von 'Fuyudori' dicker sind.
4. Verdünnen Sie die Protoplasten-haltige Lösung mit einem gleichen Volumen W5-Lösung, die aus 2 mM MES (pH 5,7), 154 mM NaCl, 125 mM CaCl₂, 5 mM KCl und 5 mM Glukose besteht (siehe Tabelle 1 zur Zubereitung), um den enzymatischen Verdau zu stoppen.
5. Lösen Sie die Protoplastensuspension durch leichtes Schwenken oder mit einem Orbitalschüttler. Filtrieren Sie die Zellsuspension durch ein 70 μm Zellsieb in ein konisches 50 mL Röhrchen.
   HINWEIS: Die isolierten Protoplasten sind in der Lage, ein 70-μm-Zellsieb zu passieren, während unverdaute Pflanzenreste vom Sieb zurückgehalten und anschließend aus der Suspension entfernt werden. Zellsiebe können wiederverwendet und nach dem Waschen in 75 % Ethanol aufbewahrt werden, aber es ist notwendig, die Zellsiebe vor der Verwendung vollständig mit W5-Lösung zu spülen, um Ethanolreste zu entfernen.
6. Die Protoplastenlösung mit 150 x g für 2 min bei 4 °C zentrifugieren, dann den Überstand vorsichtig entfernen. Waschen Sie die pelletierten Protoplasten vorsichtig, indem Sie 10 ml W5-Lösung entlang der Wand des konischen Rohrs mit einer ungefähren Flussrate von 1 ^ml-s-1 hinzufügen. Zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 150 x g für 2 min bei 4 °C und wiederholen Sie diesen Waschvorgang erneut, um eine vollständige Entfernung der Enzymlösung sicherzustellen.
7. Die Protoplasten in der W5-Lösung resuspendieren und 30 min auf Eis legen. Nach der Eisinkubation wird der Überstand mit einer Pipette jeweils 1 ml entfernt, bis der gesamte Überstand entfernt ist.
8. Resuspendieren Sie die Protoplasten in einer eisgekühlten MMG-Lösung, die aus 4 mM MES (pH 5,7), 0,4 M Mannitol und 15 mM MgCl₂ besteht (siehe Tabelle 1 zur Vorbereitung).
9. Messen Sie die Protoplastenkonzentration mit einem Hämozytometer und stellen Sie die Endkonzentration mit MMG-Lösung auf 4 x 10⁵ Protoplasten^·mL-1 ein.

3. Transfektion von Protoplasten

1. Mischen Sie ein Gesamtvolumen von 10 μl Plasmid (5-10 μg) (Ergänzungsdatei 1) mit 100 μl Protoplasten (4 x 10⁴ Protoplasten) und legen Sie es für 10 min auf Eis.
   HINWEIS: Für die Plasmidaufreinigung in Transfektionsqualität wird ein im Handel erhältliches Plasmid-Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers verwendet. Ungefähr 4 x 10⁴ Protoplasten werden typischerweise in einem Dual-Luciferase-Reporter-Assay verwendet. Für größere Experimente steht eine höhere Menge an Protoplasten für die Transfektion zur Verfügung. Konkret weisen etwa 2 x 10⁵ Protoplasten, die mit 10 μg Plasmid transfiziert wurden, eine nachgewiesene Transfektionseffizienz von 30 % bis 40 % auf.
2. Geben Sie ein gleiches Volumen (110 μl) frisch zubereiteter PEG-Lösung (siehe Tabelle 1 zur Zubereitung) mit 40 % Polyethylenglykol 4000 (PEG4000), 0,1 M CaCl₂ und 0,2 M Mannitol in die Protoplastenlösung und mischen Sie sie vorsichtig.
3. Das Protoplastengemisch wird 10 Minuten lang bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubiert und dann 440 μl W5-Lösung hinzugefügt, um die Reaktion zu beenden.
4. Die transfizierten Protoplasten werden bei 150 x g für 2 min bei 4 °C zentrifugiert und das Pellet in 750 μl sauerstoffangereicherter W5-Lösung resuspendiert. Übertragen Sie die resuspendierten Protoplasten auf eine 6-Well-Gewebekulturplatte, die mit 1 % BSA vorbeschichtet ist.
   HINWEIS: Die für die Zellinkubation verwendete W5-Lösung muss mit einem Sauerstoffkonzentrator (~90 % Sauerstoff), der mit einem Ausströmer verbunden ist, 5 Minuten lang mit Sauerstoff gefüllt werden (Abbildung 2D). Nach diesem Sauerstoffanreicherungsprozess stieg die endgültige Konzentration des gelösten Sauerstoffs in der W5-Lösung von 7,84 mg· ^L-1 ± 0,05 mg· ^L-1 bis 29,18 mg· ^L-1 ± 0,43 mg· ^L-1, gemessen mit einem Messgerät für gelösten Sauerstoff. Das Volumen der W5-Lösung zur Resuspension von transfizierten Protoplasten hängt von der Art der verwendeten Gewebezellkulturplatte ab. Bei 12-Well- oder 24-Well-Zellkulturplatten ist es ratsam, das Volumen der W5-Lösung zu reduzieren, um den Hypoxiestress während der Inkubation aufgrund der tieferen Tiefe in den Wells zu mildern. Für die BSA-Beschichtung erhielt jede Vertiefung der Kulturplatte 1 mL 1%ige BSA-Lösung, die die Vertiefungen 10 s lang beschichten durfte. Die BSA-Lösung wurde dann aus jeder Vertiefung verworfen und die Vertiefungen anschließend wieder mit W5-Lösung gefüllt. Ziel dieses Verfahrens war es, mit BSA eine temporäre, nicht haftende Oberfläche zu schaffen, die effektiv verhindert, dass Protoplasten in nachfolgenden Versuchsschritten an der plastischen Oberfläche der Kulturplatte haften bleiben.

4. Hypoxie-Behandlung bei Kohl-Protoplasten

1. Führen Sie unmittelbar nach der Protoplastentransfektion chemische oder physikalisch induzierte Hypoxiebehandlungen durch.
   HINWEIS: Es wird empfohlen, die Hypoxiebehandlung unmittelbar nach der Protoplastentransfektion durchzuführen. Eine längere Inkubation von Protoplasten kann die nachfolgende Hypoxiereaktion verringern.
   1. Bei chemisch induzierter Hypoxie auf Kohlprotoplasten fügen Sie der W5-Protoplastenlösung OxyFluor, EC-Oxyrase und Natriumsulfit hinzu.
      HINWEIS: Die Verwendung von 0,6 Einheiten ^μl-1 EC-Oxyrase, 0,6 μl 1 OxyFluor und 1 μml-1 Natriumsulfit in W5 waren die getesteten Bedingungen, die in der Lage waren, BoADH1 und BoSUS1L-Promotor (Abbildung 3A) mit geringer Schädigung der Protoplastenintegrität in den beiden untersuchten Kohlsorten zu induzieren.
   2. Bei sauerstoffverbrauchender, beutelinduzierter Hypoxie geben Sie zwei Sauerstoffabsorberpackungen in ein anaerobes 3,5-Liter-Glas, um eine hypoxische Umgebung zu schaffen.
2. Hypoxie-behandelte Protoplasten werden durch Zentrifugieren bei 150 x g für 2 min bei 4 °C gewonnen. Frieren Sie die gesammelten Protoplasten mit flüssigem Stickstoff ein und lagern Sie sie in einem -80 °C Gefrierschrank für nachfolgende Assays.

5. Dualer Luciferase-Assay

1. Führen Sie den Dual-Luciferase-Reporter-Assay gemäß den Anweisungen des Herstellers mit geringfügigen Änderungen durch.
   1. Kohlprotoplasten in 50 μl 1x passivem Lysepuffer resuspendieren und 10 s lang vortexen.
   2. Inkubieren Sie zerbrochene Protoplasten 10 min lang auf Eis und sammeln Sie den Überstand nach der Zentrifugation bei 10.000 x g für 10 min bei 4 °C.
   3. Geben Sie 20 μl Zelllysat in jede Vertiefung der Mikrotiterplatte. Geben Sie 100 μl Luciferase-Assay-Reagenz II in die Vertiefungen und messen Sie die Luciferase-Aktivität von Glühwürmchen mit einem Mikroplatten-Reader.
   4. Geben Sie 100 μl des im Handel erhältlichen Assay-Reagenzes in jede Vertiefung und messen Sie die Renilla-Luciferase-Aktivität mit einem Mikroplatten-Reader.

Ergebnisse

In dieser Arbeit wurde erfolgreich ein transientes Expressionssystem unter Verwendung von Kohlprotoplasten entwickelt (siehe Abbildung 1 für den Arbeitsablauf). Protoplasten wurden aus 2 bis 3 Wochen alten echten Kohlblättern geeigneter Größe (Abbildung 2A) von kommerziellen Kohlsorten 'Fuyudori' und '228' mittels Cellulase/Macerozym-Aufschluss und Dunkelvakuuminfiltration isoliert (Abbildung 2B,C). Um die hypoxischen Bedingungen zu mildern, die bei submersen Protoplasten während der Inkubation auftreten, wurde die W5-Lösung mit einem Ausströmer-Bubbler, der mit einer Sauerstoffmaschine verbunden war, mit Sauerstoff angereichert (Abbildung 2D). Dieser Prozess erhöhte die Konzentration des gelösten Sauerstoffs in der W5-Lösung signifikant von 7,84 mg· ^L-1 ± 0,05 mg· ^L-1 bis 29,18 mg· ^L-1 ± 0,43 mg· ^L-1 nach 5 min Sauerstoffsprudeln. Nach dem Isolationsprozess betrug die Ausbeute an Protoplasten 1,04 x 10⁷ für 'Fuyudori' und 4,00 x 10⁶ Protoplasten·g⁻¹ Frischgewicht für '228' nach einer nächtlichen Verdauungsphase (Abbildung 2E). Anschließend wurde GFP als Reportergen verwendet, um die Transformationseffizienz der PEG-vermittelten Transfektionsmethode zu bewerten, wobei gezeigt wurde, dass die Transfektionseffizienz der Protoplasten bei Kohl in beiden Sorten über 40% lag (Abbildung 2F), was die Lebensfähigkeit dieses Systems bestätigt.

Darüber hinaus wurden Promotorkonstrukte der anaeroben Atmungsreaktionsgene von Kohlköpfen, BoADH1p::Luc und BoSUS1Lp::Luc Vektoren (Abbildung 3A), als Reporter in Kohlprotoplasten eingeführt, um die hypoxischen Induktionseffekte verschiedener Behandlungen zu bewerten. Verschiedene sauerstoffregulierende Behandlungen wurden auch auf dieses transiente Expressionsmodellsystem angewendet. Die Ergebnisse zeigten, dass alle sauerstoffabsorbierenden Behandlungen, mit Ausnahme von Natriumsulfit, erfolgreich eine Hypoxiereaktion in den Kohlprotoplasten induzierten (Abbildung 3B). Insbesondere stieg die Promotoraktivität von BoADH1 im Vergleich zur Kontrolle nach Behandlung mit EC-Oxyrase bzw. OxyFluor etwa um das 2,6- bzw. 3,2-fache und insbesondere um mehr als das 7,0-fache bei der Behandlung mit Sauerstoffabsorberpacken (Abbildung 3B). In ähnlicher Weise stieg die Promotoraktivität des BoSUS1L bei der Behandlung mit EC-Oxyrase bzw. OxyFluor um das 1,7-fache bzw. 1,8-fache, während die Behandlung mit dem Sauerstoffabsorberpack einen erheblichen Anstieg um das 5,6-fache induzierte (Abbildung 3B). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass das Sauerstoffabsorberpaket eine überlegene Wirksamkeit bei der Schaffung einer hypoxischen Umgebung in diesem Kohl-Protoplasten-Versuchssystem zeigt.

Abbildung 1: Grafische Darstellung des Arbeitsablaufs bei der Protoplasten-Isolation. Diese Abbildung veranschaulicht den schrittweisen Prozess der Isolierung von Protoplasten aus Kohlblattgewebe. Der Arbeitsablauf wird visuell dargestellt, um ein klares Verständnis des Verfahrens zu vermitteln. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Protoplastenisolierung aus dem Blattgewebe von Kohl. (A) Das Aussehen der kommerziellen Kohlsorten 'Fuyudori' und '228' im empfohlenen Wachstumsstadium ist dargestellt. Die zweiten, neu vollständig ausgebreiteten echten Blätter (gekennzeichnet durch die Pfeilspitze) von Kohlköpfen im 2-Blatt-Stadium werden für die Protoplastenisolierung ausgewählt. Maßstab: 2 cm. (B) Eine Vakuumpumpe und ein Exsikkator werden für den Vakuuminfiltrationsprozess von Kohlblattstreifen verwendet, wobei eine 30-minütige Infiltration vor dem enzymatischen Aufschluss durchgeführt wird. (C) Der Zustand der Kohlblattstreifen während der enzymatischen Verdauung ist dargestellt. Die vollständige Verdauung des Blattgewebes dauert insgesamt 4-16 h. Maßstab: 3 cm. (D) Die Fotos zeigen die Verwendung eines Sauerstoffkonzentrators, der mit einem Ausströmerstein verbunden ist, um die Konzentration des gelösten Sauerstoffs in der W5-Lösung zu erhöhen. Maßstabsbalken: 5 cm. (E) Über 4,00 x 10⁶ Mesophyll-Protoplasten pro Gramm Frischgewicht (FW) wurden sowohl von den Kohlsorten 'Fuyudori' als auch von '228' gewonnen und unter dem Mikroskop betrachtet. Maßstabsbalken: 200 μm. (F) Die Transfektionseffizienz von Protoplasten beider Kohlgenotypen unter Verwendung eines konstitutiv exprimierten GFP-Reporters liegt bei über 40 %. Maßstab: 200 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Hypoxiereaktion von Kohlprotoplasten unter sauerstoffarmen Bedingungen. (A) Hypoxie-Response-Genkonstrukte, BoADH1 - und BoSUS1L-Promotoren , werden als Reporter verwendet, um die Hypoxie-Reaktion in 'Fuyudori'-Kohlprotoplasten zu bewerten. (B) Insgesamt 5 μg Reporterplasmide werden in "Fuyudori"-Kohlprotoplasten transfiziert, die in einer sauerstoffblasenartigen W5-Lösung inkubiert werden, bevor sie 4 Stunden lang einer Hypoxiebehandlung ausgesetzt werden. Der Sauerstoffgehalt wird während der Inkubation durch Zugabe von EC-Oxyrase (0,6 Einheiten·^mL-1), OxyFluor (0,6 Einheiten·^mL-1) und Natriumsulfit (1 g·^mL-1) zur W5-Lösung reduziert. Die Behandlung mit dem Sauerstoffabsorberpack wird durchgeführt, indem zwei Sauerstoffabsorberbeutel in ein anaerobes 3,5-Liter-Glas gegeben werden. Die "CK"-Gruppe stellt die Kontrollgruppe ohne jegliche Hypoxiebehandlung dar. Nach der Behandlung werden Protoplasten für einen dualen Luciferase-Assay entnommen. Jeder Wert stellt den Mittelwert ± SD dar, wobei n = 4 ist. Unterschiedliche Buchstaben weisen auf signifikante Unterschiede (P < 0,05) hin, basierend auf einer Einweg-ANOVA mit LSD-Post-hoc-Test. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Tabelle 1: Zubereitung von Enzymlösung, W5-Lösung und MMG-Lösung. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Ergänzende Datei 1: Plasmiddetails für die Protoplastentransfektion. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Diskussion

Dieses Protokoll stellt eine optimierte Methode zur Isolierung von Protoplasten aus zwei kommerziellen Kohlsorten dar. Die Wirksamkeit dieser Methode wird in erster Linie durch zwei kritische Qualitätskontrollparameter bewertet: die Ausbeute an lebensfähigen Protoplasten und die Effizienz der Protoplastentransfektion. Die Implementierung dieses Protokolls führte zu einer Ausbeute von mehr als 4,00 x 10⁶ Protoplasten·g⁻¹· FW von Mesophyllgewebe beider Kohlsorten (Abbildung 2E,F). Diese Ausbeute ist vergleichbar mit denen, die bei anderen Arten berichtet werden, darunter Auberginen, Nelken, Zuckerrohr und Camellia oleifera, wo die Protoplastenerträge zwischen 2,5 x 10⁶ und 1,4 x 10⁷ Protoplasten lagen. FW 6,7,9,17. Diese Ergebnisse deuten auf eine mögliche Anwendbarkeit des Protokolls auf verschiedene genetische Hintergründe mit B. oleracea hin.

Der Erfolg des Protokolls hängt von mehreren kritischen Faktoren ab. An erster Stelle steht die Verwertung bestimmter Blätter von gesunden Kohlsämlingen in einem geeigneten Wachstumsstadium (Abbildung 2A). Die Verwendung älterer oder ungesunder Pflanzen kann zu Protoplasten von schlechter Qualität führen. Es ist auch wichtig, das Blattgewebe vorsichtig in 0,5-1,0 mm große Streifen zu schneiden und es nicht mit einer stumpfen Klinge zu zerquetschen. Der Prozess der Enzymverdauung, der zwischen 4 und 16 Stunden dauert, ist ein weiterer kritischer Schritt. Verdauungsperioden von weniger als 4 h können zu einer unvollständigen Verdauung führen, während Verdauungsperioden von mehr als 16 h zu zellulärem Stress führen können. Insbesondere Genotypen mit dickeren Blättern, wie z. B. 'Fuyudori', können von verlängerten Verdauungszeiten profitieren, um die Protoplastenausbeute zu maximieren. Im Gegensatz dazu benötigte "228" nur 4 h für den vollständigen Aufschluss. Darüber hinaus kann eine große Bandbreite an Aufschlusszeiten eine größere Flexibilität bei der Versuchsplanung bieten. Ein 4-stündiger Aufschluss ermöglicht beispielsweise die Isolierung von Protoplasten und die anschließende Durchführung transienter Assays innerhalb eines einzigen Tages. Umgekehrt ermöglicht ein 16-stündiger Aufschluss den Beginn des Enzymverdaus am Abend und ermöglicht den Abschluss der nachfolgenden Schritte am nächsten Tag, was die Anwendung dieses Protokolls bequemer machen kann. Darüber hinaus ist es aufgrund ihrer Zerbrechlichkeit und Anfälligkeit für mechanische Beanspruchung von entscheidender Bedeutung, die Protoplasten während des gesamten Protoplastenisolationsprozesses schonend zu behandeln.

Um anaerobe Bedingungen zu simulieren, die für Überflutungsstress repräsentativ sind, wurden in diesem Protokoll gängige Sauerstofffänger und sauerstoffverbrauchende Beutel verwendet, um hypoxische Umgebungen zu schaffen. Um die Wirksamkeit des Systems zu verbessern, wird eine Sauerstoffmaschine eingesetzt, um die W5-Lösung mit Sauerstoff zu versorgen (Abbildung 2D), mit dem Ziel, hypoxische Hintergrundreaktionssignale in Kohlprotoplasten während ihrer Inkubationszeit vor der Behandlung zu reduzieren. Ein 5-minütiger Sauerstoffanreicherungsprozess erhöht den Gehalt an gelöstem Sauerstoff deutlich von 7,84 mg· ^L-1 ± 0,05 mg· ^L-1 bis 29,18 mg· ^L-1 ± 0,43 mg· ^L-1, was auf eine ausgeprägte Wirkung bei der Linderung hypoxischer Zustände hinweist. Unter den in dieser Studie verwendeten Sauerstofffängermethoden zeigten die Sauerstoffabsorberpakete eine überlegene Leistung und induzierten die höchste Promotoraktivität in zwei Kerngenen der anaeroben Reaktion (Abbildung 3). Darüber hinaus bietet dieses Verfahren den zusätzlichen Vorteil der Skalierbarkeit, da es die gleichzeitige Behandlung mehrerer Proben durch die Verwendung von sauerstoffverbrauchenden Beuteln in einem einzigen anaeroben Gefäß ermöglicht, im Gegensatz zum individuellen Auftragen von Sauerstofffängern auf jede Zellkulturplatte. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Sauerstoffabsorberpackungen eine bequeme und effektive Plattform bieten, die für die Bewertung der Reaktion von Kohlprotoplasten unter hypoxischen Bedingungen geeignet ist.

Obwohl dieses Protokoll mehrere Vorteile aufweist, ist es wichtig, seine Grenzen anzuerkennen, insbesondere die relativ bescheidene Transfektionseffizienz von Kohlprotoplasten. Obwohl diese Effizienz nicht die für Arabidopsis⁵ berichteten 90% erreicht, erweist sie sich dennoch als ausreichend für erfolgreiche nachfolgende Studien zur Promotoraktivität (Abbildung 3), was auf ein erhebliches Potenzial für die funktionelle Analyse in diesem System hinweist.

Angesichts der globalen Bedeutung von Kohl als wichtige Gemüsepflanze verspricht die Integration dieses Protokolls mit Hypoxie-Behandlungen und genetischen Analysetechniken weitere Einblicke in die Regulationsmechanismen von Kohl unter Überschwemmungsbedingungen. Solche Erkenntnisse könnten möglicherweise die Entwicklung hochwassertoleranter Kohlsorten beschleunigen und damit einen kritischen Bedarf angesichts extremer Wetterbedingungen und zunehmender Überschwemmungsereignisse decken.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
2-(N-Morpholino)-Ethansulfonsäure (MES)	PhytoTech Labs	M825	Für die Zubereitung von Enzymlösungen
228 Kohlsamen	Takii & Co., Ltd. (Kyoto, Japan)
50 mL Konisches Röhrchen	SPL Life Sciences	50050	Für die Zubereitung
Enzymlösungen 6-Well-Gewebekulturplatte	Alpha Plus	16106	Für die Protoplasten-Inkubation
70 μ m Zellen Sieb	Sorfa	SCS701	Für die Protoplastenfiltration
9 cm Petrischale	Alpha Plus	16001	Für die enzymatische Verdauung
Anaerobes Glas	HIMEDIA	Anaerobes Glas 3,5 L	Für die Behandlung von Hypoxie
Rinderserumalbumin	Sigma-Aldrich	A7906	Für die Herstellung von W5-Lösungen und die Beschichtung von Kulturplatten
Calciumchlorid	J.T.Baker	131301	Für die Herstellung von W5-Lösungen und PEG-Lösungen
Cellulase R10	Yakult		Für die Zubereitung von Enzymlösungen
Exsikkator	Tarsons	402030	Für die Vakuuminfiltration
D-Glucose	Bioshop	GLU501	Für die Herstellung von W5-Lösungen
Messgerät für gelösten Sauerstoff	Thermo Scientific	Orion Star A223	Für die Sauerstoffmessung
D-Mannitol	Sigma-Aldrich	M1902	Für die Herstellung von Enzymlösungen, PEG-Lösungen und MMG-Lösungen
Dual-Luciferase Reporter Assay System	Promega	E1960	Für Dual-Luciferase-Reporter-Assay
EC-Oxyrase	Oxyrase Inc.	EC-0005	Zur Behandlung von Hypoxie
Fuyudori Kohlsamen	Kobayashi Seed Co., Ltd. (Kakogawashi, Japan)
Hochgeschwindigkeits-Kühlzentrifuge	Hitachi	CR21GIII	Für die Protoplastenernte
Macerozym R10	Yakult		Für die Herstellung von Enzymlösungen
Magnesiumchlorid Alfa	Aesar	12315	Für die Herstellung von MMG-Lösungen
Mikrozentrifuge	Hitachi	CT15RE	Für die Protoplastenernte
Mikroplatte	Greiner	655075	Für Dual-Luciferase-Reporter-Assay
Mikroplatten-Reader	Molekulare Geräte	SpectraMax Mini	Für Dual-Luciferase-Reporter-Assay
Millex 0,22 μ m Spritzenfilter	Merck	SLGP033RS	Für die Zubereitung von Enzymlösungen
Ölfreie Vakuumpumpe	Wippe	Rocker 300	Für Vakuuminfiltration
OxyFluor	Oxyrase Inc.	OF-0005	Für die Hypoxiebehandlung
Sauerstoffabsorberpaket	Mitsubishi Gas Chemical Company	AnaeroPack, MGCC1	Für die Hypoxiebehandlung
Sauerstoffkonzentrator	HIGHEST PERFECT	AII-X	Für die Sauerstoffblasbildung in W5-Lösung
Pflanzensubstrat	Klasmann-Deilmann	Potgrond H Substrat	Für die Zubereitung von Kohlsämlingen
Plasmid Midi Kit	QIAGEN	12145	Zur Aufreinigung von Plasmid-DNA in Transfektionsqualität
Polyethylenglykol 4000	Fluka	81240	Für die Protoplastentransfektion
Kaliumchlorid	J.T.Baker 304001		Für die Herstellung von W5-Lösungen
Rasierklinge	Gillette		Für die Zubereitung von Kohlblattstreifen
Natriumchlorid	Bioshop	SOD002	Für die Herstellung von W5-Lösungen
Natriumsulfit	Sigma-Aldrich	S0505	Zur Behandlung von Hypoxie
Wasserbad	Yihder	BU-240D	Zur Herstellung von Enzymlösungen