Quantitative Struktur-Wirkungs-Beziehung, Aktivitätsvorhersage und Molekulardynamik von Nicht-Nukleotid-Reverse-Transkriptase-Inhibitoren

Summary

In dieser Studie wurden In-silico-Strategien verwendet, um das aufgezählte Etravirin als vielversprechendes Therapeutikum für HIV zu identifizieren. Unsere Erkenntnisse über molekulare Wechselwirkungen und Dynamiken unterstützen das rationale Design neuartiger NNRTIs als mögliche HIV-Behandlungsalternativen.

Abstract

Die zunehmende Inzidenz von HIV-1-Medikamentenresistenzen stellt eine Herausforderung für die Wirksamkeit der antiretroviralen Kombinationstherapie dar, insbesondere im südlichen Afrika. Die Entwicklung von Resistenzen gegen nicht-nukleotide Reverse-Transkriptase-Inhibitoren (NNRTIs) gefährdet den langfristigen Erfolg der antiretroviralen Therapie. Im Jahr 2019 waren Antibiotikaresistenzen weltweit für schätzungsweise 1,27 Millionen Todesfälle verantwortlich. In dieser Studie wurde ein In-silico-Ansatz verwendet, um NNTRI-Medikamente und ihre Derivate zu untersuchen. Zu den verwendeten Techniken gehörten Berechnungen der Dichtefunktionaltheorie, molekulares Docking, Aufzählung, quantitative Struktur-Wirkungsbeziehung (QSAR)-Analyse, Molekulardynamiksimulation (MDS) und Molekularmechanik mit verallgemeinerten Born- und Oberflächenmethoden. Die Analyse konzentrierte sich auf verschiedene Pyrimidinderivate und sechs NNRTI-Medikamente und untersuchte deren Wechselwirkungen mit dem HIV-1-Protein (PDB-Code 1HQU).

Es wurde ein QSAR-Modell entwickelt, um die biologische Aktivität der sechs untersuchten NNRTIs vorherzusagen. Unter Verwendung von 94 Pyrimidinderivaten erreichte das QSAR-Modell einen R² von 0,822 und einen Q² von 0,815, was auf ein hohes Maß an prädiktiver Genauigkeit hinweist.

MDS wurden durchgeführt, um die Stabilität verschiedener Liganden und ihrer neu entwickelten Alternativen zu bewerten und sicherzustellen, dass sie über einen Simulationszeitraum von 200 Nanosekunden an das aktive Zentrum des Proteins gebunden bleiben. Etravirin wies Schwankungen der mittleren quadratischen Abweichung (RMSD) von etwa 4,5 Å auf, während seine aufgezählten Derivate RMSD-Schwankungen von 3,5 Å aufwiesen. Durch molekulares Andocken, MDS und Berechnungen der freien Energie zeigte das aufgezählte Etravirin mit einem Aktivitätswert von 7,373 und einem Andockwert von -10,517 kcal/mol die beste Leistung. Darüber hinaus betrug die berechnete freie Bindungsenergie für das aufgezählte Etravirin -89,684 kcal/mol und übertraf damit andere untersuchte Liganden. Die signifikante Verbesserung deutet darauf hin, dass das modifizierte Etravirin vielversprechendes Potenzial als neuartiger Wirkstoff in der antiretroviralen Therapie birgt.

Der erhaltene niedrigere RMSD-Wert, die verstärkten Aminosäure-Wechselwirkungen und die höchste freie Bindungsenergie deuten darauf hin, dass das aufgezählte Etravirin als praktikable Alternative für die HIV/AIDS-Behandlung dienen könnte.

Introduction

Trotz bemerkenswerter Fortschritte bei der Behandlung bleibt die schwerwiegende globale Gesundheitsbedrohung durch das erworbene Immunschwächesyndrom (AIDS), das durch das humane Immundefizienz-Virus-1 (HIV-1) verursacht wird, eine anhaltende Bedrohung¹. Antiretrovirale Medikamente, die als Reverse-Transkriptase-Hemmer (RTIs) bekannt sind, werden zur Behandlung von HIV-Infektionen eingesetzt. Die reverse Transkriptase, ein virales Desoxyribonukleinsäure (DNA)-Polymerase-Enzym, das für die Retrovirus-Replikation essentiell ist, wird durch Reverse-Transkriptase-Inhibitoren (RTIs) gehemmt. Nukleosid-Reverse-Transkriptase-Inhibitoren (NRTIs) und Nicht-Nukleotid-Reverse-Transkriptase-Inhibitoren (NNRTIs) sind die wichtigsten RTIs².

Die hochaktive antiretrovirale Therapie (HAART), eine Kombination verschiedener antiviraler Medikamente, hat sich zur Standardtherapie für HIV entwickelt, die die Ausbreitung von AIDS wirksam kontrolliert und diese einst tödliche Krankheit in eine kontrollierbare chronische Erkrankung verwandelt³. NNRTIs für HIV-1 sind derzeit ein wesentlicher Bestandteil des HAART-Regimes⁴. Antimikrobielle Resistenzen (AMR) gehören mit schätzungsweise 1,27 Millionen Todesopfern zu den größten globalen Gesundheitsbedrohungen⁵. Daher besteht ein dringender Bedarf an der Fehlerbehebung bei AMR und der Identifizierung neuartiger antimikrobieller Wirkstoffe. Nach Angaben der Weltgesundheitsorganisation (WHO) hat die Antibiotikaresistenz in vielen Teilen der Welt ein alarmierendes Ausmaß erreicht.

Dies stellt ein erhebliches Risiko für die Erreichung der Ziele für nachhaltige Entwicklung dar, da es die Ernährungssicherheit, das Wirtschaftswachstum und die Gesundheitssicherheit untergräbt und gleichzeitig zu sozialen und wirtschaftlichen Ungleichheiten beiträgt⁶. Die Prävalenz von arzneimittelresistenten Viren nimmt zu, auch bei antiretroviralen Medikamenten zur Bekämpfung von HIV. Jüngsten Statistiken zufolge nahmen Ende 2022 fast 30 Millionen Menschen auf der ganzen Welt eine antiretrovirale Therapie^{ein 7}.

Die WHO führte 30 Erhebungen durch und stellte fest, dass in 21 dieser Erhebungen mehr als 10 % der Personen, die ihre antiretrovirale Erstlinientherapie begannen, eine Resistenz gegen Nevirapin oder Efavirenz^{aufwiesen 8}. Darüber hinaus ist die Wahrscheinlichkeit, dass Personen mit vorheriger Exposition gegenüber antiretroviralen Arzneimitteln resistent sind, bis zu dreimal höher als bei Personen ohne Exposition⁹. Studien haben gezeigt, dass eine beträchtliche Anzahl von Säuglingen unter 18 Monaten, bei denen neu HIV diagnostiziert wurde, hohe Raten an arzneimittelresistenten Stämmen aufwiesen ^10,11. Schockierenderweise hatte fast die Hälfte von ihnen bereits vor Beginn der Behandlung einen - (NNRTI)-resistenten Stamm. Diese Ergebnisse unterstreichen die Notwendigkeit, Studien zu beschleunigen, um eine innovative HIV-Therapie zu entwickeln.

Die Entwicklung arzneimittelresistenter Stämme und unerwünschte Nebenwirkungen bei längerer Anwendung haben die klinische Anwendung von NNRTIs unvermeidlich vor Herausforderungen gestellt¹². Der Beginn einer antiretroviralen Kombinationstherapie (cART) verlängert die Lebenserwartung von Menschen mit HIV trotz des Potenzials unerwünschter Nebenwirkungen. Zu diesen Nebenwirkungen gehören das Risiko, an nicht übertragbaren Krankheiten zu erkranken, darunter Lipodystrophie, Hyperlipidämie, verminderte Knochenmineraldichte, erhöhter Blutzuckerspiegel, der zu Typ-2-Diabetes mellitus führt, Bluthochdruck, ein erhöhtes Schlaganfallrisiko und Probleme im Zusammenhang mit Fettleibigkeit¹³. Eine frühzeitige Diagnose und ein zeitnaher Zugang zu einer geeigneten medizinischen Versorgung in der Anfangsphase einer HIV-Infektion bieten sowohl aus klinischer als auch aus öffentlicher Sicht erhebliche Vorteile. Die rechtzeitige Einleitung der ART und die Prophylaxe gegen opportunistische Infektionen führen zu einer deutlichen Verringerung der HIV-bedingten Erkrankungen und Mortalität.

Der Einsatz von ART kann auch zu einer Verringerung des Potenzials für eine Weiterübertragung von HIV beitragen, indem der Gehalt an zirkulierender HIV-Ribonukleinsäure reduziert wird. Darüber hinaus kann die Behandlung anderer sexuell übertragbarer Krankheiten und Koinfektionen die Wahrscheinlichkeit einer weiteren HIV-Infektion ebenfalls verringern¹⁴. NNRTIs gehören zu den optionalen Behandlungsklassen von Inhibitoren, die mit RT interagieren, indem sie an die allosterische Region oder den Ort von HIV binden. Diese Art der Hemmung ist allgemein als nicht kompetitiver Inhibitor bekannt, da der NNRTI nicht am aktiven Zentrum des Substrats, sondern an der Außenseite bindet. Der Effekt verändert die Konformation der Substratbindungsstelle, wodurch die Bindung des Standardsubstrats verhindert und eine vorzeitige Kettenbeendigung verhindert wird. Aufgrund ihrer geringeren Toxizität im Vergleich zu NRTIs, ihrer einfachen Struktur, ihrer verbesserten Bioverfügbarkeit gegenüber Proteaseinhibitoren und ihrer hervorragenden Selektivität sind NNRTIs zu den attraktivsten HIV-Inhibitoren geworden¹⁵. Daher sind die Synthese und das Design neuartiger NNRTIs aus pharmakokinetischer Sicht von entscheidender^{Bedeutung 16,17}.

NNRTIs sind aufgrund ihrer starken Wirksamkeit und geringen Toxizität bei der Behandlung von HIV/AIDS von entscheidender Bedeutung. Frühe NNRTIs wie Nevirapin, Delavirdin und Efavirenz stoßen jedoch auf Resistenzen durch virale Mutationen an der NNRTI-Bindungsstelle¹⁸. Diese Medikamente, die zur Familie der Diarylpyrimidine (DAPY) gehören, zeigen eine starke Aktivität gegen verschiedene NNRTI-Stämme, einschließlich solcher, die gegen frühe NNRTIs resistent^{sind 19}, wahrscheinlich aufgrund ihrer molekularen Flexibilität und einer höheren Resistenzbarriere gegen HIV-1^20,21. Trotz ihres Erfolgs haben die hohe Mutationsrate in der HIV-1-RT und das Fehlen einer intrinsischen Korrekturleseaktivität zu neuen Resistenzprofilen bei Patienten geführt, die Etravirin und Rilpivirin einnehmen^22,23. Diese Virusmutationen unterscheiden sich voneinander, ebenso wie diejenigen, die mit frühen NNRTI-Medikamenten assoziiert sind²⁴. Über 50 strukturell unterschiedliche Klassen von Verbindungen wurden als NNRTIs identifiziert. Bemerkenswert ist, dass sechs NNRTI die Zulassung für die Behandlung von HIV-1 erhalten haben. Zu diesen zugelassenen Wirkstoffen gehören Nevirapin (NVP), Delavirdin (DLV), Efavirenz (EFV), Etravirin (ETR), Rilpivirin (RPV) und Doravirin (DOR). Abbildung 1 zeigt die chemischen Strukturen dieser sechs zugelassenen NNRTI-Medikamente²⁵.

In einer kürzlich durchgeführten Studie²⁶ deuten DFT-Berechnungen und molekulares Docking darauf hin, dass Lovastatin und Simvastatin Potenzial als Anti-Coronavirus-Wirkstoffe aufweisen. Im Rahmen eines virtuellen Screenings wurden fünf neue, von der FDA zugelassene Kandidatenmoleküle identifiziert, die dem Efavirenz-Gerüst ähneln und eine überlegene Bindungsaffinität in der aktiven Tasche der COVID-19-Hauptprotease aufweisen.

Soltan et ^al.27 führten eine ähnliche Studie zur Identifizierung neuartiger Moleküle für eine verbesserte Bindungskapazität an HIV-RT durch, indem sie eine fragmentbasierte Strategie mit von der FDA zugelassenen Medikamenten anwandten, um chemische Derivate zu entwickeln. Sie nutzten speziell die Strukturen von Delavirdin, Efavirenz, Etravirin und Rilpivirin als grundlegende Gerüste. Die Wirkstoffähnlichkeit dieser Derivate wurde mittels Swiss-ADME beurteilt und anschließend in verwandte Kristallstrukturen eingedockt. Die Studie endete mit der Auswahl von Verbindungen, die im Vergleich zu ihren Elterngerüsten überlegene Bindungsaffinitäten aufwiesen, wobei insbesondere eine deutlichere Verbesserung bei Derivaten festgestellt wurde, die aus den NNRTIs der zweiten Generation, Etravirin und Rilpivirin, entwickelt wurden. Zum Beispiel zeigten die Derivate RPV01 und RPV15 signifikante Verbesserungen der angedockten Energiewerte gegenüber Rilpivirin, was auf einen potenziellen Nutzen bei der Bekämpfung sowohl von Wildtyp- als auch von mutierten Formen der HIV-RT hinweist.

Murugesan und Mitarbeiter²⁸ führten Forschungen durch, die verschiedene medizinisch-chemische Ansätze vorschlagen, um die Wirksamkeit zu verbessern und die Resistenz bei der HIV-Behandlung zu minimieren. Die Studie verwendete molekulare Hybridisierung, bioisosterische Substitution und Hochdurchsatz-Screening. In ihrer Studie gelang es ihnen, neuartige NNRTI-Gerüste mit hoher Wirksamkeit sowohl gegen Wildtyp- als auch gegen Arzneimittelresistenzstämme von HIV zu identifizieren. Sie entwickelten DAPY-Derivate, die eine ausgezeichnete Selektivität und geringe Toxizität aufweisen, wobei einige Verbindungen bei nanomolaren Konzentrationen eine wirksame Hemmung zeigen.

In letzter Zeit hat der Einsatz von Computerwerkzeugen neben der In-silico-Forschung aufgrund der praktischen Analyse der quantenchemischen Eigenschaften eines Medikaments an Popularität gewonnen²⁹. In dieser Studie wurden computergestütztes Wirkstoffdesign, Dichtefunktionaltheorie, qualitative Struktur-Wirkungs-Beziehung und Molekulardynamik angewendet, um potente NNRTIs zu entdecken.

Protocol

1. Rechentechnische Details – Proteinzubereitung

1. Klicken Sie auf das Fenstersymbol auf dem Monitorbildschirm und klicken Sie auf Alle Apps. Scrollen Sie nach unten, um zum Schrödinger-Ordner zu navigieren, öffnen Sie den Ordner, klicken Sie auf das in Abbildung 2B gezeigte Maestro-Symbol, und wählen Sie Öffnen aus, wie in Abbildung 2B gezeigt, um die Software zu starten.
2. Rufen Sie die gewünschte Proteinstruktur ab, indem Sie in der Software auf die Schaltfläche Registerkarte Datei navigieren. Wählen Sie im kurzen Menü, das angezeigt wird, die Option PDB abrufen aus, wie in Abbildung 3A gezeigt, und geben Sie den gewünschten PDB-Code in das Textfeld ein, wie in Abbildung 3B gezeigt. Klicken Sie auf den Download-Button , und die ausgewählte PDB-Datei wird im Projektfenster angezeigt.
3. Alternativ können Sie das Protein Ihrer Wahl aus der Proteindatenbank auf den lokalen Computer herunterladen, indem Sie den Identitätscode der Proteindatenbank (PDB-ID) in das Suchfeld eingeben und auf Herunterladen klicken, um die PDB-Datei auf den lokalen Computer herunterzuladen. Navigieren Sie zur Registerkarte Datei und wählen Sie die Option Strukturen importieren aus. Suchen Sie in der Importschnittstelle die heruntergeladene PDB-Datei, wie in Abbildung 3C gezeigt, und wählen Sie dann die Schaltfläche Importieren aus, wie in Abbildung 3D gezeigt.
   HINWEIS: Die Proteinstruktur wird als 3D-Struktur in einem separaten Fenster geöffnet, wie in Abbildung 4 gezeigt.
4. Navigieren Sie zum oberen rechten Rand der Software, wählen Sie die Aufgabenoption und geben Sie Proteinzubereitung in die Suchleiste ein. Klicken Sie in der Anzeige auf der rechten Seite auf Proteinvorbereitungs-Workflow , wie in Abbildung 5A gezeigt.
5. Geben Sie im sich öffnenden Workflow-Fenster für die Proteinzubereitung den Auftragsnamen als Dateinamen ein und klicken Sie auf die grüne Schaltfläche Ausführen in der unteren rechten Ecke, wie in Abbildung 5B gezeigt.
6. Überwachen Sie die Ausführung des Auftrags, indem Sie in der oberen rechten Ecke auf die Schaltfläche Aufträge klicken, wie in Abbildung 5C dargestellt.
7. Wählen Sie das vorbereitete Protein aus, klicken Sie mit der rechten Maustaste darauf und wählen Sie Split-Ligand, wie in Abbildung 5D gezeigt. Wählen Sie die Aufteilung in Liganden, Wasser und andere. Dies dient dazu, die Proteinkomponenten als eigenständige Einträge im Workspace-Navigator zu haben

2. Vorbereitung des Liganden

1. Laden Sie die gewünschten chemischen Verbindungen aus der PubChem-Datenbank³⁰ herunter, indem Sie den Namen der gewünschten Verbindung in die Suchleiste eingeben. Gehen Sie durch die Strukturen und wählen Sie 3-dimensionale (3D) Strukturen aus. Klicken Sie im oberen rechten Fenster auf Download , um die Strukturkoordinaten als strukturierte Datendatei (SDF) herunterzuladen. Wenn eine 3D-Struktur nicht verfügbar ist, laden Sie die 2D-Struktur herunter und verwenden Sie andere Werkzeuge, um eine 3D-Struktur aus einer 2D-Struktur zu generieren.
2. Klicken Sie in Schrödinger auf die Registerkarte Datei , und wählen Sie Strukturen importieren aus, wie in Abbildung 6A dargestellt. Navigieren Sie zu dem Dateispeicherort, an dem die Strukturen im SDF-Dateiformat gespeichert sind, um die herzustellenden Verbindungen zu laden.
3. Wählen Sie Aufgabe in der oberen rechten Ecke der Schrödinger-Software. Geben Sie LigPrep in die Suchleiste ein, und wählen Sie im rechten Fenster auf der linken Seite LigPrep aus, wie in Abbildung 6B dargestellt.
4. Wählen Sie Strukturen verwenden aus , um Dateien aus der Tabelle Arbeitsbereich oder Projekt auszuwählen. Wählen Sie im LigPrep-Fenster die bevorzugten Optionen aus, speichern Sie die Datei auf dem lokalen Computer, und klicken Sie auf Ausführen , um den Auftrag für die Ligandenvorbereitung zu übermitteln, wie in Abbildung 6C dargestellt.

3. Geometrie und Optimierung von Liganden

1. Öffnen Sie die Software³¹ zur Geometrieoptimierung der heruntergeladenen Strukturen. Navigieren Sie zur Registerkarte Datei (Abbildung 7A), und wählen Sie Öffnen aus, um die heruntergeladene SDF-Datei aus der PubChem-Datenbank auszuwählen.
   HINWEIS: Die Datei wird im Hauptfenster geladen. Klicken Sie auf das andere violette Fenster, um die gleichen chemischen Verbindungen anzuzeigen. Jede implementierte Einstellung zeigt das Ergebnis im violetten Fenster an.
2. Navigieren Sie zur Registerkarte Berechnen und wählen Sie die Registerkarte Gaußsche Berechnung einrichten aus. Navigieren Sie zur Registerkarte "Job Type" (siehe Abbildung 7B ), und wählen Sie "Optimization" oder "Opt+Freq" aus.
   HINWEIS: Abhängig von der (Größe) Anzahl der Atome oder Verbindungen wird zuerst optimiert, gefolgt von der Frequenz. Wenn die Verbindung kleiner ist, führen Sie Opt+Freq aus. Je größer das Molekül ist, desto mehr Zeit wird benötigt, um sowohl Opt+Freq als auch die Optimierung gefolgt von der Frequenz durchzuführen.
3. Navigieren Sie zur Registerkarte Methode und wählen Sie die quantenchemischen Methoden und dann das Kohn-Sham-Global-Hybrid-Austauschkorrelationsdichtefunktional Ihrer Wahl, den Basissatz, die Ladung und den Spin Ihrer Wahl aus den Dropdown-Pfeilen in jedem Abschnitt aus.
4. Navigieren Sie zum Titel , und geben Sie einen Namen für die zu untersuchende Verbindung an.
5. Navigieren Sie zur Registerkarte Link 0 und geben Sie das Speicherlimit und die gemeinsam genutzten Prozessoren der Wahl an. Deaktivieren Sie die Kontrollkästchen Vollständiger Pfad , wie in Abbildung 7C gezeigt.
6. Klicken Sie unten auf die Schaltfläche Bearbeiten , um die Gaußsche Eingabedatei zu speichern, wie in Abbildung 3C dargestellt. Speichern Sie die Datei am bevorzugten Speicherort mit einem Dateinamen Ihrer Wahl als Gaußsche Auftragsdatei (gjf).
   HINWEIS: Nach dem Speichern der Gaußschen Eingabedatei wird ein Popup-Fenster angezeigt, in dem der Inhalt der Datei im Editor angezeigt wird. Bearbeiten Sie den Inhalt der Datei, einschließlich Optionen wie das Ändern der Ladung und der Funktion, die in den Einstellungsoptionen nicht verfügbar waren. Die vorbereitete Gaußsche Jobdatei wird als Eingabedatei für die Einreichung verwendet, um die Optimierungs- und Häufigkeitsberechnungen über einen lokalen Rechner durchzuführen.
   Anschließend wurde eine geometrische Optimierung dieser Strukturen unter Verwendung des MN15-L-Funktions³² und des 6-31++G(d,p)-Basissatzes³³ durchgeführt. Sollten jedoch Probleme bei der Durchführung des Optimierungs- und Frequenzprozesses auftreten, kann man die Arbeit mit Hilfe eines HPC einreichen.

4. Generierung des Rezeptorgitters

1. Navigieren Sie zu Aufgaben und wählen Sie Rezeptorgittergeneration³⁴ aus. Die in Abbildung 8A gezeigte Schnittstelle zur Rezeptorgittergenerierung identifiziert das aktive Zentrum des Proteins, an das der Kernkristallligand gebunden ist. Klicken Sie auf Pick, um den Liganden zu identifizieren und zu überprüfen, ob ein cokristallisierter Ligand vorhanden ist, wie in der in Abbildung 8B gezeigten Popup-Benachrichtigung oben zu sehen ist.
2. Wählen Sie die Liganden und/oder Reste aus dem Arbeitsbereich aus, und die ausgewählten Verbindungen von Interesse werden im Arbeitsbereich blau hervorgehoben.
3. Wählen Sie die Registerkarte "Einstellungen" im Bedienfeld "Empfängergittergenerierung" aus, um die Größe der Gitterbox festzulegen. Die Standardgröße des Rasterfelds beträgt 10 Å x 10 Å x 10 Å. Ändern Sie die Abmessungen des Quaders auf der Registerkarte Rasterbox , indem Sie die gewünschten Werte direkt eingeben oder die Größe des Quaders manuell im Arbeitsbereich ändern.
   HINWEIS: Alternativ können Sie bei Bedarf zusätzliche Parameter auf der Registerkarte Erweitert festlegen, wie in Abbildung 8C gezeigt. Überprüfen Sie alle Einstellungen, um die Genauigkeit sicherzustellen.
4. Klicken Sie auf Ausführen , um mit der Rastererstellung zu beginnen. Speichern Sie nach Abschluss des Vorgangs die generierten Grid-Dateien für nachfolgende Docking-Simulationen. Eine Benachrichtigung wird angezeigt, wenn der Auftrag abgeschlossen ist, wie in Abbildung 8D dargestellt.

5. Molekulares Andocken

1. Laden Sie das Protein und die vorbereiteten Liganden, indem Sie zu Aufgaben, Andocken³⁵ und Liganden-Andocken (Gleitdocken) navigieren, wie in Abbildung 9A gezeigt.
2. Laden Sie die Rasterdatei aus Schritt 4.1 oben, und wählen Sie die Liganden aus dem Arbeitsbereich mit der Option Liganden verwenden aus der in Abbildung 9B aus.
3. Wählen Sie auf der Registerkarte "Einstellungen" (siehe Abbildung 9 C) die bevorzugte Andockgenauigkeitsmethode aus (die Standardandockgenauigkeit ist Standardgenauigkeit (SP)).
4. Stellen Sie das Kraftfeld auf OPLS4 ein, um molekulare Wechselwirkungen genau zu modellieren. Legen Sie Abhängigkeiten (z. B. Wasserstoffbrücken) auf der Registerkarte Abhängigkeiten fest.
5. Überprüfen Sie alle Einstellungen, und speichern Sie den Andockauftrag oder die Datei. Klicken Sie auf AUSFÜHREN , um den Andockvorgang zu starten.
6. Eine Benachrichtigung gibt an, dass der Auftrag abgeschlossen wurde und die Projekttabelle für das Andocken von Ergebnissen geöffnet wird. Untersuchen Sie die verbindlichen Posen, Bewertungen und Interaktionen.

6. Generierung von 2D-QSAR-Modellen

1. Rufen Sie die Webseite des KNIME-Community-Hubs auf, und suchen Sie in der Suchleiste nach AutoQsar. Wählen Sie den zweiten AutoQsar-Eintrag aus, der in Abbildung 10A angezeigt wird.
2. Klicken Sie auf das Symbold ownload workflow und wählen Sie im Popup-Menü in Abbildung 10B die Option Download-Workflow aus. Speichern Sie den Workflow auf dem lokalen Computer.
3. Stellen Sie sicher, dass KNIME³⁶ installiert ist, und öffnen Sie es dann vom lokalen Computer aus. Erstellen Sie eine Tabelle mit dem kanonischen Lächeln, dem Namen der Struktur, den Aktivitäts-/IC-Werten₅₀ (in Mikromolaren) und -log (Aktivität/IC) oder einem beliebigen chemischen Deskriptor Ihrer Wahl. Speichern Sie die Datei in einem CSV-Format (Comma-Separated Value) auf dem lokalen Computer.
4. Navigieren Sie zu Datei , und importieren Sie den AutoQSAR-Workflow³⁷. Klicken Sie im Popup-Fenster auf KNIME-Workflow importieren , um den heruntergeladenen AutoQSAR-Workflow auszuwählen, wie in Abbildung 10C gezeigt, und wählen Sie Öffnen | Weiter | Fertig.
5. Der AutoQsar-Workflow wird im KNIME Explorer-Fenster oben links angezeigt. Doppelklicken Sie auf den Workflow, um den Workflow in das Hauptfenster zu bringen.
6. Doppelklicken Sie auf das Symbol für den molekularen Reader (für MAE) und klicken Sie auf der Registerkarte Einstellungen auf Datei(en) hinzufügen , um das Arbeitsblatt mit den eingegebenen Daten oder Parametern hinzuzufügen.
7. Wählen Sie die Registerkarte Speicherrichtlinie und klicken Sie auf Tabellen auf Disc schreiben | In Ordnung.
8. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf die Schaltfläche Eigenschaften extrahieren , und wählen Sie Konfigurieren aus, wie in Abbildung 10D dargestellt.
9. Wählen Sie die gewünschten molekularen oder chemischen Eigenschaften aus dem Ausschlussfenster in das Fenster Einschließen aus, und filtern Sie sie. Klicken Sie auf Übernehmen.
10. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf AutoQSAR Build Model und klicken Sie auf Konfigurieren. Geben Sie denQ SAR-Modellnamen in das Popup-Dialogfeld ein.
11. Klicken Sie auf die Schaltfläche"Trennen" und wählen Sie die Eigenschaft aus, die angepasst werden soll. Wählen Sie den zufälligen Wert des Trainingssets (z. B. 85 %:15 %) und mehrere Modelle, die beibehalten werden sollen. Klicken Sie auf Übernehmen.
12. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf den unteren Molecule Reader und wählen Sie Konfigurieren. Laden Sie die Testliganden aus einer vorbereiteten CSV-Excel-Datei, die die zu testenden Liganden enthält.
13. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf Eigenschaften extrahieren und stellen Sie die Einstellungen nach Ihren Wünschen ein.
14. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf den oberen Molecule Reader und wählen Sie Ausführen.
    HINWEIS: Ein orangefarbener Punkt zeigt an, dass der Vorgang begonnen hat, und ein grünes Licht zeigt die erfolgreiche Ausführung des Prozesses an. Der nächste Schritt wird fortgesetzt, bis alle Knoten erfolgreich ausgeführt wurden.
15. . Führen Sie den zweiten Molecule Reader für Testliganden aus.
16. Speichern Sie den ZIP-Ordner mit den Ergebnissen des Tests und des Trainingssatzes nach der erfolgreichen Ausführung aller Knoten.
    HINWEIS: Wählen Sie das leistungsstärkste Modell basierend auf Kreuzvalidierungsergebnissen aus, z. B. SD – Standardabweichung, R2 – Trainingssatzkorrelation zwischen tatsächlichen und vorhergesagten Aktivitätswerten und Q2 – tatsächliche und prognostizierte Aktivitätskorrelation des Testsatzes.
17. Werten Sie die Workflow-Leistung aus, indem Sie die Leistung des Modells mithilfe eines Scorers oder statistischer Knoten bewerten.
18. Um die Ergebnisse zu interpretieren, identifizieren Sie die Haupt- oder Schlüsseldeskriptoren anhand der Feature-Wichtigkeit. Visualisieren Sie die Ergebnisse als Streudiagramm oder Balkendiagramm, um die Beziehung zwischen Leistung und Deskriptor zu bestimmen. Speichern Sie den Workflow und exportieren Sie die Ergebnisdaten, Vorhersagen und Visualisierungen als Streudiagramm und/oder CSV-Dateien.

7. Aufzählung

1. Navigieren Sie zu Task , und suchen Sie nach Ligand Designer, wie in Abbildung 11A dargestellt.
2. Wählen Sie ein Paar aus dem angedockten Protein und dem Ligandenkomplex aus dem Workspace-Navigator aus. Klicken Sie im Fenster des Liganden-Designers auf Workspace analysieren. Um neue Liganden zu generieren und auszuwerten, wählen Sie Isostere-Scan aus der Liste der angezeigten Arbeitsabläufe aus, wie in Abbildung 11B gezeigt, impliziert die Wachstumsmethode , die den Liganden erweitert, indem Fragmente zu vorhandenen Teilen des Moleküls hinzugefügt werden.
3. Nachdem Sie die Optionfür die E-Nummerierung festgelegt haben, klicken Sie im angezeigten Benachrichtigungsfenster für Isostere Scanning auf Aufzählung . Wiederholen Sie Schritt 6.2 für dasselbe Protein und einen anderen Liganden, bis alle Liganden den gleichen Prozess durchlaufen haben. Überprüfen Sie die aufgezählten Liganden aus der Tabelle Projekte.
4. Speichern Sie die Strukturen, indem Sie die entworfenen Liganden exportieren.
   HINWEIS: Die Aufzählungsmethode generierte nach Abschluss der Simulation einen Satz von Andockbewertungen.
5. Wählen Sie einzeln die aufgezählten Verbindungen mit den negativeren Andockwerten aus, und docken Sie sie mithilfe des in Abschnitt 4 beschriebenen Andockverfahrens erneut an.

8. HOMO und LUMO

1. Öffnen Sie die Software und laden Sie den optimierten Liganden im Gaußschen Job-Dateiformat hoch.
2. Navigieren Sie zu Tools , und wählen Sie MO-Editor in roten und grünen Punkten aus, wie in Abbildung 12A dargestellt.
   HINWEIS: Die Aufzählungsmethode generierte nach Abschluss der Simulation einen Satz von Andockbewertungen.
3. Laden Sie im Bereich MO-Editor unter Methode die FChk-Datei , indem Sie auf Mos aus der vorhandenen Chk- oder FChk-Datei laden klicken, wie in Abbildung 12B dargestellt.
4. Klicken Sie auf den Reiter Visualisieren | Aktualisieren. Warten Sie ~10 s, bis die aktuelle Oberfläche angezeigt wird, wie in Abbildung 12D dargestellt.
5. Klicken Sie auf eines der beiden Kontrollkästchen neben den hervorgehobenen gelben Ziffern, um entweder die HOMO - oder die LUMO^{38-Oberfläche} auszuwählen, die im Fenster daneben angezeigt werden soll.
6. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf den violetten Hintergrund und wählen Sie Datei. Klicken Sie auf Bilddatei speichern , um das Bild der aktuellen Oberfläche zu speichern, wie in Abbildung 12E gezeigt.
7. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf den violetten Hintergrund und wählen Sie Ansicht. Wählen Sie das Anzeigeformat aus, um den Hintergrund auf der Registerkarte "Allgemein ", die Oberflächentransparenz auf der Registerkarte "Oberfläche ", die Schriftgröße und -farbe auf der Registerkarte "Text", die Bildqualität und das bevorzugte Layout der Oberfläche auf der Registerkarte "Molekül" zu ändern, wie in Abbildung 12F dargestellt.
8. Alternativ können Sie eine Cube-Datei generieren und die FChk-Datei in GaussView hochladen. Navigieren Sie zur Registerkarte Ergebnisse , und wählen Sie Flächen/Konturen. Klicken Sie auf Würfelaktionen und laden Sie den Würfel. Klicken Sie auf Oberflächenaktionen und wählen Sie eine neue Oberfläche aus. Wiederholen Sie Schritt 8.7, um die Fläche zu bearbeiten.
   HINWEIS: Je kleiner die Energielücke zwischen HOMO und LUMO³⁹ (die Differenz zwischen LUMO und HOMO), desto reaktiver ist ein Molekül. Berechnen Sie die_{Energielücke (E-Lücke}) mit Gl 1 für jedes Molekül.
   

9. Simulation der Molekulardynamik – Systemvorbereitung und -minimierung

1. Stellen Sie sicher, dass die Schrödinger-Suite auf dem lokalen Rechner installiert ist, und laden Sie die Protein-Liganden-Komplexstrukturen in den Arbeitsbereich⁴⁰.
2. Klicken Sie auf die Schaltfläche Task und wählen Sie Desmond System Builder⁴¹. Wählen Sie im System-Builder-Bereich die Registerkarte Solvatation und dann das vordefinierte Lösungsmittelmodell (siehe Abbildung 13A), die Kastenform (siehe Abbildung 13B) und die Methode zur Berechnung der Schachtelgröße (siehe Abbildung 13C⁴²) aus, die für den Protein-Liganden-Komplex geeignet sind.
3. Wählen Sie die Registerkarte Ionen und klicken Sie auf Neu berechnen , um das System durch Hinzufügen von Gegenionen und Einstellen der gewünschten Salzkonzentration zu neutralisieren.
4. Wählen Sie als Kraftfeld den OPLS^43,44 Ihrer Wahl.
5. Benennen Sie den Auftrag entsprechend, und speichern Sie die Auftragsdatei auf dem lokalen Computer. Klicken Sie auf Ausführen , um den Auftrag zur Vorbereitung zu übermitteln.
   HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass der Auftragsname gespeichert ist. Verwenden Sie einen detaillierten Namen.
6. Äquilibrierung und Herstellung
7. Betrachten Sie das Projekt im Arbeitsbereich Nach der Systemvorbereitung. Wählen Sie im Workspace-Navigator den Protein-Liganden-Komplex aus, navigieren Sie durch die Aufgabe, und wählen Sie Molekulardynamik (Desmond) aus.
8. Laden Sie den Liganden-Protein-Komplex aus dem Arbeitsbereich im Molekulardynamik-Panel. Wählen Sie die gewünschte Simulationszeitachse auf der Registerkarte Simulation aus. Wählen Sie NPT als Ensemble-Klasse⁴⁵ aus.
9. Benennen Sie den Auftrag entsprechend, und schreiben Sie den Auftrag aus. Klicken Sie auf Schließen , um das Fenster für die Molekulardynamik zu verlassen.
10. Reichen Sie den ausgeschriebenen Auftrag für die Vorbereitung der Molekulardynamik über ein lokales Terminal ein. Öffnen Sie nach Abschluss des Vorgangs den abgeschlossenen Auftrag, und setzen Sie die Simulationszeit ab der ursprünglich festgelegten Simulationszeitachse bis zur gewünschten Simulationszeit⁴⁵ fort, z. B. 100 ns, 200 ns.
    HINWEIS: Wiederholen Sie Schritt 9 für die anderen Protein-Liganden-Komplexe.
    1. Öffnen Sie den abgeschlossenen Job in der Schrödinger Maestro-Software und führen Sie die verschiedenen Simulationszeiträume zusammen, wenn separate Jobs ausgeführt wurden. Navigieren Sie zur Schaltfläche TASK und wählen Sie das Simulationsinteraktionsdiagramm aus. Laden Sie die zusammengeführten Dateien oder die einzelne Datei, um die Trajektorie zu visualisieren.
11. Generieren Sie einen Bericht, der die Visualisierungen und andere detaillierte Ausgabeergebnisse enthält.

10. Molekulare Mechanik mit generalisierter Born- und Oberflächenoberfläche (MM-GBSA)

1. Öffnen Sie die Trajektoriendatei und spielen Sie die Trajektorie ab. Visualisieren Sie, wo der Protein-Liganden-Komplex äquilibriert ist, und notieren Sie sich die Anzahl der Frames. Übergeben Sie den Auftrag über das Terminal zur Verarbeitung.
2. Wiederholen Sie Abschnitt 9 (Vorbereiten der Simulation der Proteinmolekulardynamik) für den anderen Protein-Liganden-Komplex.
3. Verknüpfen/Anzeigen des Inhalts der Ausgabedatei, um die generierten Ergebnisse zu analysieren. Lesen Sie den ΔG-Mittelwert, um die freie Bindungsenergie des Protein-Liganden-Komplexes zu erhalten.
4. Laden Sie die CSV-Datei herunter, um die Beiträge verschiedener intramolekularer Moleküle zu visualisieren.
5. Um die freie Bindungsenergie des Komplexes zu berechnen, beachten Sie die verschiedenen Thermodynamik- und Desolvatitätsparameter, einschließlich der Bindungsenergie (_ΔG-Bindung), des Columbic-Solvatationsmodells (ΔG-Bindung Coulumum), des unpolaren Solvatationstermes (ΔG-Bind-Lipo), der Wasserstoffbrückenbindungskorrektur (ΔG-Bind-Hbond), der kovalenten Bindung (ΔG-Bind-Kovalent), der π-π-Packungskorrektur (ΔG-Bind-Packung), der Generalisierten elektrostatischen Solvatationsenergie (ΔG-Bind) sol GB) und van-der-Waals-Wechselwirkung (ΔG_bind vdW).
   1. Leiten Sie die endgültige ΔGbind ab, indem Sie den Durchschnitt der ΔG-Bindungswerte bilden, die für jeden Snapshot in der MD-Simulation bestimmt wurden, wie in Gl 2 gezeigt.

Results

Generierung von Rezeptorgittern und molekulares Andocken

Das Rezeptorgitter-Generierungswerkzeug von Maestro wurde verwendet, um die Bindungsstelle für das anschließende Andocken richtig zu charakterisieren. Der co-kristallisierte Ligand wurde verwendet, um das Gitter zu definieren. Es wurde die SP-Präzisions-Glide-Einstellung für das molekulare Docking verwendet. Mit dem LigPrep-Tool in Schrödinger Maestro wurden die Liganden für das Andocken mit Hilfe des OPLS4-Kraftfeldes vorbereitet. Für Molekulardynamik-Simulationen wurde das OPLS4-Kraftfeld in Desmond verwendet. Kraftfelder sind für klassische molekulare Simulationen von grundlegender Bedeutung, und ihre Genauigkeit ist entscheidend für die Qualität von Protein-Liganden-Bindungssimulationen in der Wirkstoffforschung. Für OPLS4 wurden die Ladungs- und Parameterzuweisung mit Schrödinger Maestro durchgeführt. Die Anwendung von OPLS4-Parametern führte zu signifikanten Verbesserungen sowohl im energetischen als auch im geometrischen Vergleich im Vergleich zu den Standardparametern von OPLS2005.

Dabei wurden spezifische Liganden angedockt, von denen bekannt ist, dass sie eine Affinität zum HIV-1-Zielprotein aufweisen, was eine gründliche Analyse der Wechselwirkungen zwischen Ligandenmolekülen und Rezeptorresten ermöglicht. Tabelle 1 stellt eine Zusammenfassung der Klassifizierung von Verbindungen für die QSAR-Modellierung dar.

Nach dem Andocken von HBY561 wurde das Andockprotokoll durch den Vergleich des redockierten Liganden mit dem im aktiven Zentrum des kristallinen Proteins 1HQU bewertet. Die angedockten und kristallisierten HBY561-Strukturen sind in der Ergänzungsdatei 1 (Ergänzende Abbildung S1 und Ergänzende Abbildung S2) bereitgestellt. Um die Ähnlichkeit zwischen angedockten Posen und Referenzstrukturen zu bewerten, wird ein RMSD-Wert (Root-Mean-Square Deviation) von weniger als 2,0 Å weithin als Kriterium für zuverlässige Docking-Ergebnisse angesehen. Dieser Schwellenwert gibt an, dass die vorhergesagte Struktur eng mit den experimentellen Daten übereinstimmt. In dieser Studie zeigten die Liganden einen RMSD von 1,27 Å, wenn man die Referenzstruktur mit der angedockten Pose vergleicht, wie in der ergänzenden Abbildung S3 rot dargestellt. Dies zeigte, dass das Docking-Protokoll für diese Arbeit ausreichend war, und als Ergebnis wurden alle Liganden mit den gleichen Einstellungen angedockt. Bei der Untersuchung der in Tabelle 2 dargestellten Docking-Scores zeigten Efavirenz und Etravirin die günstigsten Werte bei -10,432 eV und -9,647 eV relativ zum Docking-Score des cokristallisierten Liganden HBY561 (-9,242 eV). Ergänzende Abbildung S4 aus der ergänzenden Datei 1 zeigt die Liganden-Interaktionsdiagramme zwischen dem ursprünglichen HIV-1-Protein und dem Crystal-Liganden, Etravirin und Efavirenz.

Wasserstoffbrückenbindungen, π-π-Stapelung und hydrophobe Wechselwirkungen sind die Hauptkräfte, die zur Bindung beitragen. Ein spezifischer Fall von Wasserstoffbrückenbindung trat zwischen HBY561 und dem bezeichneten Protein 1HQU auf, an dem explizit der Aminosäurerest LYS101 beteiligt war. Dieses Bindungsmuster spiegelte Beobachtungen wider, die mit den Liganden Efavirenz und Etravirin gemacht wurden, wie in Abbildung 14 gezeigt.

Darüber hinaus waren hydrophobe Wechselwirkungen essentiell für die Bindung an mehreren Proteinstellen, an denen HBY561, Etravirin und Efavirenz beteiligt sind, zusätzlich zu den intermolekularen Kräften, der Wasserstoffbrückenbindung und der π-π-Stapelung. π-π-Stapelung wurde zwischen TYR318 und dem aromatischen Ring in Efavirenz beobachtet. Sowohl Wasserstoffbrückenbindungen als auch π-π-Stapelung waren essentiell, um die Bindungsverbindungen zwischen den Liganden und dem Protein aufrechtzuerhalten. Liganden-Interaktionsdiagramme von HBY_561, Nevirapin, Doravirin, Efavirenz und Etravirin sind in der ergänzenden Datei 1-Ergänzende Abbildung S5 dargestellt.

Diese intermolekularen Kräfte beeinflussen Protein-Liganden-Wechselwirkungen und sind entscheidend für die Entwicklung von Medikamenten, die AMR bei HIV-1 reduzieren. Ihre Rolle bei der Verbesserung der Bindungsaffinität, Spezifität und des Wirkmechanismus hilft bei der Entwicklung von Medikamenten, die das Virus wirksam bekämpfen und hemmen können, und trägt so der wachsenden Besorgnis über antimikrobielle Resistenzen im Zusammenhang mit der HIV-1-Behandlung Rechnung.

Erstellung von 2D-QSAR-Datensätzen

An den Trainings- und Testphasen nahmen 94 Wirkstoffe teil. Diese Verbindungen wurden in vier Klassen eingeteilt, die jeweils Liganden repräsentieren, die mit dem getesteten Protein assoziiert sind. Der Trainingsprozess verwendete den KNIME AutoQSAR-Workflow mit Aktivität, HOMO und LUMO wurden als die drei Deskriptoren für diese Untersuchung ausgewählt.

2D-QSAR-Generierung

Bei allen 94 Molekülen wurden die Aktivitätswerte durch experimentelle Daten bestimmt (Ergänzende Tabelle S1). Die aus dem QSAR-Modell generierten Ergebnisse sind in Tabelle 3 zu finden. Für die QSAR-Modellierung wurden Verbindungen der Klasse 1 in der ergänzenden Tabelle S2 verwendet, die die hinzugefügten Ar-Gruppen und ihre jeweiligen Aktivitätswerte zeigen. Die Ergebnisse aus den vier Klassen zeigen, dass die höchste Punktzahl von 0,8223, R² von 0,815 und Q ² von 0,8182 erreicht wurde, was der Klasse 1 entspricht. Dies steht im Einklang mit den vorherigen Kriterien, R² nahe 1 und Q² größer als 0,7⁴⁶ anzustreben. Daher haben wir die Klasse 1 für das Training unseres QSAR-Modells ausgewählt. Während die Modelle für die Klassen 3 und 4 einen hervorragenden Korrelationswert R² von 0,8172 bzw. 0,6673 zeigten, erreichten sie nicht die Leistung der Klasse 1.

Es wurde eine Kreuzkorrelation durchgeführt, um die Stabilität des vorgeschlagenen QSAR-Modells weiter zu validieren, und zwar nach dem Kriterium, dass die Differenz zwischen dem Q^2-Score 0,8223 und R² kleiner oder gleich 0,3⁴⁷ sein sollte. Unser vorgeschlagenes Modell für Klasse 1 hat eine Differenz von 0,0038. Das Streudiagramm, das die beobachtete Aktivität im Vergleich zur vorhergesagten Aktivität darstellt, ist in Abbildung 15 dargestellt.

HOMO-LUMO Energielücke

Die Bestimmung der Energielücke zwischen dem kleinsten freien Molekülorbital und dem höchsten besetzten Molekülorbital, allgemein bekannt als HOMO-LUMO-Energielücke, spielt eine entscheidende Rolle bei der Charakterisierung der chemischen Reaktivität und kinetischen Stabilität eines Moleküls im Zusammenhang mit den sechs NNRTI-Verbindungen. Die Frontier-Molekülorbitale spielen eine entscheidende Rolle bei der Erleichterung von Ladungstransfer-Wechselwirkungen mit der Bindungsstelle des HIV-Proteins. Die Bestätigung des Energieminimums wurde durch die Untersuchung der Schwingungsfrequenzen und die Bestätigung des Fehlens negativer oder imaginärer Frequenzen gewährleistet; Anschließend wurden für jedes Energieminimum die HOMO- und LUMO-Werte ermittelt. Ein höherer HOMO-Wert bedeutet die Fähigkeit eines Moleküls als Elektronendonor, während ein niedrigerer Wert darauf hindeutet, dass es als schwacher Elektronenakzeptor wirkt. Die ergänzende Abbildung S6 stellt die HOMO_LUMO Energielücken für die sechs optimierten NNRTIs dar. Darüber hinaus beeinflusst eine verringerte Energielücke zwischen den Energieniveaus HOMO und LUMO stark die intermolekularen Ladungstransferwechselwirkungen, die zwischen den untersuchten Molekülen aufgrund der starken Elektronenaufnahmefähigkeit und Bioaktivität der Moleküle auftreten⁴⁸.

Der Trend der Energielücke, wie in Tabelle 4 dargestellt, folgt einer absteigenden Reihenfolge: Efavirenz > Etravirin > HBY-561 > Nevirapin > Delavirdin > Doravirin > Rilpivirin. Die für Efavirenz und Etravirin beobachtete erhebliche Energielücke deutet darauf hin, dass die Analysen der Docking-Scores eine Korrelation zwischen der Bioaktivität und der HOMO-LUMO-Lücke aufzeigen. Bemerkenswert ist, dass das antivirale Potenzial mit größeren HOMO-LUMO-Gap-Werten zunimmt. Es zeigt nicht nur die Stabilität der Verbindungen an, sondern auch ihr Potenzial, stabile Wechselwirkungen mit dem Rezeptor zu bilden. Die HOMO-LUMO-Lücke spielt eine wichtige Rolle für das Verständnis der Bioaktivität von Molekülen, insbesondere im Zusammenhang mit der Entwicklung von HIV-1-Medikamenten.

Aufzählung

Für die Aufzählung von virtuellen Bibliotheken wurden verschiedene Werkzeuge erstellt. Zu den für die Aufzählung verwendeten Tools gehört Schrödinger. Es beruht auf dem Core-Hopping-Verfahren, bei dem Bibliotheken erstellt werden, indem ein oder mehrere Anhänge auf einer Kernstruktur durch Fragmente von Reagenzverbindungen⁴⁹ ersetzt werden. Das Enumerationstool in Maestro v13.1 wurde verwendet, um jedem der sechs NNRTIs benutzerdefinierte Seitengruppen oder Atome hinzuzufügen. Die neuen Verbindungen wurden auch zur Vorhersage von Aktivitäten verwendet. Es gab eine Verbesserung der erwarteten Aktivitätswerte der aufgezählten Moleküle im Vergleich zu den ursprünglich optimierten NNRTI-Molekülen, wie in Tabelle 5 zu sehen ist.

Die Verbesserung, die in den Aktivitätswerten der aufgezählten Liganden gezeigt wurde, war auf den Enumerationsprozess zurückzuführen, der durchgeführt wurde, da die hinzugefügte benutzerdefinierte R-Gruppe die Interaktionskräfte der neu vorgeschlagenen Verbindung und des ursprünglichen Proteins beeinflusste. Die aufgezählten Verbindungen wurden für die Quantenmechanik präpariert, indem diese Moleküle optimiert und ihre Schwingungsfrequenzen berechnet wurden. Ihre Energielücken wurden berechnet und mit den Energielücken der NNRTIs verglichen. Die Gesamtbeobachtung, wie in Tabelle 6 gezeigt, deutet darauf hin, dass die aufgezählten Verbindungen stabiler sind als ihre optimierten Gegenstücke.

In Tabelle 6 wurde beobachtet, dass die Energielücke der aufgezählten Verbindungen im Vergleich zu den optimierten Verbindungen einen ähnlichen Trend zeigte. Dies deutet darauf hin, dass die chemischen Eigenschaften der aufgezählten Moleküle unabhängig von einer Konformationsdrehung unverändert blieben. So waren sie in der Lage, wichtige intermolekulare Kräfte mit den Aminosäureresten des Proteins aufrechtzuerhalten.

Vor dem Ausführen des Aufzählungsprozesses für die NNRTIs, wie in Protokollabschnitt 6 beschrieben, hatten die beobachteten Ausgabeergebnisse ihre anfänglichen Andockwerte aus dem Aufzählungsprozess, die in Tabelle 7 in der Spalte mit der Aufzählungsbewertung dargestellt sind. Wie in Protokollabschnitt 4 erläutert, wurde der molekulare Docking-Prozess durchgeführt, um den vorgeschlagenen Docking-Score für die aufgezählten Verbindungen zu validieren. Es konnte beobachtet werden, dass sich nach dem erneuten Andocken der aufgezählten Verbindungen die neuen Andockwerte verbesserten, wie in der Spalte "Aufgezählte Liganden" gezeigt. Die redockierten Scores für die aufgezählten Verbindungen wurden mit den Docking-Scores der ursprünglichen NNRTIs verglichen, die in der Spalte "ursprünglicher Docking-Score" in Tabelle 7 dargestellt sind. Es konnte beobachtet werden, dass für die aufgezählten Verbindungen die Docking-Scores für HBY_561, Etravirin, Efavirenz und Doravirin besser waren als die ihrer äquivalenten optimierten Verbindungen. Delavirdin besitzt jedoch den gleichen Docking-Score wie aufgezähltes und optimiertes Delavirdin.

Molekulardynamik

Drei Wasserstoffbrückenbindungen werden von HBY 561 mit LYS101, den stark elektronegativen N-Atomen und dem OH gebildet. Der Kristallligand, also das dritte Molekül, baut gleichzeitig zwei Wasserstoffbrückenbindungen mit Schwefel und Wasserstoff und eine dritte Wasserstoffbindung mit GLU138 auf. Wichtig ist, dass π-π-Stapelung und hydrophobe Wechselwirkungen erheblich zu den beteiligten intermolekularen Kräften beitragen. Darüber hinaus ist das Vorhandensein zusätzlicher Wasserstoffbrückenbrücken für die Molekulardynamik von entscheidender Bedeutung, was sich insbesondere in den resultierenden Diagrammen der mittleren quadratischen Abweichung (RMSD) widerspiegelt. Insgesamt wurden drei Wasserstoffbrückenbindungen beobachtet, die von Efavirenz gebildet werden, mit dem sehr elektronegativen Stickstoffatom, dem Sauerstoffatom auf dem anderen nicht-aromatischen Ring und dem Benzolring und TYR318 zwischen dem Liganden stark elektronegatives N am zentralen Ring. Eine zweite Wasserstoffbrücke zwischen N aus dem Ring und dem OH und LY101 ist zu sehen. Etravirin weist drei Wasserstoffbrückenbindungen mit LYS101 auf. Doravirin bildet eine Wasserstoffbrückenbindung mit GLU138. Nevirapin zeigt zwei Wasserstoffbrückenbindungen mit LY101.

In diesem Fall ist die Aminosäurerest-Wechselwirkung, die allen Liganden gemeinsam ist, LYS101. Auch wenn sich ihre Strukturen unterscheiden, interagieren sie alle mit dem gleichen Aminosäurerest. MD-Simulationen wurden mit den in Protokollabschnitt 2.8 aufgeführten Parametern durchgeführt, um festzustellen, wie gut oder schlecht jeder Ligand (NNRTI und der aufgeführte NNRTI) an das aktive Zentrum von 1HQU bindet. Die in Abbildung 16 dargestellte Ligandeninteraktion deutet auf robuste Wasserstoffbrückenbindungen zwischen der Aminosäure LY101 des Proteins und den Molekülen HBY 561, Nevirapin, Efavirenz und Etravirin hin. Wie im Vergleich in Tabelle 7 zu sehen ist, sind diese starken Wechselwirkungen für die hohen Andockwerte der einzelnen Verbindungen verantwortlich.

Um die Bindungswirksamkeit jedes Liganden, einschließlich NNRTI und aufgezählter NNRTI, am aktiven Zentrum von 1HQU zu bewerten, wurden Molekulardynamik-Simulationen (MDS) durchgeführt. Insbesondere wurden die vier aufgezählten Verbindungen ausgewählt, die bessere Andockwerte als die ursprünglichen optimierten Kombos aufwiesen. Diese ausgewählten Verbindungen wurden einer MDS als Validierungsmethode unterzogen, um die Reaktion jedes Moleküls mit dem HIV-1-Protein über einen bestimmten Zeitraum unter Berücksichtigung der interatomaren Wechselwirkungen in Gegenwart eines Liganden zu untersuchen und zu beobachten.

Bevor wir mit der MDS für die kürzlich aufgezählten Glykane begannen, war es wichtig, die Eignung des Simulationsprotokolls für unser System zu bestätigen. Um dies zu erreichen, bestand der erste Schritt darin, MDS des freien Proteins 1HQU durchzuführen. Im aktiven Zentrum des Proteins war kein Ligand vorhanden (Abbildung 17A und ergänzende Abbildung S7). Bis zu ~60 ns gibt es erhebliche Schwankungen in der Proteinstruktur, die Cα RMSD-Verschiebungen von bis zu 4,5 Å erzeugen; danach scheint sich das Protein mit einer RMSD-Fluktuation von ~3,5 Å bis zu 200 ns zu stabilisieren. Diese Stabilisierung überzeugte uns, dass das MD-Protokoll für unsere Protein-Liganden-Komplexe geeignet wäre, die im folgenden Abschnitt analysiert werden.

Die 200 ns MDS von Etravirin und aufgezähltem Etravirin (Abbildung 17B,C) zeigten Fluktuationen der mittleren quadratischen Abweichung (RMSD) von Etravirin nahe 5,0 Å und eine Äquilibrierung von 4,5 Å. Das aufgezählte Etravirin zeigte RMSD-Schwankungen von 4,5 Å und eine Äquilibrierung von 3,5 Å. Diese Stabilisierung deutet darauf hin, dass das aufgezählte Etravirin ein potenzieller NNRTI-Ligand zur Behandlung von HIV/AIDS sein kann. Eine Trajektorie mit einem RMSD von weniger als 5 Å deutet auf einen robusten Bindungseffekt zwischen dem Protein des aktiven Zentrums und dem Liganden hin. Diese Beobachtung galt für alle zuvor erwähnten Verbindungen, mit Ausnahme von Nevirapin und Doravirin, unter den aufgezählten Verbindungen (Ergänzende Akte 1: Ergänzende Abbildung S8, Ergänzende Abbildung S9, Ergänzende Abbildung S10 und Ergänzende Abbildung S11).

In den Abbildungen 18 und 19 wird die Bindung zwischen Etravirin, dem aufgezählten Etravirin, und dem Protein weiter analysiert. Die analysierten Daten enthalten ein Histogramm der Interaktion, der Ligand-Protein- und der Protein-Liganden-Kontakte. Das Histogramm der Interaktionskontakte für jeden jeweiligen Liganden, der an das Protein gebunden ist, steht in direktem Zusammenhang mit den entsprechenden Wechselwirkungskräften zwischen den Resten der Aminosäure des Proteins und dem Liganden. Die hohe Abundanz von LYS101 ist für Etravirin und das aufgezählte Etravirin sehr ausgeprägt, und es wurde ein sichtbares dickes orangefarbenes Band beobachtet. Ein schwach erkennbares hellorangefarbenes Band, das sich am unteren Ende des aufgezählten Etravirin-Diagramms befindet, wurde in Korrelation mit TYR181 beobachtet. Diese Korrespondenz deutet auf die Existenz von zwei intermolekularen Anziehungskräften zwischen GLU138 hin. Diese positive Beobachtung für die Liganden und ihre aufgezählten Formen wurde verglichen, um einen besseren Liganden als potentielle NNRTI-Verbindung zu analysieren. Basierend auf den vorgelegten Ergebnissen besitzt das aufgezählte Etravirin das Potenzial, zur Behandlung von HIV/AIDS eingesetzt zu werden.

Molekularmechanik mit verallgemeinerten Born- und Oberflächenberechnungen (MM-GBSA)

In dieser Studie war die primäre Quelle des energetischen Eintrags zur bindenden freien Energie, ΔG_bind, der Beitrag der van der Waals, ΔG_VdW, Wechselwirkung. Aufgezähltes Etravirin hat einen höheren ΔG_VdW von -66,146 kcal/mol als sein bekanntes NNRTI-Pendant mit einem ΔG_VdW von -64,669 kcal/mol. Der höhere_{ΔG-Hbond-Wert} von -2,541 kcal/mol ezählt Etravirin deutet auf den signifikanten Beitrag der Wasserstoffanziehungskräfte zwischen dem Liganden und dem Protein hin. Die Beiträge des ΔG_Coulomb und des ΔG_Covalent für das aufgezählte Etravirin (-17,976 und 2,807 kcal/mol) waren weitaus größer als die des bekannten NNRTI-Gegenstücks, das -11,196 bzw. 2,491 aufwies.

Die beobachteten Ergebnisse während der Bindung von Etravirin und dem aufgezählten Etravirin an das 1HQU-Protein sind einigermaßen konsistent. Es wurde festgestellt, dass das aufgezählte Etravirin aufgrund von zwei zusätzlichen Wasserstoffbrückenbindungen besser ist als sein Gegenstück Etravirin. Die Studie zeigte auch, dass aufgezähltes Etravirin für die Bindung an die identifizierte Tasche bevorzugt wurde. Die negativere_ΔG-Bindung (-89,684 kcal/mol) für aufgezähltes Etravirin im Vergleich zu Etravirin (-80,551 kcal/mol) zeigt, dass aufgezähltes Etravirin ein guter Inhibitor der HIV-1-RT ist.

Abbildung 1: Chemische Strukturen von sechs zugelassenen nicht-nukleotiden Reverse-Transkriptase-Inhibitoren der US-amerikanischen Food and Drug Administration für das humane Immundefizienzvirus-1. NVP = Nevirapin; DLV = Delavirdin; EFV = Efavirenz; ETV = Etravirin; RPV = Rilpivirin; DOR = Doravirin. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Öffnen der Maestro Schrödinger-Anwendung unter Windows auf dem lokalen Rechner. (A) Navigieren zur Maestro-Schrödinger-Anwendung auf dem lokalen Computer. (B) Öffnen und Ausführen der Maestro Schrödinger-Anwendung auf dem lokalen Computer. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Importieren einer PDB-Dateistruktur vom lokalen Rechner in das Projektfenster in Schrödinger. (A) Funktion Struktur importieren in Maestro Schrödinger. (B) Textfeld PDB-ID. (C) Heruntergeladene PDB-Datei auf dem lokalen Computer. (D) Schaltfläche Importieren, um den Import der eingefügten PDB-ID-Datei zu ermöglichen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4: Struktur der PDB-Datei, die in das Schrödinger-Projektfenster importiert wurde. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 5: Arbeitsablauf für die Proteinzubereitung. (A) Suchschnittstelle für den Arbeitsablauf für die Proteinzubereitung. (B) Speichern des Namens der Job-Datei und Starten des Proteinvorbereitungsprozesses. (C) Überwachungsfenster für laufende Jobs. (D) Zerlegung des Liganden in seine einzelnen Bestandteile. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 6: Arbeitsablauf bei der Ligandenvorbereitung. (A) Importieren von Strukturen vom lokalen Rechner in das Projektfenster Proteinpräparation Schrödinger. (B) Suche nach dem Ligandenvorbereitungsprozess. (C) Arbeitsablauffenster für die Ligandenvorbereitung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 7: Arbeitsablauf für Geometrie und Optimierung. (A) GaussView-Menüfenster zur Geometrieoptimierung. (b) Verfügbare Auftragstypen auf der Registerkarte "Berechnen" von GaussView. (C) Optionen, die auf der Registerkarte Link0 in GaussView verfügbar sind. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. 

Abbildung 8: Arbeitsablauf bei der Erzeugung von Gleitgittern und molekularem Andocken. (A) Schnittstelle zum Arbeitsablauf bei der Generierung von Rezeptorgittern. (B) Pop-up-Benachrichtigung zur Auswahl eines Atoms innerhalb des Liganden. (C) Erweiterte Einstellungen des Rezeptors. (D) Benachrichtigung über den Abschluss der Arbeit. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 9: Andocken von Gleitliganden. (A) Schnittstelle für das Andocken von Gleitliganden Suche. (b) Liganden-Docking-Schnittstelle. (C) Präzisionseinstellungen für Glide Docking. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 10: Arbeitsablauf für die KNIME-QSAR-Vorbereitung. (A) Suche nach dem AutoQSAR-Knoten auf der KNIME-Community-Hub-Webseite. (B) Download-Schaltfläche, um den AutoQSAR KNIME-Knoten zu erhalten. (C) Importieren des heruntergeladenen AutoQSAR KNIME Workflows. (D) Konfigurationseinstellungen für Liganden beim Erstellen eines QSAR-Modells. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 11: Aufzählung von Liganden mit dem Ligand Designer in Maestro Schrödinger. (A) Suche nach Ligand Designer-Optionen in Schrödinger. (B) Liste der Workflows zur Durchführung des Aufzählungsprozesses. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 12: Arbeitsablauf bei der Generierung von HOMO-LUMO. (A) Zugriff auf die Optionen des molekularen Editors auf der Registerkarte Werkzeuge in GaussView. (B) Laden einer vorhandenen Chk- oder FChk-Datei zur Erzeugung von Grenzmolekülorbitalen. (C) Illustration der Grenzorbitale HOMO und LUMO in GaussView. (D) Visualisierungsfenster zur Anzeige der Grenzorbitale HOMO und LUMO. (E) Rettung der Grenzorbitale von HOMO und LUMO. (f) Schnittstelle für das Anzeigeformat in GaussView. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 13: Arbeitsablauf für die Vorbereitung, den Aufbau, die Vorbereitung und die Ausführung der Molekulardynamik. (A) Desmond System Builder: Solvatationsoptionen zur Bestimmung starrer Wassermodelle. (B) Desmond System Builder Boundary-Optionen zum Bestimmen der Quaderform. (c) Desmond System Builder: Methode zur Berechnung der Boxgröße. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 14: Liganden-Interaktionsdiagramme zwischen 1HQU und 3 top angedockten Liganden. Wechselwirkungskräfte zwischen Protein (1HQU) und (A) dem Kristallliganden (HBY561), (B) Efavirenz und (C) Etravirin. Diese Kräfte beeinflussen die Protein-Liganden-Wechselwirkungen und sind entscheidend für die Entwicklung von Medikamenten, die die Antibiotikaresistenz bei HIV-1 reduzieren. Ihre Rolle bei der Verbesserung der Bindungsaffinität, Spezifität und des Wirkmechanismus hilft bei der Entwicklung von Medikamenten, die das Virus wirksam bekämpfen und hemmen können, und trägt so der wachsenden Besorgnis über antimikrobielle Resistenzen im Zusammenhang mit der HIV-1-Behandlung Rechnung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 15: Ein Streudiagramm zeigt die beobachtete Aktivität im Vergleich zur vorhergesagten Aktivität für Klasse 1 des QSAR-Modells. Das Diagramm stellt die Anpassung zwischen Klasse 1 als Trainingssatz und den NNRTI-Verbindungen als Testsatz dar, um einen prädiktiven Aktivitätswert zu erhalten. Abkürzungen: NNRTI = Nicht-Nukleotid-Reverse-Transkriptase-Inhibitoren; QSAR = quantitative Struktur-Wirkungs-Beziehung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 16: Liganden-Interaktionsdiagramme. Kräfte der Wechselwirkungen zwischen dem Protein und (A) aufgezähltem Kristallliganden HBY_561, (B) aufgezähltem Nevirapin, (C) aufgezähltem Doravirin, (D) aufgezähltem Efavirenz und (E) aufgezähltem Etravirin. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 17: Interaktionsdiagramm der Molekulardynamik-Simulation des freien Proteins Etravirin und des aufgezählten Etravirins. (A) Molekulardynamisches Interaktionsdiagramm des freien Proteins. (B) Molekulardynamisches Interaktionsdiagramm von Etravirin. (C) Molekulardynamisches Interaktionsdiagramm von aufgezähltem Etravirin. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 18: Histogramm der Wechselwirkungskontakte zwischen Etravirin und dem Protein. (A) Zeitleiste der Protein-Liganden-Kontakte für Etravirin. (B) Die Zeitachse der Protein-Liganden-Wechselwirkungen im Laufe der Zeit, einschließlich H-Bindungen, hydrophobe, ionische und Wasserbrückenkontakte. (C) Ein Schema, das detaillierte Wechselwirkungen zwischen Ligandenatomen und Proteinresten zeigt. Es werden nur Wechselwirkungen angezeigt, die mehr als 30% der Simulationszeit (0,00 bis 200 ns) auftreten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 19: Histogramm der Interaktionskontakte zwischen dem aufgezählten Etravirin und dem Protein. (A) Zeitleiste der Protein-Liganden-Kontakte für das aufgezählte Etravirin. (B) Die Zeitachse der Protein-Liganden-Wechselwirkungen im Laufe der Zeit, einschließlich H-Bindungen, hydrophobe, ionische und Wasserbrückenkontakte. (C) Ein Schema, das detaillierte Wechselwirkungen zwischen Ligandenatomen und Proteinresten zeigt. Es werden nur Wechselwirkungen angezeigt, die mehr als 30% der Simulationszeit (0,00 bis 200 ns) auftreten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Klasse	Protein-Ziel	Compound-Sortiment	Gesamtzahl der ausgewählten Verbindungen
1	NL4-3 Wildtyp HIV-1	(8a1-8e5 – EC50 (nM)a)	25
2	IIIB WT HIV-1	13A1-13D6 - EC50 (nM)A	23
3	RES056 NNRTI-beständiger Stamm	13A1-13D6 - EC50 (nM)A	23
4	ROD HIV-2 Stamm	13A1-13D6 - EC50 (nM)A	23
Gesamtzahl der für die QSAR-Modellierung ausgewählten Verbindungen			94

Tabelle 1: Zusammenfassung der Kriterien für die Klassifizierung von Verbindungen für die QSAR-Modellierung. Ein Datensatz von 94 Dihydrofuro[3,4-d]-Pyrimidinverbindungen wurde von Kang und Kollegen⁵⁰ für verschiedene HIV-Stämme synthetisiert, nämlich NL4-3 Wildtyp HIV-1, IIIB WT HIV-1, RES056 NNRTI-resistenter Stamm und ROD HIV-2 Stamm. Diese Pyrimidinderivate wurden entsprechend ihrem Zielprotein in vier Klassen eingeteilt, um sie für die Durchführung unseres QSAR-Trainings vorzubereiten. Die Tabelle fasst zusammen, wie diese Moleküle in vier Klassen eingeteilt wurden, und zwar nach ihren experimentellen EC_50-Werten , die die Potenz eines Arzneimittels darstellen, operationalisiert als die Konzentration, bei der das Arzneimittel 50 % seiner maximalen Wirkung ausübt. Abkürzungen: NNRTI = Nicht-Nukleotid-Reverse-Transkriptase-Inhibitoren; QSAR = quantitative Struktur-Wirkungs-Beziehung.

Name des Proteins	Ligand	Bewertung des Andockens
1HQU	Efavirenz	-10.432
	Etravirin	-9.647
	HBY_561	-9.242
	Doravirin	-9.04
	Nevirapin	-8.825
	Rilpivirin	-7.722
	Delavirdine	-6.519

Tabelle 2: Docking-Scores von sechs optimierten NNRTIs und dem HIV-1-Protein. Die Docking-Scores beziehen sich auf die sechs NNRTIs, gegen die ermittelt wird. Der negativere Score deutet auf eine gute Bindungseffektivität zwischen dem Liganden und dem Protein hin. Efavirenz und Etravirin zeigten mit -10,432 eV und -9,647 eV die günstigsten Werte im Vergleich zum Andockwert des cokristallisierten Liganden HBY561 (-9,242). Potenzielle Liganden waren solche mit einem negativeren Andockwert von weniger als -9,242 eV.

Wirkstoffklasse	Aktivitätsanpassung bei 85 Prozent	Spalte 1	Spalte 2	Spalte 3	Spalte 4	Spalte 5
	Punktzahl	SD	Nr. R2	RMSE	Frage2	Q2 MW (Null-Hypothese)
1	0.8223	0.3268	0.815	0.2479	0.8185	0.1462
2	0.5671	0.2996	0.5067	0.1996	0.2264	0.4736
3	0.8172	0.3692	0.8114	0.1536	0.9065	-1.1532
4	0.6673	0.367	0.6436	0.1709	0.8852	0.1445
*SD – Standardabweichung,
R2 – Korrelation des Trainingssatzes zwischen tatsächlichen und prognostizierten Aktivitätswerten,
Q2 – Testset der tatsächlichen und prognostizierten Aktivitätskorrelation.
RMSE - Root Mean Squared Fehler

Tabelle 3: Statistische Parameter des 2D-QSAR-Modells. Die Tabelle zeigt die Standardabweichung, die Korrelation des Trainingssatzes zwischen den tatsächlichen und den vorhergesagten Aktivitätswerten (R²) und den Highscore für die tatsächliche und vorhergesagte Aktivitätskorrelation des Testsatzes für jede Klasse (Q²). Die höhere Punktzahl (R²) stellt die Klasse dar.

LIGAND	HOMO	LUMO	E-Lücke
Efavirenz	-0.2242	-0.06943	0.15477
Etravirin	-0.21408	-0.08141	0.13267
Nevirapin	-0.20602	-0.07759	0.12843
HBY_561	-0.19687	-0.0748	0.12207
Delavirdine	-0.19651	-0.07958	0.11693
Doravirin	-0.22413	-0.10916	0.11497
Rilpivirin	-0.21343	-0.11216	0.10127

Tabelle 4: HOMO-LUMO-Energielücke der optimierten NNRTIs. Die Tabelle zeigt die Ergebnisse der HOMO-LUMO-Energielücken, die nach der Optimierung der sechs NNRTIs erhalten wurden.

Ligand	Optimierte Liganden	Aufgezählte Liganden
Doravirin	7.229	7.374
Rilpivirin	7.302	7.279
Etravirin	7.229	7.374
Efavirenz	7.229	7.323
Delavirdine	7.302	7.302
Nevirapin	7.229	6.988
HBY_561	7.229	7.323

Tabelle 5: Prognostizierte Aktivitätswerte von optimierten NNRTIs im Vergleich zu entsprechenden aufgezählten NNRTIs. In der Tabelle werden die prädiktiven Aktivitätswerte zwischen optimierten und aufgezählten Liganden verglichen. Je höher die Aktivitätswerte, desto besser ist die Verbindung als potenzieller Wirkstofflead.

LIGAND	Energielücke nach Optimierung	Energielücke nach Aufzählung	Lückendifferenz zwischen optimierten und aufgezählten Verbindungen
Doravirin	0.115	0.126	0.011
Rilpivirin	0.101	0.127	0.030
Etravirin	0.133	0.126	0.010
Efavirenz	0.155	0.126	0.030
Delavirdine	0.117	0.126	0.010
Nevirapin	0.128	0.126	0.002
HBY_561	0.122	0.126	0.004

Tabelle 6: Vergleich der prognostizierten Energielücken der aufgezählten NNRTIs und der ursprünglichen Energielücke der optimierten NNRTIs. Die Tabelle zeigt einen Vergleich der HOMO-LUMO-Energielücke zwischen den optimierten und aufgezählten Liganden und den Energielückendifferenzen zwischen ihnen.

Aufgezählter Ligand	Regel der 5 Eigenschaften	Spalte 1	Spalte 2	Spalte 3	Spalte 4	Spalte 5	Seitengruppe hinzugefügt	Aufgezählte Andockbewertung	Originale Docking-Partitur	Redocked Enumerated Liganden
	AlogP	PSA	HBD	HBA	MW	MPO
Doravirin	2.4	125.9	2	8	441.8	0.49	Hydroxyl	-8.894	-9.04	-9.739
Etravirin	4.4	140.9	3	8	451.3	0.37	Hydroxyl	-10.258	-9.647	-10.517
Efavirenz	3.7	64.3	2	3	330.7	0.75	Amin	-10.284	-10.432	-11.025
Nevirapin	2.6	58.1	1	4	284.3	0.73	Fluorid	-9.112	-8.825	-9.445
HBY_561	2.4	93.9	2	6	358.5	0.66	Amid	-9.596	-9.242	-10.1
AlogP - (Berechneter Logarithmus des Oktanol-Wasser-Verteilungskoeffizienten).
PSA - (Polare Oberfläche)
HBD - (Spender von Wasserstoffbrückenbindungen)
HBA - (Wasserstoffbrücken-Akzeptoren)
MW - (Molekulargewicht)
MPO - (Multi-Parameter-Optimierung)

Tabelle 7: Vergleich des Docking-Scores zwischen den ursprünglichen und den aufgezählten NNRTIs. Die Tabelle zeigt den Vergleich zwischen den aufgezählten Andockbewertungen, d. h. den Andockbewertungen nach der Aufzählung. Die ursprünglichen Docking-Scores sind die Docking-Scores der optimierten NNRTIs. Die redocked enumerated scores sind die docking scores der Liganden, die aufgezählt wurden. Da der Aufzählungsprozess einen prädiktiven Docking-Score liefert, mussten die Liganden mit der gleichen Methode wie die optimierten Liganden wieder angedockt werden. Bei den hinzugefügten Gruppen handelt es sich um Gruppen, die den Liganden während des Aufzählungsprozesses hinzugefügt wurden.

Ligand	ΔG-Bindung	ΔGCoulomb	ΔGKovalent	ΔGHbond	ΔGLipo	ΔG-Packung	ΔGLösen	ΔGVdW
Etravirin	-80.551	-11.196	2.491	-1.509	-27.447	-4.826	26.605	-64.669
Aufgezähltes Etravirin	-89.684	-17.976	2.807	-2.541	-27.652	-4.211	26.034	-66.146
Nr. HBY561	-79.664	-12.261	0.994	-0.521	-26.052	-1.278	18.624	-59.169
Aufzählung HBY561	-82.719	-13.443	1.534	-0.603	-27.053	-1.210	20.600	-62.544
Efavirenz	-71.372	-12.984	1.151	-0.834	-25.353	-1.379	14.472	-46.44
Enumerated Efavirenz	-79.125	-18.602	1.753	-2.159	-25.409	-1.198	16.619	-50.129

Tabelle 8: MMGBSA reXts ausgewählter Liganden auf 1HQU. Die Tabelle stellt die Molekularmechanik mit generalisierter Born- und Oberflächenberechnung dar, die eine durchschnittliche freie Bindungsenergie (ΔGbind) des Protein-Liganden-Komplexes zeigen. Die Tabelle zeigt einen Vergleich zwischen den ursprünglich optimierten Liganden, die im Vergleich zu den Kristallliganden gute Docking-Werte aufweisen, und ihren aufgezählten Gegenstücken. Die gewählte Verbindung mit einem höheren Docking-Score und einer guten molekulardynamischen Simulation der RMSD-Fluktuation bei der Äquilibrierung sollte auch die MMGBSA-Berechnungen erfüllen, indem sie die negativstefreie Bindungsenergie von (ΔG-Bindung) zeigt. In diesem Fall erfüllt das aufgezählte Etravirin beide Berechnungsparameter.

Ergänzende Datei 1: Andere rXts, die in dieser Studie erhalten wurden. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Discussion

Die DFT^26-Methode wurde verwendet, um die elektronischen Eigenschaften und die Stabilität verschiedener Pyrimidinderivate zu analysieren, was in ähnlichen Studien nicht der Fall ist. Die Verwendung von DFT ermöglicht ein tieferes Verständnis der molekularen Wechselwirkungen auf Quantenebene und verbessert den Designprozess von NNRTIs. In dieser Studie haben wir sechs NNRTIs mit unbekannten Aktivitätswerten ausgewählt. Wir haben ihre molekularen Strukturen aus der PubChem-Datenbank abgerufen und eine geometrische Optimierung mit dem Minnesota 15 Local (MN15-L)³² Funktions- und 6-31++G (d,p)² Basissatz im Gaussian 16 Revision C01³³ Quantenmechanik-Softwarepaket durchgeführt. Zum Einrichten von Simulationseingabedateien haben wir GaussView 6.0²⁶ verwendet. Anschließend wurden die Quantenstrukturen an das aktive Zentrum des HIV-1-Proteins angedockt.

Die Studie verwendete einen QSAR-Ansatz⁵¹, der darauf zugeschnitten ist, die biologische Aktivität von NNRTIs basierend auf ihrer chemischen Struktur vorherzusagen. Dieses Modell wurde unter Verwendung eines Datensatzes von 94 Dihydrofuro[3,4-d]-Pyrimidinderivaten erstellt, was die Identifizierung wichtiger funktioneller Gruppen ermöglicht, die die antivirale Aktivität beeinflussen. Die Integration eines robusten QSAR-Modells ist ein entscheidender Fortschritt, da es dazu beiträgt, Verbindungen frühzeitig im Designprozess zu filtern und so die Wirksamkeit der Wirkstoffforschung zu verbessern.

Die vorhergesagten Aktivitäten der neuen Verbindungen wurden berücksichtigt und die Docking-Scores validiert. Die fortschrittliche molekulare Docking-Technik untersuchte die Bindungsinteraktionen zwischen NNRTIs und dem HIV-1-Reverse-Transkriptase-Enzym. Ergänzt wurde dies durch Molekulardynamik-Simulationen über einen längeren Zeitraum (200 ns), die Einblicke in die Stabilität und das Verhalten der Wirkstoff-Protein-Komplexe unter physiologischen Bedingungen gaben. Molecular dynamics⁵² validierte die Ergebnisse aus Docking-Studien. Durch die Simulation des Verhaltens von Wirkstoff-Enzym-Komplexen im Laufe der Zeit können wir die dynamische Stabilität und Wechselwirkungen bewerten, die in statischen Andockstudien möglicherweise nicht erfasst werden⁵³. Dieser Ansatz ermöglicht eine realistischere Einschätzung der Leistung von NNRTIs in biologischen Systemen. Die Simulationen zeigten, dass Etravirin RMSD-Schwankungen von etwa 4,5 Å erzeugte, während das aufgezählte Etravirin RMSD-Schwankungen von 3,5 Å ergab. Es gab verschiedene Ähnlichkeiten zwischen Etravirin und aufgezähltem Etravirin, wobei die aufgezählte Verbindung verstärkte Aminosäurewechselwirkungen innerhalb des aktiven Zentrums des Proteins aufwies. Die niedrigere RMSD, die verbesserten Aminosäureinteraktionen und die höchste freie Bindungsenergie deuten darauf hin, dass das aufgezählte Etravirin als praktikable Alternative für die Behandlung von HIV/AIDS dienen könnte.

Die Verwendung von Aufzählungstechniken⁵⁴ zur Erzeugung von Stereoisomeren und zur Durchführung von Isostere-Scans ist ein bemerkenswerter Aspekt dieser Forschung. Diese Methode ermöglicht es den Forschern, einen breiteren chemischen Raum für potenzielle NNRTIs zu erkunden, indem sie bestehende Strukturen systematisch modifizieren, was zur Entdeckung von Verbindungen mit verbesserter Wirksamkeit und reduzierter Resistenz führen kann.

Die Forschung integriert die HOMO-LUMO-Analyse, die aus quantenmechanischen Berechnungen abgeleitet wurde, um die Reaktivität und Stabilität der Verbindungen zu bewerten. Dieser Aspekt wird in ähnlichen Studien oft übersehen⁵⁵, liefert aber wertvolle Einblicke in elektronische Eigenschaften, die die biologische Aktivität beeinflussen können

Die Verwendung der MMGBSA-Methode in dieser Studie zur Abschätzung der bindenden freien Energien der aufgezählten NNRTIs als potenzielle HIV-1-Reverse-Transkriptase (RT)-Inhibitoren stellt einen neuen Aspekt dar, der die Bedeutung und den potenziellen Einfluss dieser Arbeit auf die Entwicklung von HIV-Behandlungen erhöht.

Die Anwendung von MMGBSA in dieser Studie ermöglicht eine genauere Abschätzung der bindungsfreien Energien für das aufgezählte Etravirin im Vergleich zu seinem Gegenstück. Durch die Berechnung der Bindungswerte der freien Energie wird in der Studie die Bindungsaffinität von aufgezähltem Etravirin quantitativ bewertet, die deutlich höher war (9,133 kcal/mol) als die von Standard-Etravirin. Dieser Detaillierungsgrad bei verbindlichen Energieberechnungen ermöglicht ein nuancierteres Verständnis davon, wie strukturelle Modifikationen die Wirksamkeit von NNRTIs beeinflussen können, was in ähnlichen Studien, die sich möglicherweise ausschließlich auf qualitative Bewertungen stützen, oft fehlt.

Der angegebene_kovalente ΔG-Wert von 1,477 kcal/mol zeigt die Stärke der Wechselwirkung für die aufgezählte Verbindung weiter an. Der vergleichende Ansatz ist innovativ, da er nicht nur einen vielversprechenden Kandidaten identifiziert, sondern ihn auch in den breiteren Kontext bestehender Therapien einordnet und so einen Maßstab für die zukünftige NNRTI-Entwicklung darstellt.

Der in Tabelle 8 gezeigte Vergleich zeigt auch, dass aufgezähltes Etravirin eine potenzielle Verbindung sein kann, die als alternative ART verwendet werden kann, da seine bindende freie Energie (ΔG-Bindung) im Vergleich zu Etravirin, HBY56, Etravirin und ihren aufgezählten Gegenstücken am höchsten ist.

Die Ergebnisse unserer Studie könnten die Entwicklung neuartiger Therapeutika für HIV-Infektionen erheblich beeinflussen. Darüber hinaus kann dieser Ansatz es ermöglichen, den vielversprechendsten Anti-HIV-Kandidaten zu identifizieren. Diese Ergebnisse könnten den Weg für das rationale Design neuartiger HIV-1-NNRTIs ebnen.

Die Einbeziehung von MMGBSA in Verbindung mit anderen Berechnungsmethoden (wie molekularem Docking, QSAR-Modellierung und Molekulardynamik-Simulationen) erhöht die Robustheit der Ergebnisse. Dieser integrierte Ansatz ermöglicht eine umfassende Bewertung der Verbindungen, von der strukturellen Optimierung bis hin zum dynamischen Verhalten im biologischen Kontext. Eine solche Methodik ist in der NNRTI-Forschung relativ neu, wo sich Studien oft auf isolierte Methoden konzentrieren, ohne den Prozess der Arzneimittelentwicklung ganzheitlich zu betrachten. Die Forschung zeigt mehrere vielversprechende Ergebnisse und ein verbessertes Verständnis der molekularen Wechselwirkungen zwischen NNRTIs und dem Reverse-Transkriptase-Enzym, was in die zukünftige Arzneimittelentwicklung einfließen kann.

Während sich andere Studien auf dem Gebiet der NNRTI-Entwicklung oft auf einzelne Berechnungsmethoden oder grundlegende Docking-Analysen konzentrieren, zeichnet sich diese Forschung durch die Kombination quantenchemischer Berechnungen mit Molekulardynamik und QSAR-Modellierung aus, indem sie einen systematischen Enumerationsansatz verwendet, der den potenziellen chemischen Raum für NNRTIs erweitert, und eine umfassende In-silico-Technologie verwendet Rahmenwerk, das nicht nur Bindungsaffinitäten vorhersagt, sondern auch die Stabilität und Dynamik von Arzneimittel-Enzym-Wechselwirkungen bewertet.

Insgesamt liegt die Neuheit dieser Forschung in ihrem facettenreichen Ansatz, der fortschrittliche Computertechniken nutzt, um die Herausforderungen der Arzneimittelresistenz in der HIV-Behandlung anzugehen und damit den Weg für die Entwicklung effektiverer NNRTIs zu ebnen. Die Ergebnisse unterstreichen das Potenzial für die Entwicklung wirksamerer NNRTIs, die die Grenzen der derzeitigen Therapien überwinden können.

Einige zukünftige Anwendungen des in diesem Protokoll beschriebenen Ansatzes umfassen die folgenden.

Integration mit maschinellem Lernen

Zukünftige Studien könnten MMGBSA mit Algorithmen des maschinellen Lernens integrieren, um die Vorhersagekraft der Bindung von Schätzungen der freien Energie zu verbessern. Durch das Training von Modellen auf großen Datensätzen könnten die Forscher die Genauigkeit und Zuverlässigkeit von Vorhersagen verbessern und so eine bessere Identifizierung vielversprechender NNRTI-Kandidaten ermöglichen.

Anwendung im fragmentbasierten Wirkstoffdesign

MMGBSA kann effektiv im fragmentbasierten Wirkstoffdesign eingesetzt werden, bei dem kleine molekulare Fragmente optimiert werden, um die Bindungsaffinität zu verbessern. Dieser Ansatz könnte zur Identifizierung neuartiger NNRTIs mit erhöhter Wirksamkeit und Selektivität gegen HIV-1 führen.

Erforschung von Mechanismen der Arzneimittelresistenz

Die Technik kann angewendet werden, um die Bindungsinteraktionen von NNRTIs mit mutierten Stämmen von HIV-1 zu untersuchen. Durch den Vergleich der bindenden freien Energien von NNRTIs mit Wildtyp- und resistenten Varianten können Forscher Einblicke in die Mechanismen der Arzneimittelresistenz gewinnen und das Design von Inhibitoren der nächsten Generation informieren.

Bewertung der pharmakokinetischen Eigenschaften

MMGBSA kann auch eingesetzt werden, um die pharmakokinetischen Eigenschaften von NNRTIs, wie Löslichkeit und Permeabilität, zu bewerten. Durch das Verständnis, wie diese Eigenschaften mit der Bindungsaffinität korrelieren, können Forscher Wirkstoffkandidaten für bessere therapeutische Profile optimieren.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
GaussView	GaussView		V6.1.1
KNIME	KNIME		V4.7.1
Schrödinger Maestro V13.6	SCHRÖDINGER INC.		Erscheinungsjahr der Lizenz: 2023-2